氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物及制備方法，是通過(guò)以下制備方法制備得到的：將原料藥與連接體混合，溶于有機(jī)溶劑，并加入縛酸劑，室溫下攪拌，真空旋蒸除去有機(jī)溶劑。純化后，將產(chǎn)物溶于適量有機(jī)溶劑，加入活化劑和脫水劑在室溫下活化生成原料藥酸酐活化酯。將載體溶于溶液中，加入活化劑和脫水劑攪拌活化。活化后，加入二硫鍵交聯(lián)劑，透析，凍干后得產(chǎn)物。將載體交聯(lián)產(chǎn)物溶于有機(jī)溶劑中。將原料藥酸酐酯滴入載體溶液中，孵化一定時(shí)間后。透析，凍干得目標(biāo)產(chǎn)物。本發(fā)明制得的共軛物，可有效提高多烯紫杉醇的溶解度，且具有較強(qiáng)的靶向性，其具有制備方法簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物及制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物及制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid, HA分子量：9. 7kDa)是一種粘多糖，有重要的生物功 能特性，比如穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附性和流動(dòng)性、干預(yù)細(xì)胞的增殖和分化。透明質(zhì) 酸和其衍生物已經(jīng)作為先進(jìn)材料用于制藥和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究成熟。與透明質(zhì)酸鍵合的 受體CD44和RHAMM在幾種高新陳代謝的惡性腫瘤細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)，使其在傳遞藥物方面有 靶向性。由于其高的親水性和多個(gè)可修飾的功能團(tuán)，透明質(zhì)酸-藥物的共軛物已作為生物 材料應(yīng)用于主動(dòng)靶向的生物制劑。
[0003] 多烯紫杉醇（D〇cetaXel，DTX)是一種用于治療卵巢、乳房、結(jié)腸、頭、頸和非小細(xì) 胞肺癌很有效的應(yīng)用于臨床的化學(xué)療法藥物。當(dāng)前的產(chǎn)品，泰素帝含有吐溫-80/乙醇溶劑 來(lái)提高多烯紫杉醇的水溶性。然而，過(guò)敏性和一些與以吐溫-80為基底的制劑有關(guān)的副作 用可能會(huì)在臨床應(yīng)用中發(fā)生。多烯紫杉醇與親水性材料通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成共軛物的方式 傳遞藥物已經(jīng)在提高多烯紫杉醇的溶解性、提高藥效、減少毒性方面日漸成熟。
[0004] 膠束（Micelles)是由疏水性的物質(zhì)和親水性的物質(zhì)通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合得到的兩親 性的聚合物。一些膠束產(chǎn)品已經(jīng)用于臨床實(shí)踐和臨床前實(shí)驗(yàn)。
[0005] 二硫鍵（Disulfide bonds)又稱S-S鍵，是2個(gè)-SH基被氧化而形成的-S-S-形式 的硫原子間的鍵。二硫鍵在氧化環(huán)境下穩(wěn)定存在，而在細(xì)胞內(nèi)特別是谷胱甘肽存在的還原 環(huán)境下通過(guò)硫醇二硫交換反應(yīng)可斷裂二硫鍵。由于細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽內(nèi)水平大約為2-10mM， 而細(xì)胞外谷胱甘肽水平大概為2-20 μ M，顯著地差異使二硫鍵賦予膠束氧化還原敏感的特 性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共 軛物及制備方法，作為一種氧化還原敏感的膠束，多烯紫杉醇通過(guò)二硫鍵結(jié)合到透明質(zhì)酸 骨架鏈上，從而產(chǎn)生氧化還原敏感特性。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物，由以下重量份的原料制成： 原料藥多烯紫杉醇20?80份，載體透明質(zhì)酸3?20份，連接體5?95份，縛酸劑2?20 份，其中，
[0009] 所述連接體為具有二硫鍵的化合物，酸酐，羧酸，酰肼，胺中的任一種或兩種以上 的混合。
[0010] 所述具有二硫鍵的化合物為胱胺、胱胺的鹽酸鹽，3, 3' -二硫代丙二酸、3, 3' -二 硫代丙亞氨酸二甲酯中的任一種或兩種以上的混合。
[0011] 所述酸酐為丁二酸酐（琥珀酸酐），辛烯基琥珀酸酐，順丁烯二酸酐、戊二酸酐中 的任一種或兩種以上的混合。
[0012] 所述羧酸為丁二酸或3, 3' -二硫代丙二酸中的任一種或兩種的混合。
[0013] 所述酰肼為己二酸二酰肼，間苯二甲酰肼、丁二酸二酰肼中的任一種或兩種以上 的混合。
[0014] 所述胺為胱胺，乙二胺、乙二胺鹽酸鹽，碳二酰亞胺中的任一種或兩種以上的混 合。
