專利名稱：血管生成抑制劑多肽在制備治療腫瘤及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶和具有抑制包括血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移在內(nèi)的血管生成抑制劑，可用于血管相關(guān)疾病包括腫瘤和類風(fēng)濕在內(nèi)的疾病治療。
背景技術(shù)：
近年我國腫瘤的發(fā)病率和病死率不斷增長。無限制生長、侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤的惡性標(biāo)志和特征，也是導(dǎo)致治療失敗和死亡的主要原因。因此，控制腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移是改善預(yù)后，提高生存率的主要措施。1971年Folkman首先提出腫瘤生長依賴血管新生的理論，腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，它不僅向腫瘤提供營養(yǎng)，也向宿主輸出大量的腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。絕大多數(shù)惡性實體腫瘤如卵巢癌、肝癌、宮頸癌和乳腺癌等都是血管依賴性腫瘤。新生血管一方面為腫瘤生長提供營養(yǎng)和氧氣，另一方面還是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑。因此，抑制腫瘤血管形成是重要的抗癌措施。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)是一組結(jié)構(gòu)相似和功能相關(guān)的蛋白內(nèi)切酶。它們可以切割各種細(xì)胞外基質(zhì)，為炎癥細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移打開“通路”；它們可以切割細(xì)胞因子或趨化因子，影響炎癥細(xì)胞的募集；它們還可以切割各種膜連接分子，包括受體和細(xì)胞間連接分子，從而調(diào)節(jié)這些分子的功能?；|(zhì)金屬蛋白酶-9 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶的典型代表，它的結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能多樣并且是一種誘導(dǎo)表達(dá)的酶。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9可以在幾個方面促進(jìn)腫瘤生長。首先，MMP-9是腫瘤部位血管增生的“開關(guān)”，它可以切割細(xì)胞外基質(zhì)，釋放連接于基質(zhì)上的VEGF，促進(jìn)血管增生，血管增生是腫瘤生長的前提條件。這一點可由MMP-9基因敲除小鼠抑制腫瘤部位血管增生得到證明。MMP-9還可以通過從細(xì)胞外基質(zhì)釋放VEGF的方式促進(jìn)淋巴管增生，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。其次，腫瘤細(xì)胞以及進(jìn)入腫瘤組織的巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞表面都表達(dá)有TNF-a前體，幾種金屬蛋白酶(包括MMP-9)可以切割并釋放有活性的TNF- a，促進(jìn)血管增生和抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。另外,腫瘤部位的炎癥細(xì)胞表達(dá)的MMP-9可以通過兩個方面激活TGF- ^途徑，一是把TGF- ^前體切割成有活性的TGF- ^，二是切割TGF-P連接蛋白，把TGF-P從細(xì)胞外基質(zhì)上釋放出來，活化的TGF-P抑制免疫系統(tǒng)，卻不抑制腫瘤本身的生長，從而間接的促進(jìn)腫瘤生長。MMP抑制劑不但可抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，還具有靶向功能，早在1999年，Koivunen就發(fā)現(xiàn)表達(dá)了 MMP-9多肽抑制劑序列的曬菌體可富集于腫瘤部位。Schafers用MMP-9抑制劑將123I帶到腫瘤組織中的MMP-2和MMP-9高表達(dá)部位。在最近的研究中，用熒光探針標(biāo)記的多肽片段(MMP的多肽底物)可以把腫瘤部位的MMP-2，MMP-9和MMP-14的活力定位于轉(zhuǎn)移細(xì)胞的前端(已經(jīng)做到亞細(xì)胞定位)。以上的例子表明MMP抑制劑具有靶向功能，不但可早期檢測到腫瘤組織，還可以把目的物帶到腫瘤部位。MMP-9多肽抑制劑的優(yōu)勢在于，其序列可以連接到其它有抗腫瘤活性的多肽或蛋白質(zhì)上，新的分子不但可以抑制MMP-9活力，還可以通過MMP-9多肽抑制劑部分把有抗腫瘤活性的成分富集于腫瘤部位，提高其抗腫瘤效果。內(nèi)皮抑素是一種內(nèi)源性血管增生抑制劑，但其分子中含有多個二硫鍵，作為基因工程表達(dá)產(chǎn)品，其生產(chǎn)工藝難于控制，影響到產(chǎn)物活性的發(fā)揮。WiCkStr6m發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素的50-60個氨基酸(ES-2)在體外具有很好的抑制血管生成的活性，甚至高于內(nèi)皮抑素本身的活性。Xu小組研究發(fā)現(xiàn)ES-2在雞胚尿囊膜(CAM)實驗中抑制血管增生活性很高，但在小鼠移植腫瘤模型給藥中并無此活性。這可能是因為體內(nèi)實驗中ES-2不能在腫瘤部位形成有效濃度。 基于這些研究結(jié)果，本實驗室將MMP-9多肽抑制劑連接于ES-2的N端或C端，獲得新的多肽。