檢測(cè)人類胚胎中的非整倍性的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于確定一個(gè)或多個(gè)胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力和/或一個(gè)或多個(gè)胚胎或多潛能細(xì)胞中存在染色體異常的方法、組合物和試劑盒。這些方法、組合物和試劑盒在體外確定在人類中治療不育癥中最有用的胚胎和卵母細(xì)胞中有用。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)人類胚胎中的非整倍性的方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2011年2月23日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/445，863號(hào)和2011 年9月21日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第61/537，336號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其兩者為了所有目的通 過(guò)引用全文并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明涉及為了預(yù)測(cè)成活力和檢測(cè)非整倍性的目的進(jìn)行人類胚胎的生物和臨床 測(cè)試以及尤其是成像和評(píng)估的領(lǐng)域。2010年12月30日提交的美國(guó)申請(qǐng)第12/982，341號(hào)； 2010年8月23日提交的美國(guó)申請(qǐng)第12/861,571號(hào)；2010年5月7日提交的美國(guó)申請(qǐng)第 61/332，651號(hào)；2009年8月22日提交的美國(guó)申請(qǐng)第61/236，085號(hào)；2011年2月23日提 交的美國(guó)申請(qǐng)第61/445，863號(hào)和2011年9月21日提交的美國(guó)申請(qǐng)第61/537，336號(hào)通過(guò) 引用全文并入本文。
[0004]發(fā)明背景
[0005]美國(guó)處于生育期年齡的人口中近10-15%夫婦不能生育。因此，很多不育夫婦已 選擇體外受精(IVF)，IVF在20世紀(jì)八十年代初期就引入美國(guó)。根據(jù)美國(guó)疾病控制和預(yù)防 中心，僅2006年，在美國(guó)就進(jìn)行了約140，000個(gè)周期的IVF，而在2008年，這增加到差不多 150，000個(gè)周期(cdc.gov/art)。這表明，尋找IVF的夫婦數(shù)量在增加，并且可能持續(xù)，如 果一般人群繼續(xù)推遲要孩子的話。根據(jù)這些IVF周期，估計(jì)每年產(chǎn)生超過(guò)一百萬(wàn)個(gè)胚胎， 它們通常具有用于成功植入并且發(fā)育足月的可變并且很不明確的潛力。而且，IVF之后的 每個(gè)周期平均活胎出生率僅為30%，并且自從30年前引入人類IVF以來(lái)，該百分率就未發(fā) 生顯著改變(cdc.gov/art)。盡管IVF失敗的可能原因有可能不同，但是認(rèn)為，染色體異 ?；蚍钦缎砸汛俪伤^的IVF成功率和活胎出生率(Munne等人(2003)R印rod Biomed Online, 7:91-97 ;OlgiIvie (2008) Obstetrician&Gynaeco110:88-92)。
[0006]先前研究已表明，非整倍性存在于50-70%的卵裂期人類胚胎(Vanneste等人 (2009)Nat Med, 15:577-583 Johnson 等人(2010)Hum Reprod25:1066-1075)中。盡管已 嘗試使形態(tài)學(xué)與非整倍性相關(guān)聯(lián)，但是公知的是，非整倍性胚胎對(duì)于在傳統(tǒng)IVF評(píng)價(jià)技術(shù) 下轉(zhuǎn)移通?？此普Ｇ疫m合的(Baltaci等人(2006)Reprod Biomed 0nlinel2:77-82)。 目前，最常用的用于診斷非整倍性的方法是第3天活檢卵裂球的預(yù)植入基因篩檢(PGS)， 該方法對(duì)于胚胎是侵入性的，遭受鑲嵌性(mosaicism)并且僅由較少比例的輔助生殖患 者米用(Kuo 等人,(1998) J.Assist Reprod Genet, 15:276-280 ;Baart 等人,(2006)Hum Repro21:223-233)。替代方法諸如延長(zhǎng)培養(yǎng)胚胎至胚泡期和經(jīng)由滋養(yǎng)外胚層活檢分析染 色體狀態(tài)也已用于評(píng)價(jià)非整倍性。然而，另外的潛在風(fēng)險(xiǎn)(包括引入表觀遺傳變異、胚胎 停滯和其它破壞胚胎完整性的因素)被認(rèn)為與延長(zhǎng)的胚胎培養(yǎng)有關(guān)(Khosla等人，(2001) Hum Reprod Update, 7:419-427 ；Katari,等人(2009)Hum Mol Genet, 18:3769-3778 ; Lim 等人，(2009)Hum Reprod24:741-747 ；Fernandez-Gonzalez 等人，(2009) Reproductionl37:271-283。[0007]基礎(chǔ)胚胎發(fā)育領(lǐng)域中的認(rèn)知受到限制，因?yàn)閷?duì)人類胚胎生物學(xué)的研究仍然具有爭(zhēng) 議并且常常從研究資金中免除。結(jié)果，胚胎發(fā)育的現(xiàn)有知識(shí)中的大部分來(lái)源于模式生物的 研究。然而，當(dāng)來(lái)自不同物種的胚胎經(jīng)歷相似的發(fā)育時(shí)期時(shí)，時(shí)機(jī)因物種而不同。這些不 同以及許多其他不同使得其不適于直接從一個(gè)物種推知到另一個(gè)物種(Taft，R.E.(2008) Theriogenology69 (I): 10-16)。人類發(fā)育的一般途徑，以及根本的基本分子決定因素，對(duì) 于人類胚胎發(fā)育來(lái)說(shuō)是獨(dú)一無(wú)二的。例如，在小鼠中，胚胎轉(zhuǎn)錄在受精后約12個(gè)小時(shí)被活 化，與第一次卵裂分裂同時(shí)，而在人類胚胎中，胚胎基因活化(EGA)的主波發(fā)生在第3天，約 8 細(xì)胞時(shí)期(Bell, C.E.等人(2008)Mol.Hum.Reprod.14:691-701 ；Braude, P.等人(1988) Nature332:459-461 ；Hamatani, T.等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sc1.101:10326-10331 ； Dobson, T.等人(2004) Human Molecular Geneticsl3 (14): 1461 - 1470)。此外，很多在 早期人類發(fā)育中被調(diào)節(jié)的基因是獨(dú)一無(wú)二的(Dobson, T.等人(2004)Human Molecular Geneticsl3 (14):1461 - 1470)。而且，在其他物種例如小鼠中，超過(guò)85%的體外培養(yǎng) 的胚胎達(dá)到胚泡期(哺乳動(dòng)物發(fā)育中的第一大界標(biāo)之一)，而培養(yǎng)的人類胚胎具有約 30-50%的平均胚泡形成率，以及鑲嵌性和不正常表型例如碎裂和發(fā)育停滯的高發(fā)生率 (Rienzi, L.等人(2005) Reprod.Biomed.0nlinelO:669-681 ;Alikani, M.等人(2005) Mol.Hum.Reprod.11:335-344 ；Keltz, M.D.等人(2006) Fertil.Steril.86:321-324 ； French, D.B.等人(2009)Fertil.Steril.)。雖然有這些不同，但是大部分的植入前胚 胎發(fā)育研究來(lái)源于模式生物并且很難與人類胚胎發(fā)育相關(guān)(Zernicka-Goetz’M.(2002) Developmentl29:815-829 ；ffang, Q.等人(2004)Dev Cell.6:133-144 ；Bell, C.E.等 人(2008)Mol.Hum.Reprod.14:691-701 ；Zernicka-Goetz, M.(2006)Curr.0pin.Genet.Dev.16:406-412 ；Mtango, N.R.等人(2008) Int.Rev.Cell.Mol.Biol.268:223-290)。
[0008]最近，已實(shí)現(xiàn)延時(shí)成像分析來(lái)監(jiān)控發(fā)育中的人類胚胎并且潛在地評(píng)估成活力 (Mio 和 Maeda (2008) Am J.0bstet Gynecol 199:660-665 ;Nakahara 等人,(2010) J Assist Reprod Genet，27:93-96)。除了提供評(píng)價(jià)早期胚胎發(fā)育的非侵入性方和避免其它限制諸 如鑲嵌性之外，檢測(cè)和測(cè)量人類胚胎中的動(dòng)態(tài)成像參數(shù)對(duì)于所有IVF患者是可得到的。在 這些研究中，分析發(fā)育事件(包括受精、分裂、胚泡形成和胚胎孵化)并且在第3天與傳統(tǒng) IVF形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)聯(lián)。然而，沒(méi)有與胚泡形成或妊娠結(jié)果有關(guān)的成像參數(shù)。其他方法已經(jīng) 關(guān)注作為指示的第一次卵裂的開(kāi)始以預(yù)測(cè)人類胚胎的成活力(Fenwick等人(2002)Human Reproduction, 17:407-412 ;Lundin 等人(2001) Human Reproductionl6:2652-2657)。然 而，這些方法沒(méi)有認(rèn)可胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間或早期分裂之間的時(shí)間間隔的重要性。
[0009]其他方法也已經(jīng)使用延時(shí)成像以測(cè)量早期胚胎發(fā)育期間細(xì)胞分裂的時(shí)機(jī)和程度 (W0/2007/144001)。然而，這些方法僅公開(kāi)用于牛胚胎的延時(shí)成像的基本和一般方法，其 在發(fā)育潛力、形態(tài)學(xué)表現(xiàn)、分子和后生程序以及轉(zhuǎn)移附近的時(shí)機(jī)和參數(shù)上基本上與人類胚 胎不同。例如，牛胚胎與人類胚胎相比花費(fèi)長(zhǎng)得多的時(shí)間來(lái)植入(分別為30天和9天)。 (Taft, (2008) Theriogenology69 (I): 10-16)。而且,沒(méi)有公開(kāi)可以預(yù)計(jì)人類胚胎成活力的 特定的成像參數(shù)或時(shí)間間隔。
[0010]最近，延時(shí)成像已經(jīng)被用于觀察受精之后最初24小時(shí)期間的人類胚胎發(fā)育 (Lemmen 等人(2008) Reproductive BioMedicine 0nlinel7 (3): 385-391)。發(fā)現(xiàn)首次分裂 之后細(xì)胞核的同步與妊娠結(jié)果有關(guān)。然而，這一工作得出結(jié)論早期首次卵裂不是重要的預(yù)計(jì)參數(shù)，其與之前的研究相矛盾(Fenwick等人(2002)Human Reproductionl7:407-412 ; Lundin 等人(2001) Human Reproductionl6:2652-2657)。
[0011]最終，沒(méi)有研究通過(guò)與胚胎的分子程序或胚胎的染色體組成相關(guān)聯(lián)而確認(rèn)成像參 數(shù)。因此在若干方面缺少人類胚胎評(píng)估的方法并且可通過(guò)本方法改進(jìn)，其包括時(shí)間間隔顯 微鏡(time-lapse microscopy)的新應(yīng)用、圖像分析和成像參數(shù)與分子譜和染色體組成的 關(guān)聯(lián)性。令人驚訝的是，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞周期成像參數(shù)不僅預(yù)測(cè)胚胎成活力，而且 通過(guò)將成像行為與經(jīng)成像胚胎的染色體組成相關(guān)聯(lián)來(lái)預(yù)測(cè)人類胚胎中的非整倍性(包括 簡(jiǎn)單且復(fù)雜的鑲嵌性、單體性和三體性)。
[0012]發(fā)明概述
[0013]提供了用于確定一個(gè)或多個(gè)胚胎的發(fā)育潛力和/或染色體組成的方法、組合物和 試劑盒。這些方法在體外鑒定具有正常染色體組成和/或有利發(fā)育潛力即發(fā)育成為胚泡的 能力(ability)或能力(capacity)的胚胎中是有用的，其因此在治療人類中的不育癥的方 法中是有用的。
[0014]在本發(fā)明的一些方面中，提供了用于確定胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力的方法。 在這些方面中，測(cè)量胚胎或多潛能細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以獲得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果。 然后細(xì)胞參數(shù)被用于提供對(duì)所述胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力的確定，所述確定可被用于 指導(dǎo)臨床的行動(dòng)方針。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞參數(shù)是通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡(time-lapse microscopy)可測(cè)量的形態(tài)學(xué)事件。在一些實(shí)施方案中,例如，當(dāng)胚胎被測(cè)定時(shí)，所述一個(gè)或 多個(gè)細(xì)胞參數(shù)是:胞質(zhì)分裂事件例如胞質(zhì)分裂I的持續(xù)時(shí)間；胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之 間的時(shí)間間隔和胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞周期 I的持續(xù)時(shí)間也用作細(xì)胞參數(shù)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果通過(guò)將其與來(lái)自參 考胚胎的可比較的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果相比較并且使用這一比較的結(jié)果來(lái)提供所述胚胎發(fā) 育潛力的確定來(lái)使用。在一些實(shí)施方案中，胚胎是人類胚胎。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞參數(shù) 是被測(cè)量以獲得基因表達(dá)測(cè)量結(jié)果的基因表達(dá)水平。在一些實(shí)施方案中，基因表達(dá)測(cè)量結(jié) 果通過(guò)將其與來(lái)自參考多潛能細(xì)胞或胚胎或來(lái)自其的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)測(cè)量結(jié) 果相比較來(lái)使用，其中這一比較的結(jié)果被用來(lái)提供所述多潛能細(xì)胞或胚胎的發(fā)育潛力的確 定。在一些實(shí)施方案中，所述胚胎通過(guò)體內(nèi)卵母細(xì)胞的體外受精來(lái)制備。在其它實(shí)施方案 中，所述胚胎通過(guò)體內(nèi)卵母細(xì)胞的胞漿內(nèi)精子注射來(lái)制備。在一些實(shí)施方案中，所述卵母細(xì) 胞體外成熟。在其它實(shí)施方案中，所述卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟。在一些實(shí)施方案中，所述胚胎為 非整倍體。
[0015]在本發(fā)明的一些方面中，提供了將證實(shí)具有有利發(fā)育潛力的胚胎轉(zhuǎn)移至雌性動(dòng)物 的方法。在一些方面中，在有利于促進(jìn)發(fā)育的條件下培養(yǎng)胚胎并且測(cè)量一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參 數(shù)以獲得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果。細(xì)胞參數(shù)之后被用于提供對(duì)胚胎的發(fā)育潛力的確定。在一些 實(shí)施方案中，細(xì)胞參數(shù)是通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡可測(cè)量的形態(tài)學(xué)事件。在一些實(shí)施方案中，例 如當(dāng)胚胎被測(cè)定時(shí)，所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)是:胞質(zhì)分裂事件例如胞質(zhì)分裂I的持續(xù)時(shí) 間；胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間 隔。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞周期I的持續(xù)時(shí)間也用作細(xì)胞參數(shù)。在一些實(shí)施方案中，提 供了將一個(gè)或多個(gè)證實(shí)具有有利發(fā)育潛力的胚胎轉(zhuǎn)移至雌性動(dòng)物的方法。在一些實(shí)施方案 中，所述胚胎是人類胚胎。在一些實(shí)施方案中，所述胚胎通過(guò)體內(nèi)卵母細(xì)胞的體外受精來(lái)制備。在其它實(shí)施方案中，所述胚胎通過(guò)體內(nèi)卵母細(xì)胞的胞漿內(nèi)精子注射來(lái)制備。在一些實(shí) 施方案中，所述卵母細(xì)胞體外成熟。在其它實(shí)施方案中，所述卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟。在一些實(shí) 施方案中，在有利于促進(jìn)發(fā)育的條件下在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)胚胎。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng) 皿含有一個(gè)或多個(gè)微孔。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在將胚胎轉(zhuǎn)移至需要其的雌性動(dòng)物受者 之前首先從培養(yǎng)皿除去經(jīng)確定具有有利發(fā)育潛力的胚胎。
