專利名稱：orexin-A載藥脂質(zhì)體的制備方法及用于治療發(fā)作性睡眠的藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工合成oreXin-A(食欲素A)載藥脂質(zhì)體的制備方法，以及含有所得載藥脂質(zhì)體的用于治療發(fā)作性睡眠的兩種常用藥劑。
背景技術(shù)：
發(fā)作性睡眠病是以不可抗拒的短期睡眠發(fā)作為特點(diǎn)的一種疾病，多發(fā)生于兒童和青春期的青少年，成年人偶有發(fā)生。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，該病是由于睡眠介質(zhì)紊亂引起，部分病人有腦炎和顱腦外傷史。也可以發(fā)生在免疫功能低下、腦腫瘤、多發(fā)性硬化或者情緒緊張之后。約有10% 30%的病人有家族遺傳史，多數(shù)病人沒有明顯的誘因。發(fā)作性睡眠的發(fā)病病因尚未完全明確，但最近有學(xué)者提出自身免疫假說。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)作性睡眠和HLA—些基因變化存在著相關(guān)性，HLA的復(fù)雜多樣性可以增加機(jī)體自動(dòng)免疫反應(yīng)的能力，從而使下丘腦神經(jīng)元產(chǎn)生一種名為食欲素的蛋白質(zhì)，其作用是控制食欲和睡眠。而患有發(fā)作性睡眠的病人，其下丘腦內(nèi)能產(chǎn)生食欲素的神經(jīng)元明顯降低。治療發(fā)作性睡眠要根據(jù)個(gè)人癥狀和治療反應(yīng)，治療可能需要數(shù)月或者更長(zhǎng)的時(shí)間，藥物要經(jīng)常進(jìn)行調(diào)整。目前發(fā)作性睡眠的主要治療方案是口服安非他明、甲基苯丙胺或者莫達(dá)非尼。Orexin-A是存在于下丘腦的一種神經(jīng)多肽，參與調(diào)節(jié)攝食、睡眠-覺醒周期、生殖、體溫、血壓、激素分泌和感覺等生理功能。1998年Yanagisawa等在大鼠下丘腦腹外側(cè)發(fā)現(xiàn)了兩種與食欲有關(guān)的神經(jīng)肽，命名為orexin-A(食欲素-A)和orexin-B(食欲素-B)。 近年來有多項(xiàng)研究證實(shí)orexin系統(tǒng)功能受損可導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，例如睡眠障礙、急性顱腦損傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血等。有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)作性睡眠的發(fā)生是由于下丘腦內(nèi) orexin蛋白質(zhì)表達(dá)降低所導(dǎo)致。因此，我們推測(cè)用脂質(zhì)體包裹神經(jīng)多肽orexin-A可治療發(fā)作性睡眠。目前國(guó)際上在使用orexin治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病時(shí)大部分還僅限于腦室給藥， 然而這種給藥方式易引起損傷和感染，給臨床應(yīng)用帶諸多不便，限制了其在臨床上的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為解決orexin-A治療中腦室給藥所存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種采用脂體包裹orexin-A的制備工藝，可以得到納米級(jí)orexin-A脂質(zhì)體，使載藥脂質(zhì)體更易穿透血腦屏障，增加其腦組織藥物攝入量，增加orexin-A在體內(nèi)的穩(wěn)定性，達(dá)到了較好的療效。為達(dá)到以上目的，本發(fā)明是采取如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的—種orexin-A載藥脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括下述步驟a.將orexin-A多肽準(zhǔn)確稱量，用pH為7. 2-7. 6的磷酸鹽緩沖液PBS，配制成 20 μ g/ml 的 orexin-A 原液；b.稱取400mg卵磷脂、160mg膽固醇、96mg的膜材PEG2000-DSPE，溶解于100ml三
