專利名稱：脂質(zhì)體制劑、制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療作用的體內(nèi)傳輸制劑，尤其是一種脂質(zhì)體制劑。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，不同類型的核酸被用于治療一些疾病的研究，有望發(fā)展成為新一代的基因療法。這些核酸包括用于基因治療的DNA和RNA，及其模擬物和修飾的結(jié)構(gòu)。其中，RNA包括小干擾核酸(small interfering RNA, si RNA)、微小 RNA (microRNA, mi RNA)、RNA 適配體、小配體RNA (small ligand RNA, sliRNA)等；DNA包括質(zhì)粒等,這些核酸通過不同的機(jī)制發(fā)揮作用，如siRNA和miRNA通過RNA干擾(RNA interferring, RNAi)機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)特定基因的表達(dá)水平，當(dāng)siRNA或miRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，這些雙鏈RNA能與細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白結(jié)合形成 RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNAInducing Silencing Complex, RISC), siRNA 在 RISC中解鏈后通過序列互補(bǔ)識(shí)別并與mRNA結(jié)合，mRNA被切割，達(dá)到下調(diào)基因表達(dá)的效果。RNAi 提供了一種與靶基因互補(bǔ)并阻斷編碼蛋白的mRNA表達(dá)的基因治療方法。RNAi有著廣泛的用途，靶向某一蛋白的siRNA和miRNA可以直接用化學(xué)合成的方法得到。大量的研究報(bào)道，siRNA可以在體外和體內(nèi)的模型中特異性地下調(diào)靶蛋白，至目前為止，有數(shù)十種siRNA已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。然而，目前siRNA及其它核酸藥物必須面臨兩個(gè)問題，第一，它們?cè)诩?xì)胞質(zhì)中抗核酸酶的降解能力較弱，第二是通過全身給藥的的裸露siRNA或miRNA很難透過細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)與RISC結(jié)合。這類核酸藥物可以通過在分子中引入化學(xué)修飾的核苷酸，如硫代磷酸基團(tuán)，然而這些化學(xué)修飾只能有限地保護(hù)核酸不被核酸酶降解，并且可能會(huì)降低核酸的活性。核酸藥物可以用載體系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)傳輸，如多聚體、陽(yáng)性脂質(zhì)體或化學(xué)修飾的結(jié)構(gòu)，其它如膽固醇分子進(jìn)行共價(jià)連接。然而，有必要改進(jìn)傳輸系統(tǒng)以提高siRNA和miRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性和穿膜能力，同時(shí)盡可能地避免化學(xué)修飾所帶來(lái)的不利因素。但是核酸藥物所要面對(duì)的首要問題是穩(wěn)定性，在血清或細(xì)胞中，在有核酸內(nèi)切酶和外切酶存在的情況下，核酸藥物能被快速地降解，只有很短的半衰期(Zelphati，O等人，Antisense. Res. Dev. 1993(3) :323-338)。用化學(xué)修飾的方法來(lái)減少核酸在血清或細(xì)胞內(nèi)降解解決了部分問題，如磷酸二酯鍵修飾，核苷酸修飾、或是糖環(huán)修飾等。但這些并不能完全解決問題，仍存在局限性。另一方面，核酸藥物用于治療仍然存在的問題是核酸藥物穿透細(xì)胞膜的能力有限。為了嘗試提高療效，研究人員用基于脂質(zhì)體的載體系統(tǒng)來(lái)傳輸化學(xué)修飾或未修飾的核酸藥物。有大量研究報(bào)道，陽(yáng)性脂質(zhì)體可用來(lái)包載siRNA制備成核酸脂質(zhì)體制劑，這些核酸脂質(zhì)體制劑在體外、體外的實(shí)驗(yàn)中得到了很好的驗(yàn)證。