穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物在制備防治手足口病藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及將一種現(xiàn)有的抗菌消炎藥穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物用作防治手足口病的新藥，為穿心蓮內(nèi)酯類藥物提供了新的用途。具體而言，本發(fā)明涉及穿心蓮內(nèi)酯類藥物在制備治療和/或預(yù)防手足口病病毒感染的藥物中的用途。所述穿心蓮內(nèi)酯類藥物，例如穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮內(nèi)酯磺化物、三乙酰穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯等，經(jīng)藥效學(xué)研究，表明穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物是防治手足口病的高效藥物，可以制成各種常用的劑型用于臨床防治，具有療效好、毒性低、價(jià)廉的特點(diǎn)。本發(fā)明為臨床手足口病病人的防治提供了一種新的藥物，為發(fā)現(xiàn)新的理論和藥物作用新的靶點(diǎn)提供重要依據(jù)。
【專利說(shuō)明】穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物在制備防治手足口病藥物中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及穿心蓮內(nèi)酯類藥物在制備治療和/或預(yù)防手足口病病毒感染的藥物中的用途，屬于中醫(yī)藥領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]手足口病是由小RNA病毒科，腸道病毒屬病毒引起的，現(xiàn)已成為危害嬰幼兒健康和公共衛(wèi)生安全的重要傳染病。手足口病主要由腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)和柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CA 16)所引起。手足口病通常為一過(guò)性的感染，從感染到出現(xiàn)臨床癥狀為3-6天，常在手、足、口部位出現(xiàn)丘疹、皰疹后不治自愈；但也有一部份病例，主要是小于3歲的嬰幼兒，會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥，如病毒性腦膜炎，腦炎，類似小兒麻痹的癱瘓，以及心肌炎，心包炎，心肌病且病情進(jìn)展迅速，引起的肺水腫、肺出血經(jīng)常導(dǎo)致嬰幼兒在I天內(nèi)快速死亡，痊愈后往往也存有嚴(yán)重的后遺癥。
[0003]流行病學(xué)資料顯示，EV71和/或CA16弓丨起的手足口病已在世界范圍內(nèi)多次爆發(fā)流行，尤其是近10年來(lái)，手足口病流行在亞太地區(qū)猖獗，不僅發(fā)病人數(shù)多，而且死亡病例多。自2008年5月2日起，衛(wèi)生部將手足口病納入丙類法定傳染病管理。此后，手足口病疫情在中國(guó)大陸蔓延，目前也仍得不到有效控制，據(jù)中國(guó)CDC的法定傳染病疫情通報(bào)可知，每年中國(guó)大陸手足口病發(fā)病超過(guò)百萬(wàn)例，死亡近千例。
[0004]手足口病防治已迫在眉睫，可至今尚無(wú)有效的疫苗或藥物來(lái)防治手足口病，從而控制疫情的蔓延。目前，EV71型手足口病滅活疫苗進(jìn)入臨床研究階段，距離臨床應(yīng)用仍有一段距離，其成功與否仍是未知數(shù)；其它手足口病疫苗仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，短期內(nèi)難以研究成功，預(yù)示著手足口病的防控在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)不得不完全依賴藥物對(duì)癥治療，就是疫苗有效也不能對(duì)所有的人全部保護(hù)，并且現(xiàn)在研制的疫苗不能用于特殊人群的接種。
