維康醇在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明研究維康醇對(duì)HeLa細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期調(diào)控的影響，經(jīng)過(guò)不同濃度維康醇處理24小時(shí)的HeLa細(xì)胞，細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示G1期細(xì)胞含量明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)；Western?blot結(jié)果顯示維康醇能夠降低HeLa細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)；同時(shí)ELISA結(jié)果也表明維康醇能下調(diào)CDK4的表達(dá)，并增強(qiáng)CDK抑制劑P21的表達(dá)；RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果也揭示了，經(jīng)維康醇能降低HeLa細(xì)胞中cyclinD1，CDK2，CDK4的mRNA水平，上調(diào)P21在mRNA水平上的表達(dá)。說(shuō)明維康醇將HeLa細(xì)胞阻滯在G1期，從而使細(xì)胞的增殖受到抑制。
【專利說(shuō)明】維康醇在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種云南紫杉樹皮中提取的影響腫瘤細(xì)胞增殖及周期調(diào)控的化合物，屬于腫瘤局部介入治療藥物開發(fā)領(lǐng)域的維康醇在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是指人體器官組織的細(xì)胞，在外來(lái)和內(nèi)在有害因素的長(zhǎng)期作用下所產(chǎn)生的一種以細(xì)胞過(guò)度增殖為主要特點(diǎn)的新生組織。這種新生組織與受累器官的生理需要無(wú)關(guān)，不按正常器官的規(guī)律生長(zhǎng)，破壞了原來(lái)器官結(jié)構(gòu)，喪失正常細(xì)胞的功能，從而使細(xì)胞呈現(xiàn)異常的形態(tài)，細(xì)胞的功能和代謝發(fā)生紊亂。另外，腫瘤細(xì)胞還能向周圍浸潤(rùn)蔓延，甚至擴(kuò)散轉(zhuǎn)移到其他器官組織，危及生命。
[0003]目前，惡性腫瘤已成為危害人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，僅次于心腦血管疾病，位列致死病因的第二位.世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，到2020年，將有2000萬(wàn)新發(fā)癌癥病例，其中死亡人數(shù)達(dá)1200萬(wàn)，且絕大部分將發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。臨床常用治療腫瘤的方法有外科手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法，但這些方法通常具有嚴(yán)重的副作用，患者常因免疫功能受創(chuàng)，出現(xiàn)遠(yuǎn)處播散、腫瘤轉(zhuǎn)移，使得生活質(zhì)量下降、生存期縮短。因而近年來(lái)從天然藥物中尋找高效低毒的抗腫瘤藥物成為研究熱點(diǎn)，迄今已成功開發(fā)出紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、足葉乙甙等一大批植物中獲取的化學(xué)成分并已成功應(yīng)用到惡性腫瘤的一線臨床治療中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于維康醇對(duì)HeLa腫瘤細(xì)胞增殖及對(duì)此細(xì)胞周期調(diào)控的影響進(jìn)行研究，尋找其作用靶點(diǎn)，為維康醇將來(lái)的研究和開發(fā)提供理論依據(jù)的維康醇在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的目的是通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn)的
[0006]其實(shí)驗(yàn)方法:
[0007](1)主要試劑的配制，其中包括DMEM培養(yǎng)基配制、維康醇的配制、胰酶的配制、PI染色液的配制
[0008](2)細(xì)胞培養(yǎng)
[0009](3) Hechs染色觀察細(xì)胞形態(tài)
[0010](4)細(xì)胞周期測(cè)定
[0011](5)Western Blotting實(shí)驗(yàn),其中包括主要試劑配制、樣品制備、蛋白含量測(cè)定、樣品進(jìn)行SDS.PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜
[0012](6)Cyclin Dl，Cdk4，P2I 含量的測(cè)定
[0013](7)半定量RT-PCR，其中包括細(xì)胞總RNA的提取、cDNA第一條鏈合成、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳
[0014]⑶數(shù)據(jù)處理
[0015](9)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中包括Hoechst33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)、維康醇對(duì)HeLa細(xì)胞周期調(diào)控的影響、維康醇抑制細(xì)胞周期蛋白(cyclin Dl)的表達(dá)、維康醇對(duì)HeLa細(xì)胞中Cyclin D1，⑶K4，P21表達(dá)的影響、半定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白mRNA水平的表達(dá)