[0015] 所述脫水劑為1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺、碳酰二亞胺鹽酸鹽中 的任一種或兩種的混合。
[0016] 所述縛酸劑為4-二甲氨基吡啶、吡啶、三乙胺中的任一種或兩種以上的混合。
[0017] 所述共軛物分散于水中形成的膠束粒徑在100?500nm范圍內(nèi)。
[0018] 所述氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物的制備方法，步驟如下：
[0019] (1)將原料藥多烯紫杉醇與連接體混合溶于有機(jī)溶劑，加入縛酸劑，室溫下攪拌反 應(yīng)60?84小時(shí)（優(yōu)選72小時(shí)），真空旋蒸除去有機(jī)溶劑，將產(chǎn)物溶于有機(jī)溶劑，加入活化 劑和脫水劑，在室溫下活化生成原料藥活化酯；
[0020] (2)將載體透明質(zhì)酸溶于緩沖液或水中，加入活化劑和脫水劑攪拌活化；活化后， 加入連接體（優(yōu)選有二硫鍵的化合物），透析，凍干后得載體交聯(lián)產(chǎn)物，將載體交聯(lián)產(chǎn)物溶 于有機(jī)溶劑中，得載體溶液；
[0021] (3)將原料藥活化酯滴入載體溶液中，孵化4?48h后，透析，凍干，得目標(biāo)產(chǎn)物。
[0022] 所述活化劑為N-羥基丁二酰亞胺，硫醇化N-羥基丁二酰亞胺，4-二甲氨基吡啶、 二環(huán)己基碳二亞胺中的任一種或兩種以上的混合。
[0023] 所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷，二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亞砜中的任一 種或兩種以上的混合。
[0024] 所述緩沖液為PBS緩沖液（pH 7. 4)或MES緩沖液（pH 4. 75)。
[0025] 所述氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物的另一種制備方法步驟如下：
[0026] (1)取原料藥多烯紫杉醇，加入活化劑、縛酸劑、脫水劑、連接體，然后溶于有機(jī)溶 齊U，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，有機(jī)相用鹽酸萃取，再用蒸餾水萃取，真空旋蒸除去有 機(jī)溶劑，得產(chǎn)物；
[0027] (2)上述產(chǎn)物溶于有機(jī)溶劑，加入活化劑、脫水劑和連接體，室溫下反應(yīng)8?12h， 得原料藥活化酯；
[0028] (3)將載體透明質(zhì)酸溶于緩沖液或水中，加入連接體，調(diào)整pH至2?7,然后加入 脫水劑，反應(yīng)1小時(shí)，調(diào)整pH至8?12,結(jié)束反應(yīng)；透析三天，凍干后得載體交聯(lián)產(chǎn)物，將載 體交聯(lián)產(chǎn)物溶于有機(jī)溶劑中，得載體溶液；或：將載體透明質(zhì)酸溶于緩沖液或水中，加入碳 酸氫鈉或氫氧化鈉，調(diào)整PH至8?14,得載體溶液；
[0029] (4)將原料藥活化酯滴入載體溶液中，孵化4?48h后，透析，凍干，得目標(biāo)產(chǎn)物。
[0030] 所述活化劑為N-羥基丁二酰亞胺，硫醇化N-羥基丁二酰亞胺，4-二甲氨基吡啶、 二環(huán)己基碳二亞胺中的任一種或兩種以上的混合。
[0031] 所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷，二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亞砜中的任一 種或兩種以上的混合。
[0032] 所述緩沖液為PBS緩沖液（pH 7. 4)或MES緩沖液（pH 4. 75)。
[0033] 本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果：
[0034] 多烯紫杉醇水溶性差，現(xiàn)有的注射劑采用吐溫-80和乙醇溶液作為混合溶媒，應(yīng) 用時(shí)常引發(fā)嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)，不利于臨床用藥，因而研發(fā)具有良好溶解性能的多烯紫杉醇 藥物輸送系統(tǒng)一直是研究的熱點(diǎn)。多烯紫杉醇是高親脂性的藥物，鍵合到高親水性的材料 上形成兩親性共軛物后在水溶液中容易形成膠束。因此，本發(fā)明研究的是具有高氧化還原 敏感性和穩(wěn)定性多烯紫杉醇的一種新型的氧化還原敏感的靶向膠束制劑。該氧化還原敏感 的共軛物相比于非氧化還原敏感共軛物，顯示了更強(qiáng)的細(xì)胞攝取作用。本發(fā)明的共軛物制 劑在4°C條件下儲(chǔ)藏超過(guò)六個(gè)月顯示出良好的穩(wěn)定性。細(xì)胞毒性研究結(jié)果顯示，氧化還原敏 感的共軛物相比于非氧化還原敏感共軛物，可明顯提高多烯紫杉醇對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的 毒性。本發(fā)明的氧化還原敏感的多烯紫杉醇共軛物膠束制劑將來(lái)有望成為癌癥治療的新型 藥物制劑。