氯甲烷中得到混合液；
c.將上述混合液在常溫水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)； d.蒸干物中滴加IOml磷酸鹽緩沖液PBS，制得水性混懸液；e.用對(duì)水性混懸液超聲3 5min，冷至室溫；f.將IOml的步驟a所得orexin-A原液加入超聲后的水性混懸液中室溫下磁力攪拌30min，0. 45 μ m濾膜過濾2次，即得orexin-A載藥脂質(zhì)體。上述方法中，所述步驟a中，orexin-A多肽可采用商售的產(chǎn)品(美國(guó)Tocris公司， No. 1455)，也可采用本發(fā)明自制的orexin-A多肽，其制備方法包括以下步驟；(1)將Ig的Rink-MBHAresin樹脂用IOml的DMF溶液溶脹40分鐘；(2)將溶脹后的上述Rink-MBHAresin樹脂用DMF溶液洗滌三次；(3)洗滌后的Rink-MBHAresin樹脂加入IOml的DMF溶液反應(yīng)20分鐘；(4)在步驟(3)反應(yīng)后的溶液中加入3倍于溶液質(zhì)量的Fmoc-L-Leu-OH，和4倍于溶液質(zhì)量的HOBT和DIC，以及IOml的DMF溶液，反應(yīng)45分鐘，得到連接有多肽分子的樹脂；(5)將步驟(4)連接有多肽分子的樹脂用甲醇清洗，凍干后用95%三氟乙酸溶液浸泡1 2小時(shí)，將樹脂上的多肽分子切掉；將切掉多肽分子后的三氟乙酸溶液迅速倒入預(yù)冷的乙醚中，得到白色沉淀即為還原型orexin-A多肽；(6)將還原性orexin-A多肽以濃度為0. 5-lmg/ml的量加入PH值為7. 2-7. 6的磷酸鹽緩沖液PBS中，并用的H2A氧化，12-36小時(shí)后停止氧化，得到氧化的orexin-A多肽。本發(fā)明的另一目的是提供兩種治療發(fā)作性睡眠的常用藥劑，其中之一為鼻噴劑， 該鼻噴劑的特征在于對(duì)本發(fā)明前述方法所得的orexin-A載藥脂質(zhì)體進(jìn)行冷凍干燥即可。 另一種為靜脈注射劑，該靜脈注射劑的特征在于對(duì)經(jīng)冷凍干燥所得鼻噴劑，將其溶解于生理鹽水中即可臨床使用。與現(xiàn)有莫達(dá)非尼作為已知的治療發(fā)作性睡眠的藥物相比，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、在制備工藝中可通過分次載藥提高載藥率，通過超聲處理和濾膜過濾相結(jié)合降低脂質(zhì)體粒徑，可以得到納米級(jí)orexin-A脂質(zhì)體。2、采用本發(fā)明脂質(zhì)體包裹orexin-A可以防止orexin-A被體內(nèi)的酶所降解，從而提高其穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期，具有較好的發(fā)揮orexin-A生物活性的能力。3、本發(fā)明所提供的orexin-A脂質(zhì)體鼻噴劑(或注射劑)可明顯提高大鼠覺醒時(shí)間，從而提高治療發(fā)作性睡眠的療效。此外，由于orexin-A是正常存在于人體中的一種神經(jīng)多肽，因此就開發(fā)成藥品的角度而言，其具有毒副作用小，對(duì)正常生理功能干擾小等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，研制開發(fā)orexin-A類藥物用于治療發(fā)作性睡眠具有廣泛的應(yīng)用前景。說明書附1為傳統(tǒng)工藝與改良工藝脂質(zhì)體包封率比較。圖2為orexin-A脂質(zhì)體、orexin-A與空白組12h活動(dòng)時(shí)間比較。圖3為orexin-A給藥前與給藥后12h活動(dòng)時(shí)間比較圖4為orexin-A不同劑量組Mh總體活動(dòng)時(shí)間。圖5為orexin-A與莫達(dá)非尼給藥前后1 活動(dòng)時(shí)間。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例1一種orexin-A載藥脂質(zhì)體的制備方法，包括下述步驟a、準(zhǔn)確稱量orexin-A，用pH = 7. 2-7. 