專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解滅活方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā) 明屬于生物制藥領(lǐng)域，尤其是指一種人用流感病毒裂解疫苗生產(chǎn)中流感病毒單價(jià)原液的裂解滅活方法。
背景技術(shù)：
流行性感冒(簡(jiǎn)稱(chēng)流感)是由流行性感冒病毒(Influenza virus)引起的急性呼吸道傳染病，它的特點(diǎn)是爆發(fā)突然、傳染性強(qiáng)，能引起較高的發(fā)病率，并可迅速傳播造成大面積流行，歷史上已經(jīng)記載了 4次世界性大流行，而近幾年禽流感(Avian influenza)的不斷爆發(fā)，2009年甲型HlNl新型流感的爆發(fā)，進(jìn)一步加大了各國(guó)衛(wèi)生防疫的壓力，引起人們的恐慌。流感是第一個(gè)實(shí)現(xiàn)全球性監(jiān)測(cè)的傳染病，但對(duì)其治療卻無(wú)特效藥物，疫苗接種是預(yù)防流感流行的有效措施。流感病毒是有包膜病毒，病毒顆粒內(nèi)部為核衣殼，由核蛋白、聚合酶和病毒的基因組RNA組成；包膜由雙層類(lèi)脂膜、糖蛋白突起和基質(zhì)蛋白組成。流感病毒包膜由來(lái)自宿主細(xì)胞的雙層類(lèi)脂膜和流感病毒糖蛋白突起組成，流感病毒糖蛋白突起主要包括血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)。HA的抗體能抑制血凝素并能中和病毒，是最主要的保護(hù)性抗體。NA的抗體雖不能中和病毒，但能抑制病毒的繁殖，減輕癥狀。目前市場(chǎng)上流感疫苗主要有裂解滅活苗、亞單位疫苗等，其中裂解疫苗免疫效果較好，副作用較小，應(yīng)用最廣。目前國(guó)內(nèi)外流感病毒的滅活從滅活劑使用上大體可分為以下幾種
一、￠-丙內(nèi)酯滅活多為國(guó)外流感廠家所使用；
二、乙醚滅活國(guó)內(nèi)2家流感疫苗生產(chǎn)企業(yè)及日本某些流感疫苗生產(chǎn)企業(yè)所使用；
三、甲醛滅活國(guó)內(nèi)大多數(shù)流感疫苗企業(yè)及巴斯德所使用，是最早被使用的滅活劑； 而單就以甲醛為滅活劑的滅活方法，其滅活方式又可分為
一、前滅活是將流感病毒接種雞胚，收獲尿囊液后即加入甲醛滅活，該滅活方式為最傳統(tǒng)也是國(guó)內(nèi)使用最廣的滅活方式。二、濃縮液階段滅活是先將流感病毒超濾濃縮后，再加入甲醛滅活。目前，傳統(tǒng)前滅活工藝中存在如下問(wèn)題加入甲醛后，易產(chǎn)生病毒聚團(tuán)現(xiàn)象，病毒裂解的均勻度不高，病毒裂解效果不佳；滅活時(shí)間長(zhǎng)，滅活效率低；甲醛的使用量大；滅活操作步驟多，染菌風(fēng)險(xiǎn)高；所需廠房、人力和能耗較大；滅活的均一性和穩(wěn)定性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解滅活方法，以解決目前傳統(tǒng)前滅活工藝中存在的病毒裂解效果差、滅活時(shí)間長(zhǎng)、滅活效率低、滅活劑的用量大、滅活操作步驟多，染菌風(fēng)險(xiǎn)增加、滅活所需廠房、設(shè)施和能耗增加、滅活的均一性和穩(wěn)定性差的問(wèn)題。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
(一)、將梯密度離心純化后的HlNl型、H3N2型或B型單價(jià)流感全病毒置于密閉容器中、其蛋白含量控制在2. 0-3. 0 mg/ml，加入作用濃度為0. 7%-0. 9%濃度的裂解劑TritonX-100或作用濃度范圍為0. 7-1. 2%的Triton N-101 ;置20°C _25°C，振蕩裂解；(二)、采用震蕩裝置進(jìn)行震蕩，震蕩時(shí)間為采用TritonX-100震蕩I. 5_2. 5h，或采用Triton N-101震蕩4_5h，超濾去除裂解劑；
