專利名稱：融合蛋白、藥物組合物及預防或治療癌癥的方法
融合蛋白、藥物組合物及預防或治療癌癥的方法相關(guān)申請的交叉引用本申請要求于2011年7月25日在韓國知識產(chǎn)權(quán)局提交的韓國專利申請No. 10-2011-0073635的權(quán)益，其公開內(nèi)容通過引用全部引入本文中。電子提交材料的通過引用的引入在本文中通過引用全部引入的是與此同時提交且鑒別如下的計算機可讀的核苷酸/氨基酸序列表2011年8月9日創(chuàng)建的名為“708782SequenceListing.TXT”的一份63，762字節(jié)的ASCII (文本)文件。
背景技術(shù)：
目前，用于治療的抗體的開發(fā)正在積極進行。這為用現(xiàn)有的合成藥物難以治療的 疾病提供了解決方案，并且正在取代合成藥物。目前，16種用于治療的抗體是可商購的，且約7000或更多種抗體在被全球約300家或更多的公司開發(fā)。這些抗體產(chǎn)品正使醫(yī)藥市場持續(xù)增長。血管發(fā)生對于所有癌組織中的細胞分化是必不可少的，且即使抑制血管發(fā)生的靶是已知的，由于其效率低，還沒有單獨的治療劑是可用的。此外，尚未開發(fā)出可廣泛用于各種癌癥的治療劑。二十年前，被稱為脂皮質(zhì)蛋白、依鈣蛋白、內(nèi)附蛋白等的蛋白質(zhì)被賦予標準名膜聯(lián)蛋白(Annexin),其已在過去的十年中使用。膜聯(lián)蛋白結(jié)合鈣和磷脂，并具有獨特的保守域，其中稱為內(nèi)附蛋白折疊的包括“GXGTDE” (SEQ ID NO :118)基序的約70個氨基酸序列重復4次(有時重復8次)。常規(guī)已知的膜聯(lián)蛋白包括保守域。蛋白質(zhì)取決于序列保守與否而被鑒定為膜聯(lián)蛋白。已知膜聯(lián)蛋白存在于從哺乳動物到霉菌的多種活生物體中，且已報道膜聯(lián)蛋白I、II、III、IV、V、VI、VII,VIII,XIII等存在于人類中。已知膜聯(lián)蛋白涉及骨的結(jié)構(gòu)形成和多種生物現(xiàn)象例如膜運輸、跨膜通道活性、磷脂酶A2的抑制、凝血抑制、有絲分裂信號的轉(zhuǎn)導和細胞-基質(zhì)相互作用的介導。雖然相關(guān)技術(shù)公開了通過使用結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的抗體遞送物質(zhì)的方法，但是沒有關(guān)于通過使用抗體治療癌癥的公開內(nèi)容。雖然另一相關(guān)技術(shù)公開了通過將針對癌癥的多重標記的抑制劑組合治療癌癥的方法，但是沒有公開使用膜聯(lián)蛋白Al作為標記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供包含(a)包括特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的第一蛋白質(zhì)和(b)包括誘導細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的多肽的第二蛋白質(zhì)的融合蛋白，以及包含所述融合蛋白和可藥用載體的藥物組合物和使用所述創(chuàng)造性的藥物組合物治療或預防癌癥的方法。額外的方面將在隨后的說明中部分闡述，和部分將從該說明中明晰，或者可通過所呈現(xiàn)的實施方式的實踐而獲知。


圖I是說明融合蛋白的示意圖，所述融合蛋白包含包括特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的第一蛋白質(zhì)和包括誘導作用于癌細胞的細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的多肽的第二蛋白質(zhì)。圖2是NdeI-XhoI片段的示意圖，所述NdeI-XhoI片段插入到用于根據(jù)實施方式的由以下構(gòu)成的融合蛋白表達的載體中包括特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的第一蛋白質(zhì)和包括誘導細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的多肽的第二蛋白質(zhì)。(GGGGS)接頭對應于 SEQ ID NO 120o圖3是說明融合蛋白的純化結(jié)果的照片，所述融合蛋白包含包括特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的第一蛋白質(zhì)和包括抗CD3的第二蛋白質(zhì)。根據(jù)實施方式，在各道中的L、FT、W和數(shù)字分別表示加載、流過、洗滌和咪唑摩爾濃度(mM)。圖4是AAlBPx⑶3-活化的T細胞對分離的膜聯(lián)蛋白Al-陽性/-陰性細胞的效 果的圖。細胞毒性T細胞克隆(由PMBC產(chǎn)生)與靶細胞(Ramos、SNU-1、SNU-2)混合并以10:1的效應物對靶(E:T)之比在AAlBPx⑶3的指示濃度下溫育3小時。顯示來自特異性靶溶解的重復三次測定的平均值，以百分比計。
