柯薩奇病毒a16型的保守中和表位多肽及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及柯薩奇病毒A16型的保守中和表位多肽及其用途。具體而言，本發(fā)明提供了柯薩奇病毒A16型中和表位多肽；本發(fā)明還提供了可特異性結(jié)合上述中和表位多肽的結(jié)合分子、包含所述結(jié)合分子的抗血清、檢測柯薩奇病毒A16型的試劑盒、檢測方法以及抑制柯薩奇病毒A16型的組合物；本發(fā)明還提供了上述中和表位多肽、結(jié)合分子和抗血清在制備預(yù)防、治療手足口病藥物以及診斷手足口病診斷劑中的用途。其優(yōu)點在于：首次鑒定出6個在CA16VP1上的線性中和表位，不同基因型CA16序列比對結(jié)果顯示這些表位非常保守，將中和表位多肽免疫小鼠引起的血清可以中和同源和異源的CA16株型，這些結(jié)果對于柯薩奇病毒A16型疫苗及診斷試劑盒的開發(fā)有重要的指導(dǎo)意義。
【專利說明】柯薩奇病毒Al 6型的保守中和表位多肽及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗原的表位及其應(yīng)用，具體地說，是柯薩奇病毒A16型的保守中和表位多肽及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002]柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CA16, CVA16)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，病毒基因組是約7410bp的單股正鏈RNA，包含一個編碼長肽鏈的開放閱讀框，長肽鏈分為結(jié)構(gòu)蛋白Pl和非結(jié)構(gòu)蛋白P2和P3區(qū)域，Pl被病毒蛋白酶切割為病毒衣殼蛋白VPl、VPO和VP3 ;部分VPO進一步自切割為VP2和VP4。
[0003]CA16 是兒童中常見的手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)的一個主要致病原。CA16感染的多數(shù)患者臨床病癥較輕微，大多能自愈，包括發(fā)熱、口腔潰瘍、手足部紅色皰疹。但越來越多的證據(jù)顯示CA16的感染也能引起患兒嚴重病癥甚至死亡。例如最近Xu等報道了 92例嚴重神經(jīng)癥狀的HFMD，其中19例是由于感染了 CA16 (XuWj Liu CF，Yan Lj Li JJj Wang LJj Qi Y，et al.Distribution of enterovirusesin hospitalized children with hand, foot and mouth disease and relationshipbetween pathogens and nervous system complications.Virol J 2012;9 (I):8.)。目前還沒有針對CA16的有效疫苗和藥物。但是最近中國大陸的幾家疫苗公司開始研發(fā)CA16的全病毒滅活苗。另外，上海巴斯德研究所已制備了基于病毒樣顆粒的CA16新型疫苗，該疫苗能在小鼠體內(nèi)引起較好的中和抗體反應(yīng)，所產(chǎn)生的抗血清在CA16病毒攻擊實驗中能夠有效保護小鼠，具體可參見期刊文獻:Liu Q, Yan K, Feng Y, Huang X，Ku Z, Cai Y,et al.A virus-like particle vaccine for coxsackievirus A16 potently elicitsneutralizing antibodies that protect mice against lethal challenge.Vaccine2012 Oct 19;30(47):6642-8.);還可參見專利文獻:申請?zhí)?201010553419.1，申請日 2010年11月19日，發(fā)明名稱“柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒疫苗”。Mao等報道的CA16滅活病毒免疫小鼠抗血清中的中和抗體也能在一定程度保護小鼠致死劑量的攻擊(Mao Q, Wang Y,Gao Rj Shao Jj Yao X， Lang S， et al.A Neonatal Mouse Model of CoxsackievirusA16 for Vaccine Evaluation.J Virol 2012 Sep 5.)。這些發(fā)現(xiàn)都證明了中和抗體在體內(nèi)可以抵抗CA16病毒感染。
[0004]許多研究表明，腸道病毒的VPl衣殼蛋白是主要的中和位點所在。如期刊文獻:Foo DGj Alonso S， Phoon MCj Ramachandran NP， Chow VTj Poh CL Identificationof neutralizing linear epitopes from the VPl capsid protein of Enterovirus 71using synthetic peptides.Virus Res 2007 Apr; 125 (I): 61-8，鑒定出的EV71 的兩個中和表位在VPl上。然而，截至目前CA16的中和表位卻仍未被鑒定出。而CA16中和表位的鑒定對于CA16預(yù)防或治療藥物以及診斷劑的制備，其意義十分重大。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種分離的多肽。
[0006]本發(fā)明的再一的目的是，提供上述多肽的用途。