(三)、病毒滅活滅活采用PH值7.2、用磷酸鹽緩沖液PBS終濃度為O. I M/L、EDTA終濃度為O. 5mM/L的調(diào)配流感病毒滅活溶液，裂解后病毒液的蛋白濃度O. 5-1. Omg/ml，加入終濃度為200ug/ml的甲醛，2-8°C震蕩滅活，滅活時(shí)長(zhǎng)4_5天。本發(fā)明所述的流感病毒滅活溶液是通過(guò)下列方法得到的
(1)2M/L磷酸鹽緩沖液PBS的配制
稱(chēng)取 1600g NaCl、40g KCl、288g Na2HPO4 和 48g KH2PO4,溶于 800ml 蒸餾水中，用 HCl調(diào)節(jié)溶液的PH值至7. 2，最后加蒸餾水定容至IL即可；
在151bf/in2(1034X105Pa)高壓下蒸氣滅菌40分鐘，保存于室溫或4°C冰箱中；
(2)100mM/L EDTA溶液的配制
稱(chēng)取37. 224gEDTA溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 2，最后加蒸餾水定容至IL即可；
在151bf/in2(1034X 105Pa)高壓下蒸氣滅菌40分鐘，保存于室溫或4°C冰箱中；
(3)流感病毒滅活溶液的調(diào)配
流感病毒滅活前，將2M/L磷酸鹽緩沖液(PBS)20倍稀釋?zhuān)?00mM/L EDTA溶液200倍稀釋后混合，最終配成pH值7. 2，PBS終濃度為0. I M/L、EDTA終濃度為0. 5mM/L的流感病毒滅活溶液。本發(fā)明一種實(shí)施方式還包括裂解后純化步驟
采用柱色譜法進(jìn)行病毒裂解后的再純化，色譜介質(zhì)為S^)herose 4FF，每次上樣量不超過(guò)柱體積的5%，以磷酸鹽緩沖液PBS0. 01 mol/L, pH7. 2為洗脫液，流速為300ml/分鐘，在監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下，收集全部第一蛋白峰。
本發(fā)明選用符合疫苗生產(chǎn)的海蘭白種蛋孵化的9-11日齡雞胚，使用流感病毒工作種子，進(jìn)行病毒的規(guī)?；瘮U(kuò)增，收獲病毒液。在本發(fā)明中，我公司研究用毒種為WHO推薦北半球季節(jié)性人用流感疫苗生產(chǎn)用毒株，來(lái)自英國(guó)NIBSC。毒種傳代和制備用雞胚，來(lái)自無(wú)外源性禽白血病病毒、無(wú)外源性禽腺病毒I型和III型的SPF雞群，并選用9-11日齡無(wú)畸形、血管清晰、活動(dòng)的健康雞胚。本發(fā)明的目標(biāo)是開(kāi)發(fā)一種新的季節(jié)性人用流感疫苗的生產(chǎn)工藝，本工藝中其主要特征及創(chuàng)新點(diǎn)在于開(kāi)發(fā)了一種流感單價(jià)原液先裂解后滅活的工藝流程，該流程可1、減少傳統(tǒng)前滅活工藝加入甲醛后所導(dǎo)致的病毒聚團(tuán)現(xiàn)象，提高病毒裂解的均勻度，提高病毒裂解效果；2、縮短滅活時(shí)間，提高滅活效率；3、減少甲醛的使用量；4、簡(jiǎn)化滅活操作步驟，降低染菌風(fēng)險(xiǎn)；5、減少所需廠房、人力和能耗；6、增加滅活的均一性和穩(wěn)定性。 該發(fā)明是利用WHO推薦的三型流感病毒毒株，建立主代種子及工作代種子庫(kù)，在雞胚上進(jìn)行流感病毒培養(yǎng)，收獲尿囊液，通過(guò)純化、裂解、滅活等一系列工藝過(guò)程，分別獲得三型流感病毒單價(jià)原液，再將三型單價(jià)原液稀釋合并、除菌過(guò)濾制成疫苗。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是一方面解決了加甲醛滅活之后裂解所導(dǎo)致的流感病毒聚合的問(wèn)題，使流感病毒裂解得更加均勻和徹底，提高了疫苗的裂解效果；另一方面解決了前滅活工藝中尿囊液容易染菌、滅活劑添加不均勻、大量尿囊液存放需要大面積4°C冷庫(kù)的問(wèn)題。因此，將傳統(tǒng)前滅活方式改為先純化裂解，然后再滅活的方法，可提高病毒裂解效果，縮短滅活時(shí)間，提高滅活效率，明顯降低滅活劑的用量，簡(jiǎn)化滅活操作步驟，降低染菌風(fēng)險(xiǎn)，減少滅活所需廠房、設(shè)施和能耗，增加滅活的均一性和穩(wěn)定性。


