硫酸化糖胺聚糖用于改善因子viii的生物利用度的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含一種或多種因子VIII和硫酸化糖胺聚糖、用于在非靜脈內(nèi)施用后增加因子VIII的生物利用度的的藥物組合物。本發(fā)明還涉及因子VIII和硫酸化糖胺聚糖組合用于治療或預(yù)防出血障礙，由此因子VIII的生物利用度得到增加，以及涉及通過(guò)硫酸化糖胺聚糖的共施用增加因子VIII的非靜脈內(nèi)施用后生物利用度的方法。
【專利說(shuō)明】硫酸化糖胺聚糖用于改善因子Vl I I的生物利用度的用途
[0001]本發(fā)明涉及包含至少一種因子VIII和硫酸化糖胺聚糖、用于在非靜脈內(nèi)施用后增加因子VIII的生物利用度的藥物制劑。本發(fā)明還涉及因子VIII和硫酸化糖胺聚糖組合用于治療和預(yù)防出血障礙的用途，其中因子VIII的生物利用度得到增加，以及涉及通過(guò)共施用硫酸化糖胺聚糖化增加因子VIII的非靜脈內(nèi)施用后生物利用度的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]因子VIII (FVIII)
[0004]FVIII是哺乳動(dòng)物肝臟中產(chǎn)生的分子量約280kDa的血漿糖蛋白。其為導(dǎo)致血液凝固的凝血反應(yīng)級(jí)聯(lián)的至關(guān)重要的組分。該級(jí)聯(lián)中有一個(gè)其中因子IXa(FIXa)與活化的因子VlII(FVIIIa) 一起將因子X(jué)(FX)轉(zhuǎn)化成活化形式FXa的步驟。FVIIIa在該步驟中充當(dāng)輔因子，其與鈣離子和磷脂一起是使FIXa的活性最大化所需要的。最常見(jiàn)的血友病障礙是由被稱為血友病A的功能性FVIII缺乏而引起的。
[0005]血友病A的治療中的一項(xiàng)重要進(jìn)展是分離到編碼人FVIII的完整2，351個(gè)氨基酸的序列的cDNA克隆(美國(guó)專利N0.4，757，006)以及提供了人FVIII基因DNA序列和其重
組生產(chǎn)方法。
[0006]從克隆的cDNA確定的人FVIII的推導(dǎo)一級(jí)氨基酸序列的分析表明，其為從更大的前體多肽加工而成的異二聚體。該異二聚體由約80kDa的C末端輕鏈與以金屬離子依賴性方式相締合的約200kDa N末端重鏈組成。(參見(jiàn)Kaufman, Transfusion Med.Revs.6:235(1992)的綜述)。該異二聚體的生理活化通過(guò)凝血酶對(duì)其蛋白質(zhì)鏈的蛋白水解切割發(fā)生。凝血酶將重鏈切割 成90kDa的蛋白質(zhì)，隨后將其切割成54kDa和44kDa的片段。凝血酶還將80kDa的輕鏈切割成72kDa的蛋白質(zhì)。正是后一種蛋白質(zhì)和通過(guò)鈣離子保持在一起的兩個(gè)重鏈片段(上述54kDa和44kDa)構(gòu)成了活性FVIII。當(dāng)44kDa A2重鏈片段從該分子上解離下來(lái)時(shí)或當(dāng)72kDa和54kDa結(jié)構(gòu)域被凝血酶、活化的蛋白C或FXa進(jìn)一步切割時(shí)，發(fā)生失活。在血漿中，F(xiàn)VIII通過(guò)與50倍摩爾濃度過(guò)量的Von Willebrand因子蛋白(〃VWF〃)締合而得以穩(wěn)定，所述因子蛋白似乎抑制上述FVIII的蛋白水解破壞。
[0007]FVIII的氨基酸序列被組織成3個(gè)結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域:三重330個(gè)氨基酸的A結(jié)構(gòu)域、單個(gè)980個(gè)氨基酸的B結(jié)構(gòu)域和二重150個(gè)氨基酸的C結(jié)構(gòu)域。B結(jié)構(gòu)域與其它蛋白質(zhì)不具有同源性，并且提供該蛋白質(zhì)的25個(gè)潛在天冬酰胺(N)-連接糖基化位點(diǎn)中的18個(gè)。B結(jié)構(gòu)域似乎在凝血中不具有功能，并且可被缺失，該B結(jié)構(gòu)域被缺失的FVIII分子仍然具有促凝血活性。
[0008]Von Willebrand 因子(VWF)
[0009]VWF是存在于哺乳動(dòng)物血漿中的多聚粘著糖蛋白，其具有多個(gè)生理功能。在主要的止血過(guò)程中，VWF充當(dāng)血小板表面上的特異性受體與細(xì)胞外基質(zhì)的組分例如膠原之間的介質(zhì)。此外，VWF還充當(dāng)促凝血因子FVIII的載體和穩(wěn)定化蛋白。VWF在內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞中被合成為2813個(gè)氨基酸的前體分子。前體多肽(前VWF原)由22個(gè)殘基的信號(hào)肽、741個(gè)殘基的前肽和在成熟血漿VWF中發(fā)現(xiàn)的2050個(gè)殘基的多肽組成(Fischer等人，F(xiàn)EBSLett.351:345-348, 1994)。在分泌進(jìn)入血漿后，VWF以具有不同分子大小的不同種類的形式循環(huán)。這些VWF分子由具有2050個(gè)氨基酸殘基的成熟亞基的寡聚體和多聚體組成。VWF通?？勺鳛橐粋€(gè)二聚體至由50 - 100個(gè)二聚體組成的多聚體形式發(fā)現(xiàn)于血漿中(Ruggeri等人，Thromb.Haemost.82:576-584，1999)。在人循環(huán)中人VWF的體內(nèi)半衰期約為12小時(shí)。