[0035] 本發(fā)明的氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物膠束制劑，可有效提高多 烯紫杉醇的溶解度，且具有較強(qiáng)的靶向性，其具有制備方法簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1 :胱胺修飾的透明質(zhì)酸（HA-CYS);
[0037] 圖2 :通過(guò)二硫鍵連接的多烯紫杉醇-透明質(zhì)酸共軛物質(zhì)譜圖（HA-ss-DTX);
[0038] 圖3 :氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物膠束制劑粒徑圖，其中，A圖中 平均粒徑為179. 5nm ;B圖中平均粒徑在237. 4nm ;
[0039] 圖4:靜脈注射多烯紫杉醇后血漿濃度對(duì)時(shí)間的曲線圖，小鼠給予多烯紫杉醇 10mg/kg，三條曲線分別代表在吐溫-80/乙醇中的多烯紫杉醇（方形），非氧化還原敏感的 膠束制劑（三角形）或者氧化還原敏感的膠束制劑（菱形）。

【具體實(shí)施方式】
[0040] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0041] 實(shí)施例1 :制備氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物
[0042] 步驟如下：
[0043] 稱取300mg多烯紫杉醇，與2mg琥珀酸酐混合，溶于4mL二氯甲燒，并加入60 μ L 吡啶，室溫下攪拌72h，真空旋蒸（除去二氯甲烷）。純化得200mg多烯紫杉醇琥珀酸酐衍 生物。將120mg多烯紫杉醇琥珀酸酐衍生物溶于4mL N，N-二甲基甲酰胺，加入45mg N-羥 基丁二酰亞胺和824mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽在室溫下活化得 130mg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯。
[0044] 將3g透明質(zhì)酸溶于ImL PBS緩沖液（pH 7.4)中，加入18mg 1-乙基-(3-二甲基 氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽和300mg硫醇化N-羥基丁二酰亞胺攪拌活化?；罨螅尤?IOg胱胺鹽酸鹽，透析72h，凍干后得2. 2g透明質(zhì)酸二硫鍵交聯(lián)產(chǎn)物。將2g透明質(zhì)酸二硫 鍵交聯(lián)產(chǎn)物溶于2. OmL甲酰胺中，得透明質(zhì)酸溶液，將多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯滴入 透明質(zhì)酸溶液中，攪拌孵化。透析，凍干即得目標(biāo)產(chǎn)物。
[0045] 分別取上述制備的透明質(zhì)酸二硫鍵交聯(lián)產(chǎn)物和目標(biāo)產(chǎn)物適量?jī)龈煞郏尤胭|(zhì)譜儀 進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖1為透明質(zhì)酸二硫鍵交聯(lián)產(chǎn)物的質(zhì)譜圖，圖2為目標(biāo)產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。
[0046] 實(shí)施例2 :制備氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物
[0047] 步驟如下：
[0048] 稱取270mg多烯紫杉醇，與14mg琥珀酸酐混合，溶于3mL二氯甲烷，并加入124 μ L 吡啶，室溫下攪拌三天，真空旋蒸（除去二氯甲烷）。純化得250mg多烯紫杉醇琥珀酸酐衍 生物。將200mg多烯紫杉醇琥珀酸酐衍生物溶于5mL N，N-二甲基甲酰胺，加入68mg N-羥 基丁二酰亞胺和24mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽在室溫下活化得 230mg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯。
[0049] 將3. 2g透明質(zhì)酸溶于4mL MES緩沖液（pH 4. 75)中，加入48mg 1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽和27mg硫醇化N-羥基丁二酰亞胺攪拌活化?；罨?， 加入IOg胱胺鹽酸鹽，透析72h，凍干后得3g透明質(zhì)酸二硫鍵交聯(lián)產(chǎn)物。將3g透明質(zhì)酸二 硫鍵交聯(lián)產(chǎn)物溶于4. 5mL甲酰胺中，得透明質(zhì)酸溶液，將多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯滴 入透明質(zhì)酸溶液中，攪拌孵化。透析，凍干即得目標(biāo)產(chǎn)物。