圖I流感病毒電鏡照片(全病毒放大4萬(wàn)倍)；
圖2滅活后流感病毒采用裂解劑Triton N-101裂解后電鏡照片(放大4萬(wàn)倍)；
圖3未經(jīng)滅活流感病毒采用裂解劑Triton N-101裂解后電鏡照片(放大4萬(wàn)倍)；
圖4未經(jīng)滅活流感病毒采用裂解劑Triton X-100裂解后電鏡照片(放大4萬(wàn)倍)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的流感病毒滅活溶液是通過(guò)下列方法得到的
(1)2M/L磷酸鹽緩沖液PBS的配制
稱(chēng)取 1600g NaCl、40g KCl、288g Na2HPO4 和 48g KH2PO4,溶于 800ml 蒸餾水中，用 HCl調(diào)節(jié)溶液的PH值至7. 2，最后加蒸餾水定容至IL即可；
在151bf/in2(1034X105Pa)高壓下蒸氣滅菌40分鐘，保存于室溫或4°C冰箱中；
(2)100mM/L EDTA溶液的配制
稱(chēng)取37. 224gEDTA溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 2，最后加蒸餾水定容至IL即可；
在151bf/in2(1034X 105Pa)高壓下蒸氣滅菌40分鐘，保存于室溫或4°C冰箱中；
(3)流感病毒滅活溶液的調(diào)配
流感病毒滅活前，將2M/L磷酸鹽緩沖液(PBS)20倍稀釋?zhuān)?00mM/L EDTA溶液200倍稀釋后混合，最終配成pH值7. 2，PBS終濃度為0. I M/L、EDTA終濃度為0. 5mM/L的流感病毒滅活溶液。實(shí)施例I HlNl型流感病毒單價(jià)原液的生產(chǎn)
I)生產(chǎn)用雞胚
毒種傳代和制備用雞胚應(yīng)來(lái)源于SPF雞群；疫苗生產(chǎn)用雞胚應(yīng)來(lái)源于封閉式房舍內(nèi)飼養(yǎng)的健康雞群，并選用9 11日齡無(wú)畸形、血管清晰、活動(dòng)的雞胚。2)病毒接種和培育
用PBS (0. 01 mol/L, pH7. 2)稀釋工作種子批毒種，HlNl型毒種稀釋至4. 0LgEID50/ml。接種雞胚尿囊腔，每胚接種0. 2ml。33-35°C培養(yǎng)44-48小時(shí)。工作種子批毒種融化后若一次未使用完，不得再凍結(jié)繼續(xù)使用。3)病毒收獲
篩選活雞胚，置2 8°C冷胚12-18小時(shí)后，收獲尿囊液于容器內(nèi)，逐容器取樣進(jìn)行尿囊收獲液檢定。
4)濃縮及純化
將單價(jià)病毒收獲液進(jìn)行連續(xù)流離心(轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘、流速為1000ml/分鐘)初步澄清后，上清用截留分子量300kD的膜包進(jìn)行超濾濃縮，采用蔗糖密度區(qū)帶離心法進(jìn)行純化，采用的蔗糖濃度為A液30%±2%和C液55%±2%，進(jìn)樣轉(zhuǎn)數(shù)為2000_3000r/分鐘，進(jìn)樣時(shí)泵流速為IOOml/分鐘，離心條件為30000r/min，離心時(shí)間3小時(shí)，在紫外監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下，收集糖度范圍30%_50%的病毒峰，梯度樣用PBS以截留分子量300kD膜包超濾透析除糖。5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在2.0 mg/ml JpATriton X-100使其終濃度為0. 7%，置20°C，振蕩裂解I. 5小時(shí)。6)裂解后純化 采用柱色譜法進(jìn)行病毒裂解后的再純化，色譜介質(zhì)為S^herose 4FF。每次上樣量不超過(guò)柱體積的5%，以PBS (0.01 mol/L，pH7. 2)液為洗脫液，流速為300ml/分鐘左右，在監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下，收集全部第一蛋白峰。7)病毒滅活