[0010]人中最常見(jiàn)的遺傳性出血障礙是維勒布蘭德病(VWD)。取決于出血癥狀的嚴(yán)重度，VWD可通過(guò)利用含VWF (通常地來(lái)源于人血漿，但重組VWF也在開(kāi)發(fā)中)的濃縮物的替代療法來(lái)治療?？蓮娜搜獫{制備VWF，如例如EP0503991中描述的。在專利EP0784632中描述了分離重組VWF的方法。
[0011]已知VWF體內(nèi)穩(wěn)定FVIII，從而起著調(diào)節(jié)FVIII的血漿水平的關(guān)鍵作用，因此是控制原發(fā)性和繼發(fā)性止血的中心因子。還已知在于VWD患者中靜脈內(nèi)施用含VWF的藥物制劑后，可觀察到在24小時(shí)內(nèi)內(nèi)源性FVII1: C達(dá)到I至3個(gè)單位/ml的增加，這表明VWF對(duì)FVIII的體內(nèi)穩(wěn)定作用。
[0012]患者總的來(lái)說(shuō)受益于活性成分的特定作用模式，但目前所有商購(gòu)可得的因子VIII制劑是通過(guò)靜脈內(nèi)施用來(lái)給藥的，這牽涉注射部位感染的風(fēng)險(xiǎn)并且通常是患者希望避免的過(guò)程，尤其是在治療凝血系統(tǒng)中具有缺陷的兒童中。
[0013]直至今天，血友病A和VWD的標(biāo)準(zhǔn)治療包括頻繁靜脈內(nèi)輸注FVIII和VWF濃縮物的制劑。血友病B的治療需要每周2次的因子IX施用，在利用FVIIa作為抑制劑的患者的治療中，使用每周多次施用FVIIa來(lái)避免出血。
[0014]這些替代療法通常是有效的，然而，例如在經(jīng)歷預(yù)防性治療的嚴(yán)重血友病A患者中，因因子VIII約12小時(shí)的短暫血漿半衰期的原因，必須每周約3次地靜脈內(nèi)(1.V.)施用因子VIII。通過(guò)使FVIII水平高于正常人血漿1% (對(duì)應(yīng)于FVIII水平升高0.01U/ml)，已經(jīng)將嚴(yán)重的血友病A轉(zhuǎn)變成中度血友病A。在預(yù)防性治療中，給藥方案被設(shè)計(jì)成使FVIII活性的谷底水平不降至非血友病患者中FVIII活性的2-3%以下的水平。
[0015]通過(guò)靜脈內(nèi)施用進(jìn)行的因子VIII給藥是非常麻煩的，其伴隨著疼痛并且具有造成感染的風(fēng)險(xiǎn)，特別是這主要是患者自己或由診斷為血友病A的兒童的父母在家治療中進(jìn)行這一操作。此外,頻繁的靜脈內(nèi)注射不可避免地導(dǎo)致瘢痕形成,干擾將來(lái)的輸注。由于嚴(yán)重血友病的預(yù)防性治療始于生命的早期，兒童通常在2歲以前開(kāi)始，因此甚至難以將FVIII每周3次地注射進(jìn)入這樣小的患者的靜脈。在有限的時(shí)期內(nèi)，端口系統(tǒng)的植入可提供另一選擇。然而，在這些情況下，重復(fù)感染可能會(huì)發(fā)生，并且端口可在體育運(yùn)動(dòng)中引起不便。
[0016]因此，存在對(duì)避免靜脈內(nèi)輸注因子VIII的巨大醫(yī)學(xué)需要。
[0017]皮下施用在例如W095/01804A1和W095/026750中已被建議用于因子VIII。然而，必須施用極高劑量的因子VIII才能獲得可接受的生物利用度。
[0018]改善非靜脈內(nèi)施用后生物利用度的另一個(gè)方法是使用白蛋白融合的因子VIII(W02011/020866A2)。
[0019]高度期望改善非靜脈內(nèi)施用后因子VIII的生物利用度。本申請(qǐng)的發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，如果將因子VIII與硫酸化糖胺聚糖一起施用，因子VIII的生物利用度可得到顯著增加。
`[0020]發(fā)明概述
[0021]在第一方面，本發(fā)明因此涉及用于治療或預(yù)防出血障礙的因子VIII，所述治療或預(yù)防包括非靜脈內(nèi)注射所述因子VIII和硫酸化糖胺聚糖。[0022]在另一方面，本發(fā)明從而涉及用于治療或預(yù)防出血障礙的因子VIII，所述治療或預(yù)防包括非靜脈內(nèi)注射所述因子VIII和硫酸化糖胺聚糖，其中，當(dāng)以50至ιοοοιυ/kg體重的劑量皮下施用因子VIII時(shí)，在從注射后2小時(shí)至注射后48小時(shí)期間，被治療受試者的因子VIII血漿水平持續(xù)地比健康受試者的因子VIII正常血漿水平高2%。
[0023]該方面的一個(gè)優(yōu)選方案是用于治療或預(yù)防人個(gè)體的血友病A的因子VIII，所述治療或預(yù)防包括通過(guò)皮下、經(jīng)皮膚或肌內(nèi)注射施用所述因子VIII和硫酸化糖胺聚糖，其中，當(dāng)以50至1000IU/kg體重的劑量皮下施用因子VIII時(shí)，在從注射后2小時(shí)至注射后48小時(shí)期間，該人個(gè)體中因子VIII的血漿水平持續(xù)地比健康人個(gè)體中因子VIII的正常血漿水平聞2%。
[0024]本發(fā)明的另一個(gè)方面是用于治療或預(yù)防人個(gè)體的出血障礙的因子VIII，所述治療或預(yù)防包括通過(guò)皮下、經(jīng)皮或肌內(nèi)注射施用所述因子VIII和硫酸化糖胺聚糖，其中在所述人個(gè)體中因子VIII的相對(duì)生物利用度比以相同方式施用但無(wú)硫酸化糖胺聚糖的因子VIII的生物利用度高至少20%。