[0016]在本發(fā)明的一些方面中，提供了用于檢測(cè)胚胎中的非整倍性的方法。在本發(fā)明的 這類方面中，提供了首先確定胚胎到達(dá)胚泡的潛力、然后確定存在或不存在胚胎中碎裂和/ 或其水平的方法，其中碎裂、特別是高碎裂水平的存在指示非整倍體胚胎。在一些實(shí)施方案 中，到達(dá)胚泡的潛力通過(guò)確定一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)來(lái)測(cè)量。在某些方面中，細(xì)胞參數(shù)包括第 一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間、胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔、胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂 3之間的時(shí)間間隔、直到第一細(xì)胞分裂的時(shí)間、胚胎形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)模式、或本領(lǐng)域已知的 確定胚胎到達(dá)胚泡的潛力的任何其它方法及其組合。
[0017]在本發(fā)明的一些方面中，提供了用于檢測(cè)胚胎中的非整倍性的方法。在這類方面 中，測(cè)量胚胎或多潛能細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以獲得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果。細(xì)胞參數(shù)測(cè) 量結(jié)果被用于提供胚胎是否為非整倍體的確定，所述確定可被用于指導(dǎo)臨床的行動(dòng)方針。 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞參數(shù)是通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡可測(cè)量的形態(tài)學(xué)事件。在一些實(shí)施方 案中，例如當(dāng)胚胎被測(cè)定時(shí)，所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)是:胞質(zhì)分裂事件例如胞質(zhì)分裂I的 持續(xù)時(shí)間；胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的 時(shí)間間隔。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞周期I的持續(xù)時(shí)間也用作細(xì)胞參數(shù)。在一些實(shí)施方案 中，提供了確定經(jīng)確定為非整倍體的胚胎是否為歸因于有絲分裂或減數(shù)分裂錯(cuò)誤的非整倍 體的方法。在一些實(shí)施方案中，所述胚胎是人類胚胎。在一些實(shí)施方案中，所述胚胎為非整 倍體。在一些實(shí)施方案中，所述非整倍性是三體性。在一些實(shí)施方案中，所述三體性是三體 性21。在其它實(shí)施方案中，所述非整倍性是單體性。在一些實(shí)施方案中，所述單體性是單體 性22。在一些實(shí)施方案中，所述胚胎是人類胚胎。在一些實(shí)施方案中，所述胚胎通過(guò)體內(nèi)卵 母細(xì)胞的體外受精來(lái)制備。在其它實(shí)施方案中，所述胚胎通過(guò)體內(nèi)卵母細(xì)胞的胞漿內(nèi)精子 注射來(lái)制備。在一些實(shí)施方案中，所述卵母細(xì)胞體外成熟。在其它實(shí)施方案中，所述卵母細(xì) 胞體內(nèi)成熟。在一些實(shí)施方案中，在測(cè)量細(xì)胞參數(shù)之前所述胚胎被冷凍。在其它實(shí)施方案 中，在測(cè)量細(xì)胞參數(shù)之前所述胚胎未被冷凍。
[0018]在本發(fā)明的一些方面中，提供了用于選擇具有正常染色體計(jì)數(shù)的胚胎的方法。在 這類方面中，測(cè)量胚胎或多潛能細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以獲得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果。然 后細(xì)胞參數(shù)被用于提供對(duì)所述胚胎是否具有正常染色體計(jì)數(shù)的確定，所述確定可被用于指 導(dǎo)臨床的行動(dòng)方針。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞參數(shù)通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡可測(cè)量的形態(tài)學(xué)事 件。在一些實(shí)施方案中，例如當(dāng)胚胎被測(cè)定時(shí)，所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)是:胞質(zhì)分裂事件 例如胞質(zhì)分裂I的持續(xù)時(shí)間；胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和胞質(zhì)分裂2和 胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞周期I的持續(xù)時(shí)間也用作細(xì)胞參數(shù)。 在一些實(shí)施方案中，所述胚胎是人類胚胎。在一些實(shí)施方案中，所述胚胎通過(guò)體內(nèi)卵母細(xì)胞 的體外受精來(lái)制備。在其它實(shí)施方案中，所述胚胎通過(guò)體內(nèi)卵母細(xì)胞的胞漿內(nèi)精子注射來(lái) 制備。在一些實(shí)施方案中，所述卵母細(xì)胞體外成熟。在其它實(shí)施方案中，所述卵母細(xì)胞體內(nèi) 成熟。在一些實(shí)施方案中，在測(cè)量細(xì)胞參數(shù)之前在有利于促進(jìn)發(fā)育的條件下在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)胚胎。在一些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)皿含有一個(gè)或多個(gè)微孔。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，從 培養(yǎng)皿除去經(jīng)確定具有正常染色體計(jì)數(shù)的胚胎。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在從培養(yǎng)皿除去 經(jīng)確定具有正常染色體計(jì)數(shù)的胚胎之后將所述胚胎進(jìn)一步移植至雌性動(dòng)物受者中。
[0019]在本發(fā)明的一些方面中，提供了用于選擇具有正常染色體計(jì)數(shù)的胚胎的方法。在 本發(fā)明的這類方面中，提供了首先確定胚胎到達(dá)胚泡的潛力、然后確定存在或不存在胚胎 中碎裂和/或其水平的方法，其中碎裂、特別是高碎裂水平的存在指示非整倍體胚胎并且 碎裂的不存在指示具有正常染色體計(jì)數(shù)的胚胎。低碎裂水平與具有高碎裂水平的胚胎相比 指示較低風(fēng)險(xiǎn)的非整倍性并且與根本沒(méi)有碎裂的胚胎相比指示較高風(fēng)險(xiǎn)的非整倍性。換句 話說(shuō)，碎裂水平越低，則胚胎將為非整倍體的可能性越低，并且碎裂水平越高，則胚胎將為 非整倍體的可能性越高。在一些實(shí)施方案中，到達(dá)胚泡的潛力通過(guò)確定一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參 數(shù)來(lái)測(cè)量。在某些方面中，細(xì)胞參數(shù)包括，第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間、胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分 裂2之間的時(shí)間間隔、胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔、直到第一細(xì)胞分裂的時(shí) 間、胚胎形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)模式、或本領(lǐng)域已知的確定胚胎到達(dá)胚泡的潛力的任何其它方法 及其組合。
[0020]在本發(fā)明的一些方面中，提供了將證實(shí)具有正常染色體計(jì)數(shù)的胚胎轉(zhuǎn)移至雌性動(dòng) 物的方法。在一些方面中，在有利于促進(jìn)發(fā)育的條件下培養(yǎng)胚胎并且測(cè)量一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞 參數(shù)以獲得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果。然后細(xì)胞參數(shù)被用于提供對(duì)胚胎是否具有正常染色體計(jì)數(shù) 的確定。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞參數(shù)通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡可測(cè)量的形態(tài)學(xué)事件。在一些 實(shí)施方案中，(例如)當(dāng)胚胎被測(cè)定時(shí)，所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)是:胞質(zhì)分裂事件例如胞 質(zhì)分裂I的持續(xù)時(shí)間；胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分 裂3之間的時(shí)間間隔。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞周期I的持續(xù)時(shí)間也用作細(xì)胞參數(shù)。在一 些實(shí)施方案中，提供了用于將一個(gè)或多個(gè)具有正常染色體計(jì)數(shù)的胚胎轉(zhuǎn)移至雌性動(dòng)物的方 法。在一些實(shí)施方案中，所述胚胎是人類胚胎。在一些實(shí)施方案中，所述胚胎通過(guò)體內(nèi)卵母 細(xì)胞的體外受精來(lái)制備。在其它實(shí)施方案中，所述胚胎通過(guò)體內(nèi)卵母細(xì)胞的胞漿內(nèi)精子注 射來(lái)制備。在一些實(shí)施方案中，所述卵母細(xì)胞體外成熟。在其它實(shí)施方案中，所述卵母細(xì)胞 體內(nèi)成熟。在一些實(shí)施方案中，在測(cè)量細(xì)胞參數(shù)之前胚胎被冷凍。在其它實(shí)施方案中，在測(cè) 量細(xì)胞參數(shù)之前胚胎未被冷凍。
[0021]在本發(fā)明的一些方面中，提供用于將胚胎或多潛能細(xì)胞按照它們相對(duì)于組中其他 胚胎或多潛能細(xì)胞的染色體含量分級(jí)的方法。在這些實(shí)施方案中，測(cè)量所述組中的所述胚 胎或多潛能細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以獲得所述胚胎或多潛能細(xì)胞的每一個(gè)的細(xì)胞參 數(shù)測(cè)量結(jié)果。然后將所述細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果用于確定所述組中所述胚胎或多潛能細(xì)胞的每 一個(gè)相對(duì)于彼此的染色體含量，所述確定可被用于指導(dǎo)臨床的行動(dòng)方針。在一些實(shí)施方案 中，細(xì)胞參數(shù)是通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡可測(cè)量的形態(tài)學(xué)事件。在一些實(shí)施方案中，(例如)當(dāng) 胚胎被分級(jí)時(shí)，一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)是胞質(zhì)分裂事件例如胞質(zhì)分裂I的持續(xù)時(shí)間；胞質(zhì)分 裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔和胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。在某些實(shí) 施方案中，細(xì)胞周期I的持續(xù)時(shí)間也被測(cè)量。在一些實(shí)施方案中，將胚胎分級(jí)為具有正常染 色體計(jì)數(shù)的胚胎，歸因于有絲分裂錯(cuò)誤的非整倍體或歸因于減數(shù)分裂錯(cuò)誤的非整倍體。在 一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果通過(guò)將來(lái)自所述組中的所述胚胎或多潛能 細(xì)胞中的每一個(gè)的所述細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果彼此比較以確定所述胚胎或多潛能細(xì)胞相對(duì)于彼此的染色體含量。在一些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果通過(guò)將每個(gè)細(xì) 胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果與來(lái)自參考胚胎或多潛能細(xì)胞的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果相比較以確定來(lái)自每 個(gè)胚胎或多潛能細(xì)胞的染色體含量并且將這些染色體含量相比較以確定所述胚胎或多潛 能細(xì)胞相對(duì)于彼此的染色體含量來(lái)使用。
[0022]附圖簡(jiǎn)述
[0023]當(dāng)結(jié)合所附附圖閱讀時(shí)，從下列詳細(xì)描述最好地理解本發(fā)明。強(qiáng)調(diào)的是，根據(jù)慣 例，附圖的不同特征是不按比例的。相反，為了清楚不同特征的直徑是任意放大或縮小的。 附圖包括下列各圖。
[0024]圖1是顯示用于評(píng)估胚胎的流程圖。
[0025]圖2顯示6天的時(shí)間段的細(xì)胞卵裂和分裂的一系列照片。圖像被標(biāo)明第I天至第 6天。比例尺代表50iim。
[0026]圖3是顯示從I細(xì)胞胚胎(合子)成功發(fā)育為胚泡的百分比的柱狀圖。4個(gè)不同 實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡觀察總共100個(gè)胚胎直到第5天或第6天。顯示了達(dá) 到每個(gè)標(biāo)明的階段(胚泡，8細(xì)胞、4至7細(xì)胞、2至3細(xì)胞和I細(xì)胞)的細(xì)胞的百分比。
[0027]圖4是為了標(biāo)明的時(shí)期而關(guān)注的一系列四個(gè)不同的胚胎。
[0028]圖5是顯示用于本評(píng)估的階段之間的延時(shí)的圖表，包括第一次胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí) 間，第一次和第二次分裂之間的時(shí)間(測(cè)量為胞質(zhì)分裂I的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的開(kāi)始之間 的時(shí)間間隔)以及第二次和第三次有絲分裂之間的時(shí)間(測(cè)量為胞質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì) 分裂3的起始之間的時(shí)間間隔)。
[0029]圖6是顯示一大組胚胎的三個(gè)事件的測(cè)量的3-D點(diǎn)圖，包括第一次胞質(zhì)分裂的持 續(xù)時(shí)間，第一次和第二次細(xì)胞分裂之間的時(shí)間間隔(測(cè)量為胞質(zhì)分裂I的結(jié)束和胞質(zhì)分裂 2的開(kāi)始之間的時(shí)間間隔)以及第二次細(xì)胞和第三次細(xì)胞分裂之間的時(shí)間間隔(測(cè)量為胞 質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的起始之間的時(shí)間間隔)。達(dá)到胚泡階段的胚胎(用圓環(huán)標(biāo) 記)顯示在3-D圖上聚集在一起，而在達(dá)到胚泡前停滯的胚胎(用X標(biāo)記)分散各處。
[0030]圖7是顯示用于使用3維形態(tài)學(xué)參數(shù)預(yù)測(cè)胚泡形成的接受者操作表征(ROC)曲線 的圖表。
[0031]圖8是顯示來(lái)自6個(gè)停滯的I至2細(xì)胞胚胎和5個(gè)正常的I至2細(xì)胞胚胎的52 個(gè)基因的基因表達(dá)水平的雷達(dá)圖表。如通過(guò)曼-惠特尼檢驗(yàn)所確定的，正常和不正常胚胎 之間的表達(dá)水平上的差異對(duì)于以黃色加亮并且用星號(hào)指示的那些基因來(lái)說(shuō)是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。
[0032]圖9是顯示停滯的2細(xì)胞胚胎和正常的2細(xì)胞胚胎中不同基因的表達(dá)水平的柱狀 圖。頂部顯示停滯的2細(xì)胞胚胎的選擇數(shù)量的延時(shí)圖像。
[0033]圖10是顯示圖9中在停滯的4細(xì)胞胚胎和正常的4細(xì)胞胚胎中存在的相同基因 的比較的柱狀圖。頂部顯示停滯的4細(xì)胞胚胎的選擇數(shù)量的延時(shí)圖像。
[0034]圖11是顯示具有4個(gè)不同模式的基因表達(dá)模式(ESSP)的一系列柱狀圖。標(biāo)明的 是胚胎基因活化(第2天)和第3天的典型表達(dá)之前的早期轉(zhuǎn)移的時(shí)機(jī)。
[0035]圖12顯示來(lái)自不同階段的單個(gè)卵裂球的基因的基因表達(dá)。(A)來(lái)自標(biāo)繪在不同細(xì) 胞時(shí)期的單個(gè)卵裂球的兩個(gè)基因CTNNBl和CDX2的基因表達(dá)以及在不同階段例如2細(xì)胞、 3細(xì)胞、桑椹胚和胚泡這些基因表達(dá)水平上的變化。(B)柱狀的基因表達(dá)標(biāo)記代表與來(lái)自合子程序的基因表達(dá)比較的母體程序中的基因表達(dá)。
[0036]圖13是用于使用延時(shí)圖像分析和有關(guān)的分子分析測(cè)定胚胎成活力的模型的圖。
[0037]圖14是顯示體外卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中發(fā)育的三個(gè)階段的一系列照片。
[0038]圖15是顯示體外卵母細(xì)胞成熟后胚胎發(fā)育的過(guò)程的一系列照片。
[0039]圖16是顯示用于測(cè)定卵母細(xì)胞的程序的流程圖。
[0040]圖17是顯示用于測(cè)定干細(xì)胞和多潛能干細(xì)胞的程序的流程圖。
[0041]圖18是顯示誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞分化為神經(jīng)元玫瑰花狀簇(rosette)的過(guò)程的 一系列照片。
[0042]圖19是測(cè)定表達(dá)水平的基因可被分類的類別的表，包括每類別基因的數(shù)目。
[0043]圖20是在141個(gè)正常發(fā)育的單個(gè)胚胎和單個(gè)卵裂球的基因表達(dá)分析中確定的四 個(gè)胚胎期特異模式(ESSP)和將所述基因分類至這些類別中的每一個(gè)的表。
