專利名稱：多孔牙齒羥基磷灰石的檢測方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種用于檢測牙齒多孔羥基磷灰石的試劑盒及探針，以及ー種用于檢測涉及牙齒多孔羥基磷灰石的狀況的方法。
背景技術：
牙齒的彈性取決于礦物質(稱為羥基磷灰石)與有機成分(蛋白質、細胞和組織)之間的復雜的相互作用。在正常情況下，牙釉質和牙本質中的羥基磷灰石構成極其致密的結構，這種結構提供了維持牙齒完整性所需的硬度和韌性。牙釉質和牙本質中礦物質密度的流失導致異常的多孔羥基磷灰石，進而導致牙齒物理彈性的下降及結構破損。多孔羥基磷灰石是由幾種普遍的情況所引起的，包括齲齒和發(fā)育性牙齒缺陷(DDD)。齲齒(蛀牙)是ー種由分泌酸的細菌引起的疾病。由致齲細菌產生的酸能在ー種稱為脫礦化作用的過程中溶解羥基磷灰石。脫礦化作用的初始過程(稱為初期齲病)會導致羥基磷灰石的不連續(xù)區(qū)域，稱為白斑病變。隨著時間的流逝，白斑病變會發(fā)展成為洞(即牙齒材料的流失)，或者其有可能停止發(fā)展(稱為不活躍齲病)并在ー種稱為重礦化作用的過程中重新形成致密的羥基磷灰石売。在洞的形式之前，該過程是可逆的(即，重礦化作用)，但是一旦牙釉質流失，其將不會再生。齲病通過外觀檢查，物理檢查(即使用牙用探針劃痕)和X射線照相(用以檢測牙齒之間或牙齦線以下的齲齒)的結合來診斷。令人擔憂的是，這些診斷途徑會錯失大約一半的早期齲病，而使用這些方法診斷為齲病的牙齒診斷中高達13%事實上并不是齲病。改善診斷的最新嘗試包括使用測量電阻的設備、定量光導熒光技術(QLF)和紅外激光熒光技術(DIAGNOdent ),但是由于裝置的成本和尺`寸以及個體之間的差異，沒有ー個能獲得廣泛的應用。另ー種途徑是使用了染料來檢測牙本質中的齲病。然而，這些染料對多孔羥基磷灰石是非選擇性的:它們與蛋白質結合(推測為與牙本質中感染細菌有關的蛋白質)，或者它們占據胞間隙，這降低了特異性與敏感性。此外，這些染料會引起口腔變色、附著于健康的牙齒或需要輻照器才能被觀測到。齲病有兩種主要的治療方法，它們的選擇是以疾病的程度來決定的。白斑病變可以通過重礦化的途徑治療(如，氟化物療法或對生物活性分子穩(wěn)定的無定形磷酸鈣)。牙洞需要常規(guī)的修復牙醫(yī)學手段治療(即，填充)。DDD是另ー種引起多孔羥基磷灰石的普遍原因。它們令人不安的流行并潛在影響超過50%的具有包括牙痛，外形損傷和増加的齲病風險多重負擔的人群。兩種最普遍的DDD是牙齒氟中毒(以擴散的池斑為特征)和臼齒/門齒的低礦化(Hypomineralisation)(MIH，以界限清楚的濁斑為特征)；它們都是由環(huán)境因素引起的(即后天缺陷)。另ー種嚴重但是不常見的可以導致多孔羥基磷灰石的DDD是遺傳性的牙釉質發(fā)生不全疾病。MIH典型地影響10-20%的兒童并且是齲齒的ー個主要風險因素，畸齒矯正的一個風險因素，對社會來講代價昂貴。MIH被認為是起因于牙釉質形成細胞的多因子系統(tǒng)性紊舌し。然而，MIH的起因除了與排除氟化物和與幼年時期的疾病相關之外，仍然是個迷。
目前沒有可用的用于診斷和修復MIH或其他DDD的產品，齲齒和不同類型的DDD的鑒別診斷是困難的，并且在很大程度上依賴于每個牙科專業(yè)人士的經驗和技能。目前為齲齒重礦化而開發(fā)的程序和/或產品對MIH效果不好?；謴托灾委熃洺Ｊ茏?，這是因為MIH的釉質是軟的，多孔的并且與正常的牙組織分界不清。因此，需要ー種用于診斷、劃界和修復由齲齒和DDD引起的多孔性性牙齒羥基磷灰石的新工具。這里我們通過對新技術的詳述來對這種需求進行說明，這種新技術是基于我們在涉及多孔羥基磷灰石的狀況的致病機理的最新發(fā)現。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一方面是提供一種試劑盒，當用于檢測多孔牙齒羥基磷灰石時，包括:能與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質；或者能檢測結合到所述多孔牙齒羥基磷灰石的所述蛋白質的檢測物(detector)。本發(fā)明的第二方 面提供一種探針，當用于檢測多孔牙齒羥基磷灰石時，包括:能與多孔牙齒輕基磷灰石結合的蛋白質；和報告物(reporter)。本發(fā)明的第三方面提供一種制備第二方面中的探針的方法，包括連接(i)能與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質和(ii)報告物。本發(fā)明的第四方面提供一種用于檢測涉及多孔牙齒羥基磷灰石的狀況的方法，包括在受體的牙齒或該牙齒試樣的內部或表面，檢測與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質。本發(fā)明的第五方面提供ー種用于檢測低礦化DDD的方法，包括檢測蛋白質，其與牙齒或該牙齒試樣的測試羥基磷灰石結合的濃度相比于其與對照牙齒樣本或對照牙齒的對照羥基磷灰石結合的濃度提高了，并且檢測牙釉蛋白，其與所述測試羥基磷灰石結合的濃度接近于其與對照羥基磷灰石結合的濃度。本發(fā)明的第六方面提供一種用于檢測完整的和/或受損MIH釉質的方法，包括檢測與MIH羥基磷灰石結合的白蛋白和血紅蛋白，其中只檢測到白蛋白而未檢測到血紅蛋白表示完整的MIH釉質，而檢測到血紅蛋白表示受損的MIH釉質。本發(fā)明的第七方面提供一種用于去除與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質的試劑盒，包括:(a) (i) 一種或多種沖洗液或(ii)干組分，用干與水混合以制備ー種或多種沖洗液，其中所述ー種或多種沖洗液適用于去除與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質；和(b) 一種重礦化劑或矯正礦化劑。本發(fā)明的第八方面提供一種用于去除與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質的方法，包括使用一種或多種沖洗液清洗牙齒或該牙齒試樣。本發(fā)明的第九方面提供一種用于去除與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質的試劑盒，包括:一種或多種沖洗液；一種或多種干組分，用干與水混合制備ー種或多種沖洗液，其中所述ー種或多種沖洗液適用于去除牙齒或該牙齒試樣的內部或表面的蛋白質，所述牙齒或牙齒試樣通過第四方面中的方法檢測為具有多孔羥基磷灰石的牙齒或牙齒試樣。第一至第六方面中的試劑盒、探針或方法允許原位檢測或非原位診斷。第一至第六方面中的試劑盒、探針或方法，其可用于檢測齲的和/或MIH/DDD以及劃分齲的和/或MIH/DDD的邊界，以為牙齒的恢復做準備。而后臨床醫(yī)生可以明確地去除由此而顯示的齲的或MIH組織，確保了清晰邊界的制備并且提高了恢復成功的可能性。
第一方面中的試劑盒或第二方面中的探針提供了關鍵的工具，第四方面中的方法可用于多孔牙齒羥基磷灰石的例行篩查。此外，第一至第六方面中的試劑盒、探針或方法可以用于暴露的牙齒羥基磷灰石的早期檢測。以這樣的方式，第一至第六方面中的試劑盒、探針或方法可以用于牙齒變化的例行篩查，這種牙齒變化若未檢測到，可能最終導至齲齒(齲病的前兆)。因此，可以精確并及時地確定目標進行恢復和/或重礦化，以阻止齲病的發(fā)展和/或促進重礦化。在一些實施例中，第一至第六方面中的試劑盒、探針或方法尤其適用于兒童第一永久大白齒長出之后的例行篩查。由此，第一至第六方面中的試劑盒、探針或方法也適用于早期檢測多孔羥基磷灰石的牙齒例行篩查。定期的例行篩查提供了在可行的最早時間檢測到可能導致齲齒的牙齒變化的極好機會。而且，第一至第六方面中的試劑盒、探針和方法可對任何治療進行監(jiān)控，例如已知的重礦化治療法，其包括被生物活性分子穩(wěn)定的氟化物或磷酸鈣。第八方面中的方法以及第七和第九方面中的試劑盒能夠溫和地和/或特異性地去除過量的強カ留存在多孔羥基磷灰石上的蛋白質，例如在MIH病變中，在重礦化治療之前或期間使用。第一至第五或第七至第九方面中的蛋白質可以選自于以下群組:血清白蛋白，ネト體C3 0鏈(Complement C3 beta chain)、a-1-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳運鐵蛋白、白細胞彈性蛋白酶抑制劑、抗凝血酶-1I1、血紅蛋白a亞基(Hemoglobin subunit alpha)、血紅蛋白 P 亞基(Hemoglobin subunit beta)、血紅蛋白 5 亞基(Hemoglobin subunitdelta)、催乳素誘導蛋白、a-淀粉酶1、IgK鏈V-1II區(qū)SIE ;Ig a-2鏈C區(qū)；非典型蛋白c6或f 58和絲氨酸蛋白酶抑制劑B3。此外,第一至第四或第七至第九方面任ー項中的蛋白質可以為牙軸蛋白。第一、第七和第九方面中的試劑盒，或第二方面中的探針可以為替代的形式。ー種形式限定為適合于或限于ー種特定用途并以詞語“用干”來表明。另ー種形式為只限于ー種特定用途并以短語“當用干”來表明。第三至第六或第八方面可以以替代的形式來體現，例如在歐洲形式(供使用的試齊U)或第二醫(yī)學用途(Swiss)形式(“ー種試劑在藥物生產中的用途”)。


