蛋白質(zhì)-活性劑綴合物及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了具有可被類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶識(shí)別的氨基酸基序的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物。本發(fā)明還提供了包含綴合物的組合物，以及用于制備綴合物和組合物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供了使用綴合物將活性劑遞送至靶細(xì)胞的方法，以及使用綴合物對(duì)需要治療的個(gè)體(例如需要活性劑的個(gè)體)進(jìn)行治療的方法。
【專利說(shuō)明】蛋白質(zhì)-活性劑綴合物及其制備方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年5月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/483，698的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)-活性劑綴合物(conjugate)。蛋白質(zhì)(例如，寡肽、多肽、抗體等)對(duì)于所需靶標(biāo)具有底物特異性，活性劑(例如，藥物、毒素、配體、檢測(cè)探針等)具有特定的功能或活性。本發(fā)明還涉及制備該綴合物的方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及使用綴合物將活性劑遞送至個(gè)體的靶細(xì)胞的方法，以及治療需要活性劑的個(gè)體(例如患有癌癥的個(gè)體)的方法。
【背景技術(shù)】
[0004]已提出了通過(guò)靶向遞送抗癌藥物抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。例如，已證明靶向遞送抗體-藥物綴合物可以殺死特定的癌細(xì)胞。由于抗體(或抗體片段)與癌細(xì)胞特異性地結(jié)合，藥物被遞送至目標(biāo)癌細(xì)胞。藥物的靶向遞送確保藥物作用于目標(biāo)癌細(xì)胞，而不是正常的宿主細(xì)胞，因此，使正常細(xì)胞損壞所帶來(lái)的副作用最小化。
[0005]抗體綴合物可用于遞送化學(xué)和/或生物分子。示例性化學(xué)和/或生物分子包括常規(guī)用于化學(xué)療法的藥物、細(xì)菌蛋白毒素(例如白喉毒素)、植物蛋白毒素(例如蓖麻毒蛋白)、小分子毒素(例如auristatin、格爾德霉素(geldanamycin)、美登素(maytansinoid)、刺抱霉素(calicheamycin)、道諾霉素(daunomycin)、氨甲喋呤(methotrexate)、長(zhǎng)春地辛(vindesine)、tubulysin)、親和配體、檢測(cè)探針(例如,突光探針,放射性探針)等(包括它們的組合)。
[0006]迄今為止，已提出的抗體-藥物綴合物是通過(guò)使藥物部分與抗體的多個(gè)賴氨酸基團(tuán)相連接而制備?；蛘?，抗體-藥物綴合物通過(guò)以下方式制備:還原抗體的所有或部分鏈間二硫鍵或還原所有鏈間二硫鍵，再進(jìn)行部分氧化，由此產(chǎn)生游離的半胱氨酸巰基，然后將自由的半胱氨酸巰基與藥物部分相連接。
[0007]然而，現(xiàn)有的制備方法存在一些問(wèn)題。例如，總體制備過(guò)程是復(fù)雜的，因?yàn)橥ㄟ^(guò)現(xiàn)有制備方法制備的抗體-藥物綴合物不是均一的(均質(zhì)的)。當(dāng)通過(guò)使藥物部分與賴氨酸基團(tuán)相連接來(lái)制備抗體-藥物綴合物時(shí)，由于抗體內(nèi)存在很多賴氨酸基團(tuán)(例如每個(gè)抗體內(nèi)100個(gè)賴氨酸基團(tuán))，導(dǎo)致獲得了各種類型和形式的抗體-藥物綴合物。同樣，當(dāng)通過(guò)使巰基與藥物部分相連接來(lái)制備抗體-藥物綴合物時(shí)，由于巰基與馬來(lái)酰亞胺基(maleimidegroups)的連接，導(dǎo)致獲得了非對(duì)映異構(gòu)體的混合物。例如，如果綴合η種藥物，會(huì)獲得2η種立體異構(gòu)體的混合物。因此，當(dāng)藥物分配數(shù)是0-8時(shí)(例如鏈間二硫鍵被還原的情況)，
會(huì)獲得
【權(quán)利要求】
1.蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，包含具有可被類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶識(shí)別的氨基酸基序的蛋白質(zhì)，其中所述活性劑在所述氨基酸基序處共價(jià)連接至所述蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，其中所述蛋白質(zhì)包含選自主要由以下修飾方式組成的組的修飾: (i)所述蛋白質(zhì)羧基末端中的缺失； (?)所述蛋白質(zhì)的羧基末端中寡肽或多肽的添加；以及 (iii)所述蛋白質(zhì)羧基末端中的缺失，和所述蛋白質(zhì)的羧基末端中寡肽或多肽的添加； 其中所述修飾連接到所述氨基酸基序上。
3.如權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，其中所述蛋白質(zhì)是抗原多肽的片段或抗體。
4.如權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，其中所述蛋白質(zhì)是單克隆抗體。
5.如權(quán)利要求4所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，其中所述單克隆抗體的至少一條輕鏈和/或至少一條重鏈包含具有所述氨基酸基序的氨基酸區(qū)。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，其中所述類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶是 FTase 或 GGTase。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，其中所述活性劑是藥物、毒素、親和配體、檢測(cè)探針或其組合。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，其中所述氨基酸基序是CAAX、XXCC、XCXC或CXX，其中C代表半胱氨酸，A代表脂肪族氨基酸，X代表決定所述類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶的底物特異性的氨基酸`。`
9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，其中所述氨基酸基序通過(guò)至少一個(gè)接頭與所述活性劑共價(jià)連接。
10.如權(quán)利要求9所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，其中所述接頭是可被所述類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶識(shí)別的異戊二烯衍生物。
11.如權(quán)利要求9或10所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，其中所述接頭由下式表示:
12.如權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，其中所述活性劑連接至含有能與所述FGl反應(yīng)的第二官能團(tuán)(FG2)的基團(tuán)，其中，所述FG2選自乙炔、羥胺、疊氮化物、醒、肼、酮和胺。
13.如權(quán)利要求12所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，其中所述活性劑通過(guò)-(CH2)A1 (CH2)p-或-[ZCH2CH2O (CH2CH2O).CH2CH2Z]-連接至所述含有FG2的基團(tuán)，其中，
