專利名稱：雞新城疫與h9亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞新城疫與H9亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法，特別 是指一種免疫劑量小、免疫效果更好的雞新城疫與H9亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
新城疫病毒(Newcastledisease virus, NDV)又稱亞洲雞癌病毒、偽雞癌病毒或禽肺腦炎病毒。在病毒分類學(xué)中的位置屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒屬 (Paramyxovirus)中的一個種。該病毒主要危害雞、珠雞和火雞，在被侵襲的雞群中迅速傳播，強毒株可使雞群全群毀滅。弱毒株僅引起雞群呼吸道感染和產(chǎn)蛋量下降，但可迅速康復(fù)。人類可因接觸病禽和活毒疫苗而引起結(jié)膜炎或淋巴腺炎，但很快便康復(fù)。新城疫病毒被OIE規(guī)定為A類疫病，是一種急性、高度接觸性傳染病，發(fā)病率和死亡率都在90%以上， 1935年梁英、馬聞天等首次證實我國有該病的流行，現(xiàn)在本病被我國列為I類疫病。禽流感(Avian influenza, Al)是由正粘病毒科流感病毒屬的A型流感病毒引起的一種以侵害呼吸系統(tǒng)為主的急性傳染病、該病發(fā)生于各種家禽和野鳥。至1878年禽流感首發(fā)于意大利，目前全球性的禽流感大流行已出現(xiàn)多次，特別是自2003年12月以來，高致病性禽流感橫掃亞洲多國家禽養(yǎng)殖業(yè)，造成極大的經(jīng)濟損失。禽流感病毒的抗原非常容易變異，這是禽流感反復(fù)流行的重要原因，禽流感病毒存在多種亞型，在特種條件下會跨越種屬界限而傳染到人，2004年初在越南流行感染人的H5W再一次給人類敲響了警鐘。目前新城疫、禽流感嚴重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，在各種防控措施中，疫苗免疫仍為最重要的措施。針對新城疫、禽流感，現(xiàn)已有相應(yīng)的單項滅活疫苗及二聯(lián)滅活苗，現(xiàn)有疫苗免疫劑量大(1 5周齡雞，每只0. 3ml)，免疫應(yīng)激大，特別不適于對小日齡雞的免疫。如 《雞新城疫病毒禽流感病毒二聯(lián)滅活疫苗免疫試驗》(中國家禽，2009年)使用雞新城疫_禽流感二聯(lián)苗，但其注射劑量仍為0. 3ml/只(參見1. 2. 4節(jié))，免疫效果對禽流感的保護率最高僅為5/10的保護率(參見第50頁表3、表4)。又如《雞新城疫-禽流感二聯(lián)油乳劑滅活苗的研制及應(yīng)用效果》(任素芳等，山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002年第6期第38頁)一文中公開了一種雞新城疫_禽流感二聯(lián)油乳劑滅活苗，即“40只試驗雞注射0. 3ml疫苗免疫，從免疫后第 2周開始采血檢測抗體”。但是該二聯(lián)疫苗的免疫的劑量偏大，每只雞為0.3ml。在這種情況下，免疫劑量大，免疫應(yīng)激大，特別不適于小日齡的雞。而且，由于油乳劑疫苗的粘連性， 給疫苗的接種帶來了困難。因此，當前研制出免疫劑量小、免疫效果更好、成本更低、免疫保護期更長的新城疫、禽流感二聯(lián)疫苗是一項緊迫的任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種預(yù)防雞新城疫和H9亞型禽流感二聯(lián)濃縮滅活疫苗組合物含有滅活的新城疫病毒LaSota株；滅活的H9亞型禽流感病毒HL株和佐劑。