圖1描繪了 MIH牙釉質的蛋白質含量，其含量相對于正常牙釉質異常高。從正常牙釉質(正常)和表現為長牙后分解的嚴重病變組(試樣7-11)中提取不能溶于酸的蛋白質，然后用密度斑點印記分析定量。顯示了重復實驗平均值(土SD)，每ー實驗在不同的載荷下進行以確保定量的線性度Cr2 > 0.95)。如圖所示，當使用Student T檢驗(Student' st-test，同方差的，雙側檢驗)成對的比較時，所有的MIH試樣與正常樣品顯著不同。使用白蛋白標準從這些數據中得出絕對蛋白水平。圖2說明了完整的和受損的MIH病變具有區(qū)別的蛋白質譜(proteinprofiles)。如圖所示，來自MIH病變和正常釉質(正常)中的不能溶于酸的蛋白質經過了十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 和考馬斯亮藍染色或與牙釉蛋白抗體(杭-AMG)免疫印跡。(A)為完整表面和破損表面病變(分別為試樣1-6和7-11)的對比，顯示了不同形式的主要蛋白質條帯。并且顯示了白蛋白和血紅蛋白的位置(Alb，Hb)。(B)為來自于大鼠的分泌階段的牙釉質基質與MIH試樣的對比，其中來自于大鼠的分泌階段的牙釉質基質用作大部分完整的牙釉蛋白(AMG)的對照。試樣7和11分別代表帶有低的或相當大量的牙釉蛋白片段的病變。為了定量，大鼠和人類牙釉蛋白的交叉免疫反應性使用人類的牙釉蛋白進行標準化(來自于Abnova，臺北市，臺灣)。(C)為兩個完全病變的蛋白質譜，對比使用新鮮的提取物的第一輪跑膠與使用在_20°C下保存16周后的SDS-提取物的第二輪跑膠，注意到主要條帶在66kDa處(白蛋白)消失。圖3列出了完整和受損MIH病變的蛋白質組學分析的結果，顯示了在MIH釉質中多種體液蛋白。所顯示的來自于完整和受損病變的主要凝膠帶(圖2A，試樣1-11)經過了蛋白質組學鑒定，詳見表I。圖3描述了每一條帶中經鑒定的蛋白質，以及在其中進行鑒定的試樣(括號中的試樣序號)。試樣6和7的凝膠帶由圖2A重現以分別說明完整的和受損的病變的凝膠帶。圖4描述了礦化試驗，其掲示了表面完整性調節(jié)MIH牙釉質蛋白質的組成。(A)為MIH牙釉質和體液的對比譜圖，顯示了相對于血清的完全病變和相對于唾液和紅細胞的破損病變的相似性。(B)為羥基磷灰石結合(HAp-親和性)試驗，顯示來自模擬口腔液體(0-液體)的蛋白質亞基優(yōu)先保留下來(參見載荷，結合和未結合分數的不同)。注意到標記結合譜和受損病變在板A(試樣7)非常相似。(C)為B的等價礦物質結合試驗，但是以粉末化的MIH牙釉質代替羥基磷灰石。譜圖顯示了來自于完全病變的釉質，其為在暴露于模擬口腔液體之前或之后(+/-0-液體)。注意到在板A和板B標記那些受損病變和羥基磷灰石的蛋白結合譜(+)相似。這ー結果表明總體結構(包括完整表面)的損失導致完全病變的蛋白質結合能力顯著變化。為了使這些相似性合理化，親和基質(粒狀的羥基磷灰石，MIH釉質)在試驗前被研磨成均一粒徑(粗粉)。圖5描述了羥基磷灰石結合試驗(考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE)顯示來自于模擬口腔液體的血紅蛋白和白蛋白與羥基磷灰石結合。三步沖洗程序可以從羥基磷灰石中去除>90%的蛋白質，所述三步沖洗程序包括相繼使用5mM MgCl2, IM MgCl2JP0.4M NaH2P04 —行沖洗，其中每ー步沖洗5 分鐘。圖6提供了人類血清白蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1 ;SWiSSProt登記號P02768)。圖7提供了人類補體C3的氨基酸序列(SEQ ID NO:2 ;SwissProt登記號PO 1024)。圖8提供了人類a -1-抗胰蛋白酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3 ；SwissProt登記號 P01009)。圖9提供了人類蛋白S100-A9的氨基酸序列(SEQ ID NO:4 ;SwissProt登記號P06702)。圖10提供了人類乳運鐵蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:5 ;SWiSSProt登記號P02788)。圖11提供了人類白細胞彈性蛋白酶抑制劑的氨基酸序列(SEQ ID NO:6 ；SwissProt 登記號 P30740)。圖12提供了人類抗凝血酶-1II的氨基酸序列(SEQ ID NO:7 ；SwissProt登記號P01008)。圖13提供了人類血紅蛋白a亞基的氨基酸序列(SEQ ID NO:8 ；SwissProt登記號 P69905)。圖14提供了人類血紅蛋白P亞基的氨基酸序列(SEQ ID NO:9 ；SwissProt登記號 P68871)。圖15提供了人類血紅蛋白5亞基的氨基酸序列(SEQ ID NO:10 ;SwissProt登記號 P02042)。圖16提供了(人類催乳素誘導蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:11 ;SwissProt登記號 P12273)。圖17提供了人類a -淀粉酶I的氨基酸序列(SEQ ID NO:12 ；SwissProt登記號P04745)。圖18 提供了人類 IgK 鏈 V-1II 區(qū) SIE 的氨基酸序列(SEQ ID NO:13 ；SwissProt登記號P01620)。圖19提供了人類Iga-2鏈C區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO:14 ;SwissProt登記號P01877)。圖20提供了人類非典型蛋白c6或f 58的氨基酸序列(SEQ ID NO:15 ；SwissProt登記號Q6P5S2)。圖21提供了人類絲氨酸蛋白酶抑制劑B3的氨基酸序列(SEQ ID NO:16 ；SwissProt 登記號 P29508)。圖22提供了人類牙釉蛋白X型異構體的氨基酸序列(SEQ ID NO:17 ；SwissProt登記號Q99217)。圖23提供了人類牙釉蛋白Y型異構體的氨基酸序列(SEQ ID NO:18 ；SwissProt登記號Q99218)圖24提供了小鼠牙釉蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:19 ;SwissProt登記號P63277)，其同樣對應于重組的小鼠牙釉蛋白。圖25提供了牛的血紅蛋白a亞基的氨基酸序列(SEQ ID NO:20 ;SwissProt登記號 P01966)。圖26提供了牛的血紅蛋白P亞基的氨基酸序列(SEQ ID NO:21 ;SwissProt登記號 P02070)。
圖27描述了通過N-羥基琥珀酰亞胺酷(SMCC)與氨基黑(伯胺)反應來制備馬來酰亞胺激活顯色的報告物制備的化學反應。馬來酰亞胺激活顯色的報告物為有巰基活性的物質，能與血紅蛋白P亞基中的半胱氨酸-硫醇結合。圖28描述了制備探針(在此實施例中為與顯色報告物結合的蛋白質)的化學反應，其是通過將如圖28的馬來酰亞胺激活顯色報告物與血紅蛋白3亞基中的半胱氨酸硫醇基(SH)反應制得。每個血紅蛋白四聚體結合兩分子顯色的報告物，并且保留兩個亞基未經修飾，這對與保持血紅蛋白的羥基磷灰石結合功能是重要的。圖29描述了根據圖27和圖28和實施例2制備的探針與羥基磷灰石的體外結合。探針包括血紅蛋白(Hb)，黒-藍顯色的報告物(氨基黒)和連接物(linker)。在應用探針的5分鐘內，羥基磷灰石變成深藍色。探針可以經受水洗，但只有顯色的報告物(即未與Hb連接的)在水中沖洗時被去除。通過三步沖洗程序從羥基磷灰石去除探針，所述三步沖洗程序包括依次使用5mM MgCl2, IM MgCl2JP0.4M NaH2PO4進行沖洗，其中每ー步沖洗5分鐘。