[0025]該方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是用于治療或預(yù)防人個(gè)體中血友病A的因子VIII，所述治療或預(yù)防包括通過(guò)皮下、經(jīng)皮或肌內(nèi)注射施用所述因子VIII和硫酸化糖胺聚糖，其中所述人個(gè)體中因子VIII的相對(duì)生物利用度比以相同方式施用但無(wú)硫酸化糖胺聚糖的因子VIII的生物利用度高至少20%。
[0026]在第三方面，本發(fā)明涉及用于改善因子VIII的生物利用度的硫酸化糖胺聚糖。
[0027]在其它方面，本發(fā)明涉及用于改善因子VIII的生物利用度的硫酸化糖胺聚糖，其中所述硫酸化糖胺聚糖和所述因子VIII通過(guò)皮下、經(jīng)皮或肌內(nèi)注射來(lái)進(jìn)行施用。
[0028]本發(fā)明的其它方面是用于治療或預(yù)防出血障礙的藥物試劑盒，其中包含因子VIII和硫酸化糖胺聚糖。
`[0029]本發(fā)明的其它方面是治療或預(yù)防出血障礙的方法，包括給有此需要的受試者施用治療有效量的因子VIII和硫酸化糖胺聚糖以增加因子VIII的生物利用度，其中所述施用包括皮下、經(jīng)皮或肌內(nèi)注射。
[0030]本發(fā)明的其它方面是用于增加因子VIII的生物利用度的方法，其中通過(guò)皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi)注射將硫酸化糖胺聚糖與所述因子VIII共施用。
[0031]在本發(fā)明的所有方面，因子VIII優(yōu)選為人因子VIII。優(yōu)選硫酸化糖胺聚糖是肝素，最優(yōu)選肝素是未分級(jí)分離的肝素。
[0032]附圖概述
[0033]圖1描述了實(shí)施例1的結(jié)果。如果共施用硫酸化糖胺聚糖，則FVIII的生物利用度增加。如可看到的，硫酸葡聚糖無(wú)積極效果。
[0034]詳述
[0035]本發(fā)明涉及出血障礙的治療和預(yù)防。
[0036]如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“出血障礙”包括家族性和獲得性血友病A。
[0037]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了因子VIII的治療性非靜脈內(nèi)應(yīng)用，其包括硫酸化糖胺聚糖的共施用。
[0038]因子VIII可以是野生型因子VIII多肽或可包含突變的因子VIII多肽。糖基化或其它翻譯后修飾的程度和位置可取決于選擇的宿主細(xì)胞和宿主細(xì)胞環(huán)境的性質(zhì)而變化。當(dāng)提及特定氨基酸序列時(shí)，這樣的序列的翻譯后修飾包括在本申請(qǐng)中。
[0039]術(shù)語(yǔ)〃因子VIII"和FVIII"在本文中可互換使用?！ㄒ蜃覸III"包括野生型因子VIII以及具有野生型因子VIII的促凝活性的野生型因子VIII衍生物。衍生物相較于野生型因子VIII的氨基酸序列可具有缺失、插入和/或添加。術(shù)語(yǔ)因子VIII包括因子VIII的蛋白水解加工的形式，例如包含重鏈和輕鏈的激活之前的形式。
[0040]術(shù)語(yǔ)〃因子VIII"包括具有野生型因子VIII的生物活性的至少10%，優(yōu)選至少25%，更優(yōu)選至少50%，最優(yōu)選至少75%的任何因子VIII變體或突變體。測(cè)定因子VIII的生物活性的適當(dāng)測(cè)試是一階段或兩階段凝血測(cè)定(Rizza等人1982.Coagulation assay ofFVII1:C and FIXa in Bloom ed.The Hemophilias.NY Churchchill Livingstonl992)或生色底物 FVII1:活性測(cè)定(S.Rosen, 1984.Scand J Haemato133:139-145，suppl.)。將這些參考資料的內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。
[0041]作為非限定性實(shí)例，因子VIII分子包括防止或減少APC切割的因子VIII突變體(Amanol998.Thromb.Haemost.79:557-563)、白蛋白融合的 FVIII 分子(W02011/020866A2)、FVII1-Fc 融合分子(W004/101740A)、進(jìn)一步穩(wěn)定 A2 結(jié)構(gòu)域的因子VIII突變體(W097/40145)、導(dǎo)致表達(dá)增加的FVIII突變體(Swaroop等人1997.JBC272:24121-24124)、免疫原性降低的因子 VIII 突變體(LolIar 1999.Thromb.Haemost.82:505-508)、從不同地表達(dá)的重鏈和輕鏈重建的FVIII (Oh等人1999.Exp.Mol.Med.31:95-100)、減少對(duì)受體的結(jié)合(從而導(dǎo)致FVIII樣HSPG (硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)和/或LRP(低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白)的分解代謝)的FVIII突變體(Ananyeva 等人 2001.TCM, 11:251-257)、二硫鍵穩(wěn)定化的 FVIII 