其中新城疫(LaSota株)抗原，疫苗中優(yōu)選含滅活的雞新城疫病毒(LaSota株) 病毒含量每0. Iml彡4X108 °EID50,滅活濃縮后HA價彡101og2 ；H9亞型禽流感HL株滅活前病毒含量每0. Iml彡4X108 °EID50,滅活濃縮后HA價彡101og2。最優(yōu)選病毒含量每 0. Iml 彡 4X 108 5EID50。本發(fā)明的免疫佐劑為白油，最優(yōu)選法國美孚公司白油。本發(fā)明的另一目的在于提供一種治療和預(yù)防雞新城疫和H9亞型禽流感二聯(lián)濃縮滅活疫苗的制備方法，其步驟如下

1)生產(chǎn)用毒種的制備H9亞型禽流感病毒HL株和新城疫LaSota株毒種繁殖、毒種鑒定(病毒含量、純凈性、特異性)、毒種保存、毒種繼代；2)制苗病毒液的制備接種、孵育與觀察、收獲、檢驗；3)制苗病毒液的濃縮濃縮裝置的滅菌、病毒液濃縮、濃縮檢驗；4)制苗病毒液的滅活甲醛滅活；5)半成品檢驗無菌檢驗、滅活檢驗、病毒含量測定；6)油乳劑滅活苗的制備油相制備、水相制備、乳化制苗；7)成品檢驗物理性狀、無菌檢驗、安全檢驗、效力檢驗、甲醛硫柳汞殘留量測定。由本發(fā)明下面的實施例可以看出，本發(fā)明通過提高疫苗單位體積的抗原含量，使疫苗免疫劑量降低到現(xiàn)有疫苗的1/3劑量，即對于1 5周齡雞，每只0. 3ml疫苗降低到 0. Iml疫苗，從而減小疫苗免疫對機體的應(yīng)激反應(yīng)，而且適用于小日齡雞群，增大疫苗的適用范圍。此外，在降低疫苗劑量的前提下，本發(fā)明的疫苗的免疫效果沒有降低。即，本發(fā)明提供了一種免疫劑量小、免疫效果更好、成本更低、免疫保護期更長的新城疫、禽流感二聯(lián)疫苗。
具體實施例方式本發(fā)明實施例的禽流感病毒A/Chicken/Henan/Luoyang/HL/2001 (H9N2)(簡稱 HL 株)。已于文獻《雞新城疫病毒禽流感病毒二聯(lián)滅活疫苗免疫試驗》(中國家禽，2007年第 29卷第16期，49-52)中公開，并在普萊柯生物股份有限公司保藏。雞新城疫病毒Lasota 株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。實施例1雞新城疫和H9亞型禽流感二聯(lián)濃縮滅活疫苗的制備1生產(chǎn)用毒種的制備1. 1H9HL株毒種繁殖及鑒定1. 1. 1 毒種繁殖禽流感病毒 A/Chicken/Henan/Luoyang/HL/2001 (H9N2)(簡稱 HL 株)。將HL株凍干毒用滅菌生理鹽水作適當稀釋(10_3 10_4)，0. Iml/枚尿囊腔接種10 日齡SPF胚，于37°C孵育96h，期間48h以前的死胚棄去，48h后每隔4 6小時照胚1次， 及時取出死亡的胚。至96h全部取出，放2 8°C冰箱冷藏12h以上，分別收獲雞胚液，裝入滅菌容器中，將檢驗無菌且HA > 1 512的雞胚液混合，定量分裝，每瓶2ml，冷凍保存。 注明收獲日期、毒種代數(shù)等。1. 1. 2病毒含量測定將毒種用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-7、10_8、10-9倍稀釋毒種。
上述三個稀釋度經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚各5枚，每胚0. lml，37 °C繼續(xù)孵育，24h前死去的胚棄去不計，在24 120h死亡的雞胚隨時取出，收獲雞胚液，同一稀釋度的雞胚液等體積量混合，按稀釋度分別測定紅細胞凝集價，至120h，取出所有活胚，逐個收獲雞胚液，分別測定紅細胞凝集價，凝集價> 1 16者判為感染，計算EID50。 EID50 彡 10_8 CI/0. 1ml。