[0016]維康醇是一種分子量為352，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖一，它是從云南紫杉樹皮中獲取一種微生物菌誘變株，經(jīng)過(guò)發(fā)酵、純化等工藝從該菌的菌絲體及培養(yǎng)基中分離出一種新型單體化合物。到目前為止，維康醇的抗腫瘤作用未見(jiàn)研究。因此，本研究的目的就是對(duì)維康醇抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)理進(jìn)行初步研究，尋找其作用靶點(diǎn)，為維康醇將來(lái)的研究和開發(fā)提供理論依據(jù)。
[0017]本實(shí)驗(yàn)擬采用SRB法，檢測(cè)不同濃度維康醇對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞株的增殖抑制作用來(lái)研究維康醇的抗腫瘤機(jī)制。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0018]圖1為配制lmg/ml的BSA(牛血清白蛋白)，0.15Μ NaCl，在取樣管中加入試劑的量
[0019]圖2為cDNA合成體系
[0020]圖3為擴(kuò)增體系
[0021]圖4為擴(kuò)增引物及退火溫度
[0022]圖5為Hoechst33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)
[0023]圖6為流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期
[0024]圖7為維康醇抑制細(xì)胞周期蛋白(cyclin Dl)的表達(dá)
[0025]圖8為維康醇對(duì)HeLa細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)量的影響
[0026]圖9為半定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明:
[0028]具體方案:
[0029]步驟1:主要試劑的配制:(I)DMEM培養(yǎng)基的配制:將DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基10.3g，NaHC033.7g，加1000ml超純水?dāng)嚢枞芙?，調(diào)整PH = 7.2-7.4，加入青霉素和鏈霉素，其終濃度都是100U/ml，貯存于4°C備用，0.22 μ m濾膜過(guò)濾除菌分裝，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们凹尤?0%胎牛血清，即為完全培養(yǎng)基。(2)維康醇的配制:稱取維康醇Img放入0.5mL離心管中，加入DMSO 4μ I將其溶解，即為50mg/ml維康醇母液。臨用前無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。(3)胰酶的配制:配制濃度為0.25%胰蛋白酶。稱取胰蛋白酶
0.25g，溶于100ml PBS中，加NaHC03調(diào)pH7.2，充分溶解后，過(guò)濾除菌，IOml小瓶分裝后保存于-20°C，用前融化。(4)PI染液的配制:稱取PI 5mg、RNase 5mg、枸櫞酸納100mg、然后量取 1.0% Triton X-100 0.25ml、生理鹽水 65ml，加蒸餾水至 100ml，調(diào) pH 值 7.2-7.6，用棕色瓶子分裝，4 °C避光保存。
[0030]步驟2:細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的完全培養(yǎng)基中，置于37°C，5% C02，95%空氣和100%飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞每?jī)商靷鞔鷵Q液一次。
[0031]步驟3 =Hechs染色觀察細(xì)胞形態(tài)，取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成懸液，用血球細(xì)胞板計(jì)數(shù)，配成2 X 105/ml，取放有蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加細(xì)胞懸液3ml，將每組藥液分別加入各孔中。將細(xì)胞板放在37°C，于5%CO2的培養(yǎng)箱中分別孵育24h后取出。取出載玻片，加I滴混合Hoechst熒光染色液:壓上爬滿細(xì)胞的蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)。
[0032]步驟4:細(xì)胞周期測(cè)定，細(xì)胞經(jīng)過(guò)維康醇處理24h后，收集細(xì)胞于離心管中，離心去除上清,加預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇3ml邊加邊震蕩，使細(xì)胞完全分散，后置4°C冰箱過(guò)夜，然后離心棄去乙醇，加PBS洗2遍,最后加配好的PI染液(0.05mg/ml), RNaseA(0.5mg/ml)避光染色30min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞周期所占的比例。激發(fā)波長(zhǎng)Ex =488nm ;發(fā)射波長(zhǎng) Em = 650nm。
[0033]步驟5:ffestern Blotting
[0034](I)主要試劑:10X轉(zhuǎn)移緩沖液、TBS緩沖液、TBST緩沖液、轉(zhuǎn)移平衡液、封閉液、考馬斯亮藍(lán)G-250、SDS聚丙烯酰胺凝 膠
[0035](2)樣品制備:將細(xì)胞培養(yǎng)至80-90%融合時(shí)，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至2X105個(gè)/ml，加入細(xì)胞瓶中培養(yǎng)24h后，加入含不同濃度的維康醇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。棄掉上清，用PBS清洗細(xì)胞2次，用胰酶消化，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中，加入100 y L含PMSF的裂解液，置冰上裂解30min，不時(shí)輕彈管壁以便裂解均勻。然后用液氮反復(fù)凍融三次，于