具體實施例方式現(xiàn)在將詳細介紹實施方式，其實例在附圖中說明，其中相同的附圖標記始終是指相同的要素。在這方面，本發(fā)明的實施方式可具有不同的形式，且不應解釋為限于本文所闡述的說明。因此，以下僅通過參考附圖描述實施方式以解釋本說明的各方面。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，包含(a)包括特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的第一蛋白質(zhì)和(b)包括誘導細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的多肽的第二蛋白質(zhì)的融合蛋白可用于靶向在細胞表面表達膜聯(lián)蛋白Al的癌細胞。因此，本發(fā)明提供包含如下、基本上由如下組成或由如下組成的融合蛋白(a)包括特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的第一蛋白質(zhì)和(b)包括誘導細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的多肽的第二蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供含有融合蛋白及可藥用載體的藥物組合物，所述融合蛋白包含(a)包括特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的第一蛋白質(zhì)和(b)包括誘導細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的多肽的第二蛋白質(zhì)。如本文中使用的術(shù)語“融合蛋白”是指包括兩種或更多種(例如三種、四種、五種或更多種)蛋白質(zhì)的蛋白復合物，其通過兩種或更多種蛋白質(zhì)自身的化學結(jié)合或者是通過接頭的結(jié)合形成。已知膜聯(lián)蛋白(所述融合蛋白特異性結(jié)合的靶之一)存在于在從哺乳動物到霉菌的多種活生物體中，并且具有獨特的保守域，其中稱作內(nèi)附蛋白折疊的包括“GXGTDE” (SEQID NO :118)基序的約70個氨基酸序列重復4次(有時重復8次)。已知膜聯(lián)蛋白Al涉及多種生物現(xiàn)象例如膜運輸、跨膜通道活性、磷脂酶A2的抑制、凝血抑制、有絲分裂信號的轉(zhuǎn)導和細胞-基質(zhì)相互作用的介導。膜聯(lián)蛋白Al (膜聯(lián)蛋白的亞家族)也稱作脂皮質(zhì)蛋白I。例如，膜聯(lián)蛋白Al可由ANXAl基因編碼。膜聯(lián)蛋白Al屬于膜聯(lián)蛋白家族的Ca2+-依賴性的磷脂結(jié)合蛋白且可位于質(zhì)膜的胞質(zhì)面上。膜聯(lián)蛋白Al蛋白質(zhì)可具有約40kDa的分子量，具有磷脂酶A2抑制活性。另外，因為膜聯(lián)蛋白Al具有位于正常細胞內(nèi)部且由于癌癥的產(chǎn)生而遷移到細胞的外膜的特性，因此其可用作癌癥標記。因此，融合蛋白中的包括特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的第一蛋白質(zhì)可通過所述多肽特異性結(jié)合到癌細胞表面上的膜聯(lián)蛋白Al。如本文中使用的術(shù)語“特異性結(jié)合”與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的含義相同，且是指通過在兩種或更多種多肽或蛋白質(zhì)之間的共價鍵或非共價鍵的在分子間的特異性相互作用。例如，可包括抗原與抗體特異性相互作用以引起免疫反應的概念。如本文中使用的術(shù)語“多肽”是指由彼此通過肽鍵相互結(jié)合的氨基酸殘基形成的線性分子。特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽可具有例如4-200、4-100或4_50個氨基酸殘基。具有小于4個氨基酸殘基的多肽可具有低的對膜聯(lián)蛋白Al的結(jié)合親和性。具有超過200個氨基酸殘基的多肽可特異性結(jié)合到膜聯(lián)蛋白Al。多肽可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法制備，例如，基因克隆方法和固相合成技術(shù)。此外，多肽可以通過可商購的多肽文庫(例 如多肽文庫,噬菌體M13-多肽文庫等)經(jīng)驗地獲得。根據(jù)實施方式，第一蛋白質(zhì)可為全長抗體或其抗原結(jié)合片段。全長抗體具有擁有兩個全長輕鏈和兩個全長重鏈的結(jié)構(gòu)，并且各輕鏈通過二硫鍵(SS鍵)連接到各重鏈?？