盡管最近取得一些進(jìn)展，但在本領(lǐng)域中，仍然需要改進(jìn)基于核酸脂質(zhì)體制劑的成分，以適用于一般治療。理想狀態(tài)下，這些組分具有高效的核酸包封率，具有高的藥脂比，保護(hù)核酸藥物不被細(xì)胞內(nèi)核酸酶降解，適合全身傳輸，并提供適于細(xì)胞內(nèi)傳輸?shù)陌玫暮怂?。此外，這些脂質(zhì)體制劑應(yīng)該要有很好的耐受性，并提供適當(dāng)?shù)闹委熤笖?shù)，如核酸藥物的有效劑量且對(duì)病人沒有明顯的毒性。本發(fā)明提供了這樣的脂質(zhì)體制劑，以及該脂質(zhì)體制劑的制備方法，同時(shí)也提供了該脂質(zhì)體制劑將核酸藥物導(dǎo)入哺乳動(dòng)物體內(nèi)的方法，用于疾病的治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種既容易制備又容易傳遞到靶組織的脂質(zhì)體制劑，可用于治療由基因的異常表達(dá)引起的相關(guān)疾病。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種脂質(zhì)體制劑，其特征在于，包括互補(bǔ)雙陽(yáng)性脂質(zhì)、磷脂和長(zhǎng)效脂質(zhì)。優(yōu)選地，所述脂質(zhì)體制劑中互補(bǔ)雙陽(yáng)性脂質(zhì)、磷脂和長(zhǎng)效脂質(zhì)的摩爾百分比分別為 20 80%、10%和 10%。優(yōu)選地，所述的互補(bǔ)雙陽(yáng)性脂質(zhì)包括第一陽(yáng)性脂質(zhì)和第二陽(yáng)性脂質(zhì)，第一陽(yáng)性脂 質(zhì)和第二陽(yáng)性脂質(zhì)在脂質(zhì)體制劑中的摩爾百分比分別為20 60%;所述的第一陽(yáng)性脂質(zhì)為4- (N, N- 二甲基胺基)丁酸-6，9，28，31-四烯-19-三十七醇酯(heptatriaconta-6,9, 28，31-tetraen-19-yl-4- (dimethylamino) butanoate, CLOI)或 N, N-二甲基-2, 3_ 二亞油氧基丙胺(N, N-dimethyl- (2, 3-dilinoleyloxy) propylamine, DLinDMA);所述的第二陽(yáng)性脂質(zhì)為 3_(N,N-二甲基胺基)丙酸-膽固醇酯(cholesteryl3_(dimethylamino)propanoate,CL06)或2_(N,N-二甲基胺基)乙酸-膽固醇酯(cholesteryl2_(dimethylamino)acetate,CL08)。優(yōu)選地，所述的磷脂為二?；字Ｄ憠A(distearyl phosphatidyl choline,DSPC)。優(yōu)選地，所述的長(zhǎng)效脂質(zhì)為N-(2，3_ 二十四醚丙基)氨基甲酸聚乙二醇單甲醚酯(N_[(methoxy poly (ethylenegIycol)2000)carbamoyl]-I,2-dimyristyloxypropy 1-3-amine, PEG-c-DMA)、N-(聚乙二醇單甲醚基)氨基甲酸-6,9,28,31-四烯-19-三十七醇酯(heptatriaconta-6,9, 28, 31-tetra-en-19-ol methoxypoly (ethylene glycol) 2000carbamate, PEG-DLM)、N_ (聚乙二醇單甲醚基)氨基甲酸膽固醇酯(cholesterolmethoxy poly (ethylene glycol) 2000carbamate, PEG-Chol)、N-(聚乙二醇單甲釀基)氛基甲酸 _15-二十九醇酷(nonacosan-15-ol methoxypoly (ethyleneglycol) 2000carbamate, PEG-DMM)中的任意一種。優(yōu)選地,還包括一種具有治療效果的藥物。進(jìn)一步地，所述的藥物為核酸；所述的核酸為功能性RNA及其含有修飾的結(jié)構(gòu)形式或模擬物和DNA及其含有修飾的結(jié)構(gòu)形式或模擬物中的任意一種或幾種的混合物進(jìn)一步地,所述的功能性RNA 為 siRNA (small ligand RNA,簡(jiǎn)稱 sliRNA)、miRNA、小配體RNA和RNA適配體中的任意一種或幾種的混合物。本發(fā)明還提供了上述脂質(zhì)體制劑的制備方法，其特征在于，將互補(bǔ)雙陽(yáng)性脂質(zhì)、磷月旨、長(zhǎng)效脂質(zhì)的溶液混合后形成預(yù)制空囊泡，然后與核酸溶液混合，形成核酸脂質(zhì)體制劑。