4。。，12，000 Xg離心15min。將上清分裝，_70°C保存。
[0036](3)蛋白含量測(cè)定
[0037]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:配制lmg/ml的BSA(牛血清白蛋白)，()? 15M NaCl，按下表在取樣管中加入試劑。(見(jiàn)附圖1)混勻后，加96孔板每孔150iU，室溫放置2min，酶標(biāo)儀595nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0038]檢測(cè)樣品蛋白含量:取樣品4iU，0.15MNaCl 16 yl，考馬斯亮藍(lán)G-250溶液1ml，混勻。于595nm處測(cè)定吸光度，從蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算相對(duì)應(yīng)的蛋白含量，將樣品用電泳緩沖液調(diào)成等蛋白含量，加入1/4體積的5XSDS-PAGE上樣緩沖液，沸水浴5min后，-70°C保存。
[0039](4)樣品進(jìn)行SDS.PAGE電泳:將上述樣品(約為20 yl)上樣，電泳(10 %SDS-PAGE膠)，40V 30min, 60V 3h后，終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
[0040](5)轉(zhuǎn)膜:剪切與凝膠尺寸一致的2張濾紙和I張硝酸纖維素膜，一般下濾紙>膜>膠>上濾紙，將凝膠及硝酸纖維素膜浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中30分鐘，并用轉(zhuǎn)移緩沖液將濾紙浸濕。在陽(yáng)極(石墨板)一側(cè)依次放上I張濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠及I張濾紙(用玻璃移液管排除所有的氣泡)，與陰極一側(cè)連接后，接通電源，在23V條件下轉(zhuǎn)移40min。用含5%脫脂奶粉的封閉緩沖液封閉硝酸纖維素膜2h，用TBST緩沖液洗膜5次，5min/次，4°C下用一抗孵育過(guò)夜(兔抗人Cyclin Dl抗體，I: 200)。再用0.1 % TBST洗膜5次，5min/次，室溫下用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育2h(抗兔，I: 1000) ；0.1% TBST洗膜3次，IOmin/次。SantaCruz敏感曝光試劑盒曝光底片顯影,并用Gel-PRO Analyzer軟件分析結(jié)果。
[0041]步驟6 =Cyclin Dl, Cdk4，P21 含量的測(cè)定
[0042]本實(shí)驗(yàn)采用的是生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定樣品中人周期素依賴性激酶4(CDK4)、細(xì)胞周期素Dl以及P21的水平。向預(yù)先包被了人周期素依賴性激酶4(⑶K4)單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入周期素依賴性激酶4 (⑶K4)，溫育；溫育后，加入生物素標(biāo)記的抗⑶K4抗體，再與鏈霉親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中人周期素依賴性激酶4(CDK4)的濃度呈正相關(guān)
[0043]具體步驟如下:
[0044](I)試驗(yàn)前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫(20_25°C )。
[0045](2)取出所需數(shù)量的板條，其余密封放回4°C。
[0046](3)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:設(shè)定5個(gè)濃度，每個(gè)濃度兩個(gè)復(fù)孔，每孔中各加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100uL。首先在小試管中加入120 μ I的原倍標(biāo)準(zhǔn)品，再加入120 μ I的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，即濃度為12ng/ml ;再取120 μ I前次標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，然后加入120 μ I的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，此時(shí)濃度為6ng/ml ;依次類推，得到3，1.5,0.75ng/ml的稀釋液。
[0047](4)加樣:待測(cè)樣品孔:加入樣本40 μ I，然后各加入抗-CCNDl抗體10 μ 1、鏈酶親和素-HRP50y 1，蓋上封板膜，輕輕振蕩混勻，即2: 3稀釋。
[0048](5)將反應(yīng)板置37°C，60分鐘。
[0049](6)洗板:小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
[0050](7)顯色:每孔先加入顯色劑Α50μ I,再加入顯色劑Β50μ I,輕輕震蕩混勻。
[0051](8)37°C避光顯色10分鐘。
[0052](9)每孔加終止液50 μ I，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)
[0053](10)測(cè)定:在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(0D值)。測(cè)定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