6的PBS (磷酸鹽緩沖液)配制成質(zhì)量濃度為20 μ g/mlorexin-A原液；其中orexin-A多肽采用商售的產(chǎn)品(美國(guó)Tocris公司， No. 1455)；b、稱取卵磷脂400mg，膽固醇160mg，膜材PEG2000-DSPE (長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體)96mg,溶解于IOOml三氯甲烷中得到混合液；C、將上述混合液于30°C水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；d、蒸干后滴加PBS溶液10ml，制得水性混懸液；e、探頭式超聲儀超聲3min，冷至室溫；f、將orexin-A原液5ml加入水性混懸液中超聲Imin后，再加入orexin-A原液 5ml,室溫下磁力攪拌30min，0. 45 μ m濾膜過濾2次，即得orexin-A載藥脂質(zhì)體，終濃度 10μ g/ml。所得載藥脂質(zhì)體平均粒徑5 士 5. 6nm，包封率也從原來的72%提高到98% (圖 1)。對(duì)所得脂質(zhì)體微囊和包裹于其中的神經(jīng)多肽食欲素-A，可應(yīng)用制備治療發(fā)作性睡眠的凝膠劑、噴霧劑、溶液劑、混懸劑、粉針劑。例如對(duì)實(shí)施例1所制備的orexin-A載藥脂質(zhì)體進(jìn)行冷凍干燥即得鼻噴劑。或?qū)⒃搊rexin-A載藥脂質(zhì)體的鼻噴劑溶于生理鹽水中，可用于腹腔及靜脈注射。實(shí)施例2另一種orexin-A載藥脂質(zhì)體的制備方法，與實(shí)施例1不同的是，其中的orexin-A 多肽采用自制的合成orexin-A，包括下述步驟合成原料多肽合成用樹脂Rink-MBHAresin(美國(guó)默克公司出品)有機(jī)溶劑DMF( 二甲基甲酰胺)，甲醇，乙醚。TFA(三氟乙酸)溶液其它試劑1-羥基苯并三唑(HOBT)，N, N- 二異丙基碳二亞胺(DIC)①稱取Ig的Rink-MBHAresin樹脂用IOmlDMF溶脹40分鐘。②溶脹后的上述Rink-MBHAresin樹脂用DMF洗滌三次③洗滌后的RinK-MBHAresin樹脂加入IOml的DMF溶液反應(yīng)20分鐘，脫去樹脂上的Fmoc保護(hù)基團(tuán)。④在步驟③反應(yīng)后的溶液中加入3倍量的Fmoc-L-Leu-OH(金思特科技有限公司生產(chǎn)的)，和4倍量的H0BT，DIC，以及IOml的DMF，反應(yīng)45分鐘，反應(yīng)后得到連接有多肽分子的樹脂，并用茚三酮檢驗(yàn)連接效率。⑤將連接有多肽分子的樹脂用甲醇清洗，凍干后用質(zhì)量濃度95% TFA溶液浸泡2 小時(shí)，樹脂上的多肽分子被切掉，進(jìn)入TFA溶液中，將溶液迅速倒入預(yù)冷的乙醚中，得到白色沉淀，然后通過HPLC(高效液相色譜法)純化，得到純度大于98%的產(chǎn)品，即為還原型 orexin-A多月太。⑥將還原性orexin-A多肽以濃度為0. 5-lmg/ml的量加入PH = 7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBQ中溶解，用質(zhì)量濃度1 %的H2A氧化，12-36小時(shí)后停止氧化，通過HPLC監(jiān)測(cè)并純化，得到氧化的orexin-A多肽。通過質(zhì)譜檢驗(yàn)，比對(duì)氧化的樣品和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。鼻腔注射orexin-A，監(jiān)測(cè)大鼠覺醒時(shí)間1.實(shí)驗(yàn)方法1. 1動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)計(jì)劃1. 1. Iorexin-A與orexin-A脂質(zhì)體(本發(fā)明實(shí)施例1所得orexin-A載藥脂質(zhì)體) 比較此部分實(shí)驗(yàn)共采用18只SD大鼠，隨機(jī)分為3組對(duì)照組、orexin-A組、orexin-A 脂質(zhì)體組。三組每隔4小時(shí)分別鼻腔注射相應(yīng)劑量生理鹽水(0. lml)、orexin-A脂質(zhì)體 10 μ g/kg (用 PBS 溶解稀釋成 0. Iml)、orexin-ΑΙΟ μ g/kg (用 PBS 溶解稀釋成 0. Im)，放于視頻系統(tǒng)下觀察大鼠12小時(shí)內(nèi)總體活動(dòng)時(shí)間。1. 1. 2orexin_A脂質(zhì)體與空白組自體比較此部分實(shí)驗(yàn)共采用12只SD大鼠。