變體(Gale 等人，2006.J.Thromb.Hemost.4:1315-1322)、具有改善的分泌性質(zhì)的FVIII突變體(Miao等人，2004.Bloodl03:3412-3419)、輔因子比活性增加的 FVIII 突變體(Wakabayashi 等人，2005.Biochemistry44:10298-304)、具有改善的生物合成和分泌、降低的ER伴侶蛋白相互作用、改善的ER-Golgi轉(zhuǎn)運(yùn)、活化增強(qiáng)或?qū)κЩ畹目剐栽鰪?qiáng)和半衰期改善的FVIII突變體(由Pipe2004.Sem.Thromb.Hemost.30:227-237概述的)，以及具有B結(jié)構(gòu)域全部或部分的缺失的 FVIII 突變體(參見(jiàn)例如 W02004/067566A1、W002/102850A2、W000/24759A1 和美國(guó)專利N0.4，868，112)。特別優(yōu)選作為“單鏈”FVIII分子的FVIII分子。單鏈FVIII具有B結(jié)構(gòu)域全部或部分的缺失以及酸性a3區(qū)域全部或部分的缺失，從而缺失了 Argl648處的切割位點(diǎn)(其通常在分泌過(guò)程中被切割)。單鏈FVIII分子公開(kāi)于例如W02004/067566A1 ；US2002/132306A1 ；Krishnan 等人(1991)European Journal of Biochemistry 第 195卷,n0.3,第 637-644 頁(yè);Herlitschka 等人(1998)Journal of Biotechnology,第 61卷,n0.3,第 165-173 頁(yè);Donath 等人(1995) Biochem.J.,第 312 卷，第 49-55 卷中。
[0042]將所有這些因子VIII突變體和變體通過(guò)引用整體并入本文。
[0043]人因子VIII的成熟野生型形式的氨基酸序列示于SEQ ID N0:2中。提及特定序列的氨基酸位置時(shí)意指所述氨基酸在FVIII野生型蛋白中的位置，并且不排除在所提及的序列中其它位置處突變例如缺失、插入和/或取代的存在。例如，提及SEQ ID N0:2的〃Glu2004〃處的突變時(shí)，不排除在被修飾的同源物中，SEQ ID N0:2的位置I至2332處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸不存在。編碼SEQ ID NO:2的DNA序列示于SEQ ID NO:1中。
[0044]術(shù)語(yǔ)“糖胺聚糖”，如本文中所用，是指特別地包含氨基己糖單位的低聚糖或多糖。硫酸化糖胺聚糖包括但不限于硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、肝素和硫酸乙酰肝素。優(yōu)選地，硫酸化糖胺聚糖是肝素，最優(yōu)選硫酸化糖胺聚糖選自未分級(jí)分離的肝素。
[0045]術(shù)語(yǔ)“肝素”包括未分級(jí)分離的肝素和具有更低分子量的肝素。在一個(gè)實(shí)施方案中，按照本發(fā)明使用的肝素是“未分級(jí)分離的肝素”，其可具有約SkDa至約30kDa，優(yōu)選約IOkDa至約20kDa，最優(yōu)選約12kDa至約16kDa，例如約15kDa的平均分子量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，按照本發(fā)明使用的肝素是低分子量肝素(LMWH)。LMWH是平均分子量小于SOOODa的肝素或肝素鹽，對(duì)于所述肝素或肝素鹽，所有鏈的至少60%具有小于SOOODa的平均分子量。優(yōu)選地，按照本發(fā)明使用的LMWH的分子量為約2kDa至約8kDa，更優(yōu)選約3kDa至約6kDa，最優(yōu)選約4kDa至約5kDa,例如約4.5kDa。LMWH可通過(guò)多聚肝素的分級(jí)分離或解聚合的各種方法來(lái)獲得。LMWH的實(shí)例包括但不限于阿地肝素鈉(Normiflo)、舍托肝素(Sandoparin)、依諾肝素(Lovenox和克賽)、帕肝素(Fluxum)、亭扎肝素(Innohep和洛集帕林)、達(dá)肝素(法安明)、瑞肝素(諾易平)和納屈肝素(Fraxiparin)。
[0046]術(shù)語(yǔ)“肝素”還包括通過(guò)裂解和分離而衍生自天然肝素或通過(guò)合成途徑產(chǎn)生的肝素分子的小分子量片段。已有例如合成地制造的并且其結(jié)構(gòu)來(lái)源于肝素的商購(gòu)可得的硫酸化戊糖。其可以磺達(dá)肝素鈉獲得。
[0047]硫酸軟骨素包括例如硫酸軟骨素A(軟骨素-4-硫酸)、硫酸軟骨素C(軟骨素-6-硫酸)、硫酸軟骨素D (軟骨素-2，6-硫酸)和硫酸軟骨素E (軟骨素-4，6-硫酸)。
[0048]硫酸皮膚素(先前稱為硫酸軟骨素B)是商購(gòu)可得的另一種硫酸化糖胺聚糖。
[0049]硫酸角質(zhì)素是另一種硫酸化的糖胺聚糖。硫酸角質(zhì)素的結(jié)構(gòu)描述于例如Funderburgh (2000)Glycobiology 第 10 卷 n0.10 第 951-958 頁(yè)。