[0054]所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品12、6、3、1.5,0.750ng/ml之OD值在半對(duì)數(shù)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將濃度作為X軸(對(duì)數(shù)軸)，OD值作為Y軸(線性軸)。曲線應(yīng)為一光滑曲線。根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)Cyclin Dl，Cdk4，P21含量。(此時(shí)所查出的目的蛋白的量為稀釋I倍后的濃度值，因此還須再乘以稀釋倍數(shù))
[0055]步驟7:半定量RT-PCR
[0056](I)細(xì)胞總RNA的提取:用Trizol試劑按說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，藥物處理后的HeLa細(xì)胞，用胰酶消化，并收集與1.5ml的EP管，加入0.5ml Trizol試劑，混勻后室溫下放置5min，使核蛋白和核酸完全分離；加入0.1ml氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15s后室溫放置3min ；4°C, 12000rpm離心IOmin,此時(shí)樣品分三層,上兩層為水相,最底下一層為有機(jī)相，RNA主要在最上面一層的水相中，把水相轉(zhuǎn)移的新的EP管中(大約250 μ I)，進(jìn)行下一步操作(注:不要吸任何中間層物質(zhì)，否則會(huì)出現(xiàn)染色體DNA污染)；然后緩慢加入等體積異丙醇，在-20°C放置lh，然后4°C，12000rpm離心lOmin，此時(shí)可見(jiàn)微量沉淀，去除上清液；再加入75%乙醇Iml震蕩，于4°C,7500rpm離心5min,棄掉上清；按照上述步驟再清洗兩次,棄掉上清。將EP管置于超靜工作臺(tái)通風(fēng)lOmin，以充分晾干，如有漂洗殘留物，可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)后續(xù)的操作。最后，在新的EP管中，加入30 μ I RNase_freeddH20,室溫放置2min,室溫，12000rpm 離心 2min，得到 RNA，RNA 在 _70°C儲(chǔ)存。
[0057](2) cDNA第一條鏈合成
[0058]cDNA合成體系見(jiàn)附圖2
[0059](3) PCR 擴(kuò)增[0060]擴(kuò)增體系見(jiàn)附圖3
[0061]擴(kuò)增的反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性5min,94°C變性30s,不同引物選擇不同溫度退火45s，72°C延伸45s，循環(huán)35次或者30次后于72°C延伸lOmin，得PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物短期儲(chǔ)存在_20°C，長(zhǎng)期儲(chǔ)存在_70°C，(注:盡量避免反復(fù)凍融)。
[0062]擴(kuò)增引物及退火溫度見(jiàn)附圖4
[0063](4)瓊脂糖凝膠電泳:瓊脂糖凝膠的配置:1.6g瓊脂糖溶于80ml PH為8的TBE溶液，于微波爐煮沸3次，置于室溫，待溫度下降只50-60°C之間，加入8 u I Golden View,搖勻，注意不要搖出氣泡，混勻后倒入插有梳子的制膠板待其凝固，制成2.0%的瓊脂糖凝膠。將PCR產(chǎn)物上樣，100V35min跑膠，終止電泳并在紫外線下成像、拍照。
[0064]步驟8:數(shù)據(jù)處理，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組或重復(fù)3次，結(jié)果以[± S表示，以t檢驗(yàn)進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較，以P < 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P < 0.01為差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0065]步驟9:實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0066](l)Hoechst33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)
[0067]Hoechst33258與活細(xì)胞中DNA聚AT序列富集區(qū)域的小溝處與DNA結(jié)合，從而使細(xì)胞核著色。故又把此類染料稱為DNA探針。當(dāng)受到在熒光顯微鏡紫外光激發(fā)時(shí)，Hoechst-DNA發(fā)出亮藍(lán)色熒光?；罴?xì)胞核呈彌散均勻熒光，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)濃染致密的顆粒塊狀熒光。由附圖5可見(jiàn)，維康醇處理HeLa細(xì)胞24h后，與空白組(control)相比，熒光亮度一致，細(xì)胞形態(tài)也未發(fā)生改變，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)。因此，維康醇并不是通過(guò)誘導(dǎo)HeLa凋亡而抑制細(xì)胞增殖。
[0068](2)維康醇對(duì)HeLa細(xì)胞周期調(diào)控的影響
[0069]PI染色流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期分析的結(jié)果顯示，維康醇對(duì)HeLa細(xì)胞周期的分布有影響。4.g/ml維康醇孵育24小時(shí)后，HeLa細(xì)胞的Gl期比例由45.9%上升到73.1% ;S期比例則由39.2%下降到7.1%；G2期比例變化不大。這些數(shù)據(jù)顯示維康醇將HeLa細(xì)胞周期阻滯在Gl期。見(jiàn)附圖6
[0070](3)維康醇抑制細(xì)胞周期蛋白(cyclin Dl)的表達(dá)