X 是氧、硫、-NR1-' -C (O) NR1-' -NR1C (O) -、-NR1SO2-或-SO2NR1-, Z是氧、硫或NR1, R1是氫、CV6烷基、C^6烷基芳基或CV6烷基雜芳基， r和P獨(dú)立地是O至6的整數(shù)， q是O至I的整數(shù)，以及 w是O至6的整數(shù)。
14.如權(quán)利要求13所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，其中，所述-(CH2)rXq (CH2)p-或-[ZCH2CH2O(CH2CH2O)wCH2CH2Z]-連接于⑴可被組織蛋白酶B裂解的(多個(gè))肽或(ii)可被葡糖醛酸糖苷酶裂解的葡糖苷酸。
15.如權(quán)利要求14所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，其中所述可被組織蛋白酶B裂解的妝為:

16.如權(quán)利要求14所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物，其中所述可被β-葡糖醛酸糖苷酶裂解的葡糖苷酸是:
17.制備權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物的方法，所述方法包括: (a)表達(dá)具有可被類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶識(shí)別的氨基酸基序的蛋白質(zhì)； (b)使用所述類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶使所述表達(dá)的蛋白質(zhì)與至少一個(gè)具有第一官能團(tuán)(FGl)的等同底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，由此產(chǎn)生功能化蛋白質(zhì)； (c)將第二官能團(tuán)(FG2)與活性劑連接，由此產(chǎn)生功能化活性劑；以及 (d)使所述功能化蛋白質(zhì)與所述功能化活性劑反應(yīng)，由此產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述氨基酸基序在所述蛋白質(zhì)的羧基末端。
19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述氨基酸基序是CAAX、XXCC、XCXC或CXX，其中C代表半胱氨酸，A代表脂肪族氨基酸，X代表決定所述類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶的底物特異性的氨基酸。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述氨基酸基序是CAAX，并且其中所述方法進(jìn)一步包括在步驟(b)后將AAX從所述氣基酸基序中移除。
21.如權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述FG2通過(guò)至少一個(gè)接頭與所述活性劑連接。
22.如權(quán)利要求17-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述功能化蛋白質(zhì)與所述功能化活性劑之間的反應(yīng)是點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)或腙和/或肟形成反應(yīng)。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述FGl是疊氮基，所述FG2是乙炔基，或者其中所述FGl是乙炔基，所述FG2是疊氮基。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述FGl是醛基或酮基，且所述FG2是肼或羥胺，或者其中所述FGl是肼或羥胺，且所述FG2是醛或酮。
25.制備權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物的方法，所述方法包括: (a)表達(dá)具有可被類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶識(shí)別的氨基酸基序的蛋白質(zhì)； (b)將類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶的同等底物與活性劑連接；以及 (C)使用所述類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶使所述表達(dá)的蛋白質(zhì)與和所述等同底物連接的所述活性劑進(jìn)行酶促反應(yīng)。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述氨基酸基序在所述蛋白質(zhì)的羧基末端。
27.如權(quán)利要求25或26所述的方法，其中所述氨基酸基序是CAAX、XXCC、XCXC或CXX，其中C代表半胱氨酸，A代表脂肪族氨基酸，X代表決定所述類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶的底物特異性的氨基酸。
28.如權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述等同底物通過(guò)至少一個(gè)接頭與所述活性劑連接。
29.組合物，其包含權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物。
30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述組合物是所述蛋白質(zhì)-活性劑綴合物的均質(zhì)混合物。
31.如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述蛋白質(zhì)是抗原多肽的片段或抗體。
32.將活性劑遞送至個(gè)體的靶細(xì)胞的方法，所述方法包括向所述個(gè)體施用權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物或權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)所述的組合物。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述靶細(xì)胞是癌細(xì)胞。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述靶細(xì)胞是包括病原體的細(xì)胞。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述病原體是病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲。
36.對(duì)需要治療的個(gè)體進(jìn)行治療的方法，所述方法包括向所述個(gè)體施用治療有效量的權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物或權(quán)利要求29-31中任一項(xiàng)所述的組合物。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述個(gè)體患有癌癥。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述個(gè)體被病原體感染。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述病原體是病毒、細(xì)菌、真菌或寄生蟲。
40.權(quán)利要求1-39中任一項(xiàng)的蛋白質(zhì)-活性劑綴合物、組合物或方法，其中所述活性劑是免疫調(diào)節(jié)化合物、抗癌劑、抗病毒劑、抗菌劑、抗真菌劑或抗寄生蟲劑。
【文檔編號(hào)】A61K31/70GK103648530SQ201280031480
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月8日
【發(fā)明者】金容珠, 樸泰奎, 于成昊, 李香淑, 金永云, 趙宗云, 鄭斗烷, 金善英, 權(quán)賢珍, 吳奎萬(wàn), 鄭允瑞, 樸允熙 申請(qǐng)人:樂(lè)高化學(xué)生物科學(xué)股份有限公司