新多肽可以直接抑制MMP-9的活力，抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移；還可以把ES-2富集于腫瘤部位，增加其在腫瘤部位有效濃度，增強(qiáng)其抗腫瘤活性。根據(jù)這個思路設(shè)計的多肽在C57B1/6小鼠上顯著的抑制了黑色素瘤B16F10的生長，證明了設(shè)計思路的正確性和可行性。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是臨床最常見的炎性關(guān)節(jié)病和主要致殘因素之一。在全世界發(fā)病率約為0.5%-1.0%，在我國約為0.4%。RA可發(fā)生于任何年齡，隨著年齡的增長，發(fā)病率也隨之增高。女性高發(fā)年齡為45-55歲，性別與RA發(fā)病關(guān)系密切，男女之比約I : 3。RA是一種病因尚未明了的慢性全身性炎癥性疾病，以慢性、對稱性、多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，屬于自身免疫炎性疾病?；颊叱Ｒ允植炕蛲蟛刻弁醇澳[脹(特別是腕背部的腫脹)為首發(fā)癥狀，癥狀持續(xù)不緩解，普通的對癥治療雖可以緩解癥狀，但常常由于用藥不規(guī)則或不足量而導(dǎo)致癥狀反復(fù)。病情進(jìn)展時可以出現(xiàn)明顯的晨僵，通常可達(dá)I小時以上，并不斷加重；同時出現(xiàn)一定的關(guān)節(jié)功能障礙。RA的病理過程中，血管新生是一種標(biāo)志性的組織學(xué)改變，新生血管形成伴隨滑膜增生和炎細(xì)胞浸潤，是RA中血管翳形成及關(guān)節(jié)破壞的基礎(chǔ)。原來應(yīng)該沒有血管存在的關(guān)節(jié)軟骨因某種異常變化，而形成新的血管，使得軟骨受到侵蝕，造成關(guān)節(jié)變形或疼痛。新生血管引起類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織發(fā)生異常變化，正常人的關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)層僅1-2層細(xì)胞組成，而RA患者的滑膜內(nèi)層通常有4-10層細(xì)胞(有時甚至超過20層)。這些細(xì)胞不僅在數(shù)量上異常增多，而且在功能上處于異常活躍的狀態(tài)，它們可以分泌大量的細(xì)胞因子、信號分子和蛋白酶，加速關(guān)節(jié)破壞的進(jìn)程。另外，RA滑膜中還有大量炎性細(xì)胞的浸潤，如T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞。因此，血管抑制多肽通過抑制血管生成不僅可阻止向滑膜輸送氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，且直接導(dǎo)致血管退化，從而可能抑制RA滑膜增生。抑制新生血管的形成是治療這類疾病的關(guān)鍵，而內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移是新生血管形成的關(guān)鍵步驟。此外該序列中還含有新生血管抑制序列，研究發(fā)現(xiàn)其具有高效抑制新生血管生成的活性，特別是對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎類疾病有很好的治療作用。血管抑制多肽針對抑制血管新生治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用靶點，為開發(fā)新型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物提供新的研究方向。此外，在關(guān)節(jié)滑膜腔中，有大量炎癥細(xì)胞釋放的基質(zhì)金屬蛋白酶-9，本專利所設(shè)計的多肽本身有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9的活力，可以減少該酶對滑膜組織的破壞，緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀。新設(shè)計的多肽具有抑制包括基質(zhì)金屬蛋白酶-9在內(nèi)的幾種基質(zhì)金屬蛋白酶和抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移兩種作用，前期研究發(fā)現(xiàn)多肽能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、小管生成，并發(fā)現(xiàn)其能體內(nèi)抑制不同瘤株的生長。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有治療作用，增加了適用癥，拓展了其社會價值和經(jīng)濟(jì)價值。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的 本發(fā)明針對多肽I、多肽II、多肽III、多肽IV做了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)其對多種實體腫瘤和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有治療作用，增加了其適應(yīng)癥。技術(shù)方案血管生成抑制劑多肽，其特征在于其氨基酸序列為在序列Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu (其中 Pyr 為 3_(3_ 卩比唳基)_L_ 丙氨酸，Bip為L-4，4’ -聯(lián)苯丙氨酸)的N端或C端加上血管抑制多肽序列X或序列Y，或Z序列，其中 X 的序列為 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro, Y 的序列為Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly,Z 的序列為Gly-Gly-Gly-Gly-IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro。根據(jù)權(quán)利要求I所述的血管抑制多肽序列，其特征在于所述的多肽序列包括多妝I :IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu (其中Pyr為3- (3吡啶基)-L-丙氨酸，Bip為L-4，4’ -聯(lián)苯丙氨酸);多妝II :IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu (其中 Pyr 為 3-(3-批唳基)-L-丙氨酸,Bip 為 L_4,4’ -聯(lián)苯丙氨酸)；多妝IIIPro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu-IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pix)(其中Pyr為3_(3_吡啶基)_L_丙氨酸，Bip為L_4，4’ -聯(lián)苯丙氨酸);多妝IV Pro-Pyr-CyS-Bip-Arg-Gly-Glu-Gly-Gly-Gly-Gly-IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (其中 Pyr 為 3-(3-批唳基)-L-丙氨酸,Bip 為 L_4,4’ -聯(lián)
苯丙氨酸)。根據(jù)權(quán)利要求1、2任意一項所述的血管生成抑制劑在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤為起源于人的頭頸部、腦部、甲狀腺、食管、胰腺、肺臟、肝臟、胃、乳腺、腎臟、膽囊、結(jié)腸或直腸、卵巢、子宮頸、子宮、前列腺、膀胱或睪丸的原發(fā)或繼發(fā)的癌、黑色素瘤、血管瘤以及肉瘤。根據(jù)權(quán)利要求根據(jù)權(quán)利要求1、2任意一項所述的血管生成抑制劑，其特征在于所述的多肽共價連接佐劑，佐劑是牛血清白蛋白、人血清白蛋白或聚乙二醇。根據(jù)權(quán)利要求1、2任意一項所述的血管生成抑制劑多肽在制備治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。根據(jù)權(quán)利要求3血管生成抑制劑在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物組合物可通過多種給藥方式治療原發(fā)或繼發(fā)的癌、黑色素瘤、血管瘤及肉瘤，包括皮下或肌肉注射，靜脈注射或者靜脈滴注，口服給藥如藥丸、膠囊等，鼻噴劑。根據(jù)權(quán)利要求1、2任意一項所述的血管生成抑制劑的制備方法，其特征在于所述的多肽是通過合成方法制備而得。有益效果
先前報道Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu {其中 Pyr 為 3_(3_ 卩比唳基)-L_ 丙氨酸，Bip為L-4,4’ -聯(lián)苯丙氨酸}具有抑制基質(zhì)金屬蛋白酶_8、基質(zhì)金屬蛋白酶-9和腫瘤壞死因子釋放酶的活力，因此該多肽有抑制急性炎癥的作用(參考文獻(xiàn)I)。本專利在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了新的多肽序列，新序列拓展了原來多肽的應(yīng)用范圍，將其應(yīng)用于抗腫瘤領(lǐng)域。多妝Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro 具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的活性(參考文獻(xiàn)2)，但不能在體內(nèi)抑制腫瘤細(xì)胞的生長，現(xiàn)將多肽Ile-Val-Arg-Arg-A I a-A sp -Ar g-A I a-A I a-Va I -Pr o 連接于多妝 Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu 的 C 端或 N端(多肽II和多肽IV還在其中加入4個Gly以增加整個分子的柔性)，獲得了全新的多肽，這些多肽使Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu具有了新的功能,能夠抑制實體腫瘤包括C57bl/6小鼠上黑色素瘤細(xì)胞B16F10在內(nèi)的生長。這些多肽分子有望發(fā)展成為血管生成抑制劑類抗腫瘤藥物，拓展了其社會價值和經(jīng)濟(jì)價值。本專利還將多肽I，多肽II，多肽II和多肽IV應(yīng)用于抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎上，進(jìn)一步拓展了其應(yīng)用范圍。參考文獻(xiàn)I. Hu J, Dubois V, Chaltin P, Fiten P, Dillen C, Van den Steen PE,Opdenakker G. Inhibition of lethal endotoxin shock with an L-pyridylalaninecontaining metalloproteinase inhibitor selected by high-throughput screening ofa new peptide library. Comb Chem High Throughput Screen. 2006,9(8) :599-611.參考文獻(xiàn)2. Wickstrom SA, Alitalo K, Keski-Oja J. An endostatin-derivedpeptide interacts with integrins and regulates actin cytoskeleton and migrationof endothelial cells. J Biol Chem. 2004May 7 ；279(19) :20178-85.