[0044]圖21顯示證明成像參數(shù)預(yù)測(cè)胚泡形成的能力的自動(dòng)圖像分析。(A)顯示單個(gè)胚胎 的跟蹤算法的結(jié)果。(B)顯示被分析的一組14個(gè)胚胎。(C)顯示對(duì)胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間的 手動(dòng)圖像分析與自動(dòng)成像分析的比較。(D)顯示對(duì)第一次和第二次有絲分裂之間的時(shí)間的 手動(dòng)圖像分析的比較。(E)顯示良好胚泡形態(tài)學(xué)與不良胚泡形態(tài)學(xué)的比較。
[0045]圖22是根據(jù)本發(fā)明的暗視野顯微鏡的示意圖；左邊的插圖顯示激光加工的暗視 野片裝置。
[0046]圖23是如圖22中所描述的三個(gè)顯微鏡的陣列的示意圖，裝載在支架上以便安裝 在孵育器中并用與電腦連接。圖23A顯示顯微鏡而圖23B顯示顯微鏡內(nèi)部和孵育器。
[0047]圖24是在本操作中使用的圖像捕獲軟件的屏幕截圖，顯示從3個(gè)通道成像的胚 月臺(tái)。
[0048]圖25A至D是顯示來(lái)自實(shí)驗(yàn)2，位置2的所選擇的延時(shí)圖像的一系列四張照片。圖 25A和25B是在培養(yǎng)基更換前捕獲的圖像而圖25C和2?是在培養(yǎng)基更換后捕獲的圖像。
[0049]圖26A至D是顯示來(lái)自實(shí)驗(yàn)1，位置2的所選擇的延時(shí)圖像的一系列四張照片。圖 26A和26B是在培養(yǎng)基更換前捕獲的圖像而圖26C和26D是在培養(yǎng)基更換后捕獲的圖像。
[0050]圖27A和B是具有微孔的定制培養(yǎng)皿的圖。圖27A顯示具有不同維數(shù)的培養(yǎng)皿的 圖而圖27B顯示微孔的3D視圖。
[0051]圖28A和B是顯示具有和不具有前期圖像配準(zhǔn)的細(xì)胞活性的圖表。圖28A和28B 一起顯示配準(zhǔn)凈化了結(jié)果并且除去歸因于胚胎移位或旋轉(zhuǎn)的峰。
[0052]圖29A和B是顯示正常和不正常胚胎的細(xì)胞活性的圖表(左)和細(xì)胞照片(右)。 圖29A和圖29B—起顯示在第三天胚胎具有相似的形態(tài)學(xué)但是它們的細(xì)胞活性曲線圖卻完 全不同并且它們中僅一個(gè)發(fā)育為胚泡。
[0053]圖30是顯示胚胎發(fā)育期間連續(xù)成對(duì)圖像之間的像素強(qiáng)度的差異的圖表。這可被 獨(dú)立使用以測(cè)定胚胎成活力或作為通過(guò)確定應(yīng)當(dāng)使用多少粒子(預(yù)測(cè)的胚胎模型)改善其 他算法例如粒子濾波器的方法。
[0054]圖31A-G是顯示不同細(xì)胞階段的來(lái)自2D跟蹤的結(jié)果的一系列七張照片。細(xì)胞過(guò) 程通過(guò)與每個(gè)照片對(duì)相關(guān)聯(lián)的幀序號(hào)標(biāo)明:15幀(圖31A) ,45(B)、48 (C)、189 (D)、190 (E)、 196(F)和234(G)。底部箭頭顯示所覆蓋的模擬圖像。輪廓是可見(jiàn)的細(xì)胞膜而白色虛線是 閉塞的膜。每5分鐘捕獲圖像幀并且僅展示了一些。[0055]圖32A和B是顯示3D細(xì)胞跟蹤的兩個(gè)成功實(shí)例的一系列照片和圖。在胚胎的每 張照片下的說(shuō)明顯示3D模型的俯視圖，除了幀314和幀228，其分別在幀314和幀228中顯 示模型的側(cè)視圖。每5分鐘捕獲圖像幀。
[0056]圖33是I細(xì)胞至2細(xì)胞分裂的粒子濾波器結(jié)果的圖解表示。數(shù)據(jù)點(diǎn)是細(xì)胞中心 的3D定位。點(diǎn)顯示I細(xì)胞模型、2細(xì)胞模型、3細(xì)胞模型和4細(xì)胞模型。頂部箭頭顯示預(yù)測(cè) 之后的粒子而底部箭頭顯示重采樣之后的粒子。
[0057]圖34A和B是顯示對(duì)一組14個(gè)胚胎的自動(dòng)與手動(dòng)分析的對(duì)比的圖表。圖34A顯 示第一次胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間的對(duì)比而圖34B顯示第一次和第二次有絲分裂之間的時(shí)間 的對(duì)比。
[0058]圖35是顯示圖像分析如何被用于模型胚胎并且測(cè)量某些形態(tài)學(xué)參數(shù)的流程圖。
[0059]圖36A、B和C是顯示各時(shí)間參數(shù)中的每一個(gè)和基于時(shí)序參數(shù)中的每一個(gè)的正常胚 胎、有絲分裂非整倍體和減數(shù)分裂非整倍體胚胎的聚集的三維圖。
[0060]圖37A是顯示各時(shí)間參數(shù)中的每一個(gè)和基于時(shí)序參數(shù)中的每一個(gè)的正常胚胎、三 倍體正常胚胎、單體性22胚胎、單體性其它胚胎、三體性21胚胎和三體性其它胚胎的聚集 的三維圖。B是顯示正常胚胎、三體性胚胎和單體性胚胎中的每個(gè)染色體的拷貝數(shù)。拷貝數(shù) 是基于染色體I相比于染色體2的平均信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)化的CGH值的log2比率。
[0061]圖38A顯示低鑲嵌和高鑲嵌胚胎中的每種染色體的拷貝數(shù)?？截悢?shù)是基于染色體 I相比于染色體2的平均信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)化的CGH值的log2比率。B是顯示各時(shí)間參數(shù)中的每 一個(gè)和基于時(shí)序參數(shù)中的每一個(gè)的低鑲嵌和高鑲嵌胚胎的聚集的三維圖。
[0062]圖39是顯示各時(shí)間參數(shù)中的每一個(gè)和基于時(shí)序參數(shù)中的每一個(gè)的正常胚胎、三 倍體正常胚胎、低鑲嵌胚胎、高鑲嵌胚胎、單體性22胚胎、單體性其它胚胎、三體性21胚胎 和三體性其它胚胎的聚集的三維圖。
[0063]圖40是顯示正常胚胎、具有有絲分裂錯(cuò)誤的胚胎和具有減數(shù)分裂錯(cuò)誤的胚胎的 各時(shí)間參數(shù)分析的表。
[0064]圖41A是顯示各時(shí)間參數(shù)中的每一個(gè)和沒(méi)有碎裂的整倍體胚胎、沒(méi)有碎裂的非整 倍體胚胎、具有碎裂的整倍體胚胎、具有碎裂的非整倍體胚胎、沒(méi)有碎裂的正常三倍體胚胎 和具有碎裂的正常三倍體胚胎的聚集的三維圖是顯示各時(shí)間參數(shù)中的每一個(gè)和具有碎 裂的正常胚胎、具有碎裂的正常三倍體胚胎、歸因于減數(shù)分裂錯(cuò)誤的具有碎裂的非整倍體 胚胎和歸因于有絲分裂錯(cuò)誤的具有碎裂的非整倍體胚胎的聚集的三維圖；C是顯示各時(shí)間 參數(shù)中的每一個(gè)和具有碎裂的正常胚胎、具有碎裂的正常三倍體胚胎、具有碎裂的低鑲嵌 胚胎；和具有碎裂的高鑲嵌胚胎的聚集的三維圖山是顯示各時(shí)間參數(shù)中的每一個(gè)和具有 高碎裂水平的胚胎和具有低碎裂水平的胚胎的聚集的三維圖；E是顯示各時(shí)間參數(shù)中的每 一個(gè)和在I個(gè)細(xì)胞期、2個(gè)細(xì)胞期和3個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞期碎裂起始的胚胎的聚集的三維圖。
[0065]圖42是顯示評(píng)價(jià)胚胎的染色體異常的過(guò)程的流程圖。
[0066]圖43顯示在預(yù)植入發(fā)育期間表觀遺傳擦除和轉(zhuǎn)座子激活之間的關(guān)聯(lián)。
[0067]圖44顯示碎裂的時(shí)序指示胚胎中的染色體異常。A顯示取自延時(shí)序列的獨(dú)立幀； B顯示碎裂的時(shí)序和細(xì)胞周期成像參數(shù)之間的關(guān)系的3維圖；C顯示基于碎裂時(shí)序、再吸收 和潛在的染色體異常的人類胚胎非整倍性的來(lái)源的建議模型。
[0068]圖45顯示隔離細(xì)胞碎片內(nèi)的染色體的證據(jù)。A顯示正確染色體拷貝數(shù)與不正確染色體拷貝數(shù)+或-碎裂之間的關(guān)系的3維圖；B顯示展示細(xì)胞碎裂的不含透明帶的卵裂期 胚胎的共焦成像；C顯示通過(guò)差分圖像對(duì)比度成像的另一碎裂胚胎的3維模型；D顯示延時(shí) 成像序列的最后幀，其在4-細(xì)胞期顯示具有碎裂的胚胎。
[0069]發(fā)明詳述
[0070]在描述本方法和組合物之前，應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不限于所描述的具體方法和 組合物，因?yàn)檫@些當(dāng)然可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解的是，在本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定實(shí)施 方案的目的，而不意為限制性的，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書(shū)限定
[0071]當(dāng)提供數(shù)值的范圍時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解的是，在所述范圍的上限和下限之間的每個(gè)中間 值(自到所述下限的單位的十分之一，除上下文以其他方式明確地說(shuō)明以外)也被特別地 公開(kāi)。在指定的范圍內(nèi)的任何指定的值或中間值與在該指定的范圍內(nèi)任何其它指定的值或 中間值之間的每個(gè)更小的范圍包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些更小的范圍的上限和下限可 以獨(dú)立地包括或排除在所述更小的范圍之內(nèi)，任一、無(wú)一或兩個(gè)限值包括在所述更小的范 圍之內(nèi)時(shí)的每個(gè)范圍也包含本發(fā)明的范圍內(nèi)，并受在所指定的范圍內(nèi)特別排除任何值的限 制。當(dāng)指定的范圍包括兩個(gè)限值之一或兩者時(shí)，排除了所包括的限值之一或兩者的范圍也 包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0072]除另外定義以外，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】普 通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。盡管類似于或等同于在本文描述的那些的任何方法和 材料可以用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)，但現(xiàn)在描述了一些可能的和優(yōu)選的方法和材料。在本 文中提及的所有出版物通過(guò)引用并入本文以公開(kāi)和描述與所述出版物所引用的相關(guān)的方 法和/或材料。應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)存在矛盾時(shí)，本公開(kāi)內(nèi)容替代所并入的出版物的任何公 開(kāi)。
[0073]必須注意的是，如在本文和在附隨的權(quán)利要求書(shū)中使用的，除上下文中以其他方 式明確說(shuō)明以外，單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”和“該(the) ”，包括復(fù)數(shù)的指稱對(duì)象。因此， 例如，提及“一個(gè)細(xì)胞”包括多個(gè)這樣的細(xì)胞，提及“該肽”包括提及一種或多種肽和本領(lǐng)域 技術(shù)人員已知的其等價(jià)物，例如多肽，等等。
[0074]本文討論的出版物僅為了其在本申請(qǐng)?zhí)峤蝗罩暗墓_(kāi)而提供。此處不應(yīng)解釋為 承認(rèn)本發(fā)明沒(méi)有權(quán)利憑借在先發(fā)明而先于上述出版物。此外，所提供的出版物的日期可能 不同于實(shí)際的出版日期，其可能需要被各自確認(rèn)。
[0075]定義
[0076]提供了用于確定一個(gè)或多個(gè)胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力和/或一個(gè)或多個(gè)胚 胎或多潛能細(xì)胞中染色體異常的存在的方法、組合物和試劑盒。這些方法、組合物和試劑盒 在體外確定在治療人類中的不育癥中最有用的胚胎和卵母細(xì)胞中有用。本發(fā)明的這些和其 他的對(duì)象、優(yōu)點(diǎn)和特征對(duì)本領(lǐng)域那些技術(shù)人員來(lái)說(shuō)在閱讀如下文更加全面地描述的主題方 法和組合物的細(xì)節(jié)時(shí)變得顯而易見(jiàn)。
[0077]術(shù)語(yǔ)“發(fā)育潛力”和“發(fā)育感受態(tài)”被用于本文意指健康胚胎或多潛能細(xì)胞生長(zhǎng)或 發(fā)育的能力(ability)或能力(capacity)。
[0078]術(shù)語(yǔ)“胚胎”本文被用于意指當(dāng)兩個(gè)單倍體配子細(xì)胞例如未受精的次級(jí)卵母細(xì)胞 和精子結(jié)合以形成二倍體全能細(xì)胞例如受精的卵母細(xì)胞時(shí)形成的合子和由緊接隨后的直 到桑椹胚即16細(xì)胞階段和胚泡階段的細(xì)胞分裂例如胚胎卵裂(分化的滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán))產(chǎn)生的胚胎兩者。
[0079]術(shù)語(yǔ)“多潛能細(xì)胞”本文被用于意指具有分化為生物體中多種類型的細(xì)胞的能力 的任何細(xì)胞。多潛能細(xì)胞的實(shí)例包括干細(xì)胞卵母細(xì)胞和I細(xì)胞胚胎(即合子)。
[0080]術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”本文被用于意指細(xì)胞或細(xì)胞群，其:(a)具有自我更新的能力和(b) 具有產(chǎn)生不同的分化的細(xì)胞類型的潛力。通常，干細(xì)胞具有產(chǎn)生多重譜系的細(xì)胞的潛力。 如本文所用的，干細(xì)胞可以是全能干細(xì)胞，例如受精的卵母細(xì)胞，其產(chǎn)生生物體的所有的胚 胎和胚外組織；多潛能干細(xì)胞，例如胚胎干(ES)細(xì)胞，胚胎胚(EG)細(xì)胞或誘導(dǎo)的多潛能 干(iPS)細(xì)胞，其產(chǎn)生生物體的所有胚胎組織，即內(nèi)胚層、中胚層和外胚層譜系；多潛能干 細(xì)胞，例如間質(zhì)干細(xì)胞，其產(chǎn)生生物體的胚胎組織中的至少兩種，即，內(nèi)胚層、中胚層和外胚 層譜系中的至少兩種或其可以是組織特異性干細(xì)胞，其產(chǎn)生特定組織的多種類型的分化細(xì) 胞。組織特異性干細(xì)胞包括產(chǎn)生特定組織的細(xì)胞的組織特異性胚胎細(xì)胞和位于成年組織 中并且可產(chǎn)生這一組織的細(xì)胞的體干細(xì)胞，例如產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)的所有細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì) 胞、產(chǎn)生骨骼肌的衛(wèi)星細(xì)胞和產(chǎn)生造血系統(tǒng)的所有細(xì)胞的造血干細(xì)胞。
[0081]術(shù)語(yǔ)“卵母細(xì)胞”本文被用于意指未受精的雌性卵母細(xì)胞或配子。本申請(qǐng)的卵母 細(xì)胞可以是初級(jí)卵母細(xì)胞，在這種情況下它們被放置通過(guò)或正在通過(guò)減數(shù)分裂I，或次級(jí)卵 母細(xì)胞，在這種情況下它們被放置通過(guò)或正在通過(guò)減數(shù)分裂II。
[0082]“減數(shù)分裂”意指導(dǎo)致配子產(chǎn)生的細(xì)胞周期事件。在第一次減數(shù)分裂細(xì)胞周期或 減數(shù)分裂I中，細(xì)胞的染色體被復(fù)制并且分至兩個(gè)子細(xì)胞中。然后這些子細(xì)胞在并未伴隨 DNA合成的第二次減數(shù)分裂細(xì)胞周期或減數(shù)分裂II中分離，產(chǎn)生具有單倍體數(shù)的染色體的 配子。
[0083]“生發(fā)泡”階段意指與減數(shù)分裂I細(xì)胞周期的前期I有關(guān)的初級(jí)卵母細(xì)胞的成熟的 階段，即在核質(zhì)的第一次分裂之前。這一時(shí)期的卵母細(xì)胞也稱為“生發(fā)泡卵母細(xì)胞”，因?yàn)樘?有地巨大細(xì)胞核，稱為生發(fā)泡。在體外培養(yǎng)的正常的人類卵母細(xì)胞中，生發(fā)泡在成熟開(kāi)始后 約6-24小時(shí)發(fā)生。
[0084]“中期I”階段意指與減數(shù)分裂I細(xì)胞周期的中期I有關(guān)的初級(jí)卵母細(xì)胞的成熟的 階段。與生發(fā)泡卵母細(xì)胞相比，中期I卵母細(xì)胞沒(méi)有大的，清楚界定的細(xì)胞核。在體外培養(yǎng) 的正常的人類卵母細(xì)胞中，中期I在成熟開(kāi)始后約12-36小時(shí)發(fā)生。
[0085]“中期II”階段意指與減數(shù)分裂II細(xì)胞周期的中期II有關(guān)的次級(jí)卵母細(xì)胞的成 熟的階段。中期II是可通過(guò)第一極體的排出辨別的。在體外培養(yǎng)的正常的人類卵母細(xì)胞 中，中期II在成熟開(kāi)始后約24-48小時(shí)發(fā)生。
[0086]“有絲分裂細(xì)胞周期”意指細(xì)胞中導(dǎo)致細(xì)胞的染色體的復(fù)制以及將這些染色體和 細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)分至兩個(gè)子細(xì)胞中的事件。有絲分裂細(xì)胞周期分為兩個(gè)時(shí)期:分裂間期和有 絲分裂。在分裂間期，細(xì)胞生長(zhǎng)并且復(fù)制其DNA。在有絲分裂中，細(xì)胞起始并且完成細(xì)胞分 裂，首先分隔其核質(zhì)并且之后將其胞質(zhì)和其分隔的核質(zhì)(胞質(zhì)分裂)分到兩個(gè)分離的細(xì)胞 中。
[0087]“第一次有絲分裂細(xì)胞周期”或“細(xì)胞周期I”意指從受精至第一次胞質(zhì)分裂事件 即受精的卵母細(xì)胞分裂為兩個(gè)子細(xì)胞的時(shí)間間隔。在卵母細(xì)胞被體外受精的實(shí)例中，注射 人絨毛膜促性腺激素(HCG)(通常在卵母細(xì)胞提取前施用)至第一次胞質(zhì)分裂時(shí)間完成之 間的時(shí)間間隔可用作替代的時(shí)間間隔。[0088]“第二次有絲分裂細(xì)胞周期”或“細(xì)胞周期2”意指在胚胎中觀察到的第二次細(xì)胞 周期事件，通過(guò)有絲分裂從受精的卵母細(xì)胞產(chǎn)生子細(xì)胞和通過(guò)有絲分裂從這些子細(xì)胞中的 一個(gè)(“前導(dǎo)子細(xì)胞”或子細(xì)胞A)的產(chǎn)生第一組第三代細(xì)胞(granddaughter cell)之間 的時(shí)間間隔，當(dāng)完成細(xì)胞周期2時(shí)，胚胎由3個(gè)細(xì)胞組成。換句話說(shuō)，細(xì)胞周期2可以直觀 地確定為包含2細(xì)胞的胚胎和包含3細(xì)胞的胚胎之間的時(shí)間。