將裂解純化后的病毒液(蛋白濃度控制在0. 5mg/ml)加入流感病毒滅活溶液，使其溶液所含的PBS終濃度為0. I M/L、EDTA終濃度為0. 5mM/L、pH值為7. 2，然后加入甲醛，使其終濃度為200|ag/ml，置2-8°C滅活5天，病毒滅活到期后每個(gè)病毒滅活容器應(yīng)立即取樣分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)，細(xì)菌內(nèi)毒素含量應(yīng)小于10EU/ml。滅活后的病毒液用0. 01 M/L PBS做為緩沖液，以截留分子量為50KD的膜包，超濾透析除甲醛，即為病毒滅活液。8)除菌過(guò)濾
病毒滅活液經(jīng)除菌過(guò)濾后，即為單價(jià)原液。另外，對(duì)步驟5)和7)也可采取下面的方法
5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在2. 5 mg/ml JPATriton X-100使其終濃度為0. 8%，置23°C，振蕩裂解2小時(shí)；
7)病毒滅活
將裂解純化后的病毒液(蛋白濃度控制在0. 75mg/ml)加入流感病毒滅活溶液，使其溶液所含的PBS終濃度為0. I M/L、EDTA終濃度為0. 5mM/L、pH值為7. 2，然后加入甲醛，使其終濃度為200|ag/ml，置2-8°C滅活5天，病毒滅活到期后每個(gè)病毒滅活容器應(yīng)立即取樣分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)，細(xì)菌內(nèi)毒素含量應(yīng)小于10EU/ml。另外，對(duì)步驟5)和7)也可采取下面的方法
5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在3.0 mg/ml JPATriton X-100使其終濃度為0. 9%，置25°C，振蕩裂解2. 5小時(shí)；
7)病毒滅活
將裂解純化后的病毒液(蛋白濃度控制在I. Omg/ml)加入適宜的流感病毒滅活溶液，使其溶液所含的PBS終濃度為0. I M/L、EDTA終濃度為0. 5mM/L、pH值為7. 2，然后加入甲醛，使其終濃度為200l^g/ml，置2-8°C滅活5天，病毒滅活到期后每個(gè)病毒滅活容器應(yīng)立即取樣分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)，細(xì)菌內(nèi)毒素含量應(yīng)小于10EU/ml。另外，對(duì)步驟5)也可采取下面的方法5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在2. O mg/ml JpATriton N-IOl使其終濃度為O. 7%，置20°C，振蕩裂解4小時(shí)；
Bf ·
5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在2. 5mg/ml JpATriton N-IOl使其終濃度為O. 95%，置23°C，振蕩裂解4. 5小時(shí)； Bf ·
5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在3. O mg/ml JpATriton N-IOl使其終濃度為1.2%，置25°C，振蕩裂解5小時(shí)；
實(shí)施例2 H3N2型流感病毒單價(jià)原液的生產(chǎn) O生產(chǎn)用雞胚
毒種傳代和制備用雞胚應(yīng)來(lái)源于SPF雞群；疫苗生產(chǎn)用雞胚應(yīng)來(lái)源于封閉式房舍內(nèi)飼養(yǎng)的健康雞群，并選用9 11日齡無(wú)畸形、血管清晰、活動(dòng)的雞胚。2)病毒接種和培育
用PBS (O. 01 mol/L, ρΗ7· 2)稀釋工作種子批毒種，Η3Ν2型毒種稀釋至4. 0LgEID50/ml，接種雞胚尿囊腔，每胚接種O. 2ml，33-35°C培養(yǎng)44-48小時(shí)，工作種子批毒種融化后若一次未使用完，不得再凍結(jié)繼續(xù)使用。3)病毒收獲