[0050] 實(shí)施例3 :制備氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物
[0051] 步驟如下：
[0052] 稱取34mg多烯紫杉醇，與12. 5mg琥珀酸酐混合，溶于2mL二甲基亞砜，并加入 0. 565mL批陡，室溫下攪拌72h，真空旋蒸（除去二甲基亞砜）。純化得30mg多烯紫杉醇琥拍 酸酐衍生物。將20mg多烯紫杉醇琥珀酸酐衍生物溶于5mL N，N-二甲基甲酰胺，加入23mg N-羥基丁二酰亞胺和76mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽在室溫下活 化得25mg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯。
[0053] 將500mg透明質(zhì)酸溶于IOmL MES緩沖液（pH 4.75)中，加入48mg 1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽和27mg硫醇化N-羥基丁二酰亞胺攪拌活化?；罨螅?用0. IM氫氧化鈉將pH調(diào)至7. 4,然后加入2g胱胺鹽酸鹽，透析72h，凍干后得460mg透明 質(zhì)酸二硫鍵交聯(lián)產(chǎn)物。將430mg透明質(zhì)酸二硫鍵交聯(lián)產(chǎn)物溶于2. 3mL甲酰胺中，得透明質(zhì) 酸溶液，將25mg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯滴入透明質(zhì)酸溶液中，攪拌孵化。透析，凍干 即得目標(biāo)產(chǎn)物。
[0054] 取上述制備的目標(biāo)產(chǎn)物適量，超聲處理制備膠束制劑，用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定其粒 度分布，界面電位分析儀測(cè)定膠束溶液的界面電位，結(jié)果如圖3A所示，粒徑在100?400nm 的范圍內(nèi)，電位在1?35mV范圍內(nèi)，分散性良好。
[0055] 實(shí)施例4 :制備氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物
[0056] 步驟如下：
[0057] 稱取25mg多烯紫杉醇，與6mg琥珀酸酐混合，溶于0· 2mL二氯甲烷，并加入8 μ L 吡啶，室溫下攪拌三天，真空旋蒸（除去二氯甲烷）。純化得18mg多烯紫杉醇琥珀酸酐衍 生物。將16mg多烯紫杉醇琥珀酸酐衍生物溶于8mL N，N-二甲基甲酰胺，加入13mg N-羥 基丁二酰亞胺和34mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽在室溫下活化得 18mg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯。
[0058] 將200mg透明質(zhì)酸溶于5mL MES緩沖液（pH 4.75)中，加入24mg 1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽和15mg 4-二甲氨基吡啶攪拌活化。活化后，加入608mg 胱胺鹽酸鹽，透析三天，凍干后得145mg透明質(zhì)酸二硫鍵交聯(lián)產(chǎn)物。將透明質(zhì)酸二硫鍵交聯(lián) 產(chǎn)物溶于5mL甲酰胺中，得透明質(zhì)酸溶液，將ISmg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯滴入透明 質(zhì)酸溶液中，攪拌孵化。透析，凍干即得目標(biāo)產(chǎn)物。
[0059] 實(shí)施例5 :制備氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物
[0060] 步驟如下：
[0061] 稱取30mg多烯紫杉醇，與12. 8mg辛烯基琥珀酸酐混合，溶于ImL二氯甲烷，并加 入45 μ L吡啶，室溫下攪拌72h，真空旋蒸（除去二氯甲烷）。純化得27mg多烯紫杉醇琥 珀酸酐衍生物。將產(chǎn)物溶于3mL N，N-二甲基甲酰胺，加入25. 5mg N-羥基丁二酰亞胺和 84. 5mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽在室溫下活化得29mg多烯紫杉 醇的辛烯基琥珀酸酐活化酯。
[0062] 將34mg透明質(zhì)酸溶于I. 22mL PBS緩沖液（pH 7. 4)中，加入8. 5mg 1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽和40mg硫醇化N-羥基丁二酰亞胺攪拌活化?；罨?， 加入96. 5mg胱胺鹽酸鹽，透析72h，凍干后得30mg透明質(zhì)酸二硫鍵交聯(lián)產(chǎn)物。將26mg透明 質(zhì)酸二硫鍵交聯(lián)產(chǎn)物溶于3mL甲酰胺中。將27mg多烯紫杉醇的辛烯基琥珀酸酐活化酯滴 入透明質(zhì)酸溶液中，攪拌孵化。透析，凍干即得目標(biāo)產(chǎn)物。