[0005]目前，對(duì)于手足口病患者的臨床治療，無(wú)特效藥，一般根據(jù)臨床分期，采用對(duì)癥輔助治療的方案。用于治療手足口病的藥物，常使用利巴韋林和干擾素，在乳鼠動(dòng)物模型中具有一定的療效，且具有協(xié)同效果，但并沒(méi)有大規(guī)模的臨床驗(yàn)證；用于治療重癥手足口病患者的藥物，根據(jù)《手足口病防控指南》，可以使用注射用丙種球蛋白和糖皮質(zhì)激素沖擊療法，可是丙球來(lái)源受限，激素具有副作用，并且也沒(méi)有循癥醫(yī)學(xué)的證據(jù)。盡管乳鐵蛋白在實(shí)驗(yàn)室階段，無(wú)論是在體內(nèi)試驗(yàn)，還是在體外試驗(yàn)，均能防治EV71型手足口病病毒的感染，但在小規(guī)模的臨床實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有顯示出有任何的防護(hù)效果；目前，僅有米力農(nóng)(一種磷酸二酯酶抑制劑)在小規(guī)模的臨床實(shí)驗(yàn)中報(bào)道對(duì)于EV71引起的肺水腫型重癥病人有一定的治療效果，但并沒(méi)有進(jìn)行大規(guī)模的臨床試驗(yàn)。其它防治手足口病的藥物均處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，距離臨床應(yīng)用尚有很大距離，例如石蒜堿通過(guò)抑制手足口病病毒的繁殖，病毒中和抗體通過(guò)阻斷手足口病病毒感染，從而具有防治手足口病的能力，但石蒜堿存在毒性、中和抗存在抗體依賴感染增強(qiáng)現(xiàn)象，這類手足口病候選藥物能否成為臨床用藥均是未知數(shù)。由此可見(jiàn)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域迫切需要發(fā)現(xiàn)和發(fā)展可以用來(lái)防治手足口病感染、同時(shí)具有副作用少、療效高的新藥物。
[0006]穿心蓮為爵床科植物穿心蓮的干燥地上部分，味苦，性寒。具有清熱解毒、涼血消腫之功效。穿心蓮內(nèi)酯是穿心蓮中提取的二萜內(nèi)酯類化合物，是中藥穿心蓮的主要有效成分之一，臨床上主要治療上呼吸道感染、細(xì)菌性痢疾等。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯不僅具有抗菌消炎作用，還具有抗腫瘤、保肝利膽、抗病毒作用。目前，穿心蓮已經(jīng)用于臨床治療腫瘤，有一定療效。業(yè)已證明，穿心蓮內(nèi)酯在治療各種感染性疾病造成的炎癥性疾病中，均能取得較好的效果。關(guān)于穿心蓮內(nèi)酯抗病毒研究已有很多報(bào)道，穿心蓮內(nèi)酯對(duì)流感病毒、腺病毒有抑制作用，對(duì)皰疫病毒有一定的延緩作用；也具有抗黃病毒、痕病毒、丙肝病毒、SARS冠狀病毒、HIV病毒等作用。穿心蓮內(nèi)酯還具有免疫調(diào)節(jié)的功能，抑制炎癥時(shí)毛細(xì)血管通透性的增加，從而減少炎癥滲出物的量；提高白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌病毒的吞噬能力，提高血清中溶菌酶的含量，增加細(xì)胞免疫能力，從而具有廣譜抗病原微生物作用。
[0007]由于現(xiàn)今穿心蓮內(nèi)酯的應(yīng)用還處于開(kāi)發(fā)階段，未能使穿心蓮內(nèi)酯得到廣泛的應(yīng)用。利用穿心蓮內(nèi)酯磺化物喜炎平來(lái)治療手足口病，在臨床上有零星報(bào)道，但有效性證據(jù)仍不充分，目前尚未見(jiàn)在模型動(dòng)物上研究的報(bào)道。本發(fā)明為穿心蓮內(nèi)酯類藥物“老藥新用”提供了新用途和作用機(jī)理，為穿心蓮內(nèi)酯類藥物臨床應(yīng)用開(kāi)拓了新前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的技術(shù)目的在于探究穿心蓮內(nèi)酯類藥物在制備治療和/或預(yù)防手足口病的藥物中的新用途。
[0009]因此，本發(fā)明的第一方面提供一種穿心蓮內(nèi)酯類藥物在制備治療和/或預(yù)防手足口病病毒感染的藥物中的新用途。其中所述穿心蓮內(nèi)酯藥物為穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮內(nèi)酯磺化物、三乙酰穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯等，優(yōu)選地，所述穿心蓮內(nèi)酯類藥物為穿心蓮內(nèi)酯磺化物(喜炎平)。其中所述手足口病病毒為EV71、CA16、埃可病毒，優(yōu)選地，手足口病病毒為EV71、CA16，更優(yōu)選地，手足口病病毒為EV71。
[0010]本發(fā)明的第二個(gè)方面提供一種防治手足口病的穿心蓮內(nèi)酯類藥物組合物，所述藥物組合物包含安全、有效劑量范圍內(nèi)的穿心蓮內(nèi)酯類藥物和藥學(xué)上可接受的載體。其中，穿心蓮內(nèi)酯類藥物的安全、有效劑量根據(jù)治療對(duì)象的年齡、體重、病情、病程、給藥途徑等具體情況來(lái)確定，6歲以下的兒童一般為5-20mg/kg.day,分一次或者多次給藥。特別地，穿心蓮內(nèi)酯類藥物組合物也可以和臨床上其它藥物，例如利巴韋林、米力農(nóng)等聯(lián)合使用。