篩選活雞胚，置2 8°C冷胚12-18小時(shí)后，收獲尿囊液于容器內(nèi)，逐容器取樣進(jìn)行尿囊收獲液檢定。4)濃縮及純化
將單價(jià)病毒收獲液進(jìn)行連續(xù)流離心(轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘、流速為IOOOml/分鐘)初步澄清后，上清用截留分子量300kD的膜包進(jìn)行超濾濃縮，采用蔗糖密度區(qū)帶離心法進(jìn)行純化，采用的蔗糖濃度為A液30%± 2%和C液55%± 2%，進(jìn)樣轉(zhuǎn)數(shù)為2000_3000r/分鐘，進(jìn)樣時(shí)泵流速為IOOml/分鐘，離心條件為30000r/min，離心時(shí)間3小時(shí)，在紫外監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下，收集糖度范圍30%_50%的病毒峰，梯度樣用PBS以截留分子量300kD膜包超濾透析除糖。5)病毒裂解
將除糖后的病毒液(蛋白含量控制在2. Omg/ml)，加入Triton X-100使其終濃度為
O.7%，置20°C，振蕩裂解I. 5小時(shí)，用PBS以截留分子量50kD膜包超濾透析除裂解劑；
6)裂解后純化
采用柱色譜法進(jìn)行病毒裂解后的再純化，色譜介質(zhì)為S^herose 4FF。每次上樣量不超過(guò)柱體積的5%，以PBS (0.01 mol/L，pH7. 2)液為洗脫液，流速為300ml/分鐘左右，在監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下，收集全部第一蛋白峰。7)病毒滅活
將裂解純化后的病毒液(蛋白濃度控制在O. 5mg/ml)加入適宜的流感病毒滅活溶液，使其溶液所含的PBS終濃度為O. I M/L、EDTA終濃度為O. 5mM/L、pH值為7. 2，然后加入甲醛，使其終濃度為200l^g/ml，置2-8°C滅活5天，病毒滅活到期后每個(gè)病毒滅活容器應(yīng)立即取樣分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)，細(xì)菌內(nèi)毒素含量應(yīng)小于10EU/ml。滅活后的病毒液用0. 01 M/L PBS做為緩沖液，以截留分子量為50KD的膜包，超濾透析除甲醛，即為病毒滅活液。8)除菌過(guò)濾
病毒滅活液經(jīng)除菌過(guò)濾后，即為單價(jià)原液。另外，對(duì)步驟5)和7)也可采取下面 的方法
5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在2. 5 mg/ml JPATriton X-100使其終濃度為0. 8%，置23°C，振蕩裂解2小時(shí)；
7)病毒滅活
將裂解純化后的病毒液(蛋白濃度控制在0. 75mg/ml)加入適宜的流感病毒滅活溶液，使其溶液所含的PBS終濃度為0. I M/L、EDTA終濃度為0. 5mM/L、pH值為7. 2，然后加入甲醛，使其終濃度為200l^g/ml，置2-8°C滅活5天，病毒滅活到期后每個(gè)病毒滅活容器應(yīng)立即取樣分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)，細(xì)菌內(nèi)毒素含量應(yīng)小于10EU/ml。另外，對(duì)步驟5)和7)也可采取下面的方法
5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在3.0 mg/ml JPATriton X-100使其終濃度為0. 9%，置25°C，振蕩裂解2. 5小時(shí)；
7)病毒滅活
將裂解純化后的病毒液(蛋白濃度控制在I. Omg/ml)加入適宜的流感病毒滅活溶液，使其溶液所含的PBS終濃度為0. I M/L、EDTA終濃度為0. 5mM/L、pH值為7. 2，然后加入甲醛，使其終濃度為200l^g/ml，置2-8°C滅活5天，病毒滅活到期后每個(gè)病毒滅活容器應(yīng)立即取樣分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)，細(xì)菌內(nèi)毒素含量應(yīng)小于10EU/ml。另外，對(duì)步驟5)也可采取下面的方法
