人類胚胎脊髓性肌萎縮癥突變基因檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因診斷領(lǐng)域，具體而言，涉及人類胚胎脊髓性肌萎縮癥突變基因檢 測引物及相應(yīng)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 脊髓性肌萎縮癥（spinalmuscularatrophy，SMA)是一種以脊髓前角細(xì)胞變性 為主要病理改變，以進(jìn)行性、對稱性肌無力、肌萎縮為特征的常染色體隱性遺傳性神經(jīng)肌肉 病，是臨床第二大致死性常染色體隱性遺傳性疾病。在活產(chǎn)嬰兒中，其發(fā)病率約為1/10000 至 1/6000,人群基因攜帶率約l/40(KolbSJ,KisselJT.Spinalmuscularatrophy.Arch Neurol, 2011，68 (8) :979-984)。目前SMA尚無有效的治療方法。對病情進(jìn)展緩慢者，理療、 支架以及特殊矯正器材是防止脊柱側(cè)凸及關(guān)節(jié)痙攣的主要方法，但是這些治療并不能治愈 疾病。因此，對于SMA這種嚴(yán)重致殘、致死而又無法根治的疾病，開展產(chǎn)前檢測顯得尤為重 要。
[0003] 位于人類5號染色體上的運(yùn)動神經(jīng)元存活基因1(survivalmotorneuron1， SMN1)缺陷是導(dǎo)致SMA的原因。1995年該基因被克隆。正常人的兩條5號染色體上至少 存在1個SMN1基因拷貝，而SMA患者SMN1基因缺失（特指7號外顯子純合缺失）或者帶 有1個突變的SMN1基因。研究表明，約95%的SMA患者為SMN1基因純合缺失所致（缺失 型），另5%的患者為SMN1基因突變所致（突變型）（LunnMR,WangCH.Spinalmuscular atrophy.Lancet, 2008, 371 (9630):2120-2133)〇
[0004]SMA的遺傳方式為常染色體隱性遺傳，即兩條染色體上的SMN1基因均存在缺陷時 才會導(dǎo)致SMA。一條染色體上的SMN1基因正常，而另一條染色體上的SMN1基因存在缺陷不 會致病，此時稱之為SMA攜帶者。若男女雙方均為SMA攜帶者，生育SMA患兒的風(fēng)險為25% (圖 1)。
[0005] 雖然SMA的發(fā)病率較低，但是人群攜帶率卻非常高。文獻(xiàn)報道各個國家SMA攜帶 者頻率為 1/40 至 1/60(SmithM，CalabroV，ChongB，etal.Populationscreeningand cascadetestingforcarriersofSMA[J].EurJHumGenet, 2007, 15(7):759_766.)。臺 灣地區(qū)SMA攜帶率為 1/48(SuYN,HungCC,LinSY，etal.Carrierscreeningforspinal muscularatrophy(SMA)in107,611pregnantwomenduringtheperiod2005-2009:A prospectivepopulation-basedcohortstudy.PLoSone, 2011, 6 (2) :el7067) 〇 我國南方 地區(qū)應(yīng)用DHPLC技術(shù)，篩查1712例新生兒，表明中國大陸地區(qū)SMA人群攜帶率為1/42(Zhu SY,FuX,ChenYJ,etal.MolecularcharacterizationofSMNcopynumberderived fromcarrierscreeningandfromorefamilieswithSMAinaChinesepopulation. EurJHumGenet, 2010, 18(9) : 978-984.) 〇
[0006] 采用試管嬰兒技術(shù)能有效幫助夫妻均攜帶SMN1基因的父母解決下一代出現(xiàn)SMA 的難題。試管嬰兒技術(shù)是將卵子與精子取出后置于特定的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)、受精，受精卵在恒 溫孵箱中發(fā)育為胚胎后移植回母體子宮，最終發(fā)育成胎兒。挑選健康胚胎移植是成功預(yù)防 的關(guān)鍵。胚胎植入前遺傳學(xué)篩查是指胚胎植入著床之前進(jìn)行染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的檢 測，挑選無SMA的胚胎植入子宮，以期獲得正常的后代。
[0007]SMN1基因檢測已成為SMA診斷的主要依據(jù)。目前臨床常用的特異性針對SMN1外 顯子7純合缺失的基因檢測技術(shù)有PCR限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP)、變性高效液相 色譜分析（DHPLC)、多重連接依賴性探針擴(kuò)增（MLPA)以及定量PCR技術(shù)。SMN1外顯子7純 合缺失，則可以確診為SMA(缺失型）；對于含有1個SMN1基因，而臨床表型又極似SMA的 患者，可以進(jìn)一步通過基因測序，檢測患者是否存在SMN1基因無義、錯義、移碼突變而致病 (突變型）。但這些方法靈敏度低，只適合于采用新生兒外周血作為檢測對象，不適合針對 單細(xì)胞的移植前篩查。因此急需開發(fā)一種試管嬰兒技術(shù)中胚胎SMN1突變檢測的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明設(shè)計了一種基于高通量測序技術(shù)檢測SMN1突變的方法。
[0009] 本發(fā)明的第一方面提供了一種檢測SMN1突變的引物組合物，其包括特異性擴(kuò)增 SMN1基因第7號外顯子的引物和特異性擴(kuò)增SMN1基因上下游3Mb范圍內(nèi)緊密連鎖多態(tài)性 位點(diǎn)（SNP)的引物。