[0011]優(yōu)選地，所述藥物的劑型為注射劑、口服劑、吸入劑、噴霧劑、滴鼻劑。特別指出，藥學(xué)上可接受的載體取決于穿心蓮內(nèi)酯類藥物的劑型，包括糖、淀粉、植物油、穩(wěn)定劑等。
[0012]換言之，本發(fā)明利用EV71或/和CA16型手足口病病毒攻擊7日齡乳鼠建立了致死性動(dòng)物模型，并證明炎性細(xì)胞免疫過(guò)強(qiáng)、獲得性免疫衰竭和以促炎因子、趨化因子等引起的細(xì)胞因子“風(fēng)暴”是手足口病免疫損傷致病的主要機(jī)制，針對(duì)免疫系統(tǒng)的適時(shí)干預(yù)在治療手足口病病毒感染所導(dǎo)致的損傷中，有可能發(fā)揮重要作用。本發(fā)明利用穿心蓮內(nèi)酯類藥物干預(yù)野生型乳鼠后再用手足口病病毒攻擊所述乳鼠，或者手足口病病毒攻擊乳鼠后再用穿心蓮內(nèi)酯類藥物治療之，結(jié)果說(shuō)明，穿心蓮內(nèi)酯類藥物無(wú)論是在預(yù)防或/和治療手足口病病毒感染中均發(fā)揮了重要的保護(hù)作用，而藥物載體對(duì)照組均未發(fā)揮防治作用。因此，本發(fā)明證明了免疫損傷在手足口病病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而穿心蓮內(nèi)酯類藥物可以阻止或減緩手足口病病毒感染所造成的嚴(yán)重后果。
[0013]本發(fā)明的特點(diǎn)是提出穿心蓮內(nèi)酯類藥物具有防治手足口病的作用，為發(fā)現(xiàn)新理論和藥物作用新靶點(diǎn)提供重要依據(jù)。
[0014]下面參考實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。給出這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明，它們不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1:7日齡ICR乳鼠感染1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，分別在感染前4小時(shí)，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天。記錄其14天內(nèi)存活情況，繪制死亡率曲線。每組8只小鼠。
[0016]圖2:7日齡ICR乳鼠感染1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，分別在感染前4小時(shí)，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天。記錄其14天內(nèi)體重,繪制體重變化曲線。每組8只小鼠。
[0017]圖3:7日齡ICR乳鼠感染1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，分別在感染前4小時(shí)，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天。記錄其14天內(nèi)臨床疾病得分情況，繪制疾病得分變化曲線。每組8只小鼠。打分標(biāo)準(zhǔn):0:健康；1:精神萎靡，活動(dòng)減少；2:豎毛，弓背，共濟(jì)失調(diào)；3:消瘦，體重呈負(fù)增長(zhǎng)；4:四肢麻痹；5:瀕死；6:死亡。
[0018]圖4:7日齡ICR乳鼠感染1.25X 107TCID5Q的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株，
從感染后第4天起，每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水。記錄其14天內(nèi)存活情況，繪制死亡率曲線。每組8只小鼠。
[0019]圖5:7日齡ICR乳鼠感染1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，從感染后第4天起，每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水。記錄其14天內(nèi)體重，繪制體重變化曲線。每組8只小鼠。
[0020]圖6:7日齡ICR乳鼠感染1.25X 107TCID5Q的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，從感染后第4天起，每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水。記錄其14天內(nèi)臨床疾病得分情況，繪制疾病得分變化曲線。每組8只小鼠。打分標(biāo)準(zhǔn):0:健康；1:精神萎靡，活動(dòng)減少；2:豎毛，弓背，共濟(jì)失調(diào)；3:消瘦，體重呈負(fù)增長(zhǎng)；4:四肢麻痹；5:瀕死；6:死亡。