[0063] 實(shí)施例6 :制備氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物
[0064] 步驟如下：
[0065] 稱取38.8mg多烯紫杉醇，加入14.6mg 4-二甲氨基吡啶和120mg 1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽，16. 8mg 3, 3' -二硫代丙二酸溶于2. 5mL二氯甲烷 (4-二甲氨基吡啶本身是縛酸劑和活化劑），混合物溶液加到三頸瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng) 60h。結(jié)束后，有機(jī)相用鹽酸萃取三次（每次50mL)，蒸餾水萃取三次（每次50mL)，真空旋蒸 除去二氯甲烷得30mg多烯紫杉醇-二硫代丙二酸衍生物。將25mg多烯紫杉醇-二硫代丙二 酸衍生物溶于3.6mL二甲基亞砜中，加入45mg N-輕基丁二酰亞胺和78mg 1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽在室溫下反應(yīng)12h得20g多烯紫杉醇的二硫代丙二酸酐 活化酯。
[0066] 將540mg透明質(zhì)酸溶于IOmL水中，加入4. 5g 丁二酸二酰肼，反應(yīng)物溶液的pH用 0. IM的鹽酸調(diào)到6. 5,然后加入85mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽攪 拌活化，在此pH條件下反應(yīng)1小時(shí)，加入0. IM的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH到9. 0結(jié)束反應(yīng)。 透析72h，凍干后得490g透明質(zhì)酸-丁二酸二酰肼產(chǎn)物。將400g透明質(zhì)酸-丁二酸二酰 肼產(chǎn)物溶于16mL甲酰胺中，得透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼溶液，將450mg多烯紫杉醇的二硫 代丙二酸酐活化酯滴入透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼溶液中，攪拌孵化。透析，凍干即得目標(biāo)產(chǎn) 物。
[0067] 實(shí)施例7 :制備氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物
[0068] 步驟如下：
[0069] 稱取40mg多烯紫杉醇，加入67mg 4-二甲氨基吡啶和120mg 1-乙基-(3-二甲基 氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽，4. 5mg 3, 3' -二硫代丙二酸溶于二氯甲烷（4-二甲氨基吡 啶本身是縛酸劑和活化劑），混合物溶液加到三頸瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)60h。結(jié)束后，有 機(jī)相用鹽酸萃取三次（每次50mL)，蒸餾水萃取三次（每次50mL)，真空旋蒸除去二氯甲烷。 產(chǎn)物溶于6. 5mL二甲基亞砜中，加入84mg N-輕基丁二酰亞胺和14mg 1-乙基-(3-二甲基 氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽在室溫下反應(yīng)12h得35mg多烯紫杉醇的二硫代丙二酸酐活 化酯。
[0070] 將340mg透明質(zhì)酸溶于5mL水中，加入4.2g己二酸二酰。反應(yīng)物溶液的pH用0· IM 的HCl調(diào)到6. 5,然后加入85mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽攪拌活 化。在此pH條件下反應(yīng)1小時(shí)，加入0. INaOH調(diào)節(jié)pH到9. 0結(jié)束反應(yīng)。透析三天，凍干 后得260mg透明質(zhì)酸-丁二酸二酰肼產(chǎn)物。將240mg透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼產(chǎn)物溶13mL 甲酰胺中。將25mg多烯紫杉醇的二硫代丙二酸酐活化酯滴入透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼溶 液中，攪拌孵化。透析，凍干即得目標(biāo)產(chǎn)物。
[0071] 實(shí)施例8 :制備氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物