圖30描述了實施例3的結果，實施例3說明了根據實施例2制備的探針特異性結合到多孔牙釉質特異性結合。圖31描述了實施例4的結果，實施例4說明了根據實施例2制備的探針可以特異性檢測牙釉質表面的早期脫礦化(初期齲病模型)。圖32描述了實施例5的結果，實施例5說明了根據實施例2制備的探針的反應機理為羥基磷灰石親和性。圖33描述了實施例6的結果，實施例6說明了根據實施例2制備的探針特異性標記了低礦化牙釉質和異常的牙本質。而正常的牙釉質和牙本質不標記。低礦化牙釉質特異性地并且均勻地被標記為深紫色。異常的牙本質被特異性地并且均勻地標記為深緑色。圖34描述了實施例7的結果，實施例7說明了根據實施例2制備的探針可以用于引導低礦化牙釉質的移除。圖35描述了實施例8的結果，實施例8說明了根據實施例2制備的探針可以用于引導異常牙本質的移除。圖36描述了實施例9的結果，實施例9說明了根據實施例8的異常牙本質檢測可以通過漂洗而改迸。圖37描述了實施例10的結果，實施例10說明了探針可以為射線透不過的，這可以通過用氨基-2，4，6-三吲哚間苯ニ甲酸(3I)取代實施例2中的藍色發(fā)色團(氨基黒)。圖38描述了實施例11的結果，實施例11說明了在去除與純羥基磷灰石結合的蛋白質時，包含Mg2+或PO4的沖洗液的相對效果。圖39描述了實施例 12的結果，實施例12說明了在去除與純羥基磷灰石結合的蛋白質時，包含Mg2+或PO4的沖洗液単獨或相繼應用時的相對效果。圖40描述了實施例13的結果，實施例13說明了在去除與純羥基磷灰石結合的蛋白質時，包含Mg2+或PO4的沖洗液聯(lián)合應用時的相對效果。圖41描述了實施例14的結果，實施例14說明了包含Mg2+或PO4的沖洗液從低礦化牙釉質中去除蛋白質的應用，盡管其相對于實施例11至13中羥基磷灰石的模型效果有所降低。圖42描述了實施例15的結果，實施例15說明了包含Mg2+或PO4的沖洗液從低礦化牙釉質中去除蛋白質的效果相比于實施例14可以有所増加，這種效果的增加是通過延長施用周期以使蛋白質可以被定量去除。
具體實施例方式此處掲示用于檢測可以與多孔羥基磷灰石結合的蛋白質的試劑盒、探針和方法。羥基磷灰石可以包括在牙釉質或牙本質中。而且，此處第一次掲示了ー種產品可檢測牙釉質中的缺陷，尤其通過檢測多孔牙齒羥基磷灰石，而現有產品染色牙本質(但并不檢測多孔牙齒羥基磷灰石)?？梢耘c多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質可以為人類蛋白質。例如，蛋白質可選自以下群組:血清白蛋白(P02768);補體C3 3鏈(P01024) ; a-1-抗胰蛋白酶(P01009)；蛋白質S100-A9(P06702);乳運鐵蛋白(P02788);白細胞彈性蛋白酶抑制劑(P30740);抗凝血酶-1II(P01008);血紅蛋白a亞基(P69905);血紅蛋白P亞基、(P68871);血紅蛋白8亞基(P02042催乳素誘導蛋白(P12273) ; a -淀粉酶I (P04745) ；IgK鏈V-1II區(qū)SIE(P01620) ;Iga-2鏈C區(qū)(P01877);非典型蛋白c6或f58 (Q6P5S2);絲氨酸蛋白酶抑制劑B3(P29508)，其中括號內的術語表示SwissProt數據庫的唯一登記標識(如表I所分別列出的，SEQ ID N0:1至16和圖6至21)。在一些實施例中，蛋白質可以為牙釉蛋白。牙釉蛋白可以為人類的。例如，牙釉蛋白可以為人類牙釉蛋白的X型異構體，(SEQ ID N0:17，圖
22;SwissProt登記號Q99217)或者可以為人類牙釉蛋白的Y型異構體，(SEQ ID NO: 18，圖
23;SwissProt登記號Q99218)?？商娲?所述蛋白質可以來自于非人類的受體,例如,動物如靈長類、馬、母牛、綿羊、山羊狗或貓。在第一至第四和第七至第九方面的一些實施例中，所述蛋白質可以為白蛋白、血紅蛋白或其亞基、或者為牙釉蛋白。在第四方面的一些實施例中，該方法包括檢測牙釉蛋白以外的蛋白質和檢測牙釉蛋白，其中蛋白質的存在和牙釉蛋白的缺乏是MIH的表征，而牙釉蛋白的存在是低成熟度缺陷的表現，包括**釉質發(fā)育不全或牙齒氟中毒。“牙釉蛋白以外的”蛋白質選自以下任一個:血清白蛋白，補體C3P鏈、a-1-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳運鐵蛋白、白細胞彈性蛋白酶抑制劑、抗凝血酶-1I1、血紅蛋白a亞基、血紅蛋白亞基、血紅蛋白S亞基、丨隹乳素誘導蛋白、a-淀粉酶1、IgK鏈V-1II區(qū)SIE5Iga-2鏈C區(qū)；非典型蛋白c6或f 58、和絲氨酸蛋白酶抑制劑B3。此處使用的“多孔的”或“多孔性”指低礦化或脫礦化的牙齒羥基磷灰石。増加的“多孔性”是由于礦物質密度的降低，這導致礦物質晶體之間的空間増大。此處使用的“低礦化”指牙釉質的不完全發(fā)育，其導致礦物質密度的降低(牙釉質孔隙度増加)和機械強度的降低。“低礦化”是由遺傳性的(即釉質發(fā)育不全)或后天的(即MIH，氟中毒)牙齒發(fā)育的破壞引起的?！暗偷V化”與“脫礦化”不同，例如“脫礦化”發(fā)生在齲齒中。在齲齒中，發(fā)育正常(或不正常)的牙釉質隨后會脫礦化?！懊摰V化”與“低礦化”不同，“低礦化”指由于被破壞的發(fā)育而從未達到正常礦物質含量的牙釉質。此處使用的“重礦化”指礦物質重返到牙齒分子結構中。牙齒的主要礦物質為羥基磷灰石。在一些重礦化過程中，羥基基團被氟基團所取代以產生氟磷灰石，其比羥基磷灰石更加抗酸。此處使用的“矯正礦化”指對DDD (即由不完全礦化引起的多孔羥基磷灰石)使用重礦化治療法。在DDD情況下使用術語“重礦化”是不合適的，這是由于這種多孔羥基磷灰石不是由脫礦化引起的。此處使用的“齲病”或“蛀牙”指由酸引起的牙釉質和牙本質的減少或損失，尤其指感染細菌產生的酸?！褒x病”是由脫礦化過程來界定的，而且如果發(fā)現較早，可以通過使用重礦化方法來矯正。此處使用的“涉及多孔牙齒羥基磷灰石的狀況”包括齲齒，白齒/門齒的低礦化(MIH)，釉質發(fā)育不全，牙齒氟中毒或其他表現為低礦化釉質的DDD (即擴散的或界限清楚的濁斑)。此處使用的“臼齒/門齒的低礦化”或“MIH”指導致不完全堅硬(低礦化)牙釉質的DDD，通常分別為為第一永久 大臼齒和門齒分別咬合的或相切的三分之ー處。MIH和氟中毒均表現為表層以下的孔隙，其中活躍的齲齒可以具有多孔表面(不活躍齲齒可以由于重礦化作用而形成密封的表面)。此處使用的“暴露的”牙釉質指次表面組織，因防護表層的流失而被暴露?！氨┞兜摹毖烙再|可以為正常的或多孔的；也就是說，有很多牙齒表面的崩解實例并不是受MIH或其他情況的影響(如正常牙齒可能在咬堅硬物體時斷裂)。此處使用的“結合”，“結合的”或“結合地”指蛋白質和羥基磷灰石之間的化學相互作用，使蛋白質保留在羥基磷灰石內。這種相互作用可以為離子的、共價的、非共價的，極性的或非極性的作用。此處使用的術語“檢測物”指任何化學的，生物化學的或生物的物質，其可以特定地與此處掲示的蛋白質相互作用，并產生與這種相互作用響應的效果。例如，這種響應可以為顯色報告物的可視化，以及由此得出的蛋白質可視化?！皺z測物”可以包括“報告物”或抗體。術語“檢測”或“進行檢測”指識別來自檢測物的響應。在第一方面中的試劑盒的一個實施例中，檢測物包含顯色報告物。在第二方面的探針中，檢測物為報告物。在探針的ー個實施例中，報告物包含顯色報告物。當檢測物包含顯色報告物吋，檢測顯色報告物則包含顯示顯色報告物以及由此顯示目標蛋白質?？商娲模瑘蟾嫖锟梢詾樯渚€透不過的。此處使用的術語“探針”指一種試劑，如此處掲示的蛋白質，其可以滲透進多孔釉質并可以特異性地和緊密地與羥基磷灰石結合，且發(fā)生結合后這種結合可以被檢測到。換句話說，該探針包括特定的“羥基磷灰石靶向的”分子?！疤结槨卑ù颂帓魇镜牡鞍踪|和報告物。根據本發(fā)明，“探針”可以不是抗體。相似的，術語“特異性的”或“特異性地”指一種物質特定地與第二種物質結合而基本上不與其他任何ー種物質結 合。這種結合與非特異性相互作用具有可測定程度的不同。特異性結合可以被測定，例如，通過與ー種分子的結合相比于與對照分子的結合來測定，其中對照分子通常為不具有結合活性的具有相似結構的分子。例如，特異性結合可以由與靶向分子類似的對照分子競爭來確定，例如，無標記的靶向分子過量。在這種情況下，如果靶向分子與探針的結合被過量的無標記的靶向分子在競爭中抑制，則表明為特異性結合。此處的“特異性的”或“特異性地”結合可以指⑴特定地與羥基磷灰石結合的蛋白質，(ii)特定地與蛋白質結合的檢測物，或(iii)特定地與蛋白質或檢測物結合的報告物。特別的，特異性結合指具有比非特異性靶向分子至少少2倍的Kd的物質，例如，具有比非特異性靶向分子至少少4倍、6倍、8倍、10倍、或10倍以上的Kd的物質?？蛇x的，特異性結合可以表達為ー種對于靶向分子的Kd最多為約10_4M的分子，例如，約10_5M，約10_6M，約 I(T7M,約 I(T8M,約 I(T9M,約 I(T10M,約 I(T11M,約 10_12M，或者更低。在第一方面的試劑盒的一個實施例中，檢測物包含報告物。當原位使用時，檢測物或探針對于受體無毒。此處使用的“報告物”指任何化學的，生物化學的或生物的可以產生檢測效果的物質?！皥蟾嫖铩笨梢蕴禺愋越Y合或連接到檢測物或蛋白質上。在用于高親和性、非共價生物素-鏈霉親和素結合時，報告物可以包括生物素或鏈霉親和素。報告物會產生另一種高親和性、非共價鍵。在第一方面的試劑盒或第二方面的探針的ー個具體實施方式
中，報告物可以為顯色報告物。在第一或第二方面的其他具體實施方式