[0021]圖7:7日齡ICR乳鼠感染1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，分別在感染前4小時(shí)，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天。于感染后第6天，拍攝乳鼠照片(A)，并取乳鼠肌肉組織(B)和腦組織(C)進(jìn)行組織病理檢測(cè)。每組5只小鼠。
[0022]圖8:7日齡ICR乳鼠感染1.5\1081^105(|的0416型手足口病病毒耵08/07毒株后，分別在感染前4小時(shí)，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天。記錄其14天內(nèi)存活情況，繪制死亡率曲線。每組8只小鼠。
[0023] 圖9:7日齡ICR乳鼠感染1.5 X 18TCID5tl的CA16型手足口病病毒BJ08/07毒株，從感染后第4天起，每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水。記錄其14天內(nèi)存活情況，繪制死亡率曲線。每組8只小鼠。

【具體實(shí)施方式】
[0024]下面將通過(guò)下述非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。
[0025]下述實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法，所使用的實(shí)驗(yàn)材料如無(wú)特別說(shuō)明，均可容易地從商業(yè)公司獲取。
[0026]實(shí)施例1:喜炎平可以預(yù)防EV71型手足口病病毒BJ09/07株感染所致乳鼠死亡
[0027]實(shí)驗(yàn)材料:
[0028]I)主要實(shí)驗(yàn)儀器:二級(jí)生物安全柜(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)、小鼠飼養(yǎng)籠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)、無(wú)菌胰島素注射器(購(gòu)自美國(guó)BD公司)等。
[0029]2)主要實(shí)驗(yàn)試劑:喜炎平(購(gòu)自江西青峰藥業(yè)有限公司)、注射用生理鹽水(購(gòu)自石家莊四藥有限公司)、消毒劑(84消毒液和75%酒精)等。
[0030]3)病毒:EV71型手足口病病毒BJ09/07株(GenBank JQ319054.1)，分離自臨床手足口病患兒樣本。
[0031]4)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)7日齡ICR乳母鼠，購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0032]實(shí)驗(yàn)方法:
[0033]I)分組:喜炎平預(yù)防組、生理鹽水對(duì)照組；
[0034]2)用無(wú)菌胰島素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或生理鹽水，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，分別在感染前4小時(shí)，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天；
[0035]3)安全固定乳鼠，保持乳鼠頭部向下，腹部向外姿勢(shì)，用無(wú)菌胰島素注射器腹腔注射EV71型手足口病BJ09/07株病毒液，感染病毒滴度為每只1.25X 17TCID50,每組8只乳鼠；
[0036]4)將乳鼠放置于鼠籠內(nèi)，給予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0037]5)感染后每天15時(shí)觀察，4天內(nèi)發(fā)生死亡的小鼠為非特異死亡，在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)不予計(jì)算在內(nèi)；
[0038]6)連續(xù)觀察14天，每天記錄每組小鼠存活只數(shù)、體重以及臨床疾病得分情況；
[0039]7)用Graphpad Prism5軟件統(tǒng)計(jì)小鼠死亡率、體重變化、臨床疾病得分情況。
[0040]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0041]7日齡ICR乳鼠經(jīng)腹腔注射喜炎平或生理鹽水至感染第5天后，感染病毒滴度為
1.25 X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07株后的乳鼠死亡率、體重變化以及臨床得分結(jié)果如圖1、圖2、圖3所示。