[0050]硫酸乙酰肝素是與 肝素不同的N-硫酸化多糖(參見(jiàn)，例如，Gallagher, J.T., Lyon, Μ.(2000)."Molecular structure of Heparan Sulfate and interactions withgrowth factors and morphogens〃.1n 1zzo, Μ, V..Proteoglycans: structure, biologyand molecular interactions.Marcel Dekker Inc.New York, New York.第 27 - 59 頁(yè)；和Gallagher, J.T.Walker, A.(1985)."Molecular distinctions between Heparan Sulphateand Heparin:Analysis of sulphation patterns indicates Heparan Sulphate and 月干素are separate families of N-sulphated polysaccharides^.Biochem.J.230(3):665 -74)。
[0051]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，被治療的受試者中因子VIII的血漿水平在從注射后5小時(shí)至注射后8小時(shí)的期間持續(xù)地比健康受試者的因子VIII正常血漿水平高2%，優(yōu)選高5%，更優(yōu)選高8%，最優(yōu)選高10%。將如下文實(shí)施例1中所示測(cè)定血漿水平。
[0052]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，被治療的受試者中因子VIII的血漿水平在從注射后4小時(shí)至注射后16小時(shí)的期間持續(xù)地比健康受試者的因子VIII正常血漿水平高2%，優(yōu)選聞5%，更優(yōu)選聞8%，最優(yōu)選聞10%ο
[0053]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，被治療的受試者中因子VIII的血漿水平在從注射后3小時(shí)至注射后24小時(shí)的期間持續(xù)地比健康受試者的因子VIII正常血漿水平高2%，優(yōu)選高4%，更優(yōu)選高6%，最優(yōu)選高8%。
[0054]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，被治療的受試者中因子VIII的血漿水平在從注射后2小時(shí)至注射后32小時(shí)的期間持續(xù)地比健康受試者的因子VIII正常血漿水平高2%，優(yōu)選高3%，更優(yōu)選高4%，最優(yōu)選高5%。
[0055]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，被治療的受試者中因子VIII的血漿水平在從注射后I小時(shí)至注射后48小時(shí)的期間持續(xù)地比健康受試者的因子VIII正常血漿水平高2%，優(yōu)選高3%，更優(yōu)選高4%，最優(yōu)選高5%。
[0056]優(yōu)選地，當(dāng)以如下劑量通過(guò)皮下注射施用因子VIII (例如FVIII)時(shí)獲得上述血漿水平:少于1，OOOIU/kg體重，或少于800IU/kg體重，或少于600IU/kg體重，或少于400IU/kg體重，例如約10IU/kg體重至約1，000IU/kg體重，或約20IU/kg體重至約800IU/kg體重，或約30IU/kg體重至約700IU/kg體重，或約40IU/kg體重至約600IU/kg體重，或約50IU/kg體重至約500IU/kg體重,或約75IU/kg體重至約400IU/kg體重,或約100IU/kg體重至約300IU/kg體重，或約50IU/kg體重至約1，OOOIU/kg體重，或約50IU/kg體重至約800IU/kg體重,或約50IU/kg體重至約700IU/kg體重,或約50IU/kg體重至約600IU/kg體重,或約50IU/kg體重至約500IU/kg體重，或約50IU/kg體重至約400IU/kg體重，或約50IU/kg體重至約300IU/kg體重，或約50IU/kg體重至約200IU/kg體重。
[0057]在一個(gè)實(shí)施方案中，因子VIII和硫酸化糖胺聚糖包含在相同組合物中。可通過(guò)單次注射等給患者施用所述包含這兩種組分的組合物。
[0058]在另一個(gè)實(shí)施方案中，因子VIII和硫酸化糖胺聚糖不存在于相同組合物中。例如，可以以分開(kāi)的劑型在所述藥物制劑中提供這兩種組分中的每一種。
[0059]如果兩種組分不存在于相同組合物中，則可分開(kāi)地施用分開(kāi)的組合物，或在即將施用之前將它們混合，以便因子VIII和硫酸化糖胺聚糖被同時(shí)施用。如果存在分開(kāi)的施用，則可以以例如時(shí)間錯(cuò)開(kāi)的方式相繼進(jìn)行施用。一般而言，優(yōu)選通過(guò)單次施用(例如注射)同時(shí)施用這兩種組分。下面論述不同的施用途徑。它們?cè)谧鬟m當(dāng)變動(dòng)的情形下適用于上述情況。
[0060]可將藥物制劑的組分溶解在常規(guī)生理相容性緩沖水溶液中，可任選地向所述緩沖液中添加藥物賦形劑來(lái)提供藥物制劑。藥物制劑的組分可以已包含所有必需藥物、生理上相容的賦形劑，并且可被溶解在注射用水中來(lái)提供藥物制劑。