中，報告物可以為ー種顏料，或ー種冷光的(包括熒光的或磷光的)、放射性的、化學發(fā)光的物質，酶或X射線對比分子(x-raycontrast molecule)。報告物包含ー種X射線對比分子(例如，5-氨基-2,4,6-三卩引哚間苯ニ甲酸；31)，其可以用于使用現有的臨床放射影像設備靈敏的檢測早期階段的牙鄰面齲病(現有技術的ー個主要問題)。此處的術語“顯色報告物”指任何顯色的物質，優(yōu)先吸收可見光的某些波長的物質。因此，當報告物為顯色報告物時，檢測效果是一種顏色的可視化效果。顯色報告物可以為任何顯色的可以連接、偶聯(lián)或結合到蛋白質的物質，同時維持其顯色報告物的特性。在第一方面的試劑盒或第二方面的探針的一個實施例中，顯色報告物為氨基黒。在一個實施例中，探針包含與顯色報告物連接或偶聯(lián)的蛋白質(即與羥基磷灰石結合的蛋白質)。表I中的任何蛋白質可以與顯色報告物連接或偶聯(lián)，功能是將顯色報告物靶向到多孔羥基磷灰石。在一個實施例中，蛋白質為血紅蛋白。因此，在一個實施例中，探針包含連接到氨基黑的血紅蛋白。此處掲示的探針包括蛋白質，即血紅蛋白，累積地被多孔牙齒羥基磷灰石吸收。在其他蛋白質的存在下，探針會競爭結合到羥基磷灰石上，這是由于探針能夠取代對羥基磷灰石有較低親和性的其他物質。這種探針可以包含氨基黑或31。顯色報告物可以基于本領域技術人員熟知的所需特性選自于以下群組:こ酰基黃(堅牢黃);酸性黒1(氨基黑10B);酸性藍22 (水溶藍I);酸性藍93 (甲基藍)；酸性品紅(酸性品紅)；酸性綠(亮綠SF淡黃)；酸性綠1(萘酚綠B);酸性綠5 (亮綠SF淡黃)；酸性洋紅(酸性品紅)；酸性橙10(橙黃G);酸性紅4(偶氮曙紅)；酸性紅26( ニ甲代苯胺朱紅);酸性紅29(鉻變素2R);酸性紅44(朱紅6R);酸性紅51(赤蘚紅B);酸性紅52 (麗絲胺若丹明B);酸性紅66 (比布列西猩紅)；酸性紅73 (Woodstain猩紅)；酸性紅87 (曙紅Y ws);酸性紅91 (曙紅B);酸性紅92 (熒光桃紅B);酸性紅94 (玫瑰紅)；酸性紅101 (偶氮胭脂紅G);酸性紅103(偶氮胭脂紅B);酸性品紅(Acid roseine)(酸性品紅(Acidfuchsin));酸性玉紅(酸性品紅)；酸性紫19(酸性品紅)；酸性黃1(萘酚黃S);酸性黃7 (麗絲胺黃素FF);酸性黃9 (堅牢黃)；酸性黃23 (酒石黃)；酸性黃24 (馬休黃)；酸性黃36 (間胺黃)；酸性黃73 (熒光黃)；酸性黃85 (考馬斯堅牢黃G);酸性黃S (萘酚黃S);酸性黃T (酒石黃)；吖啶橙(吖啶橙)；吖啶紅(吖啶紅)；吖啶黃(吖啶黃)；阿爾新藍(阿爾新藍8GX);阿爾新黃(阿爾新黃)；醇溶曙紅(こ基曙紅)；茜素(茜草素)；茜素藍(茜素藍)；茜素藍2RC (蒽藍SWR);茜素洋紅(茜素紅S);茜素花青BBS (茜素花青BBS);茜酚花青R (鉻花青R);茜素紅S (茜素紅S);茜草紅紫素(紅紫素)；堿性藍4B，5B(堿性藍5B);黃金色素三甲酸(鉻紫CG);氨基黑10B(氨基黑10B);氨基萘酚紅(偶氮熒光桃紅)；氨基黑(氨基黑10B);苯胺藍WS (苯胺藍WS);苯胺紫(苯胺紫)；蒽藍SWR (蒽藍SWR)；蒽藍SWX (茜草花青BBS);金胺0(金胺0);偶氮曙紅(偶氮曙紅)；偶氮胭脂紅B (偶氮胭脂紅B);偶氮胭脂紅G (偶氮胭脂紅B);偶氮曙紅G (偶氮曙紅)；色基5(堅牢紅B);色基48(耐曬藍B);偶氮熒光桃紅(偶氮熒光桃紅)；伊文思藍(伊文思藍)；天藍A (天藍A)；天藍B(天藍B);天藍C(天藍C);堿性藍8(維多利亞藍4R);堿性藍9(亞甲基藍)；堿性藍12 (尼羅藍A);堿性藍15 (夜藍)；堿性藍17 (甲苯胺藍0);堿性藍20 (甲基綠);堿性藍26(維多利亞藍B);堿性棕1(俾斯麥棕Y);堿性品紅(堿性品紅)；堿性綠4 (孔雀緑)；堿性綠5 (亞甲基綠);堿性橙14 (吖啶橙);堿性紅2 (番紅0);堿性紅5 (中性紅);堿性紅9(副品紅)；堿性紫2(新品紅)；堿性紫3(結晶紫)；堿性紫4(こ基紫)；堿性紫10(若丹明B);堿性紫14 (品紅)；堿性黃I (硫磺素T);堿性黃2 (金胺0)；比布列西猩紅(比布列西猩紅)；比布列西猩紅R (蘇丹IV);俾斯麥棕Y (俾斯麥棕Y);布勞施瓦茲(萘酚藍黑CS);氧化巴西木素(氧化巴西木素)；巴西木素(巴西木素)；亮藏花(Woodstain猩紅)；亮結晶猩紅6R(朱紅6R);亮綠(亮綠)；鈣紅(核固紅)；胭脂紅(胭脂紅)；胭脂紅酸(月因脂紅)；酸性紅6R(鉻變素2R);天青石藍B(天青石藍B);中國藍(苯胺藍)；氯冉亭堅牢綠5B (天狼星紅4B);芝加哥藍4B (滂胺天藍5B);鉻堅牢黃8GL (鉻堅牢黃8GL);鉻堅牢黃SG (鉻堅牢黃8GL);鉻紫CG (鉻紫CG);鉻變素2R (鉻變素2R);鉻花青R (鉻花青R);胭月旨蟲紅(胭脂紅)；小行星藍(天青石藍B);剛果科林斯(剛果科林斯)；剛果紅(剛果紅)；考馬斯堅牢黃G (考馬斯堅牢黃G);棉藍(甲基藍)；棉紅(剛果紅)；藏花猩紅(比布里希猩紅);藏花猩紅3B (Woodstain猩紅);藏花猩紅MOO (Woodstain猩紅);藏花(藏紅花);結晶朱紅6R(朱紅6R);結晶猩紅(朱紅6R);結晶紫(結晶紫)；大麗花(霍夫曼紫)；鉆石綠B (孔雀綠)；直接藍14(錐蟲藍)；直接藍58 (伊文思藍)；直接紅(剛果紅)；直接紅 10 (剛果科林斯)；直接紅28 (剛果紅)；直接紅80(天狼星紅F3B);直接紅81 (天狼星紅4B);直接黃7(硫磺素S);直接黃11(日光黃)；直接耐曬藍4R (直接耐曬藍4R);直接耐曬藍8G (直接耐曬藍SG);曙紅B (曙紅B)；曙紅黛青(曙紅B);曙紅(曙紅Y ws);曙紅Y (曙紅Yws);曙紅淡黃(曙紅Y ws);曙紅醇溶液(曙紅醇溶液)；伊利石榴石B (剛果科林斯)；羊毛絡花青R (羊毛絡花青R);赤鮮紅B(赤鮮紅B);こ基曙紅(こ基曙紅)；こ基綠(こ基綠)；こ基紫(こ基紫)；伊文思藍(伊文思藍)；堅牢藍B(堅牢藍B);堅牢綠FCF (堅牢綠FCF);堅牢紅B(堅牢紅B);堅牢黃(堅牢黃)；特異性堅牢黃(堅牢黃)；堅牢黃G (堅牢黃)；脂肪黑HB(蘇丹黑B);熒光黃(熒光黃)；食物綠3 (堅牢綠FCF);掊因(掊因)；加拉明藍(加拉明藍)；掊花青(掊花青)；龍膽紫(甲基紫2B);幾內亞綠(幾內亞綠B);蘇木紅(蘇木紅)；羥高鐵血紅素(羥高鐵血紅素)；蘇木紫(蘇木紫)；日光堅牢品紅BBL(核固紅)；甲藍(甲基藍)；氧化蘇木精(氧化蘇木精)；蘇木精(氧化蘇木精)；蘇木紫(蘇木紫)；霍夫曼紫(霍夫曼紫)；肼黃(酒石黃)；靛藍胭脂紅(靛藍胭脂紅)；印度紅(曙紅B);固有藍1(阿爾新藍8GX);固有黃I (阿爾新黃)；INT (碘硝基氯化四氮唑藍)；碘綠(碘綠)；胭脂蟲粉(胭脂蟲粉)；胭脂酮酸(胭脂蟲粉)；核固紅(核固紅)；基通若丹明B (麗思胺若丹明B);蟲膠(蟲膠酸)；蟲膠酸(蟲膠酸)；勞特紫(硫堇)；亮綠(亮綠SF淡黃)；麗思胺堅牢黃(麗思胺堅牢黃)；麗思胺核黃素FF(麗思胺核黃素FF);麗思胺綠SF (亮綠SF淡黃)；麗思胺若丹明B (麗思胺若丹明B);盧卡斯純黃6G (鉻堅牢黃8GL);盧卡斯堅牢藍(盧卡斯堅牢藍MBS);洋紅0 (副品紅)；洋紅I (品紅)；洋紅II (洋紅II);洋紅III (新品紅)；孔雀緑(孔雀緑)；曼徹斯特棕(俾斯麥棕Y);馬休黃(馬休黃)；苯胺紫(苯胺紫);苯胺紫(苯胺紫);紅汞(紅汞220);紅汞(紅汞220);間胺黃(間胺黃);甲基藍(甲基藍)；甲基綠(甲基緑)；甲基紫(甲基紫2B);甲基紫2B(甲基紫2B);甲基紫IOB (結晶紫)；亞甲基天藍A (天藍A);亞甲基天藍B (天藍B);亞甲基天藍C (天藍C);亞甲基藍(亞甲基藍)；亞甲基綠(亞甲基綠)；銑黃3G (銑黃3G);媒染藍3 (羊毛鉻花青R);媒染藍10 (掊花青)；媒染藍14 (天青石藍B);天青石藍23 (茜草素花青BBS);媒染藍32 (蒽藍SWR);媒染藍45 (加拉明藍)；媒染紅3 (茜草素紅S);媒染紅11 (茜草素)；媒染紫25 (掊因)；媒染紫39 (鉻紫CG);媒染黃33(鉻堅牢黃8GL);精萘藍黑(萘藍黑CS);萘酚藍黑(氨基黑10B);萘酚綠B(萘酚綠B);萘酚黃S (萘酚黃S);自然黑I (氧化蘇木精)；自然紅(紅紫素)；自然紅3(胭脂蟲)；自然紅4(胭脂紅)；自然紅8(紅紫素)；自然紅16(紅紫素)；自然紅24(巴西木素)；自然紅25(蟲膠酸)；自然紅28(苔紅素)；自然黃6(藏紅花)；NBT(四唑氮藍)；自然紅(自然紅)；新品紅(新品紅)；尼亞加拉藍3B(錐蟲藍)；夜藍(夜藍)；尼羅藍(尼羅藍A);尼羅藍A (尼羅藍A);尼羅藍硫酸鹽(尼羅藍A)；尼羅紅(尼羅紅)；硝基BT(四唑氮藍)；四唑氮藍(四唑氮藍)；核固紅(核固紅)；油紅0(油紅0);橙色G(橙色G);苔紅素(苔紅素)；副品紅(副品紅)；珀金紫(苯胺紫)；突光桃紅B(熒光桃紅B);苦味酸(苦味酸)；朱紅2R(ニ甲代苯胺朱紅)；朱紅6R(朱紅6R)；朱紅B(比布列西猩紅)；ニ甲代苯胺朱紅(ニ甲代苯胺朱紅)；朱紅S(朱紅S);滂胺天藍5B (滂胺天藍5B);櫻草植物(霍夫曼紫)；櫻草靈(櫻草靈)；紅紫素(紅紫素)；派洛寧B(派洛寧B);派洛寧G(派洛寧Y);派洛寧Y(派洛寧Y);若丹明B(若丹明B);品紅(品紅)；孟加拉玫瑰紅(孟加拉玫瑰紅)；藏紅花(藏紅花)；番紅0(番紅0);猩紅R(蘇丹IV);猩紅(蘇丹IV);猩紅R (蘇丹IV);蟲膠(蟲膠酸)；天狼星紅F3B (天狼星紅F3B);天狼星紅4B(天狼星紅4B);天狼星超級藍F3R(直接耐曬藍4R);獨鉻花青R(茜酚花青R)；可溶藍(苯胺藍)；溶劑黑3 (蘇丹黑B);溶劑藍38 (盧卡斯堅牢藍MBS);溶劑紅23 (蘇丹III);溶劑紅24 (蘇丹IV);溶劑紅27(油紅0);溶劑紅45 (こ基曙紅)；溶劑黃94 (熒光黃)；醇溶曙紅(こ基曙紅)；蘇丹III (蘇丹III);蘇丹IV(蘇丹IV);蘇丹黑B(蘇丹黑B);蘇丹紅BK(蘇丹III);硫磺黃S(萘酚黃S);磺基若丹明B(麗思胺若丹明B);日光黃(日光黃)；瑞士藍(亞甲基藍)；酒石黃(酒石黃)；硫磺素S (硫磺素S);硫磺素T (硫磺素T);硫堇(硫堇)；甲苯胺藍(甲苯胺藍0) ；Toluyline red(自然紅)；苯胺黃G(間胺黃)；吖啶黃(吖啶黃)；錐蟲藍(錐蟲藍)；螢光素鈉(熒光黃)；維多利亞藍4R(維多利亞藍4R);維多利亞藍B(維多利亞藍B);維多利亞藍R(維多利亞藍R);維多利亞綠B(孔雀綠)；水溶藍I (水溶藍I);水溶曙紅(黃色曙紅ws) ;Woodstain猩紅(Woodstain猩紅)；ニ甲苯紅B(麗絲胺若丹明B) ; ニ甲代苯胺朱紅(ニ甲代苯胺朱紅)；和淡黃曙紅(黃色曙紅ws)。