贵w的恒定區(qū)分為重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)，和重鏈恒定區(qū)具有Y、μ、α、δ和ε型以及Y I、Y 2、Y 3、Y 4、α I和α2亞類。輕鏈恒定區(qū)具有κ和λ型?？贵w包括，但不限于，單克隆抗體、雙特異性抗體、非人抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈Fv(scFv)、Fab片段、F(ab’ )片段、二硫鍵Fv (sdFV)、抗獨特型(抗-Id)抗體、及其表位結(jié)合片段。抗體可為人源化抗體或人抗體。非人抗體例如小鼠的人源化抗體可為包括得自如下的最小序列的嵌合免疫球蛋白小鼠免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段，例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’ )2或抗體的其他抗原結(jié)合亞序列。將非人抗體人源化的方法是本領(lǐng)域公知的。通常，人源化抗體具有從非人類供給源引入的一個或多個氨基酸殘基。人源化可通過使用對應于人抗體的序列基本上取代嚙齒動物的互補決定區(qū)(CDR)或CDR序列的部分進行。因此，比基本上完整的人抗體的可變區(qū)小的區(qū)域可被來自非人物種的相應序列取代。例如，人源化抗體可為其中通過來自嚙齒動物抗體中相似位點的殘基取代一些CDR殘基和可能的一些框架(FR)殘基的那些。人抗體是指其中重鏈和輕鏈的可變和恒定區(qū)序列得自人類的抗體，并可通過使用各種技術(shù)例如基因重組技術(shù)和基因工程產(chǎn)生。人抗體的效應部分可與人體免疫系統(tǒng)的其他部分相互作用。此外，人類免疫系統(tǒng)不將人抗體識別為外源物質(zhì)，因此，針對引入活的人體的抗體的免疫反應可顯著地比針對全部外源的非人抗體或部分外源的嵌合抗體的免疫反應不嚴重。此外，引入到活的人體的人抗體具有與天然存在的人抗體基本上相同的半衰期，因此施用的劑量和頻率可降低。如本文中使用的術(shù)語“嵌合”是指包括得自兩種不同物種的序列的抗體或抗原結(jié)合位點。如本文中使用的術(shù)語“抗原結(jié)合片段”是指免疫球蛋白的整體結(jié)構(gòu)的抗原可結(jié)合的片段。例如，抗原結(jié)合片段可為F(ab’)2片段、Fab’片段、Fab片段、Fv片段、或scFv片段，但不限于此。在抗原結(jié)合片段中，F(xiàn)ab片段含有輕鏈和重鏈的可變區(qū)、輕鏈的恒定區(qū)、和重鏈的第一恒定區(qū)(Chi)。Fab片段具有一個抗原結(jié)合位點。Fab’片段與Fab片段的不同在于Fab’片段具有在重鏈Chi域的C末端有至少一個半胱氨酸殘基的鉸鏈區(qū)。F(ab’)2抗體以在鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基形成二硫鍵產(chǎn)生。Fv片段是最小的抗體片段，其僅包含重鏈可變位點和輕鏈可變位點，且產(chǎn)生Fv片段的重組技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。雙鏈Fv片段可具有其中重鏈和輕鏈可變區(qū)通過非共價鍵連接的結(jié)構(gòu)，和單鏈Fv (scFv)片段可具有其中重鏈和輕鏈可變區(qū)經(jīng)由肽接頭共價結(jié)合、或在C-末端直接彼此連接的二聚體結(jié)構(gòu)。可通過使用蛋白酶獲得抗原結(jié)合片段(例如，整個抗體可通過木瓜蛋白酶消化以獲得Fab片段或通過胃蛋白酶消化以獲得F(ab’)2片段)，且可通過基因重組技術(shù)制備抗原結(jié)合片段。根據(jù)具體實施方式
，融合蛋白的第一蛋白質(zhì)可為具有由X1-Trp-Gly-His-X2-X3-Trp (SEQ ID NO :119)表示的氨基酸序列的多肽，其中XjP X2獨立地為選自 Ala、lie、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val、Asn、Cys、Gin、Gly、Ser、Thr、Tyr、Asp、Glu、Arg、His 和 Lys 的氨基酸，和 X3 是選自 Ala、lie、Leu、Met、Phe> Pro、Trp> Val、Asn、C ys>Gin、Gly、Ser、Thr 和 Tyr 的氨基酸。具有由 X1-Trp-Gly-His-X2-X3-Trp (SEQ ID NO: 119)表示的氨基酸序列的多肽可選自SEQ ID NO :1-8的氨基酸序列。根據(jù)實施方式，第一蛋白質(zhì)可選自具有SEQ ID NO :9_42的氨基酸序列的多肽。這些可為特異性結(jié)合到膜聯(lián)蛋白Al的多肽的氨基酸序列。這些可不為具有由表示X1-Trp-Glv-HiS-X2-X1-Trp 的氨基酸序列(SEQ ID NO: 119)的多肽。