核酸脂質(zhì)體制劑可由一種溶于有機(jī)溶劑(如乙醇和其易混溶的溶劑組成)的陽(yáng)離子脂質(zhì)與siRNA水溶液混合而成，包含陽(yáng)離子脂質(zhì)體的核酸混合物可立即作為藥物制劑使用或能冷藏保存?zhèn)溆?；也可采用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員常用的方法進(jìn)行化學(xué)加工。這種陽(yáng)離子脂質(zhì)復(fù)合物能夠用許多機(jī)械方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，使其能夠成為固態(tài)或液態(tài)的核酸藥物。本發(fā)明還提供了上述脂質(zhì)體制劑在治療由基因異常表達(dá)引起的相關(guān)疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的脂質(zhì)體制劑，可以用于藥學(xué)上可接受的核酸分子，如siRNA或miRNA等的體內(nèi)傳輸，這種制劑可以預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物疾病，達(dá)到更好的治療效果。


圖I為脂質(zhì)體制劑Fl 13和Fl 15給藥前后小鼠體重柱形圖；圖中，橫坐標(biāo)表示各實(shí)驗(yàn)組，縱坐標(biāo)表示小鼠體重；圖2為脂質(zhì)體制劑F113和F115給藥后小鼠血清中總膽固醇水平柱形圖； 圖中，橫坐標(biāo)表示各實(shí)驗(yàn)組，縱坐標(biāo)表示小鼠血清總膽固醇水平；圖3為脂質(zhì)體制劑Fl 13和Fl 15給藥后小鼠肝臟組織中ApoB基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平柱形圖；圖中，橫坐標(biāo)表示各實(shí)驗(yàn)組，縱坐標(biāo)表示ApoB基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；圖4為脂質(zhì)體制劑F121、F123、F128及F129給藥前后小鼠體重柱形圖；圖中，橫坐標(biāo)表示各實(shí)驗(yàn)組，縱坐標(biāo)表示小鼠體重；圖5為脂質(zhì)體制劑F121、F123、F128及F129給藥后小鼠血清中總膽固醇水平柱形圖；圖中，橫坐標(biāo)表示各實(shí)驗(yàn)組，縱坐標(biāo)表示小鼠血清總膽固醇水平；圖6為脂質(zhì)體制劑F121、F123、F128及F129給藥后小鼠肝臟組織中ApoB基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平柱形圖； 圖中，橫坐標(biāo)表示各實(shí)驗(yàn)組，縱坐標(biāo)表示ApoB基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；圖7為脂質(zhì)體制劑F120和F122給藥前后小鼠體重柱形圖；圖中，橫坐標(biāo)表示各實(shí)驗(yàn)組，縱坐標(biāo)表示小鼠體重；圖8為脂質(zhì)體制劑F120和F122給藥后小鼠血清中總膽固醇水平柱形圖；圖中，橫坐標(biāo)表示各實(shí)驗(yàn)組，縱坐標(biāo)表示小鼠血清總膽固醇水平；圖9為脂質(zhì)體制劑F120和F122給藥后小鼠肝臟組織中ApoB基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平柱形圖；圖中，橫坐標(biāo)表示各實(shí)驗(yàn)組，縱坐標(biāo)表示ApoB基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；圖10為脂質(zhì)體制劑F157、F159、F165和F167給藥前后小鼠體重柱形圖；圖中，橫坐標(biāo)表示各實(shí)驗(yàn)組，縱坐標(biāo)表示小鼠體重；圖11為脂質(zhì)體制劑F157、F159、F165和F167給藥后小鼠肝臟組織中ApoB基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平柱形圖； 