[0042]感染相同滴度的BJ09/07株EV71型手足口病病毒后，注射生理鹽水的乳鼠死亡率明顯高于注射喜炎平的乳鼠(圖1)，而體重變化結(jié)果(圖2)、臨床得分結(jié)果(圖3)與死亡率結(jié)果一致。*P < 0.05
[0043]此結(jié)果說(shuō)明，喜炎平可以有效預(yù)防EV71型手足口病病毒感染所導(dǎo)致的嚴(yán)重病情，具有預(yù)防作用。
[0044]實(shí)施例2:喜炎平可以治療EV71型手足口病病毒BJ09/07株感染所致乳鼠死亡
[0045]實(shí)驗(yàn)材料:
[0046]I)主要實(shí)驗(yàn)儀器:二級(jí)生物安全柜、小鼠飼養(yǎng)籠、無(wú)菌注射器等。
[0047]2)主要實(shí)驗(yàn)試劑:喜炎平、注射用生理鹽水對(duì)照、消毒劑等。
[0048]3)病毒:EV71型手足口病病毒株BJ09/07。
[0049]4)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)7日齡ICR乳母鼠，購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0050]實(shí)驗(yàn)方法:
[0051]I)分組:喜炎平治療組、生理鹽水對(duì)照組；
[0052]2)安全固定乳鼠，保持乳鼠頭部向下，腹部向外姿勢(shì)，用無(wú)菌胰島素注射器腹腔注射EV71型手足口病BJ09/07病毒液，感染病毒滴度為每只1.25 X 17TCID50,每組8只乳鼠；
[0053]3)用無(wú)菌胰島素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或生理鹽水，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升,從感染后第4天起,每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水；
[0054]4)將乳鼠放置于鼠籠內(nèi)，給予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0055]5)感染后每天15時(shí)觀察，4天內(nèi)發(fā)生死亡的小鼠為非特異死亡，在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)不予計(jì)算在內(nèi)；
[0056]6)連續(xù)觀察14天，每天記錄每組小鼠存活只數(shù)、體重以及臨床疾病得分情況；
[0057]7)用Graphpad Prism5軟件統(tǒng)計(jì)小鼠死亡率、體重變化、臨床疾病得分情況。
[0058]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0059]7日齡ICR乳鼠從感染后第4天經(jīng)腹腔注射喜炎平或生理鹽水治療，感染病毒滴度為1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07株后的乳鼠死亡率、體重變化以及臨床得分結(jié)果如圖4、圖5、圖6所示。
[0060]感染相同滴度的BJ09/07株EV71型手足口病病毒后，注射生理鹽水對(duì)照的乳鼠死亡率明顯高于注射喜炎平的乳鼠(圖4)，而體重變化結(jié)果(圖5)、臨床疾病得分結(jié)果(圖6)與死亡率結(jié)果一致。*P < 0.05
[0061]此結(jié)果說(shuō)明，喜炎平可以有效治療EV71型手足口病病毒感染所導(dǎo)致的嚴(yán)重疾病，具有治療作用。
[0062]實(shí)施例3:喜炎平可以緩解EV71型手足口病病毒BJ09/07株感染所致乳鼠腦組織、肌肉組織病理?yè)p傷
[0063]實(shí)驗(yàn)材料:
[0064]I)主要實(shí)驗(yàn)儀器:二級(jí)生物安全柜、小鼠飼養(yǎng)籠、無(wú)菌注射器、小動(dòng)物手術(shù)器械、組織切片機(jī)、組織包埋機(jī)、顯微鏡等。
[0065]2)主要實(shí)驗(yàn)試劑:喜炎平、注射用生理鹽水對(duì)照、多聚甲醛固定液、無(wú)菌PBS、消毒劑等。
[0066]3)病毒:EV71型手足口病病毒株BJ09/07。
[0067]4)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)7日齡ICR乳母鼠，購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0068]實(shí)驗(yàn)方法:
[0069]I)分組:喜炎平預(yù)防組、生理鹽水對(duì)照組；
[0070]2)用無(wú)菌胰島素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或生理鹽水，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，分別在感染前4小時(shí)，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天；