1. 1. 3特異性HI試驗毒種對抗H9亞型禽流感病毒特異性血清應(yīng)為陽性反應(yīng)，對抗H5亞型禽流感病毒特異性血清、抗新城疫特異性血清、抗減蛋綜合癥病毒特異性血清均應(yīng)為陰性反應(yīng)。雞胚中和試驗將毒種用滅菌生理鹽水1000倍稀釋，與等量抗AIV H9亞型特異性血清混合，室溫中和lh，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0. 2ml ；同時SPF胚5枚為對照，尿囊腔接種1000倍稀釋的毒種，每胚0. 1ml，同條件培養(yǎng)，觀察至120h，記錄觀察結(jié)果。中和組雞胚應(yīng)至少有4枚健活，對照組應(yīng)至少4枚感染，感染判定標準是雞胚死亡或存活的雞胚測定其雞胚液血凝價> 1 16。1. 1. 4純凈按《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000版)附錄448-451頁方法進行，無細菌、支原體、外源病毒污染。1. 1. 5毒種保存-15°C以下保存，保存期應(yīng)不超過6個月即可。1. 1.6毒種繼代應(yīng)不超過3代即可。1. 2新城疫病毒(下簡稱NDV) Lasota株毒種繁殖及鑒定1. 2. 1毒種繁殖雞新城疫病毒Lasota株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。將毒種用滅菌生理鹽水作適當稀釋(10_3 10_4)，按0. Iml/枚尿囊腔接種10日齡SPF胚，培養(yǎng)120h， 每隔4 6小時照胚1次，及時取出死亡的胚，選接種后72 120小時死亡且病痕明顯的雞胚，分別收獲雞胚液，裝于滅菌容器中。將檢驗無菌且HA > 1 512的雞胚液混合，定量分裝，每瓶2ml，冷凍保存。注明收獲日期、毒種代數(shù)等。1. 2. 2病毒含量測定將毒種用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10人10_8、10_9稀釋毒種。上述三個稀釋度經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚各5枚，每胚0. lml，37 °C繼續(xù)孵育，48h前死去的胚棄去不計，在48 120h死亡的雞胚隨時取出，收獲雞胚液，同一稀釋度的雞胚液等量混合，按稀釋度分別測定紅細胞凝集價，至120h，取出所有活胚， 逐個收獲雞胚液，分別測定紅細胞凝集價，凝集價> 1 128者判為感染，計算EID50。 EID50 彡 108 0/0. Imlo1. 2. 3純凈按《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000版)附錄448-452頁方法進行，無細菌、支原體、外源病毒污染。1. 2. 4特異性將毒種用滅菌生理鹽水稀釋至105_°EID50/0. ImL倍稀釋，與等量抗 NDV特異性血清混合，室溫中和Ih后，尿囊腔接種10日齡SPF雞胚10枚，每胚0. 2ml，觀察至120h，在24 120h內(nèi)應(yīng)不引起特異性死亡，且至少存活8枚，測定血凝性，應(yīng)為陰性。1. 2. 5毒種保存-15°C以下保存，不超過6個月。1.2. 6毒種繼代不超過3代。2.制苗病毒液的制備2. 1雞新城疫病毒(下簡稱NDV) LaSota株制苗用病毒液制備取生產(chǎn)用NDV LaSota株毒種，用滅菌生理鹽水作200倍稀釋，經(jīng)尿囊腔接種10日齡非免疫雞胚，每胚 0. 2ml。置36 37°C孵育，每4小時照蛋1次，隨時取出死亡雞胚，，直至96小時全部取出， 置2 8°C冷 卻12 24小時后收取尿囊液，死胚和活胚分別收獲，置-20°C保存。