[0072] 步驟如下：稱取56mg多烯紫杉醇，加入13mg 4-二甲氨基批陡和12mg 1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽，14. 6mg 3, 3' -二硫代丙二酸溶于二氯甲烷 (4-二甲氨基吡啶本身是縛酸劑和活化劑），混合物溶液加到三頸瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng) 60h。結(jié)束后，有機(jī)相用鹽酸萃取三次（每次50mL)，蒸餾水萃取三次（每次50mL)，真空旋蒸 除去二氯甲燒。產(chǎn)物溶于5mL二甲基亞砜中，加入58mg N-輕基丁二酰亞胺和43mg 1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽在室溫下反應(yīng)12h得47mg多烯紫杉醇的二硫 代丙二酸酐活化酯。透明質(zhì)酸脫乙?；簩?00mg透明質(zhì)酸溶于7mL水，加入7. 8mL(pH = 14)氫氧化鈉溶液，磁力攪拌使膠狀溶液變?yōu)槌吻迦芤骸Ｍ肝?，凍干?40mg脫乙?；?透明質(zhì)酸。將300mg多烯紫杉醇-二硫代丙二酸酐活化酯溶于12mL N，N-二甲基甲酰胺， 加入到脫乙?；耐该髻|(zhì)酸水溶液中，磁力攪拌，孵化。透析，凍干即得目標(biāo)產(chǎn)物。
[0073] 實(shí)施例9 :制備氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物
[0074] 步驟如下：稱取27. 5mg多烯紫杉醇，加入63mg 4-二甲氨基批陡和12mg 1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽，78. 5mg 3,3' -二硫代丙二酸溶于二氯甲烷 (4-二甲氨基吡啶本身是縛酸劑和活化劑），混合物溶液加到三頸瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng) 60h。結(jié)束后，有機(jī)相用鹽酸萃取三次（每次50mL)，蒸餾水萃取三次（每次50mL)，真空旋 蒸除去二氯甲烷得24. 5mg多烯紫杉醇-二硫代丙二酸衍生物。將多烯紫杉醇-二硫代丙 二酸衍生物溶于二甲基亞砜中，加入25mg N-輕基丁二酰亞胺和63mg 1-乙基-(3-二甲基 氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽在室溫下反應(yīng)12h得25mg多烯紫杉醇的二硫代丙二酸酐活 化酯。將30〇11^透明質(zhì)酸溶于4〇1^水中，室溫放置。加入5〇1^質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%碳酸氫鈉后 放置1小時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9. 5。將多烯紫杉醇-二硫代丙二酸酐 活化酯加入到堿性的透明質(zhì)酸溶液中，劇烈攪拌8h。透析，凍干即得目標(biāo)產(chǎn)物。
[0075] 實(shí)施例10 :制備氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物
[0076] 步驟如下：稱取37mg多烯紫杉醇，加入14. 6mg 4-二甲氨基批陡和12mg 1-乙 基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽，16mg 3, 3' -二硫代丙二酸溶于6mL二氯甲 烷（4-二甲氨基吡啶本身是縛酸劑和活化劑），混合物溶液加到三頸瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反 應(yīng)60h。結(jié)束后，有機(jī)相用鹽酸萃取三次（每次50mL)，蒸餾水萃取三次（每次50mL)，真空 旋蒸除去二氯甲烷得多烯紫杉醇-二硫代丙二酸衍生物。將多烯紫杉醇-二硫代丙二酸衍 生物溶于二甲基亞砜中，加入34. 7mg N-羥基丁二酰亞胺和15mg 1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽在室溫下反應(yīng)12h得25mg多烯紫杉醇的二硫代丙二酸酐活化酯。 將560mg透明質(zhì)酸溶于MES緩沖液（pH 4. 75)中，加入48mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙 基）碳酰二亞胺鹽酸鹽和27mg硫醇化N-羥基丁二酰亞胺攪拌活化?；罨?，加入30g乙 二胺鹽酸鹽，透析72h，凍干后得500mg透明質(zhì)酸-乙二胺產(chǎn)物。將480mg透明質(zhì)酸-乙二 胺產(chǎn)物溶于16mL甲酰胺中。將24mg多烯紫杉醇的二硫代丙二酸活化酯滴入透明質(zhì)酸-乙 二胺溶液中，攪拌孵化6h。透析，凍干即得共軛物。
[0077] 實(shí)施例11 :制備非氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物