[0010] 優(yōu)選地，所述特異性擴(kuò)增SMN1基因第7號外顯子的引物的上下游序列分別如SEQ IDN0:29 和 30 所示。
[0011] 優(yōu)選地，所述特異性擴(kuò)增SMN1基因上下游3Mb范圍內(nèi)緊密連鎖多態(tài)性位點(diǎn)（SNP) 的引物的上下游序列分別選自SEQIDNO:2n-l和SEQIDNO:2n，其中n為1-14或16-43 的自然數(shù)。
[0012] 在一個特定的實施方案中，所述檢測SMN1突變的引物組合物包括SEQIDNO: 1-86的全部引物序列。
[0013] 本發(fā)明的第二方面提供了一種人類胚胎脊髓性肌萎縮癥（SMA)檢測產(chǎn)品，其由本 發(fā)明的引物組合物制備得到。
[0014] 在一個特定的實施方案中，所述檢測產(chǎn)品為試劑盒，其包括：
[0015] 1)用于文庫構(gòu)建的反應(yīng)試劑，包括：特異性結(jié)合引物、通用PCR引物、多重PCR聚 合酶、DNA連接酶、末端修復(fù)酶、dNTPs、反應(yīng)緩沖液；
[0016] 2)用于純化PCR的反應(yīng)產(chǎn)物的試劑；優(yōu)選地，其包括產(chǎn)物純化磁珠及緩沖液。優(yōu) 選地，所述試劑盒還包括：
[0017] 3)陰性質(zhì)控品；和
[0018] 4)陽性質(zhì)控品。
[0019] 本發(fā)明的第三方面提供了一種檢測胚胎SMN1基因突變的方法，其包括以下步驟：
[0020] 1)提取體外培養(yǎng)的囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)全基因組擴(kuò)增；
[0021] 2)磁珠純化全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0022] 3)提取夫妻雙方全血DNA;
[0023] 4)利用本發(fā)明的引物組合物通過多重PCR擴(kuò)增單體型目標(biāo)區(qū)域；
[0024] 5)純化PCR產(chǎn)物，并測序；
[0025] 6)將測定的胚胎和夫妻3方的DNA序列進(jìn)行比對，判斷胚胎的單倍體型。
[0026] 其中，步驟1)中所述囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞全基因組擴(kuò)增方法優(yōu)選為多重置換擴(kuò)增 (MDA)〇
[0027]步驟 5)中米用IontorrentPGM或IontorrentProton進(jìn)行測序。
[0028] 步驟6)中利用Torrent_Server_4. 0_VM軟件對PGM測序儀產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)去除 接頭序列，用Tmap軟件比對到人類hgl9參考基因組，最后分析目標(biāo)位點(diǎn)覆蓋倍數(shù)和基因 型。
[0029] 本發(fā)明的第四方面提供了一種檢測人類胚胎脊髓性肌萎縮癥（SMA)的方法，其使 用本發(fā)明的方法確定胚胎的SMN1基因突變情況，從而診斷SMA。
[0030] 本發(fā)明的優(yōu)越性主要有以下幾點(diǎn)：
[0031] (1)通用性：本發(fā)明的優(yōu)選引物組合物采用了 43個SNP進(jìn)行分析，可用于不同配 偶的胚胎移植前診斷。
[0032] (2)多位點(diǎn)SNP測序：基于第二代測序技術(shù)，本發(fā)明可以對SMN1基因附近的多個 SNP進(jìn)行分析，不需依賴已知的探針和設(shè)計探針。
[0033] (3)高通量：基于高通量測序技術(shù)，本發(fā)明可以高通量地進(jìn)行SMN1突變的單倍體， 通過在每個樣品上加上不同的標(biāo)簽序列，可以一次地對大量樣品進(jìn)行分析。
[0034] (4)成本低：隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展和測序成本的不斷降低，以及一次對大量 樣品進(jìn)行分析，本發(fā)明對SMN1突變的單倍體分析的成本也在不斷下降。
[0035] (5)高靈敏度：本發(fā)明可用于3~5個細(xì)胞的分析，因此適合于試管嬰兒技術(shù)中胚 胎移植如的檢測。
[0036] (6)特異性強(qiáng)：本發(fā)明選取千人基因組計劃數(shù)據(jù)（http://www.ncbi.nlm.nih. gov/variation/tools/1000genomes/)中SMN1 基因上下游 3Mb范圍內(nèi)CHB(北方漢人）和 CHS(南方漢人）最小等位基因頻率均大于0. 1的高頻突變位點(diǎn)，去除多聚核苷酸（polyN) 和位點(diǎn)上下游50bp序列中GC含量>70%的多態(tài)性位點(diǎn)，并選擇unique比對到人類基因組 hgl9的43個SNP突變位點(diǎn)和SMN1基因外顯子7下游第6位C堿基作為目標(biāo)區(qū)域。這些引 物具有很高的特異性。
【附圖說明】
[0037] 圖1SMA遺傳方式。X.常規(guī)"2+1+1"家系，父母均為攜帶者（含1個SMN1拷貝） 子代可能為以下四種基因型（A1:缺失型患者；A2、A3:攜帶者；A4:含兩個SMN1拷貝的正常 人）；Y.突變型家系，一人為攜帶者，一人含2個SMN1拷貝，但其中1個拷貝發(fā)生突變，子代 可能為以下四種基因型（B1:突變型患者；B2:攜帶者；B3:突變型攜帶者；B4:含兩個SMN1 拷貝的正常人）。
[0038] 圖2脊髓性肌萎縮癥家系單體型結(jié)果。Hl、H2、H3、H5、H6、H10為該家系胚胎，不 同單體