[0089]“第三次有絲分裂細(xì)胞周期”或“細(xì)胞周期3”意指在胚胎中觀察到的第三次細(xì)胞 周期事件，通常是通過(guò)有絲分裂從受精的卵母細(xì)胞產(chǎn)生子細(xì)胞至通過(guò)有絲分裂從第二子細(xì) 胞中的一個(gè)(“延遲子細(xì)胞”或子細(xì)胞B)產(chǎn)生第二組第三代細(xì)胞時(shí)間間隔，當(dāng)完成細(xì)胞周 期3時(shí)，胚胎由4個(gè)細(xì)胞組成。換句話說(shuō)，細(xì)胞周期3可以直觀地確定為包含3細(xì)胞的胚胎 和包含4細(xì)胞的胚胎之間的時(shí)間。
[0090]“第一次卵裂事件”意指第一次分裂，S卩，卵母細(xì)胞分裂為兩個(gè)子細(xì)胞，即細(xì)胞周期
I。當(dāng)?shù)谝淮温蚜咽录瓿蓵r(shí)，胚胎由2細(xì)胞組成。
[0091]“第二次卵裂事件”意指第二組分裂，S卩，前導(dǎo)子細(xì)胞分裂為兩個(gè)第三代子細(xì)胞和 延遲子細(xì)胞分裂為兩個(gè)第三代子細(xì)胞。換句話說(shuō)，第二次卵裂事件由細(xì)胞周期2和細(xì)胞周 期3兩者組成。當(dāng)?shù)诙温蚜咽录瓿蓵r(shí)，胚胎由4細(xì)胞組成。
[0092]“第三次卵裂事件”意指第三組分裂，即，所有第三代子細(xì)胞的分裂。當(dāng)?shù)谌温蚜?事件完成時(shí)，胚胎由8細(xì)胞組成。
[0093]“胞質(zhì)分裂”或“細(xì)胞分裂”意指細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞分裂的有絲分裂的時(shí)期。換句話說(shuō)， 其是細(xì)胞的分隔的核質(zhì)和其胞質(zhì)被分開(kāi)以產(chǎn)生兩個(gè)子細(xì)胞的有絲分裂的階段。胞質(zhì)分裂的 時(shí)間段可被確定為當(dāng)細(xì)胞膜的收縮(“卵裂溝”)被首次觀察到時(shí)和這一收縮事件的結(jié)束即 兩個(gè)子細(xì)胞產(chǎn)生之間的時(shí)間段或窗口。卵裂溝的起始可以直觀地確定為細(xì)胞膜的曲率從凸 的(向外的圓形的)變?yōu)榘嫉?向里彎曲具有凹痕或凹入)的點(diǎn)。這通過(guò)點(diǎn)在2個(gè)卵裂溝 處的白色箭頭描述于圖4頂部組。細(xì)胞延長(zhǎng)的起始同樣可用于標(biāo)記胞質(zhì)分裂的起始，在這 種情況下胞質(zhì)分裂的時(shí)間段被定義為細(xì)胞延長(zhǎng)的起始和細(xì)胞分裂的結(jié)束之間的時(shí)間段。
[0094]“第一次胞質(zhì)分裂”或“胞質(zhì)分裂I”意指受精之后的第一次細(xì)胞分裂事件，即受精 的卵母細(xì)胞分裂以產(chǎn)生兩個(gè)子細(xì)胞。第一次細(xì)胞分裂通常發(fā)生在受精后一天。
[0095]“第二次胞質(zhì)分裂”或“胞質(zhì)分裂2”意指在胚胎中觀察到的第二次細(xì)胞分裂事件， 即受精的卵母細(xì)胞分裂的一個(gè)子細(xì)胞(“前導(dǎo)子細(xì)胞”或子代A)分裂為第一組兩個(gè)第三代。
[0096]“第三次胞質(zhì)分裂”或“胞質(zhì)分裂3”意指在胚胎中觀察到的第三次細(xì)胞分裂事件， 即受精的卵母細(xì)胞分裂的另一個(gè)子細(xì)胞(“延遲子細(xì)胞”或子代B)分裂為第二組兩個(gè)第三 代。
[0097]術(shù)語(yǔ)“基信標(biāo)記(fiduciary marker) ”或“基準(zhǔn)標(biāo)記”在成像系統(tǒng)的視野領(lǐng)域中使 用的物品，其出現(xiàn)在所產(chǎn)生的圖像中，被用作參考的點(diǎn)或度量。其可以是被放置在成像對(duì)象 中或之上的某物或在光學(xué)儀器的十字線中的一個(gè)或一組標(biāo)記物。
[0098]術(shù)語(yǔ)“微孔”是指細(xì)胞水平大小的容器，優(yōu)選地提供用于接納單個(gè)真核細(xì)胞。
[0099]“非整倍性”意指特征在于異常的染色體數(shù)量的染色體異常類型。非整倍體胚胎可 具有一個(gè)或多個(gè)缺失染色體和/或一個(gè)或多個(gè)額外染色體。非整倍性可以是“有絲分裂錯(cuò) 誤”或“減數(shù)分裂錯(cuò)誤”的結(jié)果?！胺钦扼w胚胎”是含有非整倍性的胚胎。術(shù)語(yǔ)“整倍體” 和“異常”或“異常染色體計(jì)數(shù)”在本文可互換使用。[0100]“整倍體”意指特征為在染色體方面正常的胚胎。整倍體或正常胚胎具有適當(dāng)數(shù)量 的染色體對(duì)。整倍體人類胚胎例如具有23對(duì)染色體，共計(jì)46個(gè)染色體。術(shù)語(yǔ)“整倍體”和 “正?！被颉罢Ｈ旧w計(jì)數(shù)”在本文可互換使用。
[0101]“有絲分裂錯(cuò)誤”意指由有絲分裂期間染色體分離的錯(cuò)誤引起的非整倍性類型。
[0102]“減數(shù)分裂錯(cuò)誤”意指由減數(shù)分裂期間染色體分離的錯(cuò)誤引起的非整倍性類型。
[0103]“三體性”意指其中含有特定染色體的三個(gè)拷貝而不是兩個(gè)拷貝的非整倍性類型。 “三體性胚胎”是其中染色體計(jì)數(shù)異常并且含有一個(gè)或多個(gè)染色體的三個(gè)拷貝而不是兩個(gè) 拷貝的胚胎。
[0104]“單體性”意指其中含有特定染色體的一個(gè)拷貝而不是兩個(gè)拷貝的非整倍性類型。 “單體性胚胎”是其中染色體計(jì)數(shù)異常并且含有一個(gè)或多個(gè)染色體的一個(gè)拷貝而不是兩個(gè) 拷貝的胚胎。
[0105]“正常染色體計(jì)數(shù)”意指人類的23個(gè)染色體中的每一個(gè)的兩個(gè)拷貝。
[0106]“鑲嵌”或“鑲嵌性”意指具有不同染色體含量的細(xì)胞群體?！拌偳杜咛ァ笔呛芯?有不同染色體含量的細(xì)胞群體的胚胎。
[0107]“低鑲嵌”意指具有不同染色體含量的細(xì)胞群體，其中由有絲分裂錯(cuò)誤產(chǎn)生的四個(gè) 或更少的染色體受影響。
[0108]“高鑲嵌”意指具有不同染色體含量的細(xì)胞群體，其中由有絲分裂錯(cuò)誤產(chǎn)生的超過(guò) 四個(gè)的染色體受影響。
[0109]“高碎裂水平”意指按體積計(jì)超過(guò)約25%的胞質(zhì)碎裂。
[0110]“低碎裂水平”意指按體積計(jì)約25%或更少的胞質(zhì)碎裂。
[0111]“碎裂”意指可能或不可能含有核DNA的膜結(jié)合胞質(zhì)的部分。
[0112]感興趣的多潛能細(xì)胞和胚胎
[0113]在本發(fā)明的方法中，通過(guò)測(cè)量一個(gè)或多個(gè)胚胎或多潛能細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參 數(shù)并將這些測(cè)量用于確定所述胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力、非整倍性和/或染色體含量 來(lái)評(píng)價(jià)所述胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力、非整倍性和/或染色體含量。由此產(chǎn)生的信息 可被用于指導(dǎo)臨床決策，例如是否轉(zhuǎn)移受精的胚胎，是否植入培養(yǎng)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。
[0114]可通過(guò)本發(fā)明的方法測(cè)定的胚胎的實(shí)例包括I細(xì)胞胚胎(也稱為合子)、2細(xì)胞胚 胎、3細(xì)胞胚胎、4細(xì)胞胚胎、5細(xì)胞胚胎、6細(xì)胞胚胎、8細(xì)胞胚胎等等，通常高達(dá)16細(xì)胞胚胎 并且包括16細(xì)胞胚胎，其中的任一種可通過(guò)任何方便的方式從例如已經(jīng)體內(nèi)成熟的卵母 細(xì)胞或已經(jīng)體外成熟的卵母細(xì)胞產(chǎn)生。
[0115]可通過(guò)本發(fā)明的方法測(cè)定的多潛能細(xì)胞的實(shí)例包括全能干細(xì)胞例如卵母細(xì)胞諸 如初級(jí)卵母細(xì)胞和次級(jí)卵母細(xì)胞；多潛能干細(xì)胞例如ES細(xì)胞、EG細(xì)胞、iPS細(xì)胞和類似細(xì) 胞；多潛能細(xì)胞，例如間質(zhì)干細(xì)胞和組織特異性干細(xì)胞。它們可以來(lái)自生命的任何階段，例 如胚胎的、新生期的、少年的、成年的和任何性別，即XX或XY。
[0116]胚胎和多潛能細(xì)胞可來(lái)源于任何生物體，例如任何哺乳細(xì)胞種類例如人類、靈長(zhǎng) 類動(dòng)物、馬科動(dòng)物、?？苿?dòng)物、豬科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物等。優(yōu)選地，它們來(lái)源于人類。 它們可以是之前被冷凍的，例如，I細(xì)胞階段的冷凍保存并且之后解凍的胚胎或冷凍并解 凍的卵母細(xì)胞和干細(xì)胞?？蛇x擇地，它們可以是新鮮制備的，例如，通過(guò)體外受精技術(shù)或胞 漿內(nèi)精子注射從卵母細(xì)胞新鮮制備的胚胎；通過(guò)體外成熟技術(shù)新鮮采集和/或新鮮成熟或者來(lái)源于體外分化為生殖細(xì)胞并且成熟為卵母細(xì)胞的多潛能干細(xì)胞的卵母細(xì)胞；通過(guò)本 領(lǐng)域已知的方法從組織的解離和培養(yǎng)新鮮制備的干細(xì)胞以及類似細(xì)胞。它們可在本領(lǐng)域 中已知的任何適合的條件下培養(yǎng)以促進(jìn)有待被測(cè)定的樣品的存活、生長(zhǎng)和/或發(fā)育，例如 對(duì)于胚胎，在例如體外受精領(lǐng)域或胞漿內(nèi)精子注射中所用的那些的條件下；參見(jiàn)例如美國(guó) 專利第6，610，543號(hào)、美國(guó)專利第6，130，086號(hào)、美國(guó)專利第5，837，543號(hào)，其公開(kāi)內(nèi)容通 過(guò)引用并入本文；對(duì)于卵母細(xì)胞，在例如本領(lǐng)域中所用的以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的那些的條 件下；參見(jiàn)例如美國(guó)專利第5，882，928號(hào)和美國(guó)專利第6，281,013號(hào)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引 用并入本文；對(duì)于干細(xì)胞，在例如本領(lǐng)域中所用的以促進(jìn)增殖的那些的條件下；參見(jiàn)例如 美國(guó)專利第6，777，233號(hào)、美國(guó)專利第7037892號(hào)、美國(guó)專利第7，029，913號(hào)、美國(guó)專利第 5，843，780號(hào)和美國(guó)專利第6，200, 806號(hào)、美國(guó)專利申請(qǐng)第2009/0047263號(hào)、美國(guó)專利申請(qǐng) 第2009/0068742號(hào)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。通常，胚胎/多潛能細(xì)胞在配合所測(cè) 定的特定胚胎/多潛能細(xì)胞的需要已經(jīng)補(bǔ)充了血清或血清物質(zhì)、氨基酸和生長(zhǎng)因子的商業(yè) 上可得的培養(yǎng)基例如KnockOut DMEM、DMEM-F12或Iscoves改良杜爾貝可培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0117]延時(shí)成像分析
[0118]在一些實(shí)施方案中，胚胎/多潛能細(xì)胞通過(guò)經(jīng)由延時(shí)成像測(cè)量細(xì)胞參數(shù)來(lái)測(cè)定。 胚胎/多潛能細(xì)胞可在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)?？蛇x擇地胚胎/多潛能細(xì)胞可在定制培養(yǎng)皿例 如具有如本文描述的光學(xué)品質(zhì)的微孔的定制培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。在這些定制培養(yǎng)皿中，每個(gè)微 孔裝有一個(gè)單個(gè)的胚胎/多潛能細(xì)胞并且每個(gè)微孔的底部表面具有光學(xué)品質(zhì)光潔度以致 單個(gè)皿中的整組胚胎可通過(guò)具有足夠分辨率的單個(gè)小型顯微鏡同時(shí)成像以跟隨細(xì)胞有絲 分裂過(guò)程。整組的微孔共享培養(yǎng)皿中同一個(gè)培養(yǎng)基滴頭(drop)并且還可包括放置在微孔 周圍的用于穩(wěn)定培養(yǎng)基滴頭的外部孔以及鄰近微孔放置的基準(zhǔn)標(biāo)記物。可用等離子刻蝕或 另一種處理調(diào)整表面的疏水性以防止用培養(yǎng)基充滿時(shí)微孔中形成氣泡。無(wú)論使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng) 皿還是定制培養(yǎng)皿，培養(yǎng)期間，可在同一培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個(gè)或多個(gè)發(fā)育的胚胎，例如每皿可 培養(yǎng)I個(gè)至25個(gè)之間的胚胎。
[0119]隨時(shí)間獲取圖像并且之后分析圖像以獲得一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)的測(cè)量?？捎醚b配 用于數(shù)字圖像存儲(chǔ)和分析的任何計(jì)算機(jī)控制的顯微鏡例如裝配加熱臺(tái)和培養(yǎng)箱的倒置顯 微鏡或適于常規(guī)孵育器內(nèi)部的定制微型顯微鏡陣列進(jìn)行延時(shí)成像。微型顯微鏡的陣列使得 在同一孵育器中的多個(gè)皿的樣品能夠同時(shí)培養(yǎng)并且大小可調(diào)節(jié)以適應(yīng)多個(gè)通道而對(duì)連續(xù) 圖像捕獲之間的最小時(shí)間間隔沒(méi)有限制。使用多個(gè)顯微鏡消除了移動(dòng)樣品的需要，其增加 了系統(tǒng)準(zhǔn)確度和整個(gè)系統(tǒng)的可靠性。孵育器中的單個(gè)顯微鏡可以是部分或全部分離的，為 每個(gè)培養(yǎng)皿提供自身的控制的環(huán)境。這允許皿被轉(zhuǎn)移至成像位置或從成像位置轉(zhuǎn)移而不影 響其他樣品的環(huán)境。
[0120]用于延時(shí)成像的成像系統(tǒng)可使用亮視野照明、暗視野照明、相位對(duì)比、霍夫曼調(diào)制 相襯(Hoffman modulation contrast)、微差干涉對(duì)比或突光。在一些實(shí)施方案中，暗視野 照明可被用來(lái)為隨后的特征提取和圖像分析提供增強(qiáng)的圖像對(duì)比。此外，紅色或近紅外光 源可被用來(lái)減少光毒性并且提高細(xì)胞膜和細(xì)胞的內(nèi)部部分之間的對(duì)比度。
[0121]所獲取的圖像可在連續(xù)基底上儲(chǔ)存在活動(dòng)視頻中或在間斷基底上(如在延時(shí)照 相術(shù)中)，其中對(duì)象被反復(fù)成像在靜止的照片上。優(yōu)選地，圖像之間的時(shí)間間隔應(yīng)在I至30 分鐘之間以便捕獲如下文所描述的重要的形態(tài)學(xué)事件。在可選擇的實(shí)施方案中，圖像之間的時(shí)間間隔可取決于細(xì)胞活性的量而變化。例如，在活性期間，可以每幾秒或每分鐘這么頻 繁地獲取圖像，而在非活性期間，可以每10或15分鐘或更久地獲取圖像。對(duì)所捕獲的圖像 的實(shí)時(shí)圖像分析可被用于檢測(cè)什么時(shí)候和如何變化時(shí)間間隔。在我們的方法中，樣品接收 的光的總量估計(jì)等于5天成像大約24分鐘的連續(xù)低水平曝光。用于延時(shí)成像系統(tǒng)的光強(qiáng) 度比通常用于輔助生殖顯微鏡的光強(qiáng)度低得多，歸因于LED的低功率(例如使用相比于通 常100W鹵素?zé)襞莸腎W LED)和照相機(jī)傳感器的高敏感度。因此，使用延時(shí)成像系統(tǒng)由胚胎 接收到的光能量的總量能夠與IVF臨床的常規(guī)操作期間接收到的能量的量差不多或更少。 此外，曝光時(shí)間可顯著縮短以減少對(duì)胚胎/多潛能細(xì)胞的曝光的總量。對(duì)于2天的成像，在 每5分鐘以0.5秒曝光/圖像捕獲圖像的情況下，低水平曝光的總量小于5分鐘。
[0122]圖像采集之后，提取并分析圖像的不同的細(xì)胞參數(shù)例如大小，透明帶的厚度、碎裂 的程度，從細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞的對(duì)稱性、前幾次有絲分裂之間的時(shí)間間隔和胞質(zhì)分裂 的持續(xù)時(shí)間。
[0123]可通過(guò)延時(shí)成像測(cè)量的細(xì)胞參數(shù)通常是形態(tài)學(xué)事件。例如，在測(cè)定胚胎時(shí)，延時(shí)成 像可被用于測(cè)量胞質(zhì)分裂事件例如胞質(zhì)分裂1、胞質(zhì)分裂2、胞質(zhì)分裂3、胞質(zhì)分裂4的持續(xù) 時(shí)間，其中胞質(zhì)分裂事件的持續(xù)時(shí)間定義為首次觀察到卵裂溝(胞質(zhì)分裂的起始)和卵裂 溝分離為兩個(gè)子細(xì)胞(即兩個(gè)子細(xì)胞的產(chǎn)生)之間的時(shí)間間隔。感興趣的另一個(gè)參數(shù)是細(xì) 胞周期事件例如細(xì)胞周期1、細(xì)胞周期2、細(xì)胞周期3或細(xì)胞周期4的持續(xù)時(shí)間，其中細(xì)胞周 期事件的持續(xù)時(shí)間被定義為一個(gè)細(xì)胞(對(duì)于細(xì)胞周期I來(lái)說(shuō)，卵子的受精；對(duì)于之后的細(xì)胞 周期來(lái)說(shuō)，在胞質(zhì)分裂結(jié)束時(shí))的產(chǎn)生和來(lái)自這一細(xì)胞的兩個(gè)子細(xì)胞的產(chǎn)生之間的時(shí)間間 隔?？赏ㄟ^(guò)延時(shí)成像測(cè)量的感興趣的其他細(xì)胞參數(shù)包括由這些細(xì)胞事件定義的時(shí)間間隔， 例如(a)胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔，可定義為胞質(zhì)分裂I的起始和胞質(zhì)分 裂2的起始之間的間隔、胞質(zhì)分裂I的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的結(jié)束之間的間隔、胞質(zhì)分裂I的 起始和胞質(zhì)分裂2的結(jié)束之間的間隔或胞質(zhì)分裂I的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的起始之間的間隔 的任一個(gè)；或者(b)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔，可定義為胞質(zhì)分裂2的起始 和胞質(zhì)分裂3的起始之間的間隔、或胞質(zhì)分裂2的結(jié)束和胞質(zhì)分裂3的結(jié)束之間的間隔、或 胞質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的結(jié)束之間的間隔或胞質(zhì)分裂2的結(jié)束和胞質(zhì)分裂3的起 始之間的間隔的任一個(gè)。