[0078] 步驟如下：稱取30. 5mg多烯紫杉醇，與24mg琥珀酸酐混合，溶于4mL二氯甲烷，并 加入吡啶，室溫下攪拌72h，真空旋蒸（除去二氯甲烷）。純化得27.5mg多烯紫杉醇-琥珀 酸酐衍生物。將25. 5mg多烯紫杉醇-琥珀酸酐衍生物溶于6mL N，N-二甲基甲酰胺，加入 32mg N-羥基丁二酰亞胺和8mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽在室溫 下活化得29mg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯。將37mg透明質(zhì)酸溶于水中，加入Ig己二酸 二酰。反應(yīng)物溶液的pH用0· IM的HCl調(diào)到6. 5,然后加入40mg 1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽。在此PH條件下反應(yīng)1小時(shí)，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1 % NaOH調(diào)節(jié) pH到9.0結(jié)束反應(yīng)。透析72h，凍干后得35mg透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼產(chǎn)物。將30mg透 明質(zhì)酸-己二酸二酰肼產(chǎn)物溶于5mL甲酰胺中。將25mg多烯紫杉醇的琥珀酸酐活化酯滴 入透明質(zhì)酸-己二酸二酰肼溶液中，攪拌孵化。透析，凍干即得非氧化還原敏感的共軛物。
[0079] 試驗(yàn)例1 :穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0080] 按照實(shí)施例3制備氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物膠束制劑，4°C下 存儲(chǔ)，根據(jù)載藥量和粒子大小推測(cè)其穩(wěn)定性。
[0081] 結(jié)果：該膠束在4°C條件下儲(chǔ)存6個(gè)月后，水中自組裝形成的膠束，其平均直徑及 載藥量與新鮮制備的膠束制劑相比無(wú)顯著變化（如圖3A所示）。
[0082] 試驗(yàn)例2 :穩(wěn)定性試驗(yàn)
[0083] 按照實(shí)施例7制備氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物膠束制劑，4°C下 存儲(chǔ)，根據(jù)載藥量和粒子大小推測(cè)其穩(wěn)定性（如圖3B所示）。
[0084] 試驗(yàn)例3 :細(xì)胞毒性試驗(yàn)
[0085] 按照實(shí)施例3制備的氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物膠束制劑和實(shí) 施例11制備的非氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物膠束制劑，用3-(4, 5-二甲 基-2-噻唑基）-2, 5-聯(lián)苯四唑溴化物（MTT)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定細(xì)胞毒性。在藥物治療前24小時(shí) 將KB細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中，每孔I X KT4個(gè)細(xì)胞。不同的多烯紫杉醇制劑包括轉(zhuǎn)氧化 還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物膠束制劑、非氧化還原敏感的膠束制劑或者是吐 溫-80/乙醇溶液，將其用培養(yǎng)液（RPMI-1640)稀釋到后以每孔100 μ 1加入到KB細(xì)胞中。 細(xì)胞在37°C下培養(yǎng)2h后，除去含有不同多烯紫杉醇制劑的培養(yǎng)液。所有細(xì)胞用磷酸鹽緩沖 液（pH 7.4)洗兩次后，加入新的培養(yǎng)液再培養(yǎng)72h。將四甲基偶氮唑鹽（MTT)原液（50mg/ mL，20 μ 1)加入到每孔中在37°C下培養(yǎng)4h。除去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO)溶解MTT 中藍(lán)色結(jié)晶物。所得溶液用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定吸光度，推測(cè)細(xì)胞的存活率。
[0086] 結(jié)果：如表1所示，氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物膠束制劑的細(xì)胞 半數(shù)抑制率比非氧化還原敏感的膠束制劑和吐溫-80/乙醇制劑分別低3. 8、2. 1倍。
[0087] 表IMTT實(shí)驗(yàn)測(cè)試多烯紫杉醇在KB細(xì)胞系中的細(xì)胞毒性
[0088]

【權(quán)利要求】