[0061] 這樣的藥物載體和賦形劑以及適當(dāng)?shù)乃幬镏苿┑闹苽湓诒绢I(lǐng)域是公知的(參見(jiàn)例如“Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins，，, Frokjaer等人，Taylor&Francis(2000)或“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第 3版，Kibbe等人，Pharmaceutical Press (2000))。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含至少一種添加劑，例如填料、填充劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑或賦形劑。標(biāo)準(zhǔn)藥物配制技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的(參見(jiàn),例如，2005Physicians’ Desk Reference?, Thomson Healthcare:Montvalej NJj 2004;Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第 20版，Gennaro 等人，Eds.Lippincott Wi 11 iams&Wi lkins: Philadelphia，PA，2000)。適當(dāng)?shù)乃幬锾砑觿┌ɡ缣?，如甘露醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、海藻糖或其它糖類，氨基酸如組氨酸、精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、苯丙氨酸或其它氨基酸，實(shí)現(xiàn)等滲條件的添加劑如氯化鈉或其它鹽，穩(wěn)定劑如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、聚乙二醇、丙二醇、氯化鈣等，生理pH緩沖劑例如Tris (羥甲基)氨基甲烷等。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物可包含PH緩沖劑和濕潤(rùn)劑或乳化劑。在其它實(shí)施方案中，藥物組合物可包含防腐劑或穩(wěn)定劑。具體地，可以以凍干或穩(wěn)定的可溶性形式配制包含因子VIII的藥物制劑?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法對(duì)因子VIII進(jìn)行冷凍干燥。此外，如果硫酸化糖胺聚糖和因子VIII包含在相同的組合物中，則還可以以凍干的形式或以穩(wěn)定的可溶性形式提供這樣的組合物。凍干的制劑可在使用前通過(guò)添加一種或多種藥學(xué)上可接受的稀釋劑例如無(wú)菌注射用水或無(wú)菌生理鹽水溶液或適當(dāng)?shù)木彌_液進(jìn)行重建。
[0062]本發(fā)明的藥物制劑中包含的組合物可通過(guò)任何藥學(xué)上適當(dāng)?shù)难b置遞送至個(gè)體。各種遞送系統(tǒng)是已知的，并且可用于通過(guò)任何方便的途徑施用組合物。優(yōu)選地，通過(guò)非靜脈內(nèi)注射向個(gè)體遞送本發(fā)明的藥物制劑中包含的組合物。更優(yōu)選，本發(fā)明的組合物被配制來(lái)用于皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、肺內(nèi)、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)皮膚施用，最優(yōu)選用于根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行皮下、肌內(nèi)或經(jīng)皮膚施用。制劑可通過(guò)輸注或通過(guò)單次快速推注來(lái)連續(xù)施用。一些制劑包括緩慢釋放系統(tǒng)。
[0063]以治療上有效的劑量(意指足以產(chǎn)生期望的效果，防止或減輕待治療的病況或適應(yīng)癥的嚴(yán)重度或擴(kuò)散，而未達(dá)到將產(chǎn)生不可耐受的有害副作用的劑量)給患者施用本發(fā)明的藥物制劑的組合物。確切劑量取決于許多因素，例如適應(yīng)癥、配方、施用模式，并且必須針對(duì)每一個(gè)相應(yīng)適應(yīng)征在臨床前和臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)定。
[0064]在因子VIII的情形下，一次施用的劑量可以選擇成:注射后2小時(shí)至注射后48小時(shí)期間，被治療的受試者中因子VIII血漿水平持續(xù)高于健康受試者中因子VIII的正常血漿水平2%，優(yōu)選高于3%，更優(yōu)選高于4%，最優(yōu)選高于5%。
[0065]優(yōu)選地，一次施用的因子VIII的劑量低于1，000IU/kg體重，或低于800IU/kg體重，或低于600IU/kg體重，或低于400IU/kg體重，例如為約10IU/kg體重至約1，000IU/kg體重、或約20IU/kg體重至約800IU/kg體重、或約30IU/kg體重至約700IU/kg體重、或約40IU/kg體重至約600IU/kg體重、或約50IU/kg體重至約500IU/kg體重、或約75IU/kg體重至約400IU/kg體重、或約100IU/kg體重至約300IU/kg體重、或約50IU/kg體重至約
I,OOOIU/kg體重、或約50IU/kg體重至約800IU/kg體重、或約50IU/kg體重至約700IU/kg體重、或約50IU/kg體重至約600IU/kg體重、或約50IU/kg體重至約500IU/kg體重、或約50IU/kg體重至約400IU/kg體重、或約50IU/kg體重至約300IU/kg體重或約50IU/kg體重至約200IU/kg體重的劑量。