根據(jù)實施方式，第二蛋白質(zhì)可特異性結(jié)合細胞毒性淋巴細胞的表面標記。例如，表面標記可選自，但不局限于，CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、D16、CD28、CD56、CD57、和 TCR。根據(jù)實施方式，第二蛋白質(zhì)可為具有SEQ ID NO :116或SEQ ID NO :117的氨基酸序列的多肽。SEQ ID NO :116是包含小鼠抗-CD3的Vl的氨基酸序列，和SEQ ID NO:117是包含人抗-⑶3的Vh和\的氨基酸序列。根據(jù)實施方式，第二蛋白質(zhì)可為全長抗體或其抗原結(jié)合片段。全長抗體或其抗原結(jié)合片段是如上所述的。抗體或其抗原結(jié)合片段可包括保留特異性識別膜聯(lián)蛋白Al或細胞毒性淋巴細胞的表面標記的能力的變體。例如，可對抗體的氨基酸序列進行修飾以改善抗體的結(jié)合親和力和/或其他生物性質(zhì)。所述修飾包括例如抗體的氨基酸序列殘基的缺失、插入、和/或取代。該氨基酸修飾基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，例如，如疏水性、親水性、電荷、大小等的性質(zhì)。例如，精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His)都是帶正電的殘基，丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)都是類似大小的，以及苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)都具有大體相似的形狀。因此，基于這些考慮，Arg、Lys和His ;Ala、Gly和Ser ;以及Phe、Trp和Tyr可為生物功能等同物。在蛋白質(zhì)中通常不改變這樣的分子活性的氨基酸取代在本領(lǐng)域是已知的。最通常發(fā)生的交換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Se;r、Ala/Gly、Ala/Th;r、Se;r/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly?？紤]到具有生物等同活性的修飾，可理解，特異性結(jié)合細胞毒性淋巴細胞或膜聯(lián)蛋白Al的表面標記的抗體或其抗原結(jié)合片段，可還包括展現(xiàn)出與序列表中描述的序列相當同一性的序列。相當同一性可為當對任何其他序列進行比對以最大地對應序列表中的氨基酸序列并通過使用本領(lǐng)域典型使用的算法分析經(jīng)比對的序列時顯示至少60%同一性、至少70%同一性、至少80%同一性、或至少90%同一性(例如至少95%同一性或至少99%的同一性)的序列。用于序列比較的比對方法在本領(lǐng)域是已知的。例如，序列分析程序如blastp、blastx、tblastn 和 tblastx 可通過 NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)在互聯(lián)網(wǎng)上使用。根據(jù)實施方式，融合蛋白任選地可包括將第一蛋白質(zhì)和第二蛋白質(zhì)連接的接頭。用于本發(fā)明的合適的接頭在本領(lǐng)域是已知的且包括肽接頭(例如，由多個氨基酸殘基組成的)。只要融合蛋白的生物活性不受影響，融合蛋白可不包括接頭或包括一個或多個(例如，兩個、三個、四個或更多個)任意合適長度的接頭。盡管不希望受任何特定理論的束縛，但肽接頭可通過將包括特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的第一蛋白質(zhì)和包括誘導細胞毒性淋巴細胞的活性的多肽的第二蛋白質(zhì)以足夠的距離分開而允許融合蛋白的各蛋白質(zhì)折疊為合適的二級和三級結(jié)構(gòu)。例如，肽接頭可包括Gly、Asn和Ser殘基，和中性氨基酸如Thr和Ala。適于肽接頭的氨基酸序列是本領(lǐng)域已知的，并可為例如 Gly4-SeHSEQ ID NO : 120)、(Gly4-Ser)3(SEQ ID NO :121)或 Gly4-Ser-Gly5-Ser (SEQ ID NO :122)。肽接頭可連接到特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的N-和/或C-末端區(qū)。特別地，當肽接頭連接到多肽的N-末端和C-末端時，肽接頭可包括各半胱氨酸，且在各半胱氨酸之間可出現(xiàn)二硫鍵以容許所述多肽存在于兩個半胱氨酸之間。本發(fā)明還提供治療或預防受試者的癌癥的方法，包括將藥物組合物向受試者施用使得受試者中的癌癥得到治療或預防，所述藥物組合物包括融合蛋白和可藥用載體，所述融合蛋白包含如下、基本上由如下組成或由如下組成(a)包括特異性結(jié)合藥物有效量的膜聯(lián)蛋白Al的多肽的第一蛋白質(zhì)和(b)包括誘導細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的多肽的第二蛋白質(zhì)?？