1. 一種氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物，其特征在于：由以下重量份的 原料制成：原料藥多烯紫杉醇20?80份，載體透明質(zhì)酸3?20份，連接體5?95份，縛酸 劑2?20份；其中，所述連接體為具有二硫鍵的化合物，酸酐，羧酸，酰肼，胺中的一種或兩 種以上的混合；所述的縛酸劑為吡啶、三乙胺中的任一種或兩種的混合。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物，其特征在于： 所述共軛物分散于水中形成的膠束粒徑在100?500nm范圍內(nèi)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物，其特征在于： 所述具有二硫鍵的化合物為胱胺、胱胺鹽酸鹽、3, 3'-二硫代丙二酸、3, 3'-二硫代丙亞氨 酸二甲酯中的一種或兩種以上的混合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物，其特征在于： 所述的連接體中酸酐為丁二酸酐，辛烯基琥珀酸酐，順丁烯二酸酐、戊二酸酐中的一種或兩 種以上的混合；羧酸為丁二酸，3, 3' -二硫代丙二酸中的任一種或兩種的混合；酰肼為己二 酸二酰肼，間苯二甲酰肼、丁二酸二酰肼中的任一種或兩種以上的混合；胺為胱胺，乙二胺、 碳二酰亞胺中的任一種或兩種的混合。
5. 如權(quán)利要求1所述氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物的制備方法，步驟 如下： (1) 將原料藥多烯紫杉醇與連接體混合溶于有機(jī)溶劑，加入縛酸劑，室溫下攪拌反應(yīng) 60?84小時(shí)，真空旋蒸除去有機(jī)溶劑，將產(chǎn)物溶于有機(jī)溶劑，加入活化劑和脫水劑，在室溫 下活化生成原料藥活化酯； (2) 將載體透明質(zhì)酸溶于緩沖液或水中，加入活化劑和脫水劑攪拌活化；活化后，加入 連接體，透析，凍干后得載體交聯(lián)產(chǎn)物，將載體交聯(lián)產(chǎn)物溶于有機(jī)溶劑中，得載體溶液； (3) 將原料藥活化酯滴入載體溶液中，孵化4?48h時(shí)間后，透析，凍干，得目標(biāo)產(chǎn)物； 所述活化劑為N-羥基丁二酰亞胺，硫醇化N-羥基丁二酰亞胺，4-二甲氨基吡啶、二 環(huán)己基碳二亞胺中的任一種或兩種以上的混合；所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷，二甲基亞砜、 N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亞砜中的任一種或兩種以上的混合；所述緩沖液為pH 7. 4的 PBS緩沖液或pH 4. 75的MES緩沖液。
6. 如權(quán)利要求5所述氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物的制備方法，其特 征在于，所述步驟（2)中連接體為胱胺、胱胺鹽酸鹽，3, 3' -二硫代丙二酸、3, 3'-二硫代 丙亞氨酸二甲酯中的任一種或兩種以上的混合。
7. 如權(quán)利要求5所述氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物的制備方法，其特 征在于，所述步驟（1)中室溫下攪拌反應(yīng)72小時(shí)，真空旋蒸除去有機(jī)溶劑。
8. 如權(quán)利要求1所述氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物的制備方法，其特 征在于，步驟如下： (1) 取原料藥多烯紫杉醇、活化劑、縛酸劑、脫水劑、連接體，溶于有機(jī)溶劑，在氮?dú)獗?護(hù)下反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，有機(jī)相用鹽酸萃取，再用蒸餾水萃取，真空旋蒸除去有機(jī)溶劑，得產(chǎn) 物； (2) 上述產(chǎn)物溶于有機(jī)溶劑，加入活化劑、脫水劑和連接體，室溫下反應(yīng)8?12h，得原 料藥活化酯； (3) 將載體透明質(zhì)酸溶于緩沖液或水中，加入連接體，調(diào)整pH至2?7,然后加入脫水 齊U，反應(yīng)1小時(shí)，調(diào)整pH至8?12,結(jié)束反應(yīng)；透析三天，凍干后得載體交聯(lián)產(chǎn)物，將載體交 聯(lián)產(chǎn)物溶于有機(jī)溶劑中，得載體溶液； (4)將原料藥活化酯滴入載體溶液中，孵化4?48h后，透析，凍干，得目標(biāo)產(chǎn)物； 所述活化劑為N-羥基丁二酰亞胺，硫醇化N-羥基丁二酰亞胺，4-二甲氨基吡啶、二 環(huán)己基碳二亞胺中的任一種或兩種以上的混合；所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷，二甲基亞砜、 N，N-二甲基甲酰胺，二甲基亞砜中的任一種或兩種以上的混合；所述緩沖液為pH 7. 4的 PBS緩沖液或pH 4. 75的MES緩沖液。
9.如權(quán)利要求8所述的氧化還原敏感的透明質(zhì)酸-多烯紫杉醇共軛物的制備方法，其 特征在于，所述步驟（2)中用碳酸氫鈉或氫氧化鈉調(diào)整pH。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104306983SQ201410606131
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】翟光喜, 張海群, 楊小葉 申請(qǐng)人:山東大學(xué)