附圖I 多肽II對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的抑制作用；
具體實施例方式實施例I血管生成抑制劑多肽的制備及檢驗多肽采用固相合成法合成，采用高效液相色譜法純化，并采用MS測定多肽的分子量，RP-HPLC測定多肽的純度。多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV固相合成法是以Fmoc-Rink-resin為起始原料，然后用保護(hù)氨基酸依次接各氨基酸，接肽工作完成后充分洗滌，然后切肽、后處理即得血管生成抑制劑粗品。將粗品溶解，用制備型高效液相經(jīng)過兩次純化，最后濃縮凍干得到純品。該方法不僅保證了合成的效率，又提高了純度。I.接肽的步驟如下 稱取Fmoc-Rink-resin適量,倒入玻璃砂芯反應(yīng)柱中，加入CH2Cl2適量使樹脂充分膨脹。a、脫帽加入六氫吡啶/DMF的脫帽液適量，反應(yīng)一段時間后將脫帽液抽干，中間用DMF洗滌一次，然后再加入一次脫帽液適量反應(yīng)，脫去Fmoc保護(hù)基。b、洗滌將脫帽液抽干，用DMF洗滌樹脂幾次，充分洗凈副產(chǎn)物。
C、縮合將用于接肽的保護(hù)氨基酸和激活劑溶于DMF和縮合劑中，搖勻，并充分反應(yīng)。d、洗滌將反應(yīng)液抽干，用DMF充分洗滌樹脂，洗凈副產(chǎn)物。所述切肽的步驟如下把抽干的樹脂裝入圓底燒瓶中，加入切割液充分裂解合好的二十二肽中間體，用砂芯漏斗將樹脂與多肽分離，所述的裂解液的體積組成為三氟乙酸苯酚水苯甲硫醚EDT = 86 : 2 : 4 : 3 : 5。2.后處理步驟如下先加無水乙醚到切割液中將多肽析出，然后離心，把清液倒掉，然后再用無水乙醚洗滌多肽，抽干得多肽粗品。 3.純化的步驟如下a、溶解稱取粗品配制成5_20g/l的溶液，用0. 45 y m的混合濾膜過濾。制備①一次純化用30% -40%的乙腈和60% -70%的緩沖溶液，流速為50 ml/min-100ml/min下沖洗10 min-20 min平衡制備柱。用輸液泵上樣,采集基線,收集紫外波長220nm吸收值大于200 mv的溶液，檢驗是否有樣品。用梯度洗脫，乙腈的起始百分?jǐn)?shù)為10% -20%, 30-50 min后乙腈的百分?jǐn)?shù)為80%-90%。收集紫外波長220 nm吸收值大于200mv的溶液，檢測純度大于95%的合并作為峰頂，待做二次分離純化。②二次純化將一次收到的峰頂旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑后用輸液泵上樣，用30% -40%的乙腈和60% -70%的緩沖溶液。流速50-100 ml/min，并采集基線，收取在紫外波長220 nm吸收大于200 mv的溶液，檢測是否有樣品沖出。用梯度洗脫，乙腈的起始百分?jǐn)?shù)為10^-20^,30-50 min后乙腈的百分?jǐn)?shù)為80% -90%。收取在紫外波長220 nm吸收大于200 mv的溶液，通過檢測純度大于95%的作為合格。b、濃縮、過濾、凍干將合格溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀37°C減壓濃縮，除去殘留溶劑和注射用水。最后用0. 22 ii m濾膜過濾,濾液裝入凍干盤中,用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。4.純度檢測及分子量檢測收集凍干后的純化產(chǎn)物，通過反向液相檢測多肽純度分析純度。本實驗成功采用固相合成法合成了血管生成抑制劑多肽，此方法重復(fù)性高，可操作性強(qiáng)，污染少；實驗可采用Rink樹脂來合成多肽，相對其它樹脂比較穩(wěn)定，副反應(yīng)少，工藝粗品峰型較好,純化相對收率高,所以成本相對較低。結(jié)果合成的多肽經(jīng)反向液相色譜分析進(jìn)行純度鑒定結(jié)果為96. 18%，純度均大于95%，符合設(shè)計要求。實施例2血管生成抑制劑對幾種靶點酶的抑制作用。實驗方法重組人基質(zhì)金屬蛋白酶-9由Sf9昆蟲細(xì)胞表達(dá).該酶用0.0 Iii M的基質(zhì)金屬蛋白酶-3活性位點活化，所用的緩沖液為100 mM Tris/HCl，pH 7.4,100 mM NaCl,