[0007]本發(fā)明的另一的目的是，提供一種另一種多肽。
[0008]本發(fā)明的第四個目的是，提供上述的另一種多肽的用途。
[0009]本發(fā)明的第五個目的是，提供一種基于上述多肽的結(jié)合分子。
[0010]本發(fā)明的第六個目的是，提供上述結(jié)合分子的用途。
[0011]本發(fā)明的第七個目的是，提供一種抗血清。[0012]本發(fā)明的第八個目的是，提供上述抗血清的用途。
[0013]本發(fā)明的第九個目的是,提供一種檢測柯薩奇病毒A16型Coxsackievirus A16的試劑盒。
[0014]本發(fā)明的第十個目的是，提供一種非治療目的的檢測柯薩奇病毒A16型的方法。
[0015]本發(fā)明的第十一個目的是，提供一種抑制柯薩奇病毒A16型的組合物。
[0016]為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種分離的多肽，所述的多肽選自SEQ ID N0.1-6所示氨基酸序列的任一種。
[0017]為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:如上所述的多肽在制備預(yù)防或治療柯薩奇病毒A16型感染的疾病藥，或制備診斷柯薩奇病毒A16型感染的疾病診斷劑中的用途；所述的柯薩奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。
[0018]為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種多肽，所述的多肽選自:
a)SEQ ID N0.1_6所示氨基酸序列中任一種氨基酸序列的串聯(lián)排列；或
b)SEQID N0.1-6所示氨基酸序列中任兩種或兩種以上氨基酸序列的組合，
所述的多肽用于制備預(yù)防或治療柯薩奇病毒A16型感染的疾病藥，或制備診斷柯薩奇病毒A16型感染的疾病診斷劑。在該多肽中，串聯(lián)多肽即序列如SEQ ID N0.1-6所示的多肽，其順序和每條多肽的拷貝數(shù)是隨機選擇的。
[0019]為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:上述多肽在制備預(yù)防或治療柯薩奇病毒A16型感染的疾病藥，或制備診斷柯薩奇病毒A16型感染的疾病診斷劑中的用途；所述的柯薩奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。
[0020]為實現(xiàn)上述第五個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種結(jié)合分子，所述的結(jié)合分子可特異性結(jié)合如上所述的多肽；優(yōu)選的，所述的結(jié)合分子是抗體；更優(yōu)選的，所述的抗體是廣譜中和單克隆抗體。
[0021]為實現(xiàn)上述第六個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:如上所述的結(jié)合分子在制備預(yù)防或治療柯薩奇病毒A16型感染的疾病藥，或制備診斷柯薩奇病毒A16型感染的疾病診斷劑中的用途；所述的柯薩奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。
[0022]為實現(xiàn)上述第七個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種抗血清，所述的抗血清包含如上任一所述的結(jié)合分子。
[0023]為實現(xiàn)上述第八個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:如上所述的抗血清在制備預(yù)防或治療柯薩奇病毒A16型感染的疾病藥，或制備診斷柯薩奇病毒A16型感染的疾病診斷劑中的用途；所述的柯薩奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。
[0024]為實現(xiàn)上述第九個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種檢測柯薩奇病毒A16型的試劑盒，所述的試劑盒包含如上所述的任一種多肽或如上所述的任一種結(jié)合分子。[0025]為實現(xiàn)上述第十個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:一種非治療目的的檢測柯薩奇病毒A16型的方法，包括步驟:a)將樣品與選自下組的物質(zhì)接觸:如上所述的任一種多肽、如上任一所述的抗體、或其組合；b)檢測是否形成抗原-抗體復(fù)合物，其中形成復(fù)合物就表不樣品中存在柯薩奇病毒A16型或抗柯薩奇病毒A16型的抗體。所述的非治療目的的檢測柯薩奇病毒A16型的方法諸如檢測土壤樣本中的柯薩奇病毒A16，或者是在科學(xué)研究中檢測人血液樣本中是否存在柯薩奇病毒A16等。
[0026]為實現(xiàn)上述第十一 個目的，本發(fā)明米取的技術(shù)方案是:一種抑制柯薩奇病毒A16型的組合物，所述的組合物包含:a)如上所述的任一種結(jié)合分子；和b)藥學(xué)上可接受的載體。 [0027]本發(fā)明優(yōu)點在于:
本發(fā)明利用具有中和活性的抗CA16病毒樣顆粒抗血清篩選涵蓋整個VPl蛋白的95條合成多肽，鑒定出15個結(jié)合力較強的多肽。通過體外中和抑制試驗進一步篩選出對抗CA16病毒樣顆?？寡宓闹泻托Ч酗@著抑制能力的6條不重疊的多肽。用這些多肽免疫小鼠所產(chǎn)生的抗血清能夠與同源多肽結(jié)合，并在免疫熒光和免疫印記檢測中特異性識別CA16的VPl蛋白。更重要的是,這些抗血清可以在體外中和CA16病毒感染，表明這6條多肽代表的是中和表位。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，這些表位在不同基因型的CA16毒株間非常保守。因此本發(fā)明對開發(fā)基于中和表位多肽的CA16疫苗和診斷劑具有重要指導(dǎo)意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]附圖1是多肽ELISA測定鼠抗VLP血清與合成多肽的結(jié)合反應(yīng)。用包括CA16 VPl蛋白上所有序列的95條多肽包被ELISA板，將VLP抗血清1:1000稀釋檢測包被的多肽，數(shù)值代表的是三次獨立實驗的其中一次結(jié)果。
[0029]附圖2是PEP32和PEP91抑制抗VLP血清的中和能力。多肽和抗血清的混合物，與CA16孵育后，加入RD細胞，其中，(B)未加抗血清和多肽的對照；(C)只有VLP抗血清；(D) VLP抗血清和PEP21 ； (E)抗血清和PEP32 ； (F)抗血清和PEP91 ； (A)為未感染病毒的RD細胞。
[0030]附圖3是通過免疫熒光用多肽抗血清檢測感染CA16的細胞。感染CA16的VERO細胞與1:100稀釋的免疫前血清和多肽抗血清在37 C溫浴I小時，然后與Alexa Fluor488標(biāo)記的抗小鼠IgG的抗體在37 C溫浴30分鐘。豚鼠抗CA16重組VPO蛋白的多抗血清作為陽性對照。用DAPI染色細胞。分別在Alexa Fluor 488和DAPI的濾光器下采集圖像，然后合并。
[0031]附圖4是免疫印記分析。滅活CA16蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用如圖所示的抗體作為一抗和HRP標(biāo)記的二抗去檢測。
[0032]附圖5是多肽抗血清在體外中和CA16。免疫前血清和對照血清(抗HCV多肽)在最低稀釋度1:8濃度下依然沒有顯示出中和效果，為計算GMT定義其中和滴度為4。每個圖標(biāo)代表一只小鼠。直線代表的是各組的GMT。
[0033]附圖6是中和表位的序列比對。用DNAMAN軟件比對了 11株CA16的VPl蛋白的序列。
[0034]【【具體實施方式】】下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0035]實施例1中和表位多肽的合成、篩選和鑒定 I材料與方法
1.1細胞、病毒與血清
RD細胞和VERO細胞的培養(yǎng)請參考文獻:Liu Q, Ku Z, Cai Y, Sun B, Leng Q, HuangZ.Detection, characterization and quantitation of coxsackievirus A16 usingpolyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins.J VirolMethods 2011 Apr;173(I):115-20。
[0036]所用毒株CA16-SZ05 (GeneBank ID: EU262658)請參考文獻:(I) Wu Z，GaoYj Sun Lj Tien P， Jin Q.Quick identification of effective small interferingRNAs that inhibit the replication of coxsackievirus A16.Antiviral Res 2008Dec; 80 (3): 295-301 和(2) Yang F，Jin Q，He Y，Li Lj Hou Y.The complete genomeof Enterovirus 71 China strain.Sci China C Life Sci 2001 Apr;44(2):178-83。
[0037]毒株CA16-G08從一手足口病人的糞便樣品中分離得到，分離程序請參考文獻:LiLj He Y，Yang H，Zhu Jj Xu X，Dong Jj Zhu Y，Jin Q.Genetic characterization ofhuman enterovirus 71 and coxsackievirus A16 circulating from 1999 to 2004 inShenzhen, People’ s Republic of China.J Clin Microbiol 2005 Aug;43(8):3835-9。
[0038]擴增病毒使用RD細胞。
[0039]病毒滴度 測定方法請參考文獻:Liu Q, Ku Z, Cai Y, Sun B, Leng Q, HuangZ.Detection, characterization and quantitation of coxsackievirus A16 usingpolyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins.J VirolMethods 2011 Apr;173(I):115-20。
[0040]所用的抗CA16 VLP的小鼠血清的制備請參考文獻:Liu Q，Yan K，F(xiàn)eng Y，Huang X，Ku Zj Cai Y，et al.A virus-like particle vaccine for coxsackievirusA16 potently elicits neutralizing antibodies that protect mice against lethalchallenge.Vaccine 2012 Oct 19;30 (47):6642-8。