[0071]3)安全固定乳鼠，保持乳鼠頭部向下，腹部向外姿勢(shì)，用無(wú)菌胰島素注射器腹腔注射EV71型手足口病BJ09/07病毒液，感染病毒滴度為每只1.25 X 17TCID50,每組5只乳鼠；
[0072]4)將乳鼠放置于鼠籠內(nèi)，給予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0073]5)感染后每天15時(shí)觀察，4天內(nèi)發(fā)生死亡的小鼠為非特異死亡；
[0074]6)感染病毒后第6天，拍攝乳鼠照片后用腹腔注射過(guò)量麻醉劑的方法致死乳鼠；
[0075]7)將乳鼠固定于小動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，移除皮膚及頭蓋骨，暴露腦，將鼠腦取出，再移除后肢皮膚，暴露后肢肌肉，將后肢肌肉取出，用無(wú)菌PBS洗去表面血液，置于4%多聚甲醛固定液中室溫固定48小時(shí)；
[0076]8)固定后的樣品由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行包埋、切片、HE染色等處理；
[0077]9)病理切片置于顯微鏡下觀察，記錄。
[0078]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0079]從圖7A中可見(jiàn)，生理鹽水對(duì)照組小鼠發(fā)生了嚴(yán)重的癱瘓現(xiàn)象，而喜炎平組表現(xiàn)正常，這也從圖7B和C(*200倍，HE染色)病理照片所顯示的一致:感染病毒滴度為
1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07后，腹腔注射生理鹽水對(duì)照的13日齡的ICR乳鼠肌肉組織(B)、腦組織(C)中出現(xiàn)嚴(yán)重的病理?yè)p傷。肌肉組織正常結(jié)構(gòu)被破壞，肌肉組織紋理紊亂，出現(xiàn)肌纖維斷裂，炎性滲出、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷，而腦組織中出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)細(xì)胞減少；
[0080]感染相同滴度的 EV71型手足口病BJ09/07病毒后，注射喜炎平的乳鼠肌肉組織病理?yè)p傷明顯減輕(B)，無(wú)明顯的肌肉纖維斷裂，僅有輕微的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并且腦組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕(C)。
[0081]此結(jié)果說(shuō)明，喜炎平可以有效減輕EV71型手足口病病毒感染所導(dǎo)致的嚴(yán)重免疫病理?yè)p傷，從而改善臨床癥狀及預(yù)后。
[0082]實(shí)施例4:喜炎平可以預(yù)防CA16型手足口病病毒BJ08/06株感染所致乳鼠死亡
[0083]實(shí)驗(yàn)材料:
[0084]I)主要實(shí)驗(yàn)儀器:二級(jí)生物安全柜、小鼠飼養(yǎng)籠、無(wú)菌注射器等。
[0085]2)主要實(shí)驗(yàn)試劑:喜炎平、注射用生理鹽水、消毒劑等。
[0086]3)病毒:CA16型手足口病病毒株BJ08/07 (GenBank: JX068833)，分離自臨床手足口病患兒樣本。
[0087]4)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)7日齡ICR乳母鼠:購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0088]實(shí)驗(yàn)方法:
[0089]I)分組:喜炎平預(yù)防組、生理鹽水對(duì)照組；
[0090]2)用無(wú)菌胰島素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或生理鹽水，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，分別在感染前4小時(shí)，感染后每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水至第5天；
[0091]3)安全固定乳鼠，保持乳鼠頭部向下，腹部向外姿勢(shì)，用無(wú)菌胰島素注射器腹腔注射CA16型手足口病BJ08/07病毒液，感染病毒滴度為每只1.5 X 18TCID5tl，每組8只乳鼠；