本領域技術人員要考慮的所需特性包括，例如與蛋白質和/或根據本發(fā)明使用的連接物的相容性、無毒性、和維持與多孔牙齒羥基磷灰石結合。在第一至第五或第 七至第九方面的可替代實施例中，與羥基磷灰石結合的蛋白質在表I的實施例中未被列出，但是本領域技術人員可以知道其能結合到多孔羥基磷灰石，例如骨鈣蛋白或飾膠蛋白聚糖。來自于飾膠蛋白聚糖的4-5個富亮氨酸的重復域能為牙本質中的多孔輕基磷灰石提供特定祀向機制?？商娲模诘谝恢恋谖寤虻谄咧恋诰欧矫娴膶嵤├?，蛋白質可以為多肽或蛋白質片段，并且所述多肽或蛋白質片段維持其與多孔牙齒羥基磷灰石結合的能力?？商娲?，本領域技術人員可以知道，可以與羥基磷灰石結合的小分子(或其聚合物)，例如四環(huán)素或氨基ニ磷酸鹽，其依據滲透到羥基磷灰石微孔區(qū)域的能力和依據穩(wěn)定性(即產品保質期)可以被更多的使用。氨基ニ磷酸鹽可以制備一種適于檢測和劃界齲齒的化合物(用于滲透多孔牙釉質表面和與脫礦化牙釉質強力結合的小的，高親和性的探針)。
在第一方面中的試劑盒或第二方面中的探針的ー些具體實施方式
中，檢測物或探針還包括將報告物與檢測物或蛋白質連接的連接物。連接物可以為異型雙功能的交聯(lián)齊U。例如，異型雙功能連接物可以為琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酷(SMCC)。依據本發(fā)明可以使用的連接物的其他例子包括:琥珀酰亞胺基-6-[ P -馬來酰亞胺基丙酰胺基]己酸(SMPH)，N-羥基琥珀酰亞胺基-4-疊氮水楊酸(NHS-ASA)，和 N，N- ニ環(huán)己基碳ニ亞胺(DCC)。其他類型的分子可以作為連接物。例如,此處可為如生物素-鏈霉親和素這樣的高親和性、非共價鍵。本領域技術人員可以知道可具有多種化學反應和間隔臂長度的多種交聯(lián)劑進ー步增加了本方法的靈活性。在第一方面中的試劑盒或第二方面中的探針的一些實施例中，報告物和蛋白質可以以已連接的方式提供?？商娲?，報告物和蛋白質可以単獨提供用于后續(xù)結合。試劑盒和探針可以包括連接物。試劑盒或探針中的蛋白質，報告物或連接物可以以任意可能的組合出現。例如，當報告物和蛋白質通過連接物連接時，探針為“隨時可用的”，即三種組分連接?？商娲?，蛋白質和連接物可以是連接的并單獨提供給報告物?？商娲?，連接物和報告物可以是連接并單獨提供給蛋白質?？商娲?，蛋白質，報告物和連接物作為單獨的組分提供。在第一方面的一個實施例中，試劑盒包括報告物和連接物，但不包括蛋白質。在第一方面中的試劑盒的ー些具體實施`方式中，檢測物包括與蛋白質特異性結合的抗體。在另ー個實施例中，在用于高親和性、非共價生物素-鏈霉親和素鍵時，檢測物可包括生物素或鏈霉親和素。檢測物會產生另一種高親和性、非共價鍵。例如，檢測物可包括抗體替代物，諸如肽基的蛋白配體。本領域熟知的肽基蛋白配體為synbody。術語“抗體”為廣義的含義，并且尤其涵蓋了表現出所需的生物學特性或免疫學活性的抗體，例如多克隆抗體、單克隆抗體(包括拮抗物和中和抗體)、具有多表位特異性的抗體組分、單鏈抗體和抗體片段?？贵w可以為共軛抗體或本領域技術人員熟知的其他任何類型的抗體。本領域技術人員可以使用熟知的任何方法來檢測抗體。ー級抗體可以包括報告物。可替代的，靶向ー級抗體的ニ級抗體可以包含報告物?？贵w可以為本領域技術人員所熟知的任何抗體，其與選自以下群組的蛋白質特異性結合:血清白蛋白、補體C3P鏈、a-1-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳運鐵蛋白、白細胞彈性蛋白酶抑制劑、抗凝血酶-1I1、血紅蛋白a亞基、血紅蛋白0亞基、血紅蛋白5亞基、催乳素誘導蛋白、a-淀粉酶1、IgK鏈V-1II區(qū)SIE ;Ig a-2鏈C區(qū)；非典型蛋白c6或f58、和絲氨酸蛋白酶抑制劑B3。在一個實施例中，抗體與牙釉蛋白特異性結合。在第一方面中的試劑盒的一個實施例中，抗血清白蛋白單克隆抗體可以選自以下群組:AL-01 ；1.B.731 ；1A9 ；6B 11 ；0CH1E5 ；1C8 ；1G2 ；2B2 ；2B3 ；2B6 ；14E7 ；15C7 ；Albl ;和產品編號為sc-70340的小鼠單克隆IgGl抗體(Santa Cruz Biotechnology Inc,圣克魯茲生物技術股份有限公司)。在一個實施例中，抗補體C3P鏈單克隆抗體可以為克隆755。在另ー實施例中，可以使用與補體C3P鏈交叉反應的抗人體C3單克隆抗體，其中抗人體C3單克隆抗體為克隆11H9。在一個實施例中，a-1-抗胰蛋白酶單克隆抗體可以選自以下群組:5B12 ；703 ；704 ；8A0 ；B9 ;和611。在一個實施例中，蛋白S 100-A9單克隆抗體可以選自以下群組:0.N.390A ；47-8D3 ；N0.134 ；N0.19 ;和S32.2。在一個實施例中，抗乳運鐵蛋白單克隆抗體可以選自以下群組:1C6 ；2B8 ；B97 ；CLB-13.17 ;和IAl。在一個實施例中抗凝血酶-1II單克隆抗體可以是4B3或BDI205。在一個實施例中，血紅蛋白a亞基抗體山羊多克隆IgG抗體,產品編號為sc_70340(Santa CruzBiotechnology Inc,圣克魯茲生物技術股份有限公司)。在一個實施例中，血紅蛋白P亞基抗體可以為產品編號為sc-21757的小鼠單克隆IgG1抗體(Santa Cruz Biotechnology Inc,圣克魯茲生物技術股份有限公司)。在一個實施例中，抗-1g 0-2鏈(:區(qū)單克隆抗體可以為克隆1445(也稱作抗人類化42)。在一個實施例中，抗牙釉蛋白X型抗體可以為兔的IgG多克隆抗體，產品編號為sc-32892 (SantaCruz Biotechnology Inc,圣克魯茲生物技術股份有限公司)。本領域技術人員應當理解其他適合的抗體也適用。在第一、第二或第四方面中的試劑盒、探針或方法的一個實施例中，第一蛋白質選自以下群組:可檢測到的血清白蛋白、補體C3P鏈、a-1-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳運鐵蛋白、白細胞彈性蛋白酶抑制劑、抗凝血酶-1I1、血紅蛋白a亞基、血紅蛋白P亞基、血紅蛋白S亞基、催乳素誘導蛋白、a-淀粉酶l、IgK鏈V-1II區(qū)SIE ;Iga-2鏈C區(qū)；非典型蛋白c6或f 58、和絲氨酸蛋白酶抑制劑B3，和可檢測到的第二蛋白質，其中所述第二蛋白質為牙釉蛋白。由此，第一方面中的試劑盒也可以包括檢測牙釉蛋白的第二檢測物。第ニ檢測物可以為抗牙釉蛋白抗體?？商娲?，檢測可以包括免疫檢測、色譜分析、電泳、質譜分析法和顯微鏡。免疫檢測可以包括例如酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、蛋白質印跡(Western Blot)、斑點印記、槽印記(slot blot)或流式細胞術。顯微鏡可以包括例如共聚焦激光，熒光或電子顯微鏡。檢測物或探針可以以不同方式應用，例如以液態(tài)、凝膠、膠囊、片劑、水溶液、水相或油相懸浮液、錠劑、片劑、粉末、顆粒、乳剤、糖漿或酏劑。在第一方面的試劑盒或第二方面的探針的一個實施例中，檢測物或探針包含溶齊IJ，檢測物或探針被溶解、懸浮或乳化于其中。所述溶劑可以是ー種通常用在藥學或エ業(yè)或其類似的溶剤。