[0124]為了體外受精和胞漿內(nèi)精子注射的目的，被認(rèn)為是有利的發(fā)育中早期例如第2 天或第3天即直到8細(xì)胞階段將胚胎轉(zhuǎn)移至子宮以減少胚胎損失(歸因于培養(yǎng)條件相 對(duì)于體外環(huán)境的缺點(diǎn))并減少與可在培養(yǎng)期間發(fā)生的后生錯(cuò)誤有關(guān)的可能的不良后果 (Katari 等人(2009) Hum Mol Genet.18 (20): 3769-78 ;Sepiilveda 等人(2009) Fertil Steril.91 (5):1765-70)。因此，優(yōu)選的是，盡管分析的時(shí)間較長(zhǎng)，例如約36小時(shí)、約54小 時(shí)、約60小時(shí)、約72小時(shí)、約84小時(shí)、約96小時(shí)或更長(zhǎng)，本方法同樣預(yù)期在受精的2天中 發(fā)生的細(xì)胞參數(shù)的測(cè)量。
[0125]可通過(guò)延時(shí)成像測(cè)定的正在成熟的卵母細(xì)胞的細(xì)胞參數(shù)的實(shí)例包括但不限于卵 母細(xì)胞細(xì)胞膜的形態(tài)學(xué)上的變化，例如從透明帶分離的速度和程度；卵母細(xì)胞細(xì)胞核的形 態(tài)學(xué)上的變化，例如胚泡破裂(GVBD)的起始、完成和速度；細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中顆粒的運(yùn)動(dòng) 速度和方向；卵母細(xì)胞和第一極體的胞質(zhì)分裂以及第一極體的排出的運(yùn)動(dòng)和/或持續(xù)時(shí) 間。其他的參數(shù)包括成熟次級(jí)卵母細(xì)胞和第二極體的胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間。[0126]可通過(guò)延時(shí)成像測(cè)定的干細(xì)胞或干細(xì)胞群中的細(xì)胞參數(shù)的實(shí)例包括但不限于胞質(zhì)分裂事件的持續(xù)時(shí)間，胞質(zhì)分裂事件之間的時(shí)間，胞質(zhì)分裂事件之前和過(guò)程中干細(xì)胞的大小和形狀、由胞質(zhì)分裂事件產(chǎn)生的子細(xì)胞的數(shù)目、卵裂溝的空間定向、所觀察到的非對(duì)稱分裂的速度和/或數(shù)目(即其中一個(gè)子細(xì)胞保持干細(xì)胞而其他的分化)、所觀察到的對(duì)稱分裂的速度和/或數(shù)目(即其中兩個(gè)子細(xì)胞都保持干細(xì)胞或都分化)以及胞質(zhì)分裂事件的結(jié)束和當(dāng)干細(xì)胞開(kāi)始分化之間的時(shí)間間隔。
[0127]參數(shù)可手動(dòng)測(cè)量或者它們可被自動(dòng)測(cè)量，例如通過(guò)圖像分析軟件。當(dāng)使用圖像分析軟件時(shí)，可以使用利用以序貫蒙特卡羅方法為基礎(chǔ)的隨機(jī)模型估算技術(shù)的圖像分析算法，例如產(chǎn)生假定的胚胎/多潛能細(xì)胞模型的分布，以簡(jiǎn)單的光學(xué)模型為基礎(chǔ)模擬圖像并將這些模擬與觀察到的圖像數(shù)據(jù)比較。當(dāng)使用這樣的隨機(jī)模型估算時(shí)，細(xì)胞可以被建模為任何適合的形狀，例如2D空間中的橢圓的集合，3D空間中的橢圓體的集合以及類似形狀。 為了處理遮擋和深度不確定性，方法可實(shí)行相應(yīng)于所期望的實(shí)體行為的幾何約束。為了提高魯棒性，可在一個(gè)或多個(gè)焦平面上捕獲圖像。
[0128]基因表汰分析
[0129]在一些實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)量基因表達(dá)測(cè)定胚胎或多潛能細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，細(xì)胞參數(shù)是基因表達(dá)水平或基因表達(dá)譜。測(cè)定一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)，即獲得表達(dá)譜或表達(dá)評(píng)估，可通過(guò)測(cè)量感興趣的一個(gè)或多個(gè)基因的核酸轉(zhuǎn)錄物Hf^nmRNA)例如核酸表達(dá)譜進(jìn)行；或通過(guò)測(cè)量為感興趣的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)不同蛋白/多肽的水平即蛋白組表達(dá)譜來(lái)進(jìn)行。換句話說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)譜”和“表達(dá)評(píng)估”被寬泛使用以包括RNA水平或蛋白水平的基因表達(dá)譜。
[0130]在一些實(shí)施方案中，基因的表達(dá)可通過(guò)獲得核酸表達(dá)譜來(lái)估計(jì)，其中確定樣品中的一種或多種核酸的量或水平，例如感興趣的一種或多種基因的核酸轉(zhuǎn)錄物。在這些實(shí)施方案中，被測(cè)定以產(chǎn)生表達(dá)譜的樣品是核酸樣品。核酸樣品包括多個(gè)或一群不同核酸，其包括正被評(píng)估的胚胎或細(xì)胞的感興趣的基因的表達(dá)信息。核酸可包括RNA或DNA核酸，例如 mRNA.cRNA.cDNA等，只要樣品保留其所獲得自的宿主細(xì)胞或組織的表達(dá)信息。樣品可以許多不同方式制備，如本領(lǐng)域中已知的，例如通過(guò)從細(xì)胞分離mRNA，其中所分離的mRNA如在差異表達(dá)領(lǐng)域中已知的被用來(lái)擴(kuò)增、使用以制備cDNA、cRNA等。使用標(biāo)準(zhǔn)程序，樣品可從單個(gè)細(xì)胞制備，例如感興趣的多潛能細(xì)胞的培養(yǎng)基的多潛能細(xì)胞或來(lái)自感興趣的胚胎的單個(gè)細(xì)胞(卵裂球)；或來(lái)自幾個(gè)細(xì)胞，例如多潛能細(xì)胞的培養(yǎng)基的一部分或感興趣的胚胎的2、
3、或4或者更多個(gè)卵裂球。
[0131]表達(dá)譜可使用任何常規(guī)程序從初始核酸樣品產(chǎn)生。當(dāng)產(chǎn)生表達(dá)譜的多種不同方式是已知的，例如在差異基因表達(dá)分析的領(lǐng)域中使用的那些時(shí)，用于產(chǎn)生表達(dá)譜的一個(gè)代表性且適宜性類型的程序是以陣列基礎(chǔ)的基因表達(dá)譜產(chǎn)生程序。這些應(yīng)用是雜交測(cè)定，其中使用在有待被產(chǎn)生的譜中展示用于有待被測(cè)定或進(jìn)行譜分析的基因中的每一種的“探針” 核酸的核酸。在這些測(cè)定中，首先從正在測(cè)定的初始核酸樣品制備靶核酸的一個(gè)樣品，其中，制備可包括用標(biāo)記物例如信號(hào)表達(dá)系統(tǒng)的一員來(lái)標(biāo)記靶核酸。靶核酸樣品制備之后，將樣品在雜交條件下與陣列接觸，由此在與連接至陣列表面的探針序列互補(bǔ)的靶核酸之間形成復(fù)合物。之后定性或者定量地檢測(cè)雜交復(fù)合物的存在。
[0132]可實(shí)行以產(chǎn)生在主題方法中使用的表達(dá)譜的特異雜交技術(shù)包括描述于美國(guó)專利第 5，143，854 ；5, 288，644 ；5, 324，633 ；5, 432，049 ；5, 470，710 ；5, 492，806 ；5, 503，980 ； 5，510，270 ；5, 525，464 ；5, 547，839 ；5, 580，732 ；5, 661，028 ；5, 800，992 號(hào)，其公開(kāi)內(nèi)容通 過(guò)引用并入本文;以及 W095/21265 ；W096/31622 ；W097/10365 ；W097/27317 ；EP373 203 和 EP785 280中的技術(shù)。在這些方法中，如上文描述的將包括用于其表達(dá)正被測(cè)定的表型決定 基因中的每一種的探針的“探針”核酸的陣列與靶核酸接觸。在雜交條件例如嚴(yán)格雜交條 件下進(jìn)行接觸，并且之后除去未結(jié)合的核酸。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格測(cè)定條件”是指適 于產(chǎn)生具有足夠互補(bǔ)性以在測(cè)定中提供所期望的特異性水平的核酸例如表面結(jié)合的和溶 液相核酸的結(jié)合對(duì)而較不適于形成具有不足以提供所期望的特異性的互補(bǔ)性的結(jié)合成員 之間的結(jié)合對(duì)的條件。嚴(yán)格互補(bǔ)條件是雜交和清洗條件的總和或組合(全體)。
[0133]所得到的雜交的核酸的模式提供關(guān)于已經(jīng)被探針探測(cè)的基因中的每一種的表達(dá) 信息，其中表達(dá)信息是以基因是否表達(dá)以及典型地什么水平表達(dá)的方式，其中表達(dá)信息，即 表達(dá)譜(例如以轉(zhuǎn)錄組(transcriptosome)形式)，都可以是定性和定量的。
[0134]可選擇地，可使用用于將樣品中的一個(gè)或多個(gè)核酸的水平定量的非陣列基礎(chǔ)的方 法，包括以擴(kuò)增程序?yàn)榛A(chǔ)的那些例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)基礎(chǔ)的測(cè)定，包括定量PCR、 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實(shí)時(shí)PCR等。
[0135]在一些實(shí)施方案中，基因的表達(dá)可通過(guò)獲得蛋白組表達(dá)譜來(lái)評(píng)估，其中確定樣品 中的一種或多種蛋白/多肽的量或水平，例如由感興趣的基因編碼的蛋白/多肽。在這些實(shí) 施方案中，被測(cè)定以產(chǎn)生所述方法中使用的表達(dá)譜的樣品是蛋白樣品。當(dāng)表達(dá)譜是蛋白組 表達(dá)譜，即樣品中一種或多種蛋白水平的譜時(shí)，可使用用于評(píng)估蛋白水平的任何常規(guī)程序， 其中確定所測(cè)定的樣品中的一種或多種蛋白的水平。
[0136]盡管用于蛋白水平的多種不同方式的測(cè)定是本領(lǐng)域中已知的，但用于測(cè)定蛋白水 平的一種代表性且適宜性類型的方案是ELISA。在ELISA和以ELISA基礎(chǔ)的測(cè)定中，對(duì)于 感興趣的蛋白來(lái)說(shuō)特異性的一種或多種抗體可被固定在所選擇的固體表面上，優(yōu)選地展示 蛋白親和性的表面例如聚苯乙烯微量滴定板的孔。清洗以除去不完全吸附的材料之后，將 測(cè)定板孔用對(duì)于測(cè)試樣品例如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液來(lái)說(shuō)已知抗原中性 的非特異性“封閉”蛋白包被。這允許封閉固定表面上的非特異性吸附位點(diǎn)，由此減少由所 述表面上抗原的非特異性結(jié)合導(dǎo)致的背景。清洗以除去未結(jié)合封閉的封閉蛋白之后，將固 定的表面與有待被測(cè)試的樣品在有助于免疫復(fù)合物(抗原/抗體)形成的條件下接觸。這 些條件包括同樣有助于幫助減少非特異性背景的用稀釋液例如溶于鹽酸緩沖鹽水(PBS)/ 吐溫或PBS/Triton-XlOO中的BSA或牛血清丙種球蛋白(BGG)稀釋樣品和允許樣品在約 250C _27°C的溫度(盡管也可使用其他溫度)孵育約2-4小時(shí)。孵育后，清洗抗血清接觸 的表面以便除去非免疫復(fù)合的材料。示例性的清洗程序包括用溶液例如PBS/吐溫、PBS/ Triton-XlOO或硼酸鹽緩沖液清洗。免疫復(fù)合物形成的出現(xiàn)和量然后可通過(guò)使結(jié)合的免疫 復(fù)合物經(jīng)歷對(duì)與第一抗體不同的靶具有特異性的第二抗體并且檢測(cè)第二抗體的結(jié)合來(lái)確 定。在某些實(shí)施方案中，第二抗體具有所結(jié)合的酶，例如尿素酶、過(guò)氧化物酶或堿性磷酸化 酶，其將在與適當(dāng)?shù)娘@色底物孵育時(shí)產(chǎn)生有色沉淀。例如，可使用尿素酶或過(guò)氧化物酶軛合 的抗人類IgG —段時(shí)間并且在有利于免疫復(fù)合物形成的發(fā)展的條件下(例如在含有PBS的 溶液例如PBS/吐溫中于室溫孵育2小時(shí))。這樣用第二抗體孵育并且清洗以除去未結(jié)合的 材料之后，將標(biāo)記的量定量，例如通過(guò)在尿素酶標(biāo)記的實(shí)例中用顯色底物例如尿素和溴甲酚紫或在過(guò)氧化物酶標(biāo)記物的實(shí)例中用2，2’ -聯(lián)氮-雙-(3-乙基-苯并噻唑啉)-6-磺 酸(ABTS)和H2O2孵育。然后通過(guò)測(cè)量顏色生成的程度例如使用可見(jiàn)光譜分光光度計(jì)獲得定量。
[0137]之前的格式可通過(guò)首先將樣品與測(cè)定板結(jié)合來(lái)改變。之后將初級(jí)抗體與測(cè)定板孵 育，之后使用對(duì)初級(jí)抗體具有特異性的標(biāo)記的次級(jí)抗體檢測(cè)結(jié)合的初級(jí)抗體。
[0138]一種或多種抗體固定于其上的固體基質(zhì)可由許多種材料制成并且為許多種形狀 例如微量滴定板、微珠、測(cè)驗(yàn)片、樹(shù)脂顆粒等?？梢赃x擇基質(zhì)以最大化信噪比，從而最小化背 景結(jié)合以及便于分離和包被?？梢赃m合所使用的基質(zhì)的方式實(shí)施清洗，例如通過(guò)將微珠或 測(cè)驗(yàn)片從儲(chǔ)器除去，將儲(chǔ)器例如微量滴定板孔清空或稀釋或者用清洗溶液或溶劑漂洗珠、 顆粒、層析柱或?yàn)V器。
[0139]可選擇地，可使用用于測(cè)量樣品中一種或多種蛋白的水平的以非ELISA基礎(chǔ)的方 法。代表性的實(shí)例包括但不限于質(zhì)譜、蛋白組陣列、xMAP?微球技術(shù)、流式細(xì)胞計(jì)、蛋白質(zhì)印 跡和免疫組織化學(xué)。
[0140]所得到的結(jié)果提供了與已經(jīng)被探針探測(cè)的基因中的每一種的表達(dá)有關(guān)的信息，其 中表達(dá)信息以基因是否表達(dá)以及通常以什么水平表達(dá)的方式并且其中表達(dá)數(shù)據(jù)可以是定 性并且定量的。
[0141]在產(chǎn)生表達(dá)譜時(shí)，在一些實(shí)施方案中，測(cè)定樣品以產(chǎn)生包括至少一個(gè)基因/蛋白、 有時(shí)多個(gè)基因/蛋白的表達(dá)數(shù)據(jù)的表達(dá)譜，其中復(fù)數(shù)意指至少兩種不同的基因/蛋白以及 經(jīng)常至少約3種，通常至少約10種或更多，常常至少約15種不同的基因/蛋白或更多，例 如50種或更多或者100種或更多等。
[0142]在最廣泛的意義上，表達(dá)評(píng)估可以是定性或者定量的。像這樣，當(dāng)檢測(cè)是定性的 時(shí)，所述方法提供讀數(shù)或評(píng)價(jià)，例如評(píng)估靶分析物例如核酸或表達(dá)產(chǎn)物是否存在于被測(cè)定 的樣品中。在又其他的實(shí)施方案中，所述方法提供了靶分析物是否存在于被評(píng)估的樣品中 的定量檢測(cè)，即估計(jì)或評(píng)估靶分析物例如被測(cè)定的樣品中的核酸或蛋白的真實(shí)量或相對(duì)豐 度。在這些實(shí)施方案中，定量檢測(cè)可以是絕對(duì)的或如果所述方法是檢測(cè)樣品中的兩種或更 多種不同分析物例如核酸或蛋白的方法時(shí)是相對(duì)的。像這樣，術(shù)語(yǔ)“定量”用于定量樣品中 的靶分析物例如一種或多種核酸或蛋白的上下文時(shí)，可指絕對(duì)或相對(duì)定量。絕對(duì)定量可通 過(guò)包含已知濃度的一種或多種對(duì)照分析物并且用已知的對(duì)照分析物(例如通過(guò)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn) 曲線)參照即標(biāo)準(zhǔn)化靶分析物的檢測(cè)水平來(lái)完成。可選擇地，可通過(guò)將兩種或更多種不同 的靶分析物之間的檢測(cè)水平或量比較以提供兩種或更多種不同分析物中的每一種的相對(duì) 定量例如相對(duì)于彼此來(lái)完成相對(duì)定量。
[0143]表達(dá)水平預(yù)測(cè)合子發(fā)育潛力的基因的實(shí)例包括Cofi 11 in (NM_005507)， DIAPHl(NM_001079812、NM_005219)，ECT2(匪_018098)，MYLC2/MYL5(NM_002477)， DGCR8(NM_022720)，Dicer/DICERl (NM_030621、NM_177438)，TARBP2 (NM_004178、 NM_134323、NM_134324)，CPEBl(NM_001079533,NM_001079534、NM_001079535、NM_030594)， 偶對(duì)蛋白(Symplekin)/SYMPK(NM_004819)， YBX2(NM_015982)， ZARl(NM_175619)， CTNNBl (NM_001098209、NM_001098210、NM_001098210、NM_001904)，DNMT3B (NM_006892、 NM_175848、NM_175849、NM_175850)，TERT (NM_198253、NM_198255)，YYl (NM_003403)， IFGR2/IFNGR2 (NM_005534)，BTF3 (NM_001037637、NM_001207)，和 NELF (NM_001130969、NM_001130970、NM_001130971，NM_015537)。表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛力的細(xì)胞參數(shù) 的其他基因提供于圖8中。獲得基因表達(dá)水平測(cè)量時(shí)，基因水平常常被評(píng)估并且之后對(duì)標(biāo) 準(zhǔn)對(duì)照例如已知在整個(gè)發(fā)育中恒定的基因例如GAPDH或RPLPO或者在這一時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)已 知的基因的樣品中的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
[0144]基因表達(dá)水平可從單個(gè)細(xì)胞、例如來(lái)自感興趣的胚胎的分裂球或分離的卵母細(xì)胞 或來(lái)自干細(xì)胞的培養(yǎng)基的分離的細(xì)胞等確定，或者它們可以從胚胎例如感興趣的胚胎的2、 3或4或更多個(gè)卵裂球直到并且包括感興趣的全胚胎、或者來(lái)自干細(xì)胞的培養(yǎng)基的多個(gè)細(xì) 胞直到并且包括干細(xì)胞的整個(gè)培養(yǎng)基等確定。