圖中，橫坐標(biāo)表示各實(shí)驗(yàn)組，縱坐標(biāo)表示ApoB基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平；圖12為脂質(zhì)體制劑F155和F156給藥前后小鼠體重柱形圖；圖中，橫坐標(biāo)表示各實(shí)驗(yàn)組，縱坐標(biāo)表示小鼠體重；圖13為脂質(zhì)體制劑F155和F156給藥后小鼠肝臟組織中ApoB基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平柱形圖中，橫坐標(biāo)表示各實(shí)驗(yàn)組，縱坐標(biāo)表示ApoB基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更明顯易懂，茲以優(yōu)選實(shí)施例，并配合附圖作詳細(xì)說明如下。實(shí)施例I制備6,9,28,31-四烯-19-三十七醇(heptatriaconta-6,9,28,31-tetra-en-19-ol, DLM,6a)步驟I :亞油醇2的合成，反應(yīng)方程式如下式I
OVitride*
Uli I Hr, toluenem .....…
I M.W = 280IIL燒瓶中通入干燥氬氣，然后將亞油酸l(30g，107mmol)及THF(320mL)加入反應(yīng)器中。使用丙酮-干冰浴冷卻至0°c。將紅鋁的甲苯溶液(73mL，60% wt/vol)緩慢滴加至反應(yīng)器中，滴加過程中保持溫度在0°C以下。滴加完畢后，室溫反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完畢后，溶液冷卻至0°C，緩慢加入飽和的硫酸鈉溶液(5. 75g Na2SO4溶于7. 85mL水中)，滴加時(shí)間不低于45min。滴加完畢后,30min內(nèi)滴入乙酸乙酯(130mL),并劇烈攪拌。反應(yīng)液過濾，固體用乙酸乙酯(90mL)沖洗，合并有機(jī)相，濃縮。產(chǎn)物溶解于乙酸乙酯(90mL)中，并用水(45mL)洗兩次，并用無(wú)水硫酸鈉干燥。過濾，濃縮有機(jī)相并用真空泵除去有機(jī)溶劑，得到產(chǎn)品 2 (28. 8g)。步驟2 甲烷磺酸亞油酯3的合成，反應(yīng)方程式如下式2
令I(lǐng) δ 6
2 M^W = 266TEA, DCMIM—W = 344500mL燒瓶中通入干燥氬氣，然后加入上述產(chǎn)物2(25g，94mmol)及二氯甲烷(DCM，21OmL)，然后加入三乙胺(TEA，53mL)及DMAP (I. 15g，2. OmoI)，溶液使用丙酮-干冰浴冷卻至冷卻至-10°C。甲烷磺酸酐(32. 7g，188mmol)溶于DCM(45mL)中，緩慢滴加至反應(yīng)器中。滴加時(shí)間不低于I小時(shí)，并始終保持反應(yīng)液溫度在0°C以下。反應(yīng)液滴加完畢，繼續(xù)保持(TC反應(yīng)I小時(shí)。反應(yīng)完畢后，冰水(80mL)加入反應(yīng)液中，水相用DCM(45mL)萃取。合并有機(jī)相，有機(jī)相用稀鹽酸OmLHCl溶于36mL水中)(2X45mL)，水(2X35mL)及鹽水(50g NaCl溶于45mL水中)(45mL)洗滌，硫酸鈉(12. 5g)干燥。過濾，濃縮有機(jī)相并用真空泵除去有機(jī)溶劑，得到產(chǎn)品3(32. 3g)。步驟3 :1_溴代亞油烷4的合成，反應(yīng)方程式如下式3
3MW = 3444M.W—=328
500mL燒瓶中通入干燥氬氣，然后加入DMF (IlOmL)及產(chǎn)品3 (30g，87mmol)，溶液使用丙酮-干冰浴冷卻至冷卻至-10°C。LiBr(ll. 5g, 132mmol)溶于DMF (IlOmL)，攪拌并緩慢滴加至反應(yīng)器中。保持反應(yīng)液溫度在0°C以下。滴加完畢后，反應(yīng)液升溫至45°C，攪拌反應(yīng)18-20小時(shí)。反應(yīng)完畢后，加入水(300mL)，并用正己烷(240mL)萃取。合并有機(jī)相，并用鹽水(59gNaCl溶于45mL水中)(2X45mL)洗滌，硫酸鈉(17g)干燥。過濾，濃縮有機(jī)相并用真空泵除去有機(jī)溶劑，得到粗品(27. 5g)。用60-120目硅膠純化(正己烷為流動(dòng)相)，得到純品 4(23g，三步產(chǎn)率為 81% )。1H-Nmr(Cdci3JOOmHz), δ = 5. 41-5. 29(m,4H) ,4. 20 (d,2H)，3. 40 (t,2H)，2. 77 (t,2H)，2. 09-2. 02 (m, 4H)，I. 88-1. 00 (m, 2H)，I. 46-1. 27 (m, 18H)，0. 88(t，3H)。步驟4:6，9，28，31-四烯-19-三十七醇6a的合成，反應(yīng)方程式如下式權(quán)利要求