[0041]1.2多肽合成
在上海吉爾生化有限公司合成了 95條多肽，這些多肽覆蓋了毒株CA16-SZ05的整個VPl蛋白的氨基酸序列。每條多肽含有15個氨基酸，其中12個殘基與相鄰多肽相重疊。另外，氨基酸序列如SEQ ID N0.1-6所示的多肽均化學(xué)偶聯(lián)了 KLH。
[0042]1.3 多肽 ELISA
用ELISA方法來檢測95條多肽與CA16 VLP抗血清的反應(yīng)。簡短的說，將每條多肽50μ1 (lOPg/ml)包被于96孔ELISA板，37 C溫浴2小時。用含5%脫脂牛奶的PBST每孔200μ1 37 C封閉I小時。50μ1每孔加入用含1%牛奶的PBST 1:1000稀釋的小鼠血清，37 C溫浴2小時。每孔加入50μ1用含1%牛奶的PBST 1:5000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗小鼠IgG，37 C溫浴I小時。每次溫浴后，ELISA板用PBST洗5遍。最后每孔加入50μ1 TMB顯色底物，避光孵育5-10分鐘，然后每孔加入50μ1 IN H3PO4終止反應(yīng)。在讀板機上測定OD45tl。
[0043]1.4中和實驗和中和抑制實驗中和實驗方法請參考文獻:Liu Q, Yan K, Feng Y, Huang X, Ku Z, Cai Y,et al.A virus-like particle vaccine for coxsackievirus A16 potently elicitsneutralizing antibodies that protect mice against lethal challenge.Vaccine2012 Oct 19;30(47):6642-8,其不同之處僅在于所使用的病毒量由IOOTCID5q改為50TCID50O能夠阻止細胞出現(xiàn)病變(細胞變圓、聚集并且漂浮)的血清最高稀釋度判定為中和滴度。
[0044]進一步通過多肽抑制實驗來研究多肽對CA16 VLP抗血清的中和能力的影響。簡短的說，將含2% FBS的DMEM倍比稀釋的CA16 VLP抗血清與不同濃度的合成多肽混合，在37 C溫浴I小時，然后將混合物做中和實驗，方法如前所述。
[0045]1.5小鼠免疫
Balb/c雌性小鼠，每組5只，腹腔注射5(^g KLH偶聯(lián)的合成多肽，初次免疫使用的是弗氏完全佐劑。每隔兩周用弗氏不完全佐劑同樣抗原劑量加免，共加免三次。在最后一次免疫后的兩周殺掉小鼠采血。所有動物操作符合上海巴斯德研究所的IACUC法則規(guī)定。
[0046]1.6抗體滴度測定
多肽特異的IgG滴度測定采用如文獻:Liu Q, Ku Z, Cai Y, Sun B, Leng Q, HuangZ.Detection, characterization and quantitation of coxsackievirus A16 usingpolyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins.J VirolMethods 2011 Apr; 173 (I): 115-20所述的終點滴度ELISA方法，但有如下改變:每孔500ng多肽包被ELISA板，二抗為HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG (購自Sigma公司)。將吸光值比空白對照(免疫前血清)^ 0.1的對應(yīng)的血清最高稀釋度的倒數(shù)作為終點滴度。
[0047]1.7 SDS-PAGE及免疫印記分析
SDS-PAGE及Western blot 請參考文獻:Liu Q, Ku Z, Cai Y, Sun B, Leng Q, HuangZ.Detection, characterization and quantitation of coxsackievirus A16 usingpolyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins.J VirolMethods 2011 Apr; 173 (I): 115-20。簡短的說，將滅活的CA16通過12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白條帶后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后用多肽的鼠抗血清和HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG(購自Sigma公司)檢測膜上的CA16蛋白。
[0048]1.8免疫熒光染色
免疫突光染色方法請參考文獻:Liu Q, Ku Z, Cai Y, Sun B, Leng Q, HuangZ.Detection, characterization and quantitation of coxsackievirus A16 usingpolyclonal antibodies against recombinant capsid subunit proteins.J VirolMethods 2011 Apr; 173 (I): 115-20。有如下改變:多肽抗血清用PBS進行1:100稀釋，用1:1000 稀釋的 Alexa Fluor 488-標(biāo)記的抗小鼠 IgG (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)為檢測二抗。用5Pg/ml 4,6 - 二脒基-2 -苯基吲哚(DAPI)室溫孵育5分鐘對細胞核染色。染色細胞用突光顯微鏡(Leica, ffetzlar, Germany)觀察。