抽樣測定HA效價及EID5tl的測定，HA效價低于1 128者棄去，同時每0. Iml病毒液的病毒含量彡 IO8 0EID5002. 2禽流感病毒(下簡稱AIV) HL株病毒液的制備取生產(chǎn)用AIV HL株毒種，用無菌生理鹽水作50萬倍稀釋，分別經(jīng)尿囊腔內(nèi)接種10日齡非免疫雞胚，每胚0.2ml。置36 37°C孵育，每4小時照蛋1次，隨時取出死亡雞胚，直至96小時全部取出，置2 8°C冷卻 12 24小時后收取尿囊液，死胚和活胚分別收獲，置_20°C保存。抽樣測定HA效價及EID5q 的測定，每0. Iml病毒液含量> IO8 0EID5003制苗病毒液的濃縮3. 1濃縮裝置的滅菌預(yù)過濾柱、容器、管道等采用高壓蒸汽121°C滅菌40min。超濾膜包清洗后排凈膜包內(nèi)水分，用2% ν/ν甲醛溶液循環(huán)5 lOmin，關(guān)閉循環(huán)泵，使甲醛溶液在膜包內(nèi)保持24h以上。使用前放掉甲醛溶液，用滅菌注射用水反復(fù)沖洗至PH7. O 7. 2。3. 2濃縮先將病毒液在無菌條件下用滅菌的二級預(yù)過濾柱濾過，除去病毒液中的殘渣和其它雜質(zhì)。再用上述超濾濃縮裝置，將病毒液連續(xù)循環(huán)，水分不斷滲出，完成病毒濃縮過程，分別將NDV和AIV病毒液按4倍體積比例進行濃縮。濃縮結(jié)束后，用蒸餾水將超濾膜包的殘留物沖洗出來，然后用0. IM NaOH溶液反復(fù)循環(huán)沖洗30min，停止循環(huán)，使NaOH溶液在膜包內(nèi)保持IOh以上，再用蒸餾水將NaOH洗凈，用甲醛溶液浸泡消毒。3. 3濃縮效果測定2種病毒濃縮前和濃縮后，用測血凝價HA方法進行檢查，并確定濃縮終點，進行4倍濃縮前后HA關(guān)系為濃縮后HA = 2+濃縮前HA。2種病毒液按上述濃縮終點進行濃縮，濃縮后的病毒應(yīng)達到濃縮終點的要求，同時對濃縮過程中的廢棄液應(yīng)隨時抽樣進行檢查，檢查其HA為零，符合要求。4制苗病毒液的滅活將無菌的兩種病毒液分別以4層紗布及一層細銅紗網(wǎng)濾過，混合于一個大玻璃瓶內(nèi)，吸出數(shù)毫升樣品備測毒價用。其余的病毒液分別加入10%甲醛溶液，隨加隨搖，使其充分混合，甲醛溶液的終濃度為0. 1%。加甲醛溶液后最好傾倒另一瓶中，以避免瓶頸附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。然后37°c滅活16h(以瓶內(nèi)溫度達到37°C開始計時)期間振搖 3 4次。滅活后置2 8°C保存，保藏時間不超過1個月。5半成品檢驗5. 1無菌檢驗取滅活的病毒液按《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000版) 附錄448頁方法進行，無菌生長，符合要求。5. 2滅活檢驗5. 2. INDV滅活檢驗取10日齡無新城疫病毒抗體的雞胚6枚，每個接種滅活胚液 0. 2ml，置36 37°C孵育，每日照蛋2次，棄去24h死亡的雞胚，觀察120h，雞胚非特異性死亡不超過1枚。對所有的胚液測定血凝價，應(yīng)不出現(xiàn)血凝，并盲傳1代，測定血凝價，均不出現(xiàn)血凝，判為滅活完全。5. 2. 2AIV滅活檢驗取10日齡無禽流感病毒抗體的雞胚6枚，每個接種滅活胚液 0.2ml，置36 37°C孵育，每日照蛋2次，觀察5日，雞胚非特異性死亡應(yīng)不超過1個。對所有的胚液測定血凝價，不出現(xiàn)血凝，并盲傳1代，測定血凝價，均不出現(xiàn)血凝，判為滅活完