捎砂ㄋ鋈诤系鞍椎慕M合物治療或預防的癌癥可選自鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、肺的鱗狀細胞癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚或眼球中的黑色素瘤、直腸癌、肛門附近的癌癥、食道癌、小腸腫瘤、內(nèi)分泌腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴細胞性淋巴瘤、肝細胞瘤、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、大腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺腫瘤、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、以及頭頸癌，但不限于此。所述組合物通過結(jié)合癌細胞表面上的膜聯(lián)蛋白和結(jié)合細胞毒性淋巴細胞表面上的表面標記(例如CD3)而治療或預防癌癥。盡管不希望受任何特定理論的束縛，但據(jù)信，所述組合物通過將細胞毒性淋巴細胞定位在癌細胞附近來治療或預防癌癥，該癌細胞隨后被細胞毒性淋巴細胞分泌的細胞毒性顆粒破壞。如圖I所示，融合蛋白140包含包括特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的第一蛋白質(zhì)和包括誘導作用于癌細胞120的細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的多肽的第二蛋白質(zhì)。融合蛋白140特異性結(jié)合癌細胞120表面上的膜聯(lián)蛋白130和細胞毒性淋巴細胞100表面上的表面標記110兩者。通過將細胞毒性淋巴細胞100定位于癌細胞120周圍，可通過細胞毒性淋巴細胞100分泌的細胞毒性顆粒特異性殺死癌細胞120，而不影響正常細胞。因此，創(chuàng)造性的融合蛋白(例如，在藥物組合物中)特異性靶向癌細胞以進行破壞，而不影響正常(非癌)細胞。
所述組合物中包括的可藥用載體是在制劑中通常使用的，并可包括，但不限于，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯樹膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、及礦物油。除了所述組分之外，所述藥物組合物可額外地包括潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、增味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。預防或治療癌癥的組合物可口服或腸胃外施用。腸胃外施用可包括靜脈注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射、內(nèi)皮施用、局部施用、鼻內(nèi)施用、肺內(nèi)施用和直腸施用。由于口服施用導致蛋白質(zhì)或肽的消化，可將活性劑包覆或配制在藥物組合物中以保護所述組合物免于在胃中分解。此外，所述組合物可通過任意具有朝向特定細胞的靶向能力的裝置施用。預防或治療癌癥的組合物的合適劑量可取決于許多因素，如配制方法、施用方法、病人的年齡、體重、性別、病理狀況、飲食、施用時間、施用途徑、排泄速度、和反應敏感性。對于成年人，所述組合物的劑量可在約O. 001-約100mg/kg的范圍內(nèi)。如本文使用的術(shù)語“治療有效量”是指用于預防或治療癌癥的足夠量。 可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法，將所述組合物與可藥用載體和/或賦形劑配制為單位劑型或多重劑型。制劑可為溶液、懸浮液、糖漿、或在油或水性介質(zhì)中的乳液、提取物、粉劑、粉末、顆粒、片劑、或膠囊，且可額外地包括分散劑或穩(wěn)定劑。此外，所述組合物可以作為單獨的治療劑施用，或與其他治療劑組合施用，并可與常規(guī)治療劑順序或同時施用。所述組合物可包含抗體或其抗原結(jié)合片段，因此可配制為免疫脂質(zhì)體?？墒褂帽绢I(lǐng)域公知的任意方法制備含有抗體的脂質(zhì)體。免疫脂質(zhì)體是包括磷脂酰膽堿、膽固醇和聚乙二醇衍生的磷脂?；掖及返闹|(zhì)組合物，并可例如通過反相蒸發(fā)法制備。例如，抗體的F(ab' )2片段可通過二硫鍵交換反應附接于脂質(zhì)體?？蓪㈩A防或治療癌癥的藥物組合物施用的受試者包括所有的動物。例如，所述受試者可為人或例如狗、貓、嚙齒動物(例如小鼠、大鼠、豚鼠或倉鼠)的動物，以及除人以外的靈長類動物。