[0049]1.9序列比對
從NCBI的PubMed網(wǎng)站下載了十一株CA16基因組序列，用DNAMAN軟件比對了這些毒株的VPl蛋白序列。
[0050]2 結(jié)果2.1多肽ELISA鑒定出VPl線性優(yōu)勢表位
如前所述，用CA16 VLP免疫小鼠能引起中和抗體(Liu Q, Yan K, Feng Y, HuangX， Ku Zj Cai Y， et al.A virus-like particle vaccine for coxsackievirus A16potently elicits neutralizing antibodies that protect mice against lethalchallenge.Vaccine 2012 Oct 19; 30 (47): 6642-8.)?為了鑒定出這些中和表位，我們首先用CA16 VLP抗血清來篩選，該抗血清針對CVA16-SZ05毒株中和滴度達到32，000，用該抗血清與CA16 VPl蛋白的95條合成多肽反應(yīng)。圖1顯示了抗血清與各條多肽的結(jié)合特性。部分多肽顯示出了高結(jié)合特性，證明其包含了 B細胞表位。根據(jù)ELISA讀值，選出了 15條結(jié)合力最高的多肽(多肽編號如表1所示)來進一步分析。
[0051]表1多肽對不同稀釋度VLP抗血清中和能力的抑制
【權(quán)利要求】
1.一種分離的多肽，其特征在于，所述的多肽選自SEQ ID N0.1-6所示氨基酸序列的任一種。
2.權(quán)利要求1所述的多肽在制備預(yù)防或治療柯薩奇病毒A16型CoxsackievirusA16感染的疾病藥，或制備診斷柯薩奇病毒A16型感染的疾病診斷劑中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的柯薩奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。
4.一種多肽，其特征在于，所述的多肽選自: a)SEQ ID N0.1_6所示氨基酸序列中任一種氨基酸序列的串聯(lián)排列；或 b)SEQID N0.1-6所示氨基酸序列中任兩種或兩種以上氨基酸序列的組合， 所述的多肽用于制備預(yù)防或治療柯薩奇病毒A16型感染的疾病藥，或制備診斷柯薩奇病毒A16型感染的疾病診斷劑。
5.權(quán)利要求4所述的多肽在制備預(yù)防或治療柯薩奇病毒A16型感染的疾病藥，或制備診斷柯薩奇病毒A16型感染的疾病診斷劑中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的柯薩奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。
7.一種結(jié)合分子，其特征在于，所述的結(jié)合分子可特異性結(jié)合權(quán)利要求1或4所述的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的結(jié)合分子，其特征在于，所述的結(jié)合分子是抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的結(jié)合分子，其特征在于，所述的抗體是廣譜中和單克隆抗體。
10.權(quán)利要求7-9任一所述的結(jié)合分子在制備預(yù)防或治療柯薩奇病毒A16型感染的疾病藥，或制備診斷柯薩奇病毒A16型感染的疾病診斷劑中的用途。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述的柯薩奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。
12.—種抗血清，其特征在于，所述的抗血清包含權(quán)利要求7-9任一所述的結(jié)合分子。
13.權(quán)利要求12所述的抗血清在制備預(yù)防或治療柯薩奇病毒A16型感染的疾病藥，或制備診斷柯薩奇病毒A16型感染的疾病診斷劑中的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于，所述的柯薩奇病毒A16型感染的疾病是手足口病。
15.一種檢測柯薩奇病毒A16型的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含權(quán)利要求1或4所述的多肽或權(quán)利要求7-9任一所述的結(jié)合分子。
16.一種非治療目的的檢測柯薩奇病毒A16型的方法，其特征在于，包括步驟: a)將樣品與選自下組的物質(zhì)接觸:權(quán)利要求1或4所述的多肽、權(quán)利要求7-9任一所述的抗體、或其組合； b)檢測是否形成抗原-抗體復(fù)合物，其中形成復(fù)合物就表示樣品中存在柯薩奇病毒A16型或抗柯薩奇病毒A16型的抗體。
17.—種抑制柯薩奇病毒A16型的組合物，其特征在于，所述的組合物包含: a)權(quán)利要求7-9任一所述的結(jié)合分子；和 b)藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號】A61P31/14GK103833830SQ201210476169
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月22日
【發(fā)明者】黃忠, 石金平 申請人:中國科學(xué)院上海巴斯德研究所