10mM CaCl2 andO. 01% Tween-20?；罨瘯r基質(zhì)金屬蛋白酶_9的濃度為92ng/y I (I y M)。酶活力的檢測是通過切割熒光產(chǎn)生多肽底物Mca-Pr0-LeU-Gly-LeU-Dpa-Ala-Arg-NH2并檢測產(chǎn)生的熒光值實現(xiàn)的(激發(fā)波長=328nm，檢測波長=392nm).所有的檢測在37°C下100 u I反應(yīng)體系中進(jìn)行。重組人基質(zhì)金屬蛋白酶-8的檢測與-9的檢測類似并使用同樣的熒光產(chǎn)生底物。反應(yīng)也是在37°C下100 ill反應(yīng)體系中進(jìn)行。檢測時向反應(yīng)體系中加20iU重組人基質(zhì)金屬蛋白酶-8(2ng/iil).底物的終濃度為IOii M。重組人基質(zhì)金屬蛋白酶-3用另外一個突光產(chǎn)生底物Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nval-Trp-Arg-Lys (Dnp)-NH2 來檢測(激發(fā)波長= 320 nm,發(fā)射波長= 405 nm)。反應(yīng)在37°C下100 ill反應(yīng)體系中進(jìn)行。反應(yīng)開始時向反應(yīng)體系中加10 ill基質(zhì)金屬蛋白酶-3存儲液(I ng/u I)底物的終濃度為10 PM。腫瘤壞死因子釋放酶的活力是通過切割熒光產(chǎn)生底 物Mca-Pro-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Dpa-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-NH 檢測的(激發(fā)波長= 320 nm,發(fā)射波長= 405 nm)。反應(yīng)在37°C下100 ill反應(yīng)體系中進(jìn)行。反應(yīng)開始時向反應(yīng)體系中加4 ill基質(zhì)金屬蛋白酶-3存儲液(I ng/u I)底物的終濃度為10 PM。結(jié)果新設(shè)計的多肽保留了對幾種靶點酶的抑制作用，如表I所示。表I.血管生成抑制劑對幾種基質(zhì)金屬蛋白酶和腫瘤壞死因子釋放酶的抑制作用
多肽對MMP-9的對MMP-8的對MMP-3的對TACE的
IC50 (|xM) IC50 (|iM) IC50 (|iM) IC50 (|iM)
多肽 I0.80.152801.5
多肽 II0.160.03632015.0
多肽 III5.68.42608.0
多肽 IV12.517.62407.0實施例3血管生成抑制劑多肽對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的遷移抑制試驗將10 mg/ml Matrigel (BD公司，USA)用HUVEC專用培養(yǎng)基以I : 2稀釋，涂布于transwell小室膜上，室溫風(fēng)干。將培養(yǎng)到對數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞消化，收集，計數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整到I X IO5個/ml。將細(xì)胞接種到transwell小室中，每孔100 yl，并且將各組試驗用液加入小室中。24孔板中加入0. 6ml含5%胎牛血清和1% ECGS的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液刺激細(xì)胞遷移，于5% 0)2，371培養(yǎng)2411。棄去孔中培液，細(xì)胞定，染色，清水漂凈，顯微鏡下觀察并選擇四個視野拍照計數(shù)。按照公式計算遷移抑制率(migration inhibition, MI)
NtestMI (%) = I--x100%
Ncontrol其中Nt6st為測試組的細(xì)胞遷移數(shù)，Ncontrol為空白對照組的細(xì)胞遷移數(shù)。表2.血管生成抑制劑多肽I，II，III，IV對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)遷移抑制作用組別(n=8)劑量(jig/ml) j 遷移細(xì)胞數(shù) ~MI (%)~
j Mean ± SD
多肽 I1! 742.6±277.7**65.54%
j
權(quán)利要求
1.血管生成抑制劑多肽，其特征在于其氨基酸序列為 在序列 Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu (其中 Pyr 為 3-(3-卩比唳基)_L_ 丙氨酸，Bip為L-4，4’ -聯(lián)苯丙氨酸)的N端或C端加上血管抑制多肽序列X或序列Y，或序列Z，其中X的序列為 Ile-Val -Ar g-Ar g-A I a-A sp -Ar g-A I a-A I a-Va I -Pr o, Y 的序列為 Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly, Z 的序列為 Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proo