[0092]4)將乳鼠放置于鼠籠內(nèi)，給予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0093]5)感染后每天15時(shí)觀察，4天內(nèi)發(fā)生死亡的小鼠為非特異死亡，在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)不予計(jì)算在內(nèi)；
[0094]6)連續(xù)觀察14天，每天記錄每組小鼠存活只數(shù)、體重以及臨床疾病得分情況；
[0095]7)用Graphpad Prism5軟件統(tǒng)計(jì)小鼠死亡率、體重變化、臨床疾病得分情況。
[0096]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0097]7日齡ICR乳鼠經(jīng)腹腔注射喜炎平或生理鹽水至感染第5天后，感染病毒滴度為
1.5 X 18TCID50的CA16型手足口病病毒BJ08/07株后的乳鼠死亡率結(jié)果如圖8所示。
[0098]感染相同滴度的BJ08/07株CA16型手足口病病毒后，注射生理鹽水對(duì)照的乳鼠死亡率明顯高于注射喜炎平的乳鼠(圖8)，而體重變化結(jié)果、臨床疾病得分結(jié)果與死亡率結(jié)果一致。*P < 0.05
[0099]此結(jié)果說(shuō)明，喜炎平可以有效預(yù)防CA16型手足口病病毒感染所導(dǎo)致的嚴(yán)重病情，具有預(yù)防作用。
[0100]實(shí)施例5:喜炎平可以治療CA16型手足口病病毒BJ08/07株感染所致乳鼠死亡
[0101]實(shí)驗(yàn)材料:
[0102]I)主要實(shí)驗(yàn)儀器:二級(jí)生物安全柜、小鼠飼養(yǎng)籠、無(wú)菌注射器等。
[0103]2)主要實(shí)驗(yàn)試劑:喜炎平、注射用生理鹽水、消毒劑等。
[0104]3)病毒:CA16型手足口病病毒株BJ08/07
[0105]4)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)7日齡ICR乳母鼠，購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0106]實(shí)驗(yàn)方法:
[0107]1)分組:喜炎平治療組、生理鹽水對(duì)照組；
[0108]2)安全固定乳鼠，保持乳鼠頭部向下，腹部向外姿勢(shì)，用無(wú)菌胰島素注射器腹腔注射CA16型手足口病BJ08/07病毒液，感染病毒滴度為每只1.5 X 18TCID5tl，每組8只乳鼠；
[0109]3)用無(wú)菌胰島素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或注射用生理鹽水，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，從感染后第4天起，每天腹腔給予喜炎平或生理鹽水；
[0110]4)將乳鼠放置于鼠籠內(nèi)，給予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0111]5)感染后每天15時(shí)觀察，4天內(nèi)發(fā)生死亡的小鼠為非特異死亡，在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)不予計(jì)算在內(nèi)；
[0112]6)連續(xù)觀察14天，每天記錄每組小鼠存活只數(shù)、體重以及臨床疾病得分情況；
[0113]7)用Graphpad Prism5軟件統(tǒng)計(jì)小鼠死亡率、體重變化、臨床疾病得分情況。
[0114]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0115]7日齡ICR乳鼠從感染后第4天經(jīng)腹腔注射喜炎平或注射用生理鹽水治療，感染病毒滴度為1.5 X 18TCID50的CA16型手足口病病毒BJ08/07株后的乳鼠死亡率結(jié)果如圖9所示。
[0116]感染相同滴度的BJ08/07株CA16型手足口病病毒后，注射生理鹽水對(duì)照的乳鼠死亡率明顯高于注射喜炎平的乳鼠(圖9)，而體重降低結(jié)果、臨床得分結(jié)果與死亡率結(jié)果一致。*P < 0.05
[0117]此結(jié)果說(shuō)明，喜炎平可以有效治療CA16型手足口病病毒感染所導(dǎo)致的嚴(yán)重疾病，具有治療作用。
[0118]實(shí)施例6:喜炎平可以預(yù)防或/和治療EV71型或/和CA16型手足口病病毒不同毒株感染所致乳鼠死亡
[0119]實(shí)驗(yàn)材料:
[0120]I)主要實(shí)驗(yàn)儀器:二級(jí)生物安全柜、小鼠飼養(yǎng)籠、無(wú)菌胰島素注射器等。
[0121]2)主要實(shí)驗(yàn)試劑:喜炎平、注射用生理鹽水、消毒劑等。
[0122]3)病毒:EV71型手足口病病毒TS株(GenBank JQ708210.1) ,CA16型手足口病病毒TS10/08 (GenBank: JX068829)，均分離自臨床手足口病患兒樣本。