[0071]cyclin Dl是細(xì)胞周期調(diào)控中cyclin蛋白家族的最重要的成員。當(dāng)cyclinDl基因變異時(shí)，cyclinDl會(huì)出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)，使細(xì)胞過(guò)度增生，產(chǎn)生腫瘤。在Gl期早期，D型周期蛋白開始表達(dá)，并與⑶K4或⑶K6等多種激酶結(jié)合，使pRb磷酸化，釋放E2f，因此促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)行。我們首先用western blot檢測(cè)cyclin Dl的表達(dá)水平。如附圖7所示,給與維康醇處理的各組隨著藥物濃度增大，cyclin Dl條帶逐漸變細(xì)，亮度變暗。經(jīng)圖象軟件分析統(tǒng)計(jì)后，對(duì)照(control)組的相對(duì)密度值為1.09，1.5,3.0,4.5 u g/ml各組比值分別降低至1.01,0.83,0.64 (P < 0.01)。數(shù)據(jù)表明，維康醇能夠有效抑制cyclin Dl蛋白的表達(dá)，并具有明顯濃度依賴性。
[0072](4)維康醇對(duì)HeLa細(xì)胞中Cyclin Dl, Q)K4, P21表達(dá)的影響
[0073]利用ELISA試劑盒對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(CyclinDl，CDK4，P21)的表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測(cè)。見(jiàn)附圖8
[0074](5)半定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白mRNA水平的表達(dá)
[0075]cyclinD, E是Gl期細(xì)胞周期蛋白，并在Gl期和G1/S交界處發(fā)揮作用、啟動(dòng)細(xì)胞周期并能促進(jìn)DNA合成的細(xì)胞周期蛋白。在Gl期，⑶K2，⑶K4或⑶K6分別與cyclin E，D形成復(fù)合物，使PRb磷酸化，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(E2f)的表達(dá)。P21是Cyclin-⑶K復(fù)合物的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，并通過(guò)抑制Rb表達(dá)而阻止細(xì)胞周期進(jìn)行。從附圖9可以看出，給與維康醇處理的各組隨著藥物濃度增大，cyclin Dl, cyclinD2以及⑶K2的mRNA的表達(dá)逐漸減低，相反的，P21的表達(dá)量則隨著濃度加大而逐漸增多。數(shù)據(jù)表明，維康醇能夠有效抑制cyclin Dl,D2的表達(dá)，增強(qiáng)P21的表達(dá)，并具有明顯濃度依賴性。
[0076]討論:細(xì)胞周期是一個(gè)復(fù)雜有序并受嚴(yán)格調(diào)控的過(guò)程，它分為Gl期、S期、G2期和M期4個(gè)時(shí)期。細(xì)胞周期調(diào)控是在G期、S期和G2/M期3個(gè)控制點(diǎn)的控制下，通過(guò)各種調(diào)控因子的激活和失活，使細(xì)胞依次啟動(dòng)和完成細(xì)胞分裂的過(guò)程。細(xì)胞周期中各種調(diào)節(jié)因子組成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括細(xì)胞周期素(cyclins)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激(CDKs)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKIs)，其核心為⑶Ks的活性表達(dá)與調(diào)控，cyclins起著正調(diào)控作用，而CKIs為負(fù)調(diào)控因子。
[0077]細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的紊亂，特別是G1/S期檢測(cè)點(diǎn)和G2/M期檢測(cè)點(diǎn)的改變，在細(xì)胞癌變過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
[0078]cyclin D1、CDK4是G1/S期關(guān)鍵的正性調(diào)節(jié)因子，兩者形成cyclin D1/CDK4復(fù)合物，激活抑癌基因pRb，pRb磷酸化后，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。
[0079]Cyclin E/⑶K2復(fù)合物是細(xì)胞周期中Gl期向S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中重要的活性物質(zhì)，Cyclin-E的過(guò)度表達(dá)能促進(jìn) Gl-S的轉(zhuǎn)換。同時(shí)，Cyclin A是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期S期和G2/M期的重要蛋白之一 [84-87]，Cyclin A在S期與依賴細(xì)胞周期蛋白的蛋白激酶2 (⑶K2)結(jié)合參與調(diào)控DNA復(fù)制，與CDKl結(jié)合參與G2/M過(guò)渡。
[0080]本研究通過(guò)Western blot, ELISA和RT-PCR分析顯不，維康醇能夠下調(diào)cyclinDl和⑶K4蛋白的表達(dá)，并且能夠降低⑶K2，cyclin D2以及cyclin E2mRNA的表達(dá)。