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，用于制備融合蛋白的方法包括培養(yǎng)包括編碼融合蛋白的多核苷酸序列的細胞，所述融合蛋白包含以下、基本上由以下組成、或由以下組成包括特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的第一蛋白質(zhì)和包括誘導細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的多肽的第二蛋白質(zhì)(例如，其中第二蛋白質(zhì)可連接到第一蛋白質(zhì)的末端)；和獲得由在細胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的培養(yǎng)物表達的蛋白質(zhì)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的各種方法進行轉(zhuǎn)化細胞的培養(yǎng)。例如,體內(nèi)或體外分泌的蛋白質(zhì)可通過如下獲得將轉(zhuǎn)化細胞接種入YT液相培養(yǎng)基中以進行培養(yǎng)，在當細胞密度達到一定水平的時間點處向培養(yǎng)基中加入IPTG以誘導通過IacZ啟動子的蛋白質(zhì)表達，和培養(yǎng)所述蛋白質(zhì)。可通過本領(lǐng)域已知的各種純化方法以純化形式得到體內(nèi)或體外分泌的蛋白質(zhì)。例如，可通過純化方法例如通過硫酸銨的溶解度分級、以及大小分級和過濾與各種色譜分離方法(對于根據(jù)大小、疏水性或親水性的分離制造的)，以純化形式得到蛋白質(zhì)。例如，當融合蛋白融合到GST和6x His時，可通過分別使用結(jié)合了谷胱甘肽的樹脂柱和Ni2+-NTAHis-結(jié)合樹脂柱容易地獲得所需的蛋白質(zhì)。實施例下面的實施例進一步說明本發(fā)明，但是當然不應該以任何方式解釋為限制其范圍。實施例I :特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的篩選(I)生物淘選編碼膜聯(lián)蛋白Al的多核苷酸是由Genotech, Inc.化學合成的，并用于表達膜聯(lián)蛋白Al以進行分離和純化。將膜聯(lián)蛋白Al固定到板上，向其加入噬菌體展示多肽文庫(DyaxCorp.)以進行結(jié)合，并通過各種結(jié)合時間和洗滌條件選擇以高親和力結(jié)合的多肽表達噬菌體。使用珠淘選方法作為所述淘選。具體地，將表面上固定有抗生蛋白鏈菌素的磁珠與生物素綴合的膜聯(lián)蛋白Al混合，并在4° C攪拌混合物18小時以將蛋白質(zhì)固定在磁珠表面上。在室溫下用脫脂乳將其上固定蛋白質(zhì)的磁珠封閉2小時，然后添加在所述珠的表面上展示多肽的噬菌體溶液。將得到的產(chǎn)物攪拌2小時進行反應，并用PBS溶液(I. 06mMKH2PO4,155. 17mM NaCl，和 2. 97mM Na2HP04_7H20)和含 0. 1% Tween20 的 PBS 溶液洗滌。僅分離出結(jié)合抗原的噬菌體。根據(jù)在淘選后獲得的噬菌體數(shù)進行淘選過程兩次或三次。(2)特異性結(jié)合于噬菌體ELISA和膜聯(lián)蛋白Dl的多肽序列的鑒定將在淘選過程中得到的噬菌體克隆各自用大腸桿菌(E. Coli)XLl-Blue感染，并在約37° C培養(yǎng)14小時以獲得噬菌體溶液。將膜聯(lián)蛋白Al添加到96孔微量滴定板(Nunc，Inc.)，并容許在約4°C放置18小時以將蛋白質(zhì)固定在板表面上。在室溫下用脫脂乳將其上固定蛋白質(zhì)的板封閉I小時，然后加入100 μ L嗤囷體溶液。在室溫下使嗤囷體與蛋白質(zhì)反應2小時，并用含O. I % Tween20的PBS溶液洗滌混合物。隨后，在室溫下向反應混合物中加入與噬菌體特異性反應的HRP綴合的抗-M13抗體(GE Healthcare)以反應I小時，然后用含O. 1% Tween20的PBS溶液洗滌兩次。最后，向板的各孔加入100 μ L三甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物(Sigma)以誘導顯色反應。隨后加入50 μ L5N H2SO4溶液以停止反應，然后用板閱讀器(Molecular Devices)測量 OD45c!值。結(jié)果，總共鑒定出42個與膜聯(lián)蛋白Al具有高反應性的噬菌體克隆。使用引物組(SEQ ID NO :114和SEQ ID NO :115)進行菌落PCR以從噬菌體的單克隆中鑒定編碼特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的核苷酸序列。通過使用GeneAmp PCR System9700 (AppliedBiosystem)進行PCR，PCR條件如下在94°C 5分鐘；在94°C I分鐘、在60°C I分鐘和在720C I. 5分鐘的連續(xù)反應重復30次；在72°C 10分鐘；和在4°C冷卻。隨后，進行由溶液獲得的多核苷酸片段的洗滌和序列分析(Solgent)，并鑒定特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽序列(表I)。表I鑒定了展示在噬菌體上展示的多肽部分(不包括肽接頭)，即特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的氨基酸序列和相應的核酸序列。[表 I]