5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在2.0 mg/ml JpATriton N-IOl使其終濃度為0. 7%，置20°C，振蕩裂解4小時(shí)；
或
5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在2. 5mg/ml JpATriton N-IOl使其終濃度為0. 95%，置23°C，振蕩裂解4. 5小時(shí)；
Bf
5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在3.0 mg/ml JPATriton N-IOl使其終濃度為1.2%，置25°C，振蕩裂解5小時(shí)；
實(shí)施例3 B型流感病毒單價(jià)原液的生產(chǎn) I)生產(chǎn)用雞胚
毒種傳代和制備用雞胚應(yīng)來(lái)源于SPF雞群；疫苗生產(chǎn)用雞胚應(yīng)來(lái)源于封閉式房舍內(nèi)飼養(yǎng)的健康雞群，并選用9 11日齡無(wú)畸形、血管清晰、活動(dòng)的雞胚2)病毒接種和培育
用PBS (O. 01 mol/L, pH7. 2)稀釋工作種子批毒種，B型毒種稀釋至病毒量為和3. OLgEID50/ml，接種雞胚尿囊腔，每胚接種O. 2ml，置33-35°C培養(yǎng)66-72小時(shí)，工作種子批毒種融化后若一次未使用完，不得再凍結(jié)繼續(xù)使用。3)病毒收獲
篩選活雞胚，置2 8°C冷胚12-18小時(shí)后，收獲尿囊液于容器內(nèi)，逐容器取樣進(jìn)行尿囊收獲液檢定。4)濃縮及純化
將單價(jià)病毒收獲液進(jìn)行連續(xù)流離心(轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘、流速為IOOOml/分鐘)初步澄清后，上清用截留分子量300kD的膜包進(jìn)行超濾濃縮，采用蔗糖密度區(qū)帶離心法進(jìn)行純化，采用的蔗糖濃度為A液30%±2%和C液55%±2%，進(jìn)樣轉(zhuǎn)數(shù)為2000_3000r/分鐘，進(jìn)樣時(shí)泵流速為IOOml/分鐘，離心條件為30000r/min，離心時(shí)間3小時(shí)，在紫外監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下，收集糖度范圍30%_50%的病毒峰，梯度樣用PBS以截留分子量300kD膜包超濾透析除糖。5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在2. O mg/ml JpATriton X-100使其終濃度為O. 7%，置20°C，振蕩裂解I. 5小時(shí)。6)裂解后純化
采用柱色譜法進(jìn)行病毒裂解后的再純化，色譜介質(zhì)為S^herose 4FF。每次上樣量不超過(guò)柱體積的5%，以PBS (0.01 mol/L，pH7. 2)液為洗脫液，流速為300ml/分鐘左右，在監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下，收集全部第一蛋白峰。7)病毒滅活
將裂解純化后的病毒液(蛋白濃度控制在O. 5mg/ml)加入適宜的流感病毒滅活溶液，使其溶液所含的PBS終濃度為O. I M/L、EDTA終濃度為O. 5mM/L、pH值為7. 2，然后加入甲醛，使其終濃度為20(^g/ml，置2-8°C滅活5天，病毒滅活到期后每個(gè)病毒滅活容器應(yīng)立即取樣分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)，細(xì)菌內(nèi)毒素含量應(yīng)小于10EU/ml。滅活后的病毒液用O. 01 M/L PBS做為緩沖液，以截留分子量為50KD的膜包，超濾透析除甲醛，即為病毒滅活液。8)除菌過(guò)濾
病毒滅活液經(jīng)除菌過(guò)濾后，即為單價(jià)原液。另外，對(duì)步驟5)和7)也可采取下面的方法