[0145]在其他的方面，本發(fā)明包括用于在單個(gè)細(xì)胞上進(jìn)行同時(shí)的基因分型和基因表達(dá)分 析的程序。對(duì)于胚胎，這可用于改善著床前胚胎遺傳學(xué)診斷(PGD)，一種將單個(gè)細(xì)胞從胚胎 除去并且檢測(cè)其DNA的染色體組型缺陷或者特定疾病基因的存在的程序。我們的方法允許 同時(shí)的遺傳和基因表達(dá)分析。所述方法包括下列步驟:(I)將單個(gè)細(xì)胞收集到小體積的培 養(yǎng)基或緩沖液中，(2)使用基因分型和基因表達(dá)分析引物的混合物進(jìn)行一步逆轉(zhuǎn)錄和聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，(3)小于18個(gè)循環(huán)的PCR之后收集等份的擴(kuò)增的cDNA以維持?jǐn)U 增的線性，(4)使用cDNA等份用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如定量實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行基因表達(dá)分析，(5)使用剩 余的樣品進(jìn)行第二輪PCR以為了基因分型的目的進(jìn)一步擴(kuò)增遺傳信息和(6)使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù) 例如凝膠電泳進(jìn)行基因分型。
[0146]檢測(cè)非整倍性的方法
[0147]在一些實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)胚胎或多潛能細(xì)胞的染色體含量。在一個(gè)實(shí)施方案中，提 供了用于檢測(cè)胚胎中的非整倍性的方法。在一些實(shí)施方案中，所述胚胎是人類胚胎。在一 些實(shí)施方案中，通過(guò)測(cè)量一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以獲得細(xì)胞測(cè)量結(jié)果以及使用測(cè)量結(jié)果以確 定胚胎是否為非整倍體，從而測(cè)定胚胎的非整倍性。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，證實(shí)為非 整倍體的胚胎為歸因于有絲分裂錯(cuò)誤的非整倍體并且在其它實(shí)施方案中，證實(shí)為非整倍體 的胚胎為歸因于減數(shù)分裂錯(cuò)誤的非整倍體。因此，本文提供的是用于從正常至最嚴(yán)重類型 的非整倍體分級(jí)胚胎的方法。更特別地，提供了用于基于細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果將胚胎分級(jí)為 含有正常染色體含量、歸因于有絲分裂錯(cuò)誤的非整倍體、或歸因于減數(shù)分裂錯(cuò)誤的非整倍 體的方法。
[0148]在一些實(shí)施方案中，提供了首先確定胚胎到達(dá)胚泡的潛力、然后確定已確定存在 或不存在具有胚泡潛力的胚胎中碎裂的和/或其水平的方法，其中碎裂、特別是高碎裂水 平的存在指示非整倍體胚胎并且碎裂的不存在指示具有正常染色體計(jì)數(shù)的胚胎。低碎裂水 平與具有高碎裂水平的胚胎相比指示較低風(fēng)險(xiǎn)的非整倍性并且與根本沒(méi)有碎裂的胚胎相 比指示較高風(fēng)險(xiǎn)的非整倍性。碎裂水平越低，則胚胎將為非整倍體的可能性越低，并且碎裂 水平越高，則胚胎將為非整倍體的可能性越高。在一個(gè)實(shí)施方案中，高碎裂的特征在于按體 積計(jì)超過(guò)約15%的胞質(zhì)碎裂。在又一實(shí)施方案中，高碎裂的特征在于按體積計(jì)超過(guò)約20% 的胞質(zhì)碎裂。在又一實(shí)施方案中，高碎裂的特征在于按體積計(jì)超過(guò)約25%的胞質(zhì)碎裂。在 又一實(shí)施方案中，高碎裂的特征在于按體積計(jì)超過(guò)約30%的胞質(zhì)碎裂。在另一實(shí)施方案中， 低碎裂的特征在于按體積計(jì)少于約30%的胞質(zhì)碎裂。在另一實(shí)施方案中，低碎裂的特征在 于按體積計(jì)少于約25%的胞質(zhì)碎裂。在再一實(shí)施方案中，低碎裂的特征在于按體積計(jì)少于 約20%的胞質(zhì)碎裂。在再一實(shí)施方案中，低碎裂的特征在于按體積計(jì)少于約15%的胞質(zhì)碎裂
[0149]該方法進(jìn)一步包括通過(guò)首先確定胚胎到達(dá)胚泡的潛力并且然后測(cè)量存在或不存在具有到達(dá)胚泡的潛力的胚胎的碎裂和/或其水平以及選擇展示碎裂不存在或低碎裂水平的胚胎來(lái)選擇具有正常染色體計(jì)數(shù)的胚胎。除了碎裂水平之外，也可評(píng)估胚胎的碎裂動(dòng)力學(xué)來(lái)確定選擇具有正常染色體計(jì)數(shù)的胚胎的可能性。例如，時(shí)間間隔顯微鏡測(cè)量的另外的碎裂標(biāo)準(zhǔn)諸如細(xì)胞碎裂的程度和發(fā)育時(shí)序，或卵裂球不對(duì)稱的包含有助于胚胎評(píng)估?？赏ㄟ^(guò)確定一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)或通過(guò)本領(lǐng)域已知的預(yù)測(cè)胚泡形成的任何其它方法來(lái)測(cè)量到達(dá)胚泡的潛力。在某些方面中，細(xì)胞參數(shù)包括，第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間、胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔、胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔、直到第一細(xì)胞分裂的時(shí)間、胚胎形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)模式、或本領(lǐng)域已知的確定胚胎到達(dá)胚泡的潛力的任何其它方法及其組合。
[0150]在一些實(shí)施方案中，確定為非整倍體的胚胎為三體性胚胎?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明的方法檢測(cè)的示例性三體性的非限制性列表包括三體性21 (唐氏綜合征)、三體性18(愛(ài)德華氏綜合征)、三體性13 (帕陶氏綜合征)；三體性8 (Warkany綜合征2)、三體性9、三體性16和三體性22 (貓眼綜合征)。
[0151]在一些實(shí)施方案中，確定為非整倍體的胚胎為單體性胚胎。可通過(guò)本發(fā)明的方法檢測(cè)的示例性單體性的非限制性列表包括單體性22、單體性4、單體性5、單體性7、單體性
11、單體性17或單體性X (特納綜合征)。
[0152] 從圖像和/或基因表達(dá)分析確定發(fā)育潛力
[0153]一旦已經(jīng)獲得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果，所述測(cè)量就被用來(lái)確定胚胎/多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力。如上文所討論的，術(shù)語(yǔ)“發(fā)育潛力”和“發(fā)育感受性”是指多潛能細(xì)胞或組織生長(zhǎng)或發(fā)育的能力(ability)或能力(capacity)。例如，在卵母細(xì)胞或胚胎的實(shí)例中，發(fā)育潛力可以是卵母細(xì)胞或胚胎生長(zhǎng)或發(fā)育為健康胚泡的能力(ability)或能力(capacity)。作為另一個(gè)實(shí)例，在干細(xì)胞的實(shí)例中，發(fā)育潛力是生長(zhǎng)或發(fā)育為感興趣的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞例如神經(jīng)元、肌肉、B或T細(xì)胞和類似細(xì)胞的能力(ability)或能力(capacity)。在一些實(shí)施方案中，卵母細(xì)胞或胚胎的發(fā)育潛力是所述卵母細(xì)胞或胚胎發(fā)育為健康胚泡；以成功植入子宮；以經(jīng)過(guò)妊娠和/或以活著出生的能力(ability)或能力(capacity)。在一些實(shí)施方案中，多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力是所述多潛能細(xì)胞發(fā)育為感興趣的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞例如神經(jīng)元、肌肉、B或T細(xì)胞和類似細(xì)胞和/或體內(nèi)促進(jìn)感興趣的組織的能力(ability)或能力 (capacity)。
[0154]“良好發(fā)育潛力”或“有利發(fā)育潛力”意指胚胎/多潛能細(xì)胞統(tǒng)計(jì)學(xué)上很可能如所期望的發(fā)育，即其具有如所期望的發(fā)育的55%、60%、70%、80%、90%、95%或更高的概率，例如 100%的概率。換句話說(shuō)，證明曾獲得對(duì)有利發(fā)育潛力的確定的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果的100個(gè)中55個(gè)、100個(gè)中60個(gè)、100個(gè)中70個(gè)、100個(gè)中80個(gè)、100個(gè)中90個(gè)、100個(gè)中95個(gè)或整個(gè)100個(gè)中100個(gè)胚胎或多潛能細(xì)胞事實(shí)上確實(shí)如所期望的繼續(xù)發(fā)育。相反地，“不良發(fā)育潛力”意指胚胎/多潛能細(xì)胞統(tǒng)計(jì)學(xué)上很可能不如所期望的發(fā)育，即其具有如所期望的發(fā)育的50%、40%、30%、20%、10%,5%或更少的概率，例如0%的概率。換句話說(shuō)，證明曾獲得對(duì)不良發(fā)育潛力的確定的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果的100個(gè)中僅50個(gè)、100個(gè)中40個(gè)、100個(gè)中30 個(gè)、100個(gè)中20個(gè)、100個(gè)中10個(gè)、100個(gè)中5個(gè)或更少的胚胎或多潛能細(xì)胞事實(shí)上確實(shí)如所期望的繼續(xù)發(fā)育。如本文所用的，“正常的”或“健康的”胚胎和多潛能細(xì)胞證明有利發(fā)育 潛力而“不正常的”胚胎和多潛能細(xì)胞表現(xiàn)出不良的發(fā)育潛力。
[0155]在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果被直接用于確定胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育 潛力。換句話說(shuō)，測(cè)量本身的絕對(duì)值足以確定發(fā)育潛力。使用延時(shí)成像測(cè)量細(xì)胞單數(shù)的實(shí) 施方案中這樣的實(shí)例包括但不限于下列，其單獨(dú)或組合中的任一種指示人類胚胎中的有利 發(fā)育潛力:(a)持續(xù)約0-30分鐘例如，約6-20分鐘，平均約14.3 + 6.0分鐘的胞質(zhì)分裂I ；
(b)持續(xù)約20-27小時(shí)例如約25-27小時(shí)的細(xì)胞周期I ; (c)約8_15小時(shí)，例如約9_13小 時(shí)，具有約11.1+/-2.1小時(shí)的平均值的胞質(zhì)分裂I的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的開(kāi)始之間的時(shí)間 間隔；(d)約0-5小時(shí)，例如約0-3小時(shí)，具有約1.0+/-1.6小時(shí)的平均時(shí)間的胞質(zhì)分裂2的 起始和胞質(zhì)分裂3的起始之間的時(shí)間間隔，即同步性。單獨(dú)或組合中的任一種指示人類胚 胎中不良發(fā)育潛力的直接的測(cè)量的實(shí)例包括但不限于(a)持續(xù)超過(guò)約30分鐘例如約32、
35、40、45、50、55或60分鐘或更多的胞質(zhì)分裂I ； (b)持續(xù)超過(guò)約27小時(shí)例如28,29或30 或更多小時(shí)的細(xì)胞周期I ;(c)持續(xù)超過(guò)15小時(shí)例如16、17、18、19或20或更多小時(shí)或少于 8小時(shí)例如約7、5、4或3或更少小時(shí)的胞質(zhì)分裂I的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的開(kāi)始之間的時(shí)間 間隔；(d) 6、7、8、9或10或者更多小時(shí)的胞質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的起始之間的時(shí) 間間隔。在一些實(shí)施方案中，在確定胚胎具有有利發(fā)育潛力時(shí)，從其中胚胎正被培養(yǎng)的培養(yǎng) 皿除去胚胎。在一些實(shí)施方案中，將確定具有有利發(fā)育潛力且從其正被培養(yǎng)的培養(yǎng)皿除去 的胚胎轉(zhuǎn)移到雌性動(dòng)物受者。
[0156]在一些實(shí)施方案中，通過(guò)將其與來(lái)自參照或?qū)φ张咛?多潛能細(xì)胞的細(xì)胞參數(shù)測(cè) 量結(jié)果比較并且使用這一比較的結(jié)果以提供對(duì)所述胚胎/多潛能細(xì)胞的發(fā)育潛力的確定 來(lái)使用細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果。術(shù)語(yǔ)“參照”和“對(duì)照”如本文所用的意指被用來(lái)解釋給定胚胎 /多潛能細(xì)胞的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果并且給出對(duì)其發(fā)育潛力的確定的標(biāo)準(zhǔn)化的胚胎或細(xì)胞。 參考或?qū)φ湛梢允且阎哂兴谕谋硇屠缬欣l(fā)育潛力并且因此可以是陽(yáng)性參照或 對(duì)照胚胎/多潛能細(xì)胞的胚胎/多潛能細(xì)胞。可選擇地，所述參照/對(duì)照胚胎/多潛能細(xì) 胞可以是已知不具有所期望的表型并且因此是陰性參照或?qū)φ张咛?多潛能細(xì)胞的胚胎/ 多潛能細(xì)胞。
[0157]在某些實(shí)施方案中，將所獲得的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果與來(lái)自單個(gè)參照/ 對(duì)照胚胎/多潛能細(xì)胞的可比較的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果比較以獲得與評(píng)估的所 述胚胎/細(xì)胞的表型有關(guān)的信息。在又其他的實(shí)施方案中，將所獲得的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參 數(shù)測(cè)量結(jié)果與來(lái)自兩個(gè)或更多個(gè)不同參照/對(duì)照胚胎或多潛能細(xì)胞的可比較的一個(gè)或多 個(gè)細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果比較以獲得與評(píng)估的所述胚胎/細(xì)胞的表型有關(guān)的更深入的信息。例 如，可將從所評(píng)估的所述一個(gè)或多個(gè)胚胎或多潛能細(xì)胞獲得的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果與陽(yáng)性和 陰性胚胎或多潛能細(xì)胞兩者相比較以獲得與所述胚胎/細(xì)胞是否具有感興趣的表型有關(guān) 的確定的信息。
[0158]作為一個(gè)實(shí)例，正常人類胚胎即具有有利發(fā)育潛力的胞質(zhì)分裂I為約0-30分鐘， 更經(jīng)常地約6-20分鐘，平均約14.3 ± 6.0分鐘，即約1、2、3、4或5分鐘，更經(jīng)常地約6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 分鐘，在某些實(shí)例中為 21、22、23、24、25、26、27、 28,29或多達(dá)約30分鐘。當(dāng)與從正常參照胚胎所觀察到的相比所評(píng)估的胚胎中完成胞質(zhì) 分裂I的較長(zhǎng)的時(shí)間段指示不良發(fā)育潛力。作為第二個(gè)實(shí)例，正常人類胚胎中的細(xì)胞周期I即從受精到胞質(zhì)分裂I完成的時(shí)間，通常在約20-27小時(shí)中，更經(jīng)常地在約25-27小時(shí)， 即約15、16、17、18或19小時(shí)，更經(jīng)常地約20、21、22、23或24小時(shí)和更經(jīng)常地約25,26或 27小時(shí)中完成。當(dāng)與從正常參照胚胎所觀察到的相比所評(píng)估的胚胎中較長(zhǎng)的細(xì)胞周期I指 示不良發(fā)育潛力。作為第三個(gè)實(shí)例，正常人類胚胎中胞質(zhì)分裂I的結(jié)束和胞質(zhì)分裂2的開(kāi) 始是約8-15小時(shí)，更常常約9-13小時(shí)，具有約11+/-2.1小時(shí)的平均值，即6、7或8小時(shí)， 更經(jīng)常地約9、10、11、12、13、14或多達(dá)約15小時(shí)。與從正常參照胚胎所觀察到的相比所評(píng) 估的胚胎中較長(zhǎng)或較短的細(xì)胞周期2指示不良發(fā)育潛力。作為第四個(gè)實(shí)例，正常人類胚胎 中胞質(zhì)分裂2的起始和胞質(zhì)分裂3的起始之間的時(shí)間間隔即第二次和第三次有絲分裂的同 步性是通常約0-5小時(shí)，更經(jīng)常地約0、1、2或3小時(shí)，具有約1.0+/-1.6小時(shí)的平均值，與 從正常參照胚胎所觀察到的相比所評(píng)估的胚胎中胞質(zhì)分裂2的完成和胞質(zhì)分裂3之間的較 長(zhǎng)的間隔指示不良發(fā)育潛力。最后，作為當(dāng)使用基因表達(dá)水平作為評(píng)估發(fā)育潛力的參數(shù)時(shí) 可如何應(yīng)用這一實(shí)施方案的實(shí)例，Cofillin, DIAPHU ECT2、MYLC2、DGCR8、Dicer、TARBP2、 CPEB1、偶對(duì)蛋白、YBX2、ZAR1、CTNNB1、DNMT3B、TERT、YY1、IFGR2、BTF3 和 / 或 NELF 的較低 的表達(dá)水平即與從正常參照2細(xì)胞胚胎所觀察到的相比所評(píng)估的2細(xì)胞胚胎中低1.5-倍、 2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、10-倍、20-倍、50-倍或100-倍的表達(dá)指示不良發(fā)育潛力，而等于 或大于從正常參照2細(xì)胞胚胎所觀察到的表達(dá)的表達(dá)指示有利發(fā)育潛力。其他實(shí)例可來(lái)自 于經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)，例如通過(guò)觀察有待被測(cè)定的胚胎/多潛能細(xì)胞旁邊的一個(gè)或多個(gè)參照胚胎或 多潛能細(xì)胞?？墒褂萌魏螀⒄张咛?多潛能細(xì)胞，例如具有有利發(fā)育潛力的正常參照樣品 或具有不良發(fā)育潛力的異常參照樣品。在一些實(shí)例中，可使用不只一個(gè)參照樣品，例如正常 參照樣品和異常參照樣品兩者都可使用。
[0159]在一些實(shí)施方案中，使用通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡或通過(guò)表達(dá)譜分析但不是通過(guò)時(shí)間 間隔顯微鏡和表達(dá)譜分析兩者獲取的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果是可以期望的。在其他的實(shí)施方案 中，使用通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡獲取的細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果以及通過(guò)表達(dá)譜分析獲取的細(xì)胞參 數(shù)測(cè)量結(jié)果是可以期望的。