例如包括 水、こ醇、正丙醇、2-丁醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇、こニ醇、2-甲氧基こ醇、ニ甘醇、三甘醇、四甘醇、聚こニ醇、丙ニ醇(propylene glycol)、ニ丙ニ醇(dipropyIeneglycoI)、聚丙ニ醇、丙ニ醇、(trimethylene glycol)、I, 2_丁ニ醇，I, 3_丁ニ醇，2，3- 丁ニ醇，1,4- 丁ニ醇，1,5-戊ニ醇，こニ醇單甲醚，こニ醇單甲醚こ酸酷，こニ醇單こ醚，こニ醇ニこ醚，こニ醇單こ醚こ酸酷，こニ醇異丙醚，こニ醇單丁醚，こニ醇ニ丁醚，こニ醇單醋酸酷，こニ醇ニ醋酸酷，ニこニ醇單甲醚，ニこニ醇單甲醚，ニこニ醇こ醚醋酸酷，ニこニ醇單丁醚，ニこニ醇單丁醚こ酸酷，ニこニ醇ニ甲醚，ニこニ醇甲こ醚，ニこニ醇ニこ醚，ニこニ醇酯，三こニ醇甲醚，三こニ醇單こ醚，丙ニ醇單甲醚，丙ニ醇單こ醚，ニ丙ニ醇單甲醚，ニ丙ニ醇單こ醚，ee三こニ醇單甲醚，甘油，四氫呋喃，ニ甲基甲酰胺，ニ氧六環(huán)，丙酮，和ニ甲氧基こ烷。在一些實施例中，溶劑為與人類相容(compatible)的溶劑，包括水、こ醇，甘油，異丁醇，こニ醇，ニこニ醇，三甘醇，丙酮，或丙ニ醇?？梢詥为毷褂靡环N溶劑或混合使用兩種或多種溶剤。檢測物可以與增稠劑復合以使得其粘度從約50增加至約2000mPa S，例如100，200，300，400，500，750，1000，1250，1500，或 1750mPa s (在25。C下)，從而形成凝膠。用牙刷應用凝膠形式的檢測物，使得清潔牙齒的同時應用檢測物。可以使用的增稠劑的例子包括:合成添加劑例如海藻酸鈉，海藻丙ニ醇酯，羧甲基纖維素鈉，羧甲基纖維素鈣，羧甲基淀粉鈉，淀粉磷酸酯鈉，聚丙烯酸鈉，甲基纖維素，羥丙基纖維素，和聚こ烯吡咯烷酮；自然增稠劑例如瓜爾豆膠，角豆膠，塔拉膠，羅望子膠，阿拉伯樹膠，黃蓍膠，刺梧桐樹膠，海藻酸，角叉菜膠，黃原膠，結冷膠，凝膠多糖，甲殼素，殼聚糖，和殼糖胺；和無機增稠劑例如碳酸鈣，硅酸鈣，硅粉，無定形水和硅酸鹽，和疏水性ニ氧化硅。為了獲得約50至約2000mPa *s的粘度，增稠劑的結合量依據增稠劑種類而不同。例如，當羧甲基纖維素鈉具有明顯的增稠效果吋，結合量可以為約0.5至4%重量，而當使用甲基纖維素時，結合量為約10至30%重量。此外，檢測物或探針可以包括添加劑例如甜味劑、香味劑和防腐剤。適合的甜味劑包括蔗糖，乳糖，葡萄糖，阿斯巴甜或糖精。適合的香味劑包括薄荷油，冬青油，櫻桃，桔子或樹莓調味。適合的防腐劑包括苯甲酸鈉，維他命E，a-生育酚，抗壞血酸，苯甲酸甲脂防腐齊U，對羥基苯甲酸丙酯或亞硫 酸氫鈉。適合的潤滑劑包括硬脂酸鎂，硬脂酸，油酸鈉，氯化鈉或云母。適合的分解劑包括玉米淀粉，甲基纖維素，聚こ烯吡咯烷酮，黃原膠，膨潤土，藻酸或瓊脂。片劑可以包括與無毒的藥學上可接受的賦形劑混合的檢測物，所述賦形劑適用于片劑的生產。在其他的實施例中，第一方面中的試劑盒還包括一種或多種沖洗液。第七或第九方面的試劑盒包括一種或多種沖洗液。第一、第七或第九方面的試劑盒中的沖洗液可以包含ー種溶液，以去除任何非特異性結合到羥基磷灰石的蛋白質，即非解吸。例如，不會使與羥基磷灰石結合的蛋白質解吸的沖洗液，可以為水、生理鹽水、氨丁三醇緩沖液或者溫和的清洗劑等。由于口腔中含有豐富的蛋白質，其中包含多種與羥基磷灰石結合的蛋白質，在應用檢測物到牙齒或試樣上之前，沖洗液使不與羥基磷灰石持異性結合的蛋白質從牙齒或試樣上被去除。在第一、第七或第九方面的試劑盒的其他實施例中，沖洗液包含鎂離子(Mg2+)，磷酸ニ氫根離子(H2PO4-),磷酸ー氫根離子(HPO42-),或磷酸根離子(PO/—)(合稱“ P04”)，或可以包含多種順序施用的沖洗液，其中的每ー種可包含鎂離子(Mg2+)，磷酸ニ氫根離子(H2PO4-),磷酸ー氫根離子(HPO42-),或磷酸根離子(PO/—)。在原位使用無毒的條件下，可以使用任何可溶的鎂鹽、磷酸ニ氫根、磷酸ー氫根離子(HPO42-)或磷酸鹽。在一個實施例中，沖洗液包含氯化鎂或磷酸ニ氫鈉。本領域技術人員可以理解其他能夠使蛋白質從羥基磷灰石解吸的沖洗液也適用。沖洗液可以包括次氯酸(HOCl)，次氯酸鹽(NaOCl)或次氯酸鈣(Ca (OCl) 2)(合稱“漂白劑”)。沖洗液可以為隨時可用?？商娲?，沖洗液可以以濃縮液形式提供，基于其與水的稀釋液制備成沖洗液?？商娲?，沖洗液可以以ー種或多種干組分的形式提供，基于其與水的混合物制備成沖洗液。沖洗液可以包含續(xù)離子少于ImM，約ImM，約2mM,約3mM,約4mM,約5mM,約6mM,約7mM，約8mM，約9mM，約IOmM或多于10mM。沖洗液可以包含鎂離子少于0.1M，約0.1M,約 0.5M,約 0.6M,約 0.7M,約 0.8M,約 0.9M,約 1M，約 1.1M,約 1.2M,約 1.3M,約 1.4M,約1.5M，約2M，約IOM或多于10M。沖洗液可以包含磷酸ニ氫根、磷酸ー氫根或磷酸根離子少于 0.04M,約 0.04M,約 0.08M,約 0.09M,約 0.1M,約 0.2M,約 0.3M,約 0.4M,約 0.5M,約 0.6M,約 0.7M,約 0.8M,約 0.9M,約 1M，約 1.5M,約 2M，約 4M，或多于 4M。沖洗液可以包括約10%的漂白劑(約0.4% _0C1)，未摻水或稀釋的漂白劑(約4 %でCl)，或可以包括約20 % (約0.8 %でCl)，約30 % (約1.2 %でCl)，約40 % (約1.6% で Cl)，約 50% (約 2.0% で Cl)，約 60% (約 2.4% で Cl)，約 70% (約 2.8% で Cl)，約80% (約3.2%でCl)，約90% (約3.6%でCl)或約95%的漂白劑(約3.8%でCl)。然而，不愿束縛于任何特定的理論，認為具有步進式濃度梯度的鎂和/或磷酸鹽的復合沖洗液相比于單ー濃度的鎂溶液可以去除更多的蛋白質。認為漂白劑foci)非特異性地從羥基磷灰石剝離蛋白質。因此，在第一、第七或第九方面的試劑盒的一個實施例中，一種或多種沖洗液或復合沖洗液可以包含約5mM氯化鎂的溶液，約IM氯化鎂的溶液，和/或約0.4M的磷酸ニ氫鈉的溶液。在使用ー種或多種(復合)沖洗液時，沖洗液可以以任何順序應用?？商娲?，在使用ー種或多種(復合)沖洗液時，沖洗液可以以下順序相繼使用，低鎂濃度(即5mM)，高鎂濃度(即1M)，磷酸ニ氫鹽(即0.4M;或磷酸ー氫鹽或磷酸鹽)?？商娲?，沖洗液可以包括鎂鹽和磷酸鹽的組合，例如，約IM的鎂濃度和約0.4M磷酸ニ氫鹽、磷酸ー氫鹽或磷酸鹽濃度。 沖洗可以實施于檢測前、檢測后、或檢測前和檢測后。此處使用的“去除”或“去除的”指與羥基磷灰石結合的蛋白質濃度的降低。此處使用的“試樣”為牙齒的一部分，用于檢測或診斷多孔羥基磷灰石。“對照試樣”為已知是健康的并且無多孔羥基磷灰石牙齒的一部分，用于當檢測或診斷待測羥基磷灰石的孔隙度時的參考。“試樣”可以通過擦、刷、刮、削片、鉆孔或類似方法取得?？梢允褂貌蓸悠魍ㄟ^刷、擦或其他本領域技術人員所熟知的任何采集方式獲得試樣。在第四至第六方面中的方法中的一個實施例中，牙齒首先通過刷或其他方式進行清潔，并干燥。在第一方面中的試劑盒、第二方面中的探針或第四至第六方面中的方法的ー個實施例中，通過使用刷子、牙刷、棉簽、棉球或通過從具有噴嘴的容器中噴出來應用檢測物。此處使用的“被應用”，“進行應用”或“應用”為其本身的含義，即將檢測物或探針或沖洗液與牙齒或其試樣接觸，或將報告物與檢測物或蛋白質接觸。在應用檢測物或探針后，檢測物或探針在牙齒上培養(yǎng)一段時間，以使檢測物與蛋白質充分結合，或者使探針與羥基磷灰石充分結合。培養(yǎng)階段可以為1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55 或 60s。可替代的，培養(yǎng)時間可以為 1,1.5,2,2.5,3,3.5，4，4.5，或5分鐘?？商娲?，培養(yǎng)時間可以為多于5分鐘，例如10，15或20分鐘。培養(yǎng)之后，過量的檢測物或探針可以從口腔中吐出，可以或可以不使用水或沖洗液來清洗。這種方法或用途可以在受體的牙齒內部或表面原位實施。可替代的，這種方法或用途可以在從受體移除后，在牙齒或試樣的內部或表面實施。

受體包括哺乳動物。哺乳動物可以為人類。人類可以為任何年齡。人類可以為約12歲以下。人類可以為約2至約12歲，約4至約10歲，或約6至約10歲?？商娲模荏w可以為 12 至 20，20 至 30，30 至 40，40 至 50，50 至 60，60 至 70，70 至 80，80 至 90，或 90 至100 歲。受體可以在正常羥基磷灰石或正常的釉質發(fā)育后發(fā)展為多孔羥基磷灰石，或者受體在整個發(fā)育過程中都有多孔羥基磷灰石?？商娲?，受體可以為馴養(yǎng)的，動物園的或寵物動物。特別的，此處的方法或用途適用于人類，也適用于靈長類，寵物如狗和貓，馴養(yǎng)動物如馬、牛、綿羊和山羊，動物園動物如貓科動物、犬科動物、?？苿游锖陀刑銊游?，或者實驗動物如兔類和嚙齒類動物。受體可以受試有牙科疾病，或可以不患有牙科疾病(即無可檢測到的疾病)。此處掲示的試劑盒或方法的診斷力，基于具有區(qū)別的蛋白質譜的多孔羥基磷灰石的情況(DDD和齲齒)(例如MIH:富含表I中的蛋白質，很少或沒有牙釉蛋白；成年的氟中毒:痕量白蛋白和牙釉蛋白；不成熟釉質發(fā)育不全:大量的牙釉蛋白)。不同的缺陷要求不同的在矯正礦化作用之前的沖洗程序，或不同的恢復方法和材料(或影響其選擇)。牙齒或其試樣的待測釉質中的蛋白質濃度可以以多種方法來評估，而涉及多孔羥基磷灰石的情況可基于識別蛋白質相對于對照組提高的量來診斷。本發(fā)明還可以應用于MIH病變的亞型(例如完整的或受損的)，該亞型影響所需治療的類型(例如在矯正礦化前，不同的蛋白質組成可能需要不同的沖洗程序)。此處使用的“完整的”為其本身的含義未破壞的，未受損傷的或未改變的，其在涉及牙釉質表面時使用。此處“完整的”指牙齒表面覆蓋有硬的釉質殼的病變，并且稱為表面病變，表不一種分層結構。相反地，“受損的”此處指MIH病變，其硬的牙釉質殼由于機械力被破壞，或最初不存在(可能在長牙過程損失，或在發(fā)育期間未產生)。