1.一種脂質(zhì)體制劑，其特征在于，包括互補(bǔ)雙陽(yáng)性脂質(zhì)、磷脂和長(zhǎng)效脂質(zhì)。
2.如權(quán)利要求I所述的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述脂質(zhì)體制劑中互補(bǔ)雙陽(yáng)性脂質(zhì)、磷脂和長(zhǎng)效脂質(zhì)的摩爾百分比分別為20 80%、10%和10%。
3.如權(quán)利要求I所述的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述的互補(bǔ)雙陽(yáng)性脂質(zhì)包括第一陽(yáng)性脂質(zhì)和第二陽(yáng)性脂質(zhì)，第一陽(yáng)性脂質(zhì)和第二陽(yáng)性脂質(zhì)在脂質(zhì)體制劑中的摩爾百分比分別為20 60% ;所述的第一陽(yáng)性脂質(zhì)為4-(N，N-二甲基胺基)丁酸-6，9，28，31-四烯-19-三十七醇酯或N，N- 二甲基-2，3- 二亞油氧基丙胺；所述的第二陽(yáng)性脂質(zhì)為3- (N，N-二甲基胺基)丙酸-膽固醇酯或2-(N，N-二甲基胺基)乙酸-膽固醇酯。
4.如權(quán)利要求I所述的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述的磷脂為二?；字Ｄ憠A。
5.如權(quán)利要求I所述的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述的長(zhǎng)效脂質(zhì)為N-(2，3-二十四醚丙基)氨基甲酸聚乙二醇單甲醚酯、N-(聚乙二醇單甲醚基)氨基甲酸-6，9，28，31-四烯-19-三十七醇酯、N-(聚乙二醇單甲醚基)氨基甲酸膽固醇酯和N-(聚乙二醇單甲醚基)氨基甲酸-15- 二十九醇酯中的任意一種。
6.如權(quán)利要求I所述的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，還包括一種具有治療效果的藥物。
7.如權(quán)利要求6所述的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述的藥物為核酸；所述的核酸為功能性RNA及其含有修飾的結(jié)構(gòu)形式或模擬物和DNA及其含有修飾的結(jié)構(gòu)形式或模擬物中的任意一種或幾種的混合物。
8.如權(quán)利要求7所述的脂質(zhì)體制劑，其特征在于，所述的功能性RNA為siRNA、miRNA,小配體RNA和RNA適配體中的任意一種或幾種的混合物。
9.權(quán)利要求I所述的脂質(zhì)體制劑的制備方法，其特征在于，將互補(bǔ)雙陽(yáng)性脂質(zhì)、磷脂、長(zhǎng)效脂質(zhì)的溶液混合后形成預(yù)制空囊泡，然后與核酸溶液混合，形成核酸脂質(zhì)體制劑。
10.權(quán)利要求I 9任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體制劑在治療由基因異常表達(dá)引起的相關(guān)疾病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脂質(zhì)體制劑、制備方法及其在治療由基因異常表達(dá)引起的相關(guān)疾病中的應(yīng)用。所述的脂質(zhì)體制劑其特征在于，包括互補(bǔ)雙陽(yáng)性脂質(zhì)、磷脂和長(zhǎng)效脂質(zhì)。制備方法為將互補(bǔ)雙陽(yáng)性脂質(zhì)、磷脂、長(zhǎng)效脂質(zhì)的溶液混合后形成預(yù)制空囊泡，然后與核酸溶液混合，形成核酸脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明提供的脂質(zhì)體制劑制備容易，能將核酸等藥物進(jìn)行體內(nèi)傳輸，發(fā)揮治療作用，可用于治療由基因異常表達(dá)引起的相關(guān)疾病。
文檔編號(hào)A61K9/127GK102895190SQ201210393528
公開日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月16日
發(fā)明者陳建新, 彭薇, 李鐵軍, 主輝, 倪燕, 馮文建 申請(qǐng)人:百奧邁科生物技術(shù)有限公司