5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在2. 5 mg/ml JpATriton X-100使其終濃度為O. 8%，置23°C，振蕩裂解2小時(shí)；
7)病毒滅活
將裂解純化后的病毒液(蛋白濃度控制在O. 75mg/ml)加入適宜的流感病毒滅活溶液，使其溶液所含的PBS終濃度為O. I M/L、EDTA終濃度為O. 5mM/L、pH值為7. 2，然后加入甲醛，使其終濃度為20(^g/ml，置2-8°C滅活5天，病毒滅活到期后每個(gè)病毒滅活容器應(yīng)立即取樣分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證 試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)，細(xì)菌內(nèi)毒素含量應(yīng)小于10EU/ml。另外，對(duì)步驟5)和7)也可采取下面的方法
5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在3.0 mg/ml JPATriton X-IOO使其終濃度為0. 9%，置25°C，振蕩裂解2. 5小時(shí)；
7)病毒滅活
將裂解純化后的病毒液(蛋白濃度控制在I. Omg/ml)加入適宜的流感病毒滅活溶液，使其溶液所含的PBS終濃度為0. I M/L、EDTA終濃度為0. 5mM/L、pH值為7. 2，然后加入甲醛，使其終濃度為200l^g/ml，置2-8°C滅活5天，病毒滅活到期后每個(gè)病毒滅活容器應(yīng)立即取樣分別進(jìn)行病毒滅活驗(yàn)證試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)，細(xì)菌內(nèi)毒素含量應(yīng)小于10EU/ml。另外，對(duì)步驟5)也可采取下面的方法
5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在2.0 mg/ml JpATriton N-IOl使其終濃度為0. 7%，置20°C，振蕩裂解4小時(shí)；
或
5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在2. 5mg/ml JpATriton N-IOl使其終濃度為0. 95%，置23°C，振蕩裂解4. 5小時(shí)；
Bf
5)病毒裂解
將除糖后的病毒液，蛋白含量在3. O mg/ml JPATriton N-IOl使其終濃度為1.2%，置25°C，振蕩裂解5小時(shí)；
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較的有益效果如下(以日投產(chǎn)80000雞胚為例)
riLieflO^ .I尿囊液階段滅活技I全病毒濃縮液階段I
項(xiàng)目棚技'術(shù)^滅活技術(shù)
甲醛滅活副作用造甲醛滅活副作用造成病毒緊密聚團(tuán)，裂成病毒緊密聚團(tuán)，裂裂解數(shù)果解時(shí)團(tuán)塊不宜打開(kāi)t解時(shí)團(tuán)塊不宜打開(kāi)，
裂后團(tuán)內(nèi)病毒完整，裂后團(tuán)內(nèi)病毒完整，
裂解不均裂解不均
滅話時(shí)長(zhǎng)__4^__7^__7-8天
滅話體積__10-12L__65 075 OL__10-12L
100-120ml6500-75 OOrril IOO-IZQml
2%甲醛計(jì))
滅活占用容器 I個(gè)30L桶25-3 Ot 5 OLffi__I個(gè)30L桶
—滅活操作—簡(jiǎn)單 復(fù)雜簡(jiǎn)單
滅話占用廠房面積_ I平方米大于30平方米 I平方米
滅話效率均一，穩(wěn)定不均一,不穩(wěn)定均一，穩(wěn)定—
實(shí)驗(yàn)例I:1.材料和設(shè)備
DTriton X-100
2)2%甲醛
3)純化后流感病毒液
權(quán)利要求