[0160]如上文所討論的，可測(cè)量并使用一個(gè)或多個(gè)參數(shù)來(lái)確定胚胎或多潛能細(xì)胞的發(fā)育 潛力。在一些實(shí)施方案中，單個(gè)參數(shù)的測(cè)量可能足以獲得對(duì)發(fā)育潛力的確定。在一些實(shí)施 方案中，使用不只一個(gè)參數(shù)例如2個(gè)細(xì)胞參數(shù)、3個(gè)細(xì)胞參數(shù)或4個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞參數(shù)的測(cè) 量是可以期望的。
[0161]在某些實(shí)施方案中，對(duì)于多個(gè)參數(shù)的測(cè)定是可以期望的，因?yàn)閷?duì)多個(gè)參數(shù)的測(cè)定 可提供更高的敏感性和特異性。敏感性意指正確鑒定為陽(yáng)性的實(shí)際上陽(yáng)性的比例。這可被 算術(shù)表示為:
[0162]
敏感性=.....................................................................................................................................................................(.真陽(yáng)性的數(shù)_ +假玥性的數(shù)目)
[0163] 因此，在其中“陽(yáng)性”是具有有利發(fā)育潛力即將發(fā)育為胚泡的胚胎而“陰性”是具 有不良發(fā)育潛力即將不會(huì)發(fā)育為胚泡的胚胎的方法中，100%的敏感性意指測(cè)試識(shí)別像這樣 將發(fā)育為胚泡的所有胚胎。在一些實(shí)施方案中，測(cè)定的敏感性可以是約70%、80%、90%、95%、 98%或更高，例如100%。特異性意指被正確鑒定為陰性的陰性的比例。這可被算術(shù)地描述
【權(quán)利要求】
1.一種用于確定人類胚胎的發(fā)育潛力的方法，其包括測(cè)量以下的至少一種:(a)所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔；且使用所述測(cè)量結(jié)果以確定所述胚胎的發(fā)育潛力，其中所述胚胎的有利發(fā)育潛力由以下指示:(i)為約14.3±6.0min的第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(ii)為約11.1 + 2.1小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(iii)為約1.0± 1.6小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其包括測(cè)量以下的至少兩種:(a)所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間 的時(shí)間間隔。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其包括測(cè)量以下的所有三種:(a)所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和(c)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測(cè)量結(jié)果是通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡測(cè)量的。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括測(cè)量細(xì)胞周期I的持續(xù)時(shí)間。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述人類胚胎的有利發(fā)育潛力由為約20-27小時(shí)的細(xì)胞周期I的持續(xù)時(shí)間指示。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括測(cè)量所述人類胚胎中的一個(gè)或多個(gè)基因的基因表達(dá)水平以獲得基因表達(dá)測(cè)量結(jié)果。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)基因選自由下列組成的組: Cofillin, DIAPHU ECT2、MYLC2/MYL5、DGCR8、Dicer/DICERl、TARBP2、CPEB1、偶對(duì)蛋白 / SYMPK, YBX2、ZARl、CTNNBl、DNMT3B、TERT, YYl、IFGR2/IFNGR2、BTF3 和 NELF。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，還包括將所述人類胚胎的一個(gè)或多個(gè)基因的基因表達(dá)水平與參考胚胎的一個(gè)或多個(gè)基因的基因表達(dá)水平相比較以提供對(duì)所述人類胚胎的發(fā)育潛力的確定。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中相對(duì)于所述參照胚胎，所述胚胎中一個(gè)或多個(gè)選自由下列組成的組的基因的較低表達(dá)水平指示不良發(fā)育潛力:Cofillin、DIAPHU ECT2、 MYLC2/MYL5、DGCR8、Dicer/DICERl、TARBP2、CPEB1、偶對(duì)蛋白 /SYMPK、YBX2、ZARU CTNNBU DNMT3B、TERT, YYl、IFGR2/IFNGR2、BTF3 和 NEF。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間大于約30分鐘且所述胚胎為非整倍體。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔少于約8 小時(shí)且所述胚胎為非整倍體。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔多于約 90分鐘且所述胚胎為非整倍體。
14.一種向雌性動(dòng)物提供具有有利發(fā)育潛力的人類胚胎的方法，其包括:(a)在足以進(jìn)行胚胎發(fā)育的條件下培養(yǎng)一個(gè)或多個(gè)胚胎；(b)測(cè)量所述一個(gè)或多個(gè)胚胎中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以獲得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果；(C)使用所述細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果以提供對(duì)所述一個(gè)或多個(gè)胚胎的發(fā)育潛力的確定，其中所述人類胚胎的有利發(fā)育潛力由以下指示:(i)為約14.3±6.0min的第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(ii)為約11.1 + 2.1小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；或(iii)為約1.0± 1.6小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔；且(d)將顯示有利發(fā)育潛力的所述一個(gè)或多個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移至需要其的雌性動(dòng)物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其包括測(cè)量以下的至少一種:(a)所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，`(a)所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔；
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其包括測(cè)量以下的所有三種:(a)所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和(c)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述胚胎通過(guò)卵母細(xì)胞的體外受精來(lái)產(chǎn)生。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述卵母細(xì)胞體外成熟。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在測(cè)量之前所述人類胚胎被冷凍。
22.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在測(cè)量之前所述人類胚胎未被冷凍。
23.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胚胎通過(guò)胞漿內(nèi)精子注射來(lái)制備。
24.一種檢測(cè)人類胚胎中的非整倍性的方法，其包括:(a)測(cè)量所述人類胚胎的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以獲得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果；(b)使用所述細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果以確定所述人類胚胎是否為非整倍體。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述細(xì)胞參數(shù)通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡來(lái)測(cè)量。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)選自由以下組成的組:(a)所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和(c)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中非整倍性通過(guò)超過(guò)一個(gè)或多個(gè)所測(cè)量細(xì)胞參數(shù)的正常范圍的細(xì)胞測(cè)量結(jié)果來(lái)檢測(cè)，其中所測(cè)量細(xì)胞參數(shù)的正常范圍為:(a)為約0至約30分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)為約8-15小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)為約0-5小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中檢測(cè)非整倍性且一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)包括:(a)多于約30分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)少于約8小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)多于約90分鐘的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所測(cè)量細(xì)胞參數(shù)的正常范圍為:(a)為14.4±4.2min的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)為11.8±0.71小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和(c)為約0.96±0.84小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
30.如權(quán)利要求24所述的方法，還包括確定非整倍性是否由有絲分裂或減數(shù)分裂錯(cuò)誤產(chǎn)生。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中有絲分裂錯(cuò)誤通過(guò)以下來(lái)確定:(a)多于約35分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)少于約7小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)長(zhǎng)于約2小時(shí)的胞質(zhì)分 裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中有絲分裂錯(cuò)誤通過(guò)以下來(lái)確定:(a)為約36.0±66.9分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)為約6.4±6.6小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)為約2.0±3.9小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其中減數(shù)分裂錯(cuò)誤通過(guò)以下來(lái)確定:(a)多于約100分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)少于約4小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)多于約2小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔，
34.如權(quán)利要求31所述的方法，其中減數(shù)分裂錯(cuò)誤通過(guò)以下來(lái)確定:(a)為約117.2±166.5分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間(b)為約4.0±5.2小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)為約2.0±4.3小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
35.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述檢測(cè)的非整倍性為單體性。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述單體性是單體性22。
37.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述檢測(cè)的非整倍體是三體性。
38.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述三體性是三體性21。
39.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述人類胚胎通過(guò)卵母細(xì)胞的體外受精來(lái)產(chǎn)生。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述卵母細(xì)胞體外成熟。
41.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟。
42.如權(quán)利要求24所述的方法，其中在測(cè)量之前所述人類胚胎被冷凍。
43.如權(quán)利要求24所述的方法，其中在測(cè)量之前所述人類胚胎未被冷凍。
44.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述人類胚胎通過(guò)胞漿內(nèi)精子注射來(lái)制備。
45.一種用于選擇具有正常染色體計(jì)數(shù)的胚胎的方法，其包括:(a)測(cè)量所述人類胚胎的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以獲得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果；(b)使用所述細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果以確定所述人類胚胎是否具有正常染色體計(jì)數(shù)。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述細(xì)胞參數(shù)通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡來(lái)測(cè)量。
47.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)選自由以下組成的組:(a)所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和(c)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，其包括測(cè)量以下的至少兩種:(a)所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
49.如權(quán)利要求47所述的方法，其包括測(cè)量以下的所有三種: (a)所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和(c)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
50.如權(quán)利要求47所述的方法，其中正常染色體計(jì)數(shù)由以下的一種或多種指示:(a)為約0至約30分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)為約8-15小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)為約0-5小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其中正常染色體計(jì)數(shù)由以下的一種或多種指示:(a)為14.4±4.2min的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)為11.8±0.71小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)為約0.96±0.84小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
52.如權(quán)利要求45所述的方法，還包括測(cè)量細(xì)胞周期I的持續(xù)時(shí)間。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中正常染色體計(jì)數(shù)由為約20-27小時(shí)的細(xì)胞周期I 的持續(xù)時(shí)間指示。