[0066]因子VIII可以本身與硫酸化糖胺聚糖一起施用?；蛘撸蜃覨VIII可以結(jié)合vWF(即稱為FVIII/vWF復(fù)合物)與硫酸化糖胺聚糖一起施用。
[0067]施用的硫酸化糖胺聚糖的量通常在約0.001至100mg/mL所施用產(chǎn)品，約0.01至約10mg/mL所施用產(chǎn)品，約0.05至約lmg/mL所施用產(chǎn)品的范圍內(nèi)。
[0068]如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“生物利用度”是指可在皮下、靜脈內(nèi)或皮內(nèi)施用后，在預(yù)定的時(shí)間直至終時(shí)間點(diǎn)在血漿中被檢測(cè)到的因子VIII (例如因子VIII或FVIII相關(guān)制劑)的施用劑量的比例。通常地，通過(guò)如下過(guò)程在測(cè)試動(dòng)物內(nèi)測(cè)量生物利用度:施用ιοιυ/kg至1000IU/kg(例如，以400IU/kg體重)的制劑劑量；在施用后預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)獲得血漿樣品；和使用生色測(cè)定或凝固測(cè)定(或任何生物測(cè)定)、免疫測(cè)定或其等同測(cè)定中的一種或多種測(cè)定來(lái)測(cè)量樣品中因子VIII (例如因子VIII或因子VIII相關(guān)多肽)的含量。生物利用度表示為施用后的時(shí)間(X軸)下血漿中因子VIII的濃度或活性(y軸)的曲線下面積(AUC)，直至施用后預(yù)定的終時(shí)間點(diǎn)。優(yōu)選地，該預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)為施用后48小時(shí)。最優(yōu)選地，如下文實(shí)施例1中所示測(cè)定生物利用度。測(cè)試制劑的相對(duì)生物利用度是指測(cè)試制劑的AUC與按照和所述測(cè)試制劑相同的劑量和方式(例如靜脈內(nèi)、皮下或皮內(nèi))施用的參照制劑的AUC之間的比率。
[0069]根據(jù)本發(fā)明，因子VIII的生物利用度(當(dāng)與硫酸化糖胺聚糖共施用時(shí))高于當(dāng)單獨(dú)施用時(shí)因子VIII的生物利用度。優(yōu)選地，生物利用度增加至少20%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少75%，最優(yōu)選至少100%。優(yōu)選地，當(dāng)以如下劑量通過(guò)皮下注射施用因子VIII時(shí)獲得生物利用度的增加:少于1，OOOIU/kg體重，或少于800IU/kg體重，或少于600IU/kg體重，或少于400IU/kg體重，例如約10IU/kg體重至約1，000IU/kg體重，或約20IU/kg體重至約800IU/kg體重，或約30IU/kg體重至約700IU/kg體重，或約40IU/kg體重至約600IU/kg體重,或約50IU/kg體重至約500IU/kg體重,或約75IU/kg體重至約400IU/kg體重,或約100IU/kg體重至約300IU/kg體重，或約50IU/kg體重至約1，000IU/kg體重，或約50IU/kg體重至約800IU/kg體重,或約50IU/kg體重至約700IU/kg體重,或約50IU/kg體重至約600IU/kg體重，或約50IU/kg體重至約500IU/kg體重，或約50IU/kg體重至約400IU/kg體重，或約50IU/kg體重至約300IU/kg體重，或約50IU/kg體重至約200IU/kg體重。
[0070]可單獨(dú)施用本發(fā)明的藥物組合物，或可將其與其它治療劑結(jié)合施用?？蓳饺脒@些試劑作為相同藥物的部分。
實(shí)施例
[0071]實(shí)施例1:在血友病A模型中評(píng)估s.c.施用的FVIII和各種添加劑的生物利用度
[0072]材料和動(dòng)物模型
[0073]實(shí)驗(yàn)中使用的因子VIII是B結(jié)構(gòu)截短的單鏈重組因子VIII (在下文中稱為“rFVIII”)。因子VIII通過(guò)直接將Asn764與Thrl653融合獲得。其已在細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)并且從細(xì)胞培養(yǎng)基中純化。
`[0074]使用的其它試劑概述于表1中。
[0075]表1
[0076]
化合物種類化合物的類型和/或來(lái)源
未分級(jí)分離的肝素__肝素納-25000-ratiopharm_
低分子量肝素__達(dá)肝素(來(lái)自Pfizer的Fragmin?)_
硫酸葡聚糖__Ca.500 kDa_
硫酸戌聚糖_磺達(dá)肝素鈉(來(lái)自SKB的Arixtra?)_
N-乙酰基脫-O-碗酸化肝素來(lái)自Sigma-Aldrich的N-乙酰基-脫-O-硫酸化

肝素鈉(Sigma產(chǎn)品編號(hào).A6039)
__CAS 編號(hào) 133686-69-8_
硫酸軟骨素來(lái)自牛氣管的硫酸軟骨素A鈉鹽，獲自

Sigma-Aldrich (Sigma 產(chǎn)品編號(hào).C9819)_CAS 編號(hào) 39455-18-0_