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血管抑制多肽序列，其特征在于所述的多肽序列包括 多月太 I IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-GIY-Glu (其中Pyr為3- (3-吡啶基)-L-丙氨酸，Bip為L-4，4’ -聯(lián)苯丙氨酸);多妝 II IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu (其中 Pyr 為 3-(3-卩比唳基)-L-丙氨酸,Bip 為 L_4,4’ -聯(lián)苯丙氨酸)；多月太 III Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu-IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (其中Pyr為3- (3-吡啶基)L丙氨酸，Bip為L-4，4’ -聯(lián)苯丙氨酸);多月太 IV Pro-Pyr-Cys-Bip-Arg-Gly-Glu—Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-A sp -Ar g-A I a-A I a-Va I -Pr O (其中 Pyr 為 3- (3-卩比唳基)-L-丙氨酸，Bip 為 L-4,4’-聯(lián)苯丙氨酸)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2任意一項所述的血管生成抑制劑在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤為起源于人的頭頸部、腦部、甲狀腺、食管、胰腺、肺臟、肝臟、胃、乳腺、腎臟、膽囊、結(jié)腸或直腸、卵巢、子宮頸、子宮、前列腺、膀胱或睪丸的原發(fā)或繼發(fā)的癌、黑色素瘤、血管瘤以及肉瘤。
4.根據(jù)權(quán)利要求根據(jù)權(quán)利要求1、2任意一項所述的血管生成抑制劑，其特征在于所述的多肽共價連接佐劑，佐劑是牛血清白蛋白、人血清白蛋白或聚乙二醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2任意一項所述的血管生成抑制劑多肽在制備治療或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求3血管生成抑制劑在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物組合物可通過多種給藥方式治療原發(fā)或繼發(fā)的癌、黑色素瘤、血管瘤及肉瘤，包括皮下或肌肉注射，靜脈注射或者靜脈滴注，口服給藥如藥丸、膠囊等，鼻噴劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2任意一項所述的血管生成抑制劑的制備方法，其特征在于所述的多肽是通過合成方法制備而得。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及具有抑制幾種基質(zhì)金屬蛋白酶和抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的血管生成抑制劑，可用于實體腫瘤和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療。所述的多肽具體是指多肽I、多肽II、多肽III和多肽IV(見Seq NO.1、Seq NO.2、Seq NO.3、Seq NO.4)；這些多肽可用于治療實體腫瘤和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。該四種血管生成抑制劑在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤為起源于人的頭頸部、腦部、甲狀腺、食管、胰腺、肺臟、肝臟、胃、乳腺、腎臟、膽囊、結(jié)腸或直腸、卵巢、子宮頸、子宮、前列腺、膀胱、睪丸的原發(fā)或繼發(fā)的癌、黑色素瘤、血管瘤以及肉瘤。
文檔編號A61P35/00GK102746380SQ20121025804
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月25日
發(fā)明者胡加亮, 邱鄭 申請人:中國藥科大學(xué)