權(quán)利要求
1.融合蛋白，包含 (a)包括特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白Al的多肽的第一蛋白質(zhì)，和 (b)包括誘導細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的多肽的第二蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求I的融合蛋白，其中所述融合蛋白進一步包括連接所述第一蛋白質(zhì)和所述第二蛋白質(zhì)的接頭。
3.權(quán)利要求I的融合蛋白，其中所述第一蛋白質(zhì)是全長抗體或其抗原結(jié)合片段。
4.權(quán)利要求I的融合蛋白，其中所述第一蛋白質(zhì)包括氨基酸序列X1-Trp-Gly-His-X2-X3-Trp(SEQ ID NO:119)， 其中 X1 和 X2 獨立地為選自 Ala、lie、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val、Asn、Cys、Gin、Gly、Ser、Thr、Tyr> Asp、Glu、Arg、His 和 Lys 的氨基酸，和 其中 X3 是選自 Ala、lie、Leu、Met、Phe> Pro> Trp、Val、Asn、Cys、Gin、Gly、Ser、Thr 和Tyr的氨基酸。
5.權(quán)利要求4的融合蛋白，其中所述氨基酸序列選自SEQID N0:l-8。
6.權(quán)利要求I的融合蛋白，其中所述第一蛋白質(zhì)包括選自SEQID N0:9-42的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求I的融合蛋白，其中所述第二蛋白質(zhì)特異性結(jié)合細胞毒性淋巴細胞的表面 T 己 O
8.權(quán)利要求7的融合蛋白，其中所述表面標記選自⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶7、⑶8、⑶16、CD28、CD56、CD57 和 TCR。
9.權(quán)利要求7的融合蛋白，其中所述第二蛋白質(zhì)包括SEQID NO: 116或SEQ ID NO: 117的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其中所述第二蛋白質(zhì)是全長抗體或其抗原結(jié)合片段。
11.藥物組合物，包括權(quán)利要求I的融合蛋白和可藥用載體。
12.在受試者中治療或預防癌癥的方法，包括將權(quán)利要求11的藥物組合物向受試者施用，由此在受試者中預防或治療癌癥。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述癌癥選自鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、肺的鱗狀細胞癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚或眼球中的黑色素瘤、直腸癌、肛門附近的癌癥、食道癌、小腸腫瘤、內(nèi)分泌腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴細胞性淋巴瘤、肝細胞瘤、胃腸癌、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、大腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺腫瘤、腎癌、肝癌、前列腺癌、夕卜陰癌、甲狀腺癌、及頭頸癌。
全文摘要
本發(fā)明提供包含(a)包括特異性結(jié)合膜聯(lián)蛋白A1的多肽的第一蛋白質(zhì)和(b)包括誘導細胞毒性淋巴細胞的細胞毒性活性的多肽的第二蛋白質(zhì)的融合蛋白、包含所述融合蛋白的藥物組合物、以及通過施用所述藥物組合物治療或預防癌癥的方法。
文檔編號A61P35/00GK102898527SQ201210258020
公開日2013年1月30日 申請日期2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月25日
發(fā)明者李在日 申請人:三星電子株式會社