[0077]將因子VIII敲除小鼠用作血友病A的動(dòng)物模型。這些小鼠缺乏外顯子16和17，從而不表達(dá) FVIII(Bi L.等人，Nature genetics, 1995，第 10 卷(I)，119-121; Bi L.等人,Blood, 1996，V0I88 (9) ,3446-3450)。這樣可以通過(guò)定量ko小鼠血漿中的FVIII活性來(lái)分析處理后的FVIII水平。
[0078]方法
[0079]為了評(píng)估血管外注射是否可能是rFVIII (人)改善療法的一個(gè)選擇，選用血管外療法的一個(gè)典型代表-皮下注射。進(jìn)行的非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究的設(shè)計(jì)描述于下面的表2和3中。在血友病A模型中，在單次靜脈內(nèi)或皮下注射rFVIII與各種添加劑(表2中詳細(xì)描述的處理組)后測(cè)定因子VIII活性的血漿水平。
[0080]在各種不同添加劑存在的情況下用相同劑量的FVIII (生色底物(CS)活性測(cè)定)處理對(duì)應(yīng)組。對(duì)于單次施用，在給重量約25g的FVIII敲除(ko)小鼠皮下施用前，將針對(duì)每一個(gè)處理組的各種不同組分于200 μ L的體積(對(duì)于所有組使用相同體積)中混合在一起。處理組概述于表2中。
[0081]在短期麻醉下，抽取血液樣品，使用檸檬酸鈉抗凝達(dá)到10%的檸檬酸鹽血，加工成血漿，于-70°C貯存以用于測(cè)定FVIII活性。取樣時(shí)間點(diǎn)詳述于表3中。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的基于aPTT的方法(Behring Coagulation Timer)進(jìn)行血衆(zhòng)內(nèi)FVIII活性的定量。將動(dòng)物保持在標(biāo)準(zhǔn)居住條件。
[0082]表 2:處理組
[0083]
【權(quán)利要求】
1.一種用于治療或預(yù)防出血障礙的因子VIII，所述治療或預(yù)防包括非靜脈內(nèi)注射所述因子VIII和硫酸化糖胺聚糖。
2.一種用于治療或預(yù)防出血障礙的因子VIII，所述治療或預(yù)防包括非靜脈內(nèi)注射所述因子VIII和硫酸化糖胺聚糖，其中，當(dāng)以50IU/kg體重至約1，OOOIU/kg體重的劑量皮下施用因子VIII時(shí)，在從注射后2小時(shí)至注射后48小時(shí)的期間，被治療的受試者中因子VIII的血漿水平持續(xù)地比健康受試者的因子VIII正常血漿水平高2%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中使用的因子VIII，其中同時(shí)施用所述因子VIII和硫酸化糖胺聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2中使用的因子VIII，其中分開(kāi)地施用所述因子VIII和硫酸化糖胺聚糖。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)使用的因子VIII，其中所述硫酸化糖胺聚糖是肝素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)使用的因子VIII，其中所述因子VIII與vonffiIIebrand因子締合,并且所述硫酸化糖胺聚糖是肝素。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)使用的因子VIII，其中所述被治療的受試者是人個(gè)體，并且一次施用的劑量少于500IU/kg體重。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)使用的因子VIII，其中所述非靜脈內(nèi)注射是皮下、經(jīng)皮膚或肌內(nèi)注射。
9.一種硫酸化糖胺聚糖，其用于在出血障礙的治療或預(yù)防中改善因子VIII的生物利用度，其中通過(guò)皮下、經(jīng)皮膚或肌內(nèi)注射施用所述硫酸化糖胺聚糖和所述因子VIII。`
10.根據(jù)權(quán)利要求9中使用的硫酸化糖胺聚糖，其中所述硫酸化糖胺聚糖是肝素。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10中使用的硫酸化糖胺聚糖，其中所述出血障礙是血友病A。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中的任一項(xiàng)使用的硫酸化糖胺聚糖，其中同時(shí)施用因子VIII和硫酸化糖胺聚糖。
13.根據(jù)權(quán)利要求9至12中任一項(xiàng)使用的硫酸化糖胺聚糖，其中分開(kāi)地施用因子VIII和硫酸化糖胺聚糖。
14.一種用于治療或預(yù)防出血障礙的藥物試劑盒，其包含因子VIII和硫酸化糖胺聚糖。
15.權(quán)利要求14的藥物試劑盒，其中所述硫酸化糖胺聚糖是肝素。
【文檔編號(hào)】A61P7/04GK103889445SQ201280051236
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2012年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月18日
【發(fā)明者】H·梅茨納, S·措爾納 申請(qǐng)人:德國(guó)杰特貝林生物制品有限公司