此處的“可滲透表面”指完整或受損的牙釉質，其允許口腔液體或任何其他溶液(和包括蛋白質的相關成分)進入次表面區(qū)域。相反地，“不滲透表面”指阻止這種進入的完整或受損軸質。MIH病變包括完整的牙釉質，無論是多孔羥基磷灰石，可以存在或不存在可檢測的多孔牙齒羥基磷灰石(即具有可滲透的或不可滲透的表面)。因此，在第一、第七或第九方面的一些實施例中，試劑盒可以包含滲透劑，或第四至第六方面中的方法(即機械滲透)可以包括滲透牙齒或牙齒試樣。這種試劑或方法在預處理具有不可滲透表面的病變中使用?？商娲?，這種試劑用于進入實施重礦化或矯正礦化作用前的病變。此處使用的“可滲透”或“可滲透的”指在不可滲透的牙釉質中開放的孔，其有充足的尺寸使得檢測物和/或沖洗液進入多孔羥基磷灰石，和/或能夠去除蛋白質。滲透劑是ー種能夠滲透進牙釉質表面基質的劑型(例如可以包括酸或一些其他本領域技術人員所熟知的試劑用于滲透牙釉質)。滲透劑可以為例如溶液或凝膠的形式。在第一、第七或第九方面的一些實施例中，試劑盒可以包含重礦化試劑，或方法可以包括重礦化牙齒或牙齒試樣。重礦化劑可以包含氟化物，可溶性磷酸鈣或無定形磷酸鈣，其可以與生物活性分子穩(wěn)定共存。實施例實施例1-與表面完整性有關的MIH牙釉質中的蛋白質組成材料和方法試樣
人類和SD (Sprague-Dawley)大鼠試樣通過適當的倫理途徑獲得，并儲存于-80°C。MIH根據標準條件(Weerhei jm，2003)診斷。MIH牙齒在提取后用水沖洗以去除可見的血跡，然后涂抹干燥并立即冷凍儲存。將通過嚼蠟狀物刺激產生的所有唾液在儲存前通過離心(20，000g，5分鐘)澄清。血清和紅細胞從來自6天大的大鼠血液以常規(guī)方法制備。除了使用5天大的第一臼齒外，通過如之前的方法(Hubbard，1996)將分泌性的牙釉質基質從顯影的(developing)大鼠牙齒上分離。牙釉質蛋白的譜圖通過使用解剖刀刮削，從新鮮的解凍的試樣上收集明顯的MIH病變，注意避免刮到齲的牙釉質和牙本質。使用緩慢旋轉的牙科鉆頭(N0.6)采集正常釉質試樣。隨即，將牙釉質試樣(2-5 u I包裝體積)懸浮于10%三氟こ酸(10體積，在室溫下渦流和超聲處理10分鐘)，然后離心(20，000g，4°C，5分鐘)以使不溶于酸的蛋白質沉淀。將蛋白沉淀溶解于含有2% SDS和lOOmmol/L ニ硫蘇糖醇的凝膠上樣緩沖液(Hubbard，1996)和額外的蛋白酶抑制齊Li (如需要)(lmmol/L苯甲基磺酰氟，lmmol/L苯甲脒，5ii g/mL胃蛋白酶抑制劑，5ii g/mL亮抑肽酶)。SDS提取物通過使用氨基黑的斑點印記進行定量，并進行小型的SDS-PAGE聯(lián)合考馬斯亮藍染色或免疫印跡法(Hubbard，1995)。使用重組小鼠牙釉蛋白(SEQ IDNO:19)作為免疫原在兔子體內培養(yǎng)牙釉蛋白抗血清。蛋白質組學分析凝膠帶用胰蛋白酶水解，并且除使用基于芯片的納米噴霧的離子阱設備(Chip-LC/MSD XCT,產自 Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)以外，使用如之前(Mangum et al.，2006)的串聯(lián)質譜法檢測。使用具有嚴格的驗收標準(最低兩個序列標簽(Mangum等人,2006))的MASCOT搜索引擎和SwissProt人類數據庫來識別蛋白質。礦物質結合實驗

模擬口腔液體通過用血清和紅細胞裂解物來強化(empirically spiking)唾液制得，這樣可以使得所有三種組分有同樣豐富的量的主要蛋白(圖4B)。為鑒定蛋白質的結合，在20°C下，口腔液體與0.1體積羥基磷灰石(產自Sigma，St Louis, MO, USA)或MIH釉質培養(yǎng)60分鐘,然后離心分離(2，000g, 2分鐘)。在使用3體積20mM的三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液(Tris-HCl) (pH 8.0)沖洗后，使用三氟こ酸和SDS對沉淀進行抽提，如在牙釉質中所述。MSMIH牙釉質富含非牙釉蛋白牙釉蛋白譜圖為氟中毒和釉質發(fā)育不全的發(fā)病機理提供了有用的見解，尤其是通過將牙釉蛋白水平與臨床性能聯(lián)系起來。相應地，未固定的MIH釉質試樣通過SDS-PAGE方法進行研究。與正常釉質不同，MIH釉質在溶于酸時，有可見的沉淀，這表明有相對較高的蛋白質含量。圖1所示為不溶于酸的來自于五個嚴重病變的蛋白質的定量，比正常蛋白質高3-15倍(0.3-1.5%蛋白質w/w)。相似的，考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE顯示在MIH牙釉質中有多條蛋白質條帶在正常釉質中幾乎檢測不到(圖2A)。由于牙釉蛋白未檢測到(圖2A，20-25kDa區(qū)域)，為獲得更高的靈敏度，使用免疫印跡法?？寡烙缘鞍滓矝]有檢測到MIH釉質中完整的牙釉蛋白，但是在一些試樣中檢測到了降解的片段(圖2B，試樣11)。在這些條件下，在正常牙釉質中的牙釉蛋白是不可檢測的(未圖示)。與分泌物相基質定量對比顯示，MIH牙釉質僅包含可檢測的牙釉蛋白總量的0.12% 土0.06% (土SE，n = 6)的蛋白(圖2B，8-kDa至25-kDa區(qū)域)。結論為MIH釉質富含蛋白質，而致病原因不是牙釉蛋白的保留。在MIH釉質中體液蛋白占主導為了鑒定MIH釉質中主要的蛋白質組成，將SDS-PAGE條帶進行蛋白質組學分析。如圖3和表I所示，鑒定了不同種類的蛋白質(16個不同基因產物)，其中13個在唾液和齦溝液中被發(fā)現。其余3個(血紅蛋白，白蛋白，補體C3)為血液中的主要成分。因此，在MIH牙釉質中鑒定的所有主要蛋白質均通常與口腔內發(fā)現的體液相關。表I在具有完整表面的MIH牙釉質(試樣I至6)和具有長牙后受損表面的MIH牙釉質(試樣7至11)中鑒別的蛋白質
權利要求
1.一種用于檢測多孔牙齒羥基磷灰石的試劑盒，包括:能與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質；或者檢測與多孔牙齒羥基磷灰石結合的所述蛋白質的檢測物。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其中所述蛋白質選自以下群組:血清白蛋白、補體03β鏈、α-l-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳運鐵蛋白、白細胞彈性蛋白酶抑制劑、抗凝血酶-1I1、血紅蛋白亞α亞基、血紅蛋白β亞基、血紅蛋白δ亞基、催乳素誘導蛋白、α-淀粉酶l、IgK鏈V-1II區(qū)SIE、Iga-2鏈C區(qū)、非典型蛋白c6或f 58、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、和牙釉蛋白。
3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其中所述蛋白質特異性地與多孔牙齒羥基磷灰石結合。
4.根據權利要求1至3任一項所述的試劑盒，其中所述檢測物包括特異性地與所述蛋白質結合的抗體。
5.根據權利要求1至4任一項所述的試劑盒，還包括報告物，所述報告物特異性地結合或連接到所述蛋白質或檢測物。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其中所述報告物為顯色的。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其中所述顯色的報告物為氨基黑。
8.根據權利要求5所述的試劑盒，其中報告物為射線不透過的。
9.根據權利要求5至8任一項所述的試劑盒，還包括連接物，所述連接物用于將所述報告物連接到所述蛋白質或檢測物。
10.根據權利要求9所述的 試劑盒，其中所述連接物為異型雙功能交聯(lián)劑。
11.根據權利要求10所述的試劑盒，其中所述異型雙功能交聯(lián)劑為琥珀酰亞胺基4-[N-馬來酰亞胺基甲基]環(huán)己烷甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SMCC)。
12.根據權利要求1至11任一項所述的試劑盒，其中所述蛋白質為血紅蛋白或其亞基。