[0123]4)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)7日齡ICR乳母鼠，購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
[0124]實(shí)驗(yàn)方法:
[0125]I)分組:喜炎平預(yù)防組、喜炎平治療組、生理鹽水對(duì)照組；
[0126]2)用無(wú)菌胰島素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或生理鹽水，預(yù)防組，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，分別在感染前4小時(shí)，感染后每天腹腔給予喜炎平至第5天；治療組，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，從感染后第4天起，每天腹腔給予喜炎平；
[0127]3)安全固定乳鼠，保持乳鼠頭部向下，腹部向外姿勢(shì)，用無(wú)菌胰島素注射器腹腔注射EV71型手足口病TS株病毒液，感染病毒滴度為每只17PFU,每組8只乳鼠，或者用無(wú)菌胰島素注射器腹腔注射CA16型手足口病毒TS10/08株病毒液，感染病毒滴度為每只
2.5 X 19TCID50 ；
[0128]4)將乳鼠放置于鼠籠內(nèi)，給予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0129]5)感染后每天15時(shí)觀察，4天內(nèi)發(fā)生死亡的小鼠為非特異死亡，在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)不予計(jì)算在內(nèi)；
[0130]6)連續(xù)觀察14天，每天記錄每組小鼠存活只數(shù)、體重以及臨床疾病得分情況；
[0131]7)用Graphpad Prism5軟件統(tǒng)計(jì)小鼠死亡率、體重變化、臨床疾病得分情況。
[0132]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0133]7日齡ICR乳鼠經(jīng)腹腔注射喜炎平或生理鹽水后，感染相同滴度的EV71型/CA16型手足口病病毒后，注射生理鹽水的乳鼠死亡率明顯高于注射喜炎平的乳鼠，而體重變化結(jié)果、臨床得分結(jié)果與死亡率結(jié)果一致。*P<0.05
[0134]此結(jié)果說(shuō)明，喜炎平可以有效預(yù)防或/和治療EV71型/CA16型手足口病病毒感染所導(dǎo)致的嚴(yán)重病情，具有防治作用。
【權(quán)利要求】
1.穿心蓮內(nèi)酯類藥物在制備治療和/或預(yù)防手足口病病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的穿心蓮內(nèi)酯類藥物，包括穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物，例如穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮內(nèi)酯磺化物、三乙酰穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯琥珀酸半酯等。
3.如權(quán)利要求1所述的穿心蓮內(nèi)酯類藥物的應(yīng)用，其特征在于穿心蓮內(nèi)酯類藥物可以制成各種劑型應(yīng)用，如注射型穿心蓮內(nèi)酯磺化物、口服型穿心蓮內(nèi)酯滴丸、噴霧型穿心蓮內(nèi)酷等。
4.如權(quán)利要求1所述的手足口病病毒，包括71型腸道病毒(EV71)、A16型柯薩奇病毒(CA16)、埃可病毒等手足口病病毒。
5.如權(quán)利要求1所述的治療和/或預(yù)防手足口病病毒感染的穿心蓮內(nèi)酯類藥物，其特征在于，該類藥物可以單獨(dú)使用，也可以與現(xiàn)有的防治手足口病的其他藥物聯(lián)合使用。
6.如權(quán)利要求1-5所述的治療和/或預(yù)防手足口病病毒感染的穿心蓮內(nèi)酯類藥物可用于不同年齡的手足口病感染人群。
【文檔編號(hào)】A61K31/7048GK104042621SQ201310093766
【公開(kāi)日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月14日
【發(fā)明者】趙忠鵬, 王希良, 任忠義, 謝寧, 管晨, 王玉光 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所, 江西青峰藥業(yè)有限公司, 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院