1.一種人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解滅活方法，其特征在于包括下列步驟 (一)、將梯密度離心純化后的HlNl型、H3N2型或B型單價(jià)流感全病毒置于密閉容器中、其蛋白含量控制在2. 0-3. O mg/ml，加入作用濃度為O. 7%-0. 9%濃度的裂解劑TritonX-100或作用濃度范圍為O. 7-1. 2%的Triton N-101 ;置20°C _25°C，振蕩裂解； (二)、采用震蕩裝置進(jìn)行震蕩，震蕩時(shí)間為采用TritonX-100震蕩I. 5_2. 5h，或采用Triton N-101震蕩4_5h，超濾去除裂解劑； (三)、病毒滅活滅活采用PH值7.2、用磷酸鹽緩沖液PBS終濃度為O. I M/L、EDTA終濃度為O. 5mM/L的調(diào)配流感病毒滅活溶液，裂解后病毒液的蛋白濃度O. 5-1. Omg/ml，加入終濃度為200ug/ml的甲醛，2-8°C震蕩滅活，滅活時(shí)長(zhǎng)4_5天。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解滅活方法，其特征在于所述的流感病毒滅活溶液是通過(guò)下列方法得到的 (1)2M/L磷酸鹽緩沖液PBS的配制 稱(chēng)取 1600g NaCl、40g KCl、288g Na2HPO4 和 48g KH2PO4,溶于 800ml 蒸餾水中，用 HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 2,最后加蒸懼水定容至IL ； 在151bf/in2(1034X105Pa)高壓下蒸氣滅菌40分鐘，保存于室溫或4°C冰箱中； (2)100mM/L EDTA溶液的配制 稱(chēng)取37. 224gEDTA溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 2，最后加蒸餾水定容至IL ； 在151bf/in2(1034X 105Pa)高壓下蒸氣滅菌40分鐘，保存于室溫或4°C冰箱中； (3)流感病毒滅活溶液的調(diào)配 分別將2M/L磷酸鹽緩沖液PBS20倍稀釋?zhuān)?00mM/L EDTA溶液200倍稀釋后混合，最終配成pH值7. 2，PBS終濃度為0. I M/L、EDTA終濃度為0. 5mM/L的流感病毒滅活溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解滅活方法，其特征在于還包括裂解后純化步驟 采用柱色譜法進(jìn)行病毒裂解后的再純化，色譜介質(zhì)為S^herose 4FF，每次上樣量不超過(guò)柱體積的5%，以磷酸鹽緩沖液PBS0. 01 mol/L, pH7. 2為洗脫液，流速為300ml/分鐘，在監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為280nm的條件下，收集全部第一蛋白峰。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解滅活方法，屬于生物制藥領(lǐng)域，將梯密度離心純化后的H1N1型、H3N2型或B型單價(jià)流感全病毒采取先純化裂解，然后再滅活的方法，可提高病毒裂解效果，縮短滅活時(shí)間，提高滅活效率，明顯降低滅活劑的用量，簡(jiǎn)化滅活操作步驟，降低染菌風(fēng)險(xiǎn)，減少滅活所需廠房、設(shè)施和能耗，增加滅活的均一性和穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)A61P31/16GK102614508SQ201210129270
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月28日
發(fā)明者任琦, 劉旭光, 劉蔭, 匡科偉, 吳業(yè)宏, 孫麗娟, 宋澤民, 張玉輝, 張賜強(qiáng), 張雪梅, 徐文, 李曉波, 畢業(yè), 王亞軍, 王春鵬, 范宇紅, 谷麗娟, 趙大鵬, 趙志芳, 郭占龍, 郭雪, 韓俊海, 顧建陽(yáng) 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司