[0081]p21認(rèn)作為是細(xì)胞周期內(nèi)通用性抑制物，它能夠與相應(yīng)的cyclin-⑶K復(fù)合物結(jié)合，抑制其蛋白激酶的激活，阻滯細(xì)胞周期的運(yùn)行。本研究通過(guò)RT-PCR分析顯示，隨著維康醇處理HeLa細(xì)胞濃度逐漸增加，其表達(dá)量逐漸增多，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果表明，維康醇誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞Gl期阻滯的主要機(jī)制可能是通過(guò)降低cyclin Dl,⑶K2，⑶K4表達(dá)量，并且上調(diào)P21表達(dá)量，從而負(fù)調(diào)控G1/S期檢測(cè)點(diǎn)，阻滯細(xì)胞由Gl期進(jìn)入S期。
[0082]綜上所述，維康醇能抑制HeLa細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與維康醇誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞cyclin D1，⑶K2，⑶K4表達(dá)上調(diào)，并且降低P21表達(dá)量，從而將HeLa細(xì)胞阻滯于Gl期有關(guān)抑制HeLa細(xì)胞增殖。
【權(quán)利要求】
1.一種維康醇在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:是由維康醇在某種濃度下對(duì)HeLa細(xì)胞增殖及周期調(diào)控的影響；所有實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組或重復(fù)3次，結(jié)果以[± S表示，以t檢驗(yàn)進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較，以P < 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P < 0.01為差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的維康醇在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:進(jìn)行維康醇的配制:稱取維康醇Img放入0.5mL離心管中，加入DMSO 4 U I將其溶解，即為50mg/ml維康醇母液；臨用前無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基稀釋到所需濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的維康醇在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng):培養(yǎng)于含10%小牛血清的完全培養(yǎng)基中，置于37°C，5% C02，95%空氣和100%飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞每?jī)商靷鞔鷵Q液一次。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的維康醇在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成懸液，用血球細(xì)胞板計(jì)數(shù)，配成2 X 105/ml，取放有蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加細(xì)胞懸液3ml，將每組藥液分別加入各孔中；將細(xì)胞板放在37°C，于5% CO2的培養(yǎng)箱中分別孵育24h后取出；取出載玻片，加I滴混合Hoechst熒光染色液:壓上爬滿細(xì)胞的蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的維康醇在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:細(xì)胞經(jīng)過(guò)維康醇處理24h后，收集細(xì)胞于離心管中，離心去除上清，加預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為70 %的乙醇3ml邊加邊震蕩 ，使細(xì)胞完全分散，后置4°C冰箱過(guò)夜，然后離心棄去乙醇，加PBS洗2遍,最后加配好的PI染液(0.05mg/ml) ,RNase A(0.5mg/ml)避光染色30min ;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞周期所占的比例。激發(fā)波長(zhǎng)Ex = 488nm ;發(fā)射波長(zhǎng)Em = 650nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的維康醇在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:進(jìn)行 Western Blotting 實(shí)驗(yàn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的維康醇在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Cyclin Dl, Cdk4，P21含量的測(cè)定。
8.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的維康醇在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:對(duì)細(xì)胞進(jìn)行半定量RT-PCR測(cè)試。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8所述的維康醇在制備治療宮頸癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于:得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【文檔編號(hào)】A61K31/336GK103520144SQ201210225706
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月3日
【發(fā)明者】劉亮亮, 鄭秋生, 姚瑛, 張波, 王振華 申請(qǐng)人:鄭秋生