全。 6油乳劑滅活苗的制備6. 1水相制備將上述滅活的抗原液，以NDV濃縮液AIV濃縮液按一定比例混合后， 按抗原混合液的4%加體積吐溫-80，充分搖勻，使吐溫-80完全溶解，即為水相。6. 2油相制備白油94份、司本-806份，混合后加硬脂酸鋁1. 5份，將3種成分混合加熱完全溶解后，121°C高壓滅菌40min，冷卻后備用，即為油相。6. 3乳化按水相油相=1 2的比例乳化。將乳化機的轉(zhuǎn)子在75體積％酒精中浸泡過夜后備用。先加油相2份于滅菌容器中，開動電機慢慢攪拌，然后徐徐加入水相1 份，加完后再以2800rpm乳化4分鐘。在終止乳化前加入1體積％硫柳汞溶液，使其終濃度為0. 01體積％。乳化后取IOml以3000rpm離心15min，不出現(xiàn)分層現(xiàn)象。6. 4疫苗制備配方按下表配制不同抗原含量的雞新城疫和h9亞型禽流感二聯(lián)濃縮滅活疫苗。通過對抗原的濃縮分別制備雞新城疫和H9亞型禽流感二聯(lián)濃縮疫苗，疫苗1、 2、3組分別含有不同的抗原含量。
權(quán)利要求
1.一種治療和預(yù)防雞新城疫和H9亞型禽流感的二聯(lián)濃縮滅活疫苗，其特征在于，含有滅活的新城疫病毒LaSota株，滅活的H9亞型禽流感病毒HL株和佐劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聯(lián)濃縮滅活疫苗，其特征在于，所述的新城疫病毒LaSota 株的含量為每0. Iml彡4X108_°EID50，滅活濃縮后HA價彡101og2 ；所述的H9亞型禽流感 HL株病毒含量每0. Iml彡4X108 °EID50，滅活濃縮后HA價彡101og2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聯(lián)濃縮滅活疫苗，其特征在于，所述的新城疫病毒LaSota 株的含量為每0. Iml ^ 4X 108 5EID50，所述的H9亞型禽流感HL株病毒的含量為每 0. Iml 彡 4X 108 5EID50。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聯(lián)濃縮滅活疫苗，其特征在于，所述的免疫佐劑為白油。
5.一種預(yù)防和治療雞新城疫和H9亞型禽流感二聯(lián)濃縮滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟1)生產(chǎn)用毒種的制備新城疫LaSota株和H9亞型禽流感HL株毒種繁殖；2)制苗病毒液的制備接種、孵育與觀察、收獲、檢驗；3)制苗病毒液的濃縮濃縮裝置的滅菌、病毒液濃縮、濃縮檢驗；4)制苗病毒液的滅活甲醛滅活；5)半成品檢驗無菌檢驗、滅活檢驗、病毒含量測定；6)油乳劑滅活苗的制備油相制備、水相制備、乳化制苗。
全文摘要
本發(fā)明提供了雞新城疫和H9亞型禽流感二聯(lián)濃縮滅活疫苗，含滅活的新城疫病毒LaSota株和滅活的H9亞型禽流感病毒HL株及佐劑。本發(fā)明還提供二聯(lián)濃縮滅活疫苗的制備方法。本發(fā)明通過提高疫苗單位體積的抗原含量，使疫苗免疫劑量降低到現(xiàn)有疫苗的1/3劑量，即對于1～5周齡雞，每只0.3ml疫苗降低到0.1ml疫苗，從而減小疫苗免疫對機體的應(yīng)激反應(yīng)，而且適用于小日齡雞群，增大疫苗的適用范圍。此外，在降低疫苗劑量的前提下，本發(fā)明的疫苗的免疫效果沒有降低。因此，本發(fā)明提供了一種免疫劑量小、免疫效果更好、成本更低、免疫保護期更長的新城疫、禽流感二聯(lián)疫苗。
文檔編號A61P31/16GK102302775SQ20111018864
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月6日
發(fā)明者孫進忠, 張許科, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司