13.根據權利要求1至12任一項所述的試劑盒，還包括第二檢測物，所述第二檢測物檢測第二蛋白質。
14.一種用于檢測多孔牙齒羥基磷灰石的探針，包括:能與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質；和報告物。
15.根據權利要求14所述的探針，其中所述蛋白質選自以下群組:血清白蛋白、補體03β鏈、a-1-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳運鐵蛋白、白細胞彈性蛋白酶抑制劑、抗凝血酶_111、血紅蛋白a亞基、血紅蛋白β亞基、血紅蛋白δ亞基、/[隹乳素誘導蛋白、Ct _淀粉酶l、IgK鏈V-1II區(qū)SIE、Iga-2鏈C區(qū)、非典型蛋白C6或f 58、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、和牙釉蛋白。
16.根據權利要求14或15所述的探針，其中所述蛋白質為血紅蛋白或其亞基。
17.根據權利要求14至16任一項所述的探針，其中所述報告物為顯色的。
18.根據權利要求17所述的探針，其中所述顯色的報告物為氨基黑。
19.根據權利要求14至16任一項所述的探針，其中所述報告物為射線不透過的。
20.根據權利要求14至19任一項所述的探針，還包括連接物，所述連接物用于將所述蛋白質連接到所述報告物。
21.根據權利要20所述的探針，其中所述連接物為交聯(lián)劑。
22.根據權利要21所述的探針，其中所述交聯(lián)劑為異型雙功能交聯(lián)劑。
23.根據權利要22所述的探針，其中所述異型雙功能交聯(lián)劑為SMCC。
24.一種用于制備如權利要求14至23任一項所述的探針的方法，包括連接(i)能與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質和(ii)報告物。
25.一種用于檢測涉及多孔牙齒羥基磷灰石狀況的方法，包括在受體的牙齒或牙齒試樣的內部或表面，檢測與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述蛋白質選自以下群組:血清白蛋白、補體C33鏈、a-1-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳運鐵蛋白、白細胞彈性蛋白酶抑制劑、抗凝血酶_111、血紅蛋白a亞基、血紅蛋白0亞基、血紅蛋白S亞基、丨隹乳素誘導蛋白、Ct _淀粉酶l、IgK鏈V-1II區(qū)SIE、Iga-2鏈C區(qū)、非典型蛋白c6或f 58、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、和牙釉蛋白。
27.根據權利要求25或26 所述的方法，其中檢測包括使用如權利要求1至13任ー項所述的試劑盒，或權利要求14至23任一項所述的探針。
28.根據權利要求25或26所述的方法，其中檢測包括免疫檢測、色譜分析、電泳或質譜分析。
29.根據權利要求24至28任一項所述的方法，其中所述受體為人類。
30.根據權利要求29所述的方法，其中所述人類為任何年齡，或在約12歲以下，約2歲至約12歲，約4歲至約10歲，或約6歲至約10歲。
31.根據權利要求25至30任一項所述的方法，在檢測蛋白質之前，還包括滲透牙齒或牙齒試樣。
32.根據權利要求25至31任一項所述的方法，其中所述狀況為齲齒、白齒/門齒低礦化(MIH)、牙釉質發(fā)育不全、牙齒氟中毒或其他發(fā)育性牙齒缺陷(DDD)。
33.根據權利要求25所述的方法，包括檢測牙釉蛋白以外的蛋白質和牙釉蛋白，其中其他蛋白質的存在和牙釉蛋白的缺乏是MIH的表征，而牙釉蛋白的存在表明釉質發(fā)育不全或牙齒氟中毒。
34.一種用于檢測低礦化發(fā)育性牙齒缺陷(DDD)的方法，包括檢測蛋白質，其與牙齒或牙齒試樣的測試羥基磷灰石結合的濃度相比于與對照牙齒或對照牙齒試樣的對照羥基磷灰石結合的濃度是提高的，并且檢測牙釉蛋白，其與測試羥基磷灰石結合的濃度接近干與對照羥基磷灰石結合的濃度。
35.根據權利要求34所述的方法，其中所述蛋白質選自以下群組:血清白蛋白、補體C33鏈、a-1-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳運鐵蛋白、白細胞彈性蛋白酶抑制劑、抗凝血酶_111、血紅蛋白a亞基、血紅蛋白0亞基、血紅蛋白S亞基、丨隹乳素誘導蛋白、Ct _淀粉酶l、IgK鏈V-1II區(qū)SIE、Iga-2鏈C區(qū)、非典型蛋白c6或f 58、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、和牙釉蛋白。
36.根據權利要求34或35所述的方法，其中所述低鈣化是由MIH引起的。
37.一種用于檢測完整的和/或受損MIH釉質的方法，包括檢測與MIH羥基磷灰石結合的白蛋白和血紅蛋白，其中只檢測到白蛋白而未檢測到血紅蛋白表示完整的MIH釉質，而其中檢測到血紅蛋白表示受損的MIH釉質。
38.一種用于去除與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質的試劑盒，包括:(a) (i) ー種或多種沖洗液或(ii) 一種或多種干組分，其與水混合用于制備一種或多種沖洗液，其中所述ー種或多種沖洗液適用于去除與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質；和(b)重礦化劑或矯正礦化劑。
39.根據權利要求38所述的試劑盒，其中所述ー種或多種沖洗液含有鎂離子和/或磷酸ニ氫根離子。
40.根據權利要求39所述的試劑盒，其中所述ー種或多種沖洗液含有氯化鎂和/或磷酸ニ氫鈉。
41.根據權利要求40所述的試劑盒，其中所述ー種或多種沖洗液含有約IM氯化鎂和/或約0.4M磷酸ニ氫鈉。
42.根據權利要求38至41任一項所述的試劑盒，其中所述重礦化劑或矯正礦化劑包括氟化物、可溶性磷酸鈣或無定形磷酸鈣。
43.根據權利要求38至42任一項所述的試劑盒，其中所述蛋白質選自以下群組:血清白蛋白、補體C3P鏈、a-1-抗胰蛋白酶、蛋白S100-A9、乳運鐵蛋白、白細胞彈性蛋白酶抑制劑、抗凝血酶_111、血紅蛋白a亞基、血紅蛋白@亞基、血紅蛋白S亞基、丨隹乳素誘導蛋白、a-淀粉酶1、IgK鏈V-1II區(qū)SIE、Ig a-2鏈C區(qū)、非典型蛋白c6或f 58、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3、和牙釉蛋白。
44.根據權利要求38至43任一項所述的試劑盒，還包括滲透劑。
45.一種用于去除與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質的方法，包括使用ー種或多種沖洗液清洗牙齒或清洗牙齒試樣。
46.根據權利要求45所述的方法，其中所述ー種或多種沖洗液含有鎂離子和/或磷酸根離子。
47.根據權利要求46所述的方法，其中所述ー種或多種沖洗液含有氯化鎂和/或磷酸ニ氫鈉。
48.根據權利要求47所述的方法，其中所述ー種或多種沖洗液含有約IM氯化鎂和/或約0.4M磷酸ニ氫鈉。
49.根據權利要求45所述的方法，其中所述沖洗包括使用如權利要求38至44任ー項所述的試劑盒。
50.一種用于去除與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質的試劑盒，包括:ー種或多種沖洗液；一種或多種干組分，其與水混合用于制備一種或多種沖洗液，其中所述ー種或多種沖洗液適用于去除牙齒或牙齒試樣的內部或表面的蛋白質，所述牙齒或牙齒試樣為通過如權利要求25至33所述的方法檢測為具有多孔羥基磷灰石的牙齒或牙齒試樣。
51.根據權利要求50所述的試劑盒，還包括重礦化劑或矯正礦化劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測多孔牙齒羥基磷灰石的試劑盒和探針，包括可以與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質或其檢測物。本發(fā)明還涉及一種用于檢測涉及多孔牙齒羥基磷灰石的狀況的方法，包括在受體的牙齒或牙齒試樣的內部或表面，檢測與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質。本發(fā)明還涉及一種檢測低礦化發(fā)育性牙齒缺陷(DDD)或檢測完整的和/或受損MIH牙釉質的方法，并且涉及一種去除與多孔牙齒羥基磷灰石結合的蛋白質的試劑盒和方法。
文檔編號A61K6/00GK103096866SQ201180024864
公開日2013年5月8日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權日2010年3月19日
發(fā)明者邁克爾·詹姆斯·哈伯德, 喬納森·愛德華·曼格姆 申請人:墨爾本大學