54.一種向雌性動(dòng)物提供具有正常染色體計(jì)數(shù)的人類胚胎的方法，其包括:(a)在足以進(jìn)行胚胎發(fā)育的條件下培養(yǎng)一個(gè)或多個(gè)胚胎；(b)測(cè)量所述一個(gè)或多個(gè)胚胎中的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以獲得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果；(C)使用所述細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果以確定所述胚胎是否具有正常染色體計(jì)數(shù)，其中所述人類胚胎的正常染色體計(jì)數(shù)由以下指示:(i)為約14.4±4.2min的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(ii)為約11.8±0.71小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(iii)為約0.96±0.84小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔；且(d)將具有正常染色體計(jì)數(shù)的所述一個(gè)或多個(gè)胚胎轉(zhuǎn)移至需要其的雌性動(dòng)物。
55.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述胚胎通過(guò)卵母細(xì)胞的體外受精來(lái)制備。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述卵母細(xì)胞體外成熟。
57.如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟。
58.如權(quán)利要求45所述的方法，其中在測(cè)量之前所述人類胚胎被冷凍。
59.如權(quán)利要求45所述的方法，其中在測(cè)量之前所述人類胚胎未被冷凍。
60.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述胚胎通過(guò)胞漿內(nèi)精子注射來(lái)制備。
61.一種用于將人類胚胎分級(jí)為以下的方法:(a)具有正常染色體計(jì)數(shù)；(b)歸因于有絲分裂錯(cuò)誤的非整倍體；或(C)歸因于減數(shù)分裂錯(cuò)誤的非整倍體，所述方法包括測(cè)量所述人類胚胎的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以獲得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果和使用所述細(xì)胞測(cè)量結(jié)果以確定所述人類胚胎是否具有正常染色體計(jì)數(shù)、是否是歸因于有絲分裂錯(cuò)誤的非整倍體或歸因于減數(shù)分裂錯(cuò)誤的非整倍體。
62.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述細(xì)胞參數(shù)通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡來(lái)測(cè)量。
63.如權(quán)利要求61所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)選自由以下組成的組:(a)所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)胞質(zhì)分裂I和胞 質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和(c)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其包括測(cè)量以下的至少兩種:(a)所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔:和/或(c)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
65.如權(quán)利要求63所述的方法，其包括測(cè)量以下的所有三種:(a)所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔:和(c)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
66.如權(quán)利要求61所述的方法，還包括測(cè)量第一細(xì)胞周期的持續(xù)時(shí)間。
67.如權(quán)利要求61所述的方法，其中正常染色體計(jì)數(shù)由以下的一種或多種指示:(a)為約0至約30分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)為約8-15小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)為約0-5小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔；
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其中正常染色體計(jì)數(shù)由以下的一種或多種指示:(a)為約14.4±4.2分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)為約11.8±0.71小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)為約0.96±0.84小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
69.如權(quán)利要求67所述的方法，其中正常染色體計(jì)數(shù)由以下的兩種或更多種指示:(a)為約14.4±4.2分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)為約11.8±0.71小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)為約0.96±0.84小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
70.如權(quán)利要求67所述的方法，其中正常染色體計(jì)數(shù)由以下指示:(a)為約14.4±4.2分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)為約11.8±0.71小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和(c)為約0.96±0.84小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
71.如權(quán)利要求61所述的方法，其中歸因于有絲分裂錯(cuò)誤的人類非整倍體胚胎由以下的一種或多種指示:(a)多于約35分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)少于約7小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)多于約2小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其中歸因于有絲分裂錯(cuò)誤的人類非整倍體胚胎由以下的一種或多種指示:(a)為約36.0±66.9分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)為約6.4±6.6小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)為約2.0±3.9小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
73.如權(quán)利要求71所述的方法，其中歸因于有絲分裂錯(cuò)誤的人類非整倍體胚胎由以下的兩種或更多種指示:(a)為約36.0±66.9分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)為約6.4±6.6小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)為約2.0±3.9小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
74.如權(quán)利要求71所述的方法，其中歸因于有絲分裂錯(cuò)誤的人類非整倍體胚胎由以下指示:(a)為約36.0±66.9分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；`(b)為約6.4 + 6.6小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和(c)為約2.0±3.9小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
75.如權(quán)利要求61所述的方法，其中歸因于減數(shù)分裂錯(cuò)誤的人類非整倍體胚胎由以下的一種或多種指示:(a)多于約100分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)少于約4小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)多于約2小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
76.如權(quán)利要求75所述的方法，其中歸因于減數(shù)分裂錯(cuò)誤的人類非整倍體胚胎由以下的一種或多種指示:(a)為約117.2±166.5分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)為約4.0±5.2小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)多于約2小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
77.如權(quán)利要求75所述的方法，其中歸因于減數(shù)分裂錯(cuò)誤的人類非整倍體胚胎由以下的兩種或更多種指示:(a)為約117.2±166.5分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)為約4.0±5.2小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)多于約2小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
78.如權(quán)利要求75所述的方法，其中歸因于減數(shù)分裂錯(cuò)誤的人類非整倍體胚胎由以下指示:(a)為約117.2±166.5分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)為約4.0±5.2小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和(c)多于約2小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
79.如權(quán)利要求24所述的方法，還包括檢測(cè)存在或不存在所述胚胎的碎裂和/或其水平。
80.一種用于檢測(cè)人類胚胎中的非整倍性的方法，其包括:(a)測(cè)量所述人類胚胎的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)以獲得細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果；(b)檢測(cè)存在或不存在所述胚胎的碎裂和/或其水平；和(c)使用所述細(xì)胞參數(shù)以確定所述人類胚胎是否為非整倍體。
81.如權(quán)利要求80所述的方法，其中所述細(xì)胞參數(shù)測(cè)量結(jié)果和碎裂通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡來(lái)測(cè)量。
82.如權(quán)利要求80所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)選自由以下組成的組:(a)所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和(c)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
83.如權(quán)利要求82所述的方法，其中非整倍性通過(guò)超過(guò)一個(gè)或多個(gè)所測(cè)量細(xì)胞參數(shù)的正常范圍的細(xì)胞測(cè)量結(jié)果來(lái)檢測(cè)，其中所測(cè)量細(xì)胞參數(shù)的正常范圍為:(a)為約0至約30分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間； (b)為約8-15小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和(c)為約0-5小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
84.如權(quán)利要求82所述的方法，其中檢測(cè)非整倍性且一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)包括:(a)多于約30分鐘的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)少于約8小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)多于約90分鐘的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
85.如權(quán)利要求83所述的方法，其中所述所測(cè)量細(xì)胞參數(shù)的正常范圍為:(a)為14.4±4.2min的所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)為11.8±0.71小時(shí)的胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和(c)為約0.96±0.84小時(shí)的胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
86.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述非整倍性是歸因于增加的轉(zhuǎn)座子活性。
87.一種用于檢測(cè)人類胚胎中的非整倍性的方法，其包括:(a)測(cè)量所述人類胚胎中的轉(zhuǎn)座子活性；(b)使用所述轉(zhuǎn)座子活性測(cè)量結(jié)果以確定所述人類胚胎是否為非整倍體。
88.一種用于檢測(cè)人類胚胎中的非整倍性的方法，其包括:(a)確定胚胎到達(dá)胚泡的潛力和選擇具有達(dá)到胚泡的潛力的胚胎；(b)測(cè)量具有達(dá)到胚泡的潛力的所述胚胎中的碎裂水平；其中高碎裂水平指示非整倍體。
89.如權(quán)利要求88所述的方法，其中高碎裂水平為按體積計(jì)超過(guò)約25%的碎裂。
90.如權(quán)利要求88所述的方法，其中所述碎裂水平通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡來(lái)確定。
91.如權(quán)利要求88所述的方法，其中確定胚胎到達(dá)胚泡的潛力通過(guò)測(cè)量一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)、測(cè)量基因表達(dá)水平和/或模式、或分析胚胎形態(tài)學(xué)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
92.一種用于選擇具有正常染色體計(jì)數(shù)的胚胎的方法，其包括: a)確定胚胎到達(dá)胚泡的潛力和選擇具有達(dá)到胚泡的潛力的胚胎；(b)測(cè)量具有達(dá)到胚泡的潛力的所述胚胎中的碎裂水平；其中低碎裂水平指示具有正常染色體計(jì)數(shù)的胚胎。
93.如權(quán)利要求92所述的方法，其中低碎裂水平為按體積計(jì)少于約25%的碎裂。
94.如權(quán)利要求92所述的方法，其中所述碎裂水平通過(guò)時(shí)間間隔顯微鏡來(lái)確定。
95.如權(quán)利要求92所述的方法，其中確定胚胎到達(dá)胚泡的潛力通過(guò)測(cè)量一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞參數(shù)、測(cè)量基因表達(dá)水平和/或模式、或分析胚胎形態(tài)學(xué)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
96.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在測(cè)量以下的至少一種之前在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)所述胚胎:(a)所述第一胞質(zhì)分裂的持續(xù)時(shí)間；(b)胞質(zhì)分裂I和胞質(zhì)分裂2之間的時(shí)間間隔；和/或(c)胞質(zhì)分裂2和胞質(zhì)分裂3之間的時(shí)間間隔。
97.如權(quán)利要求9 6所述的方法，還包括當(dāng)確定所述胚胎具有有利發(fā)育潛力時(shí)從所述培養(yǎng)皿除去所述胚胎。
98.如權(quán)利要求97所述的方法，其中將在已確定所述胚胎具有有利發(fā)育潛力之后從所述培養(yǎng)皿除去的所述胚胎進(jìn)一步移植到雌性動(dòng)物受者中。
99.如權(quán)利要求14所述的方法，其中在足以進(jìn)行胚胎發(fā)育的條件下在培養(yǎng)皿中進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)胚胎的所述培養(yǎng)。
100.如權(quán)利要求99所述的方法，其中在步驟(d)轉(zhuǎn)移所述胚胎之前將在步驟(c)中經(jīng)確定具有有利發(fā)育潛力的胚胎從所述培養(yǎng)皿除去。
101.如權(quán)利要求54所述的方法，其中在足以進(jìn)行胚胎發(fā)育的條件下在培養(yǎng)皿中進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)胚胎的所述培養(yǎng)。
102.如權(quán)利要求101所述的方法，其中在步驟(d)轉(zhuǎn)移所述胚胎之前將在步驟(c)中經(jīng)確定具有有利發(fā)育潛力的胚胎從所述培養(yǎng)皿除去。
【文檔編號(hào)】A61K35/54GK103460038SQ201280017696
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2012年2月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月23日
【發(fā)明者】S.L.查維斯, K.E.洛克, B.貝爾, R.A.賴喬佩拉 申請(qǐng)人:里蘭斯坦福初級(jí)大學(xué)理事會(huì)