實(shí)驗(yàn)第1日所有大鼠均每隔4小時(shí)給予生理鹽水，放于視頻系統(tǒng)下觀察大鼠12小時(shí)內(nèi)總體活動(dòng)時(shí)間，作為該大鼠活動(dòng)時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)第 2日，大鼠每隔4小時(shí)鼻腔注射orexin-A脂質(zhì)體30 μ g/kg (用PBS溶解稀釋成0. 5ml)，放于視頻系統(tǒng)下觀察大鼠12小時(shí)內(nèi)總體活動(dòng)時(shí)間。1. 1. 3orexin_A脂質(zhì)體與空白組異體比較此部分實(shí)驗(yàn)采用M只SD大鼠，隨機(jī)分為3組對(duì)照組、orexin-A脂質(zhì)體30 μ g/kg 組(0XA-30) ,orexin-A脂質(zhì)體100 μ g/kg組(OXA-IOO)。三組每隔6小時(shí)分別鼻腔注射溶劑(NaCl，0. 5ml)或相應(yīng)劑量的orexin-A脂質(zhì)體(0. 5ml，用PBS溶解稀釋成不同濃度)，放于視頻系統(tǒng)下觀察大鼠Mh內(nèi)總體活動(dòng)時(shí)間。1. 1. 4orexin-A脂質(zhì)體與莫達(dá)非尼組比較根據(jù)第三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們選擇30 μ g/kg作為orexin-A脂質(zhì)體治療組的給藥劑量，與已知可以治療發(fā)作性睡眠的的藥物莫達(dá)非尼進(jìn)行比較，進(jìn)一步檢驗(yàn)其治療發(fā)作性睡眠的效果。此部分實(shí)驗(yàn)采用12只SD大鼠，隨機(jī)分為2組莫達(dá)非尼組、orexin-A脂質(zhì)體 30yg/kg組(0XA-30)。實(shí)驗(yàn)第1日所有大鼠均每隔4小時(shí)給予生理鹽水，放于視頻系統(tǒng)下觀察大鼠12小時(shí)內(nèi)總體活動(dòng)時(shí)間，作為該大鼠活動(dòng)時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)第2日，0XA-30組大鼠每隔4小時(shí)鼻腔注射給藥30mg/kg，對(duì)照組每隔4小時(shí)莫達(dá)非尼灌胃50mg/kg，放于視頻系統(tǒng)下觀察大鼠12小時(shí)內(nèi)總體活動(dòng)時(shí)間。1. 2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13. 0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行所用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用χ士 s表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis H法)，P < 0. 05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2. Iorexin-A 與 orexin-A 脂質(zhì)體比較圖2示出了 orexin-A脂質(zhì)體、orexin-A與空白組1 活動(dòng)時(shí)間比較。表1顯示大鼠12h內(nèi)平均總體活動(dòng)時(shí)間。通過鼻腔注射orexin-A與orexin-A脂質(zhì)體均能明顯提高大鼠12h內(nèi)總體活動(dòng)時(shí)間，且OXA脂質(zhì)體組優(yōu)于OXA組，對(duì)于提高大鼠總體活動(dòng)時(shí)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。表 權(quán)利要求
1.一種orexin-A載藥脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括下述步驟a.將orexin-A多肽準(zhǔn)確稱量，用pH為7.2-7. 6的磷酸鹽緩沖液PBS，配制成20 μ g/ml 的orexin-A原液；b.稱取400mg卵磷脂、160mg膽固醇、96mg的膜材PEG2000-DSPE，溶解于IOOml三氯甲烷中得到混合液；c.將上述混合液在常溫水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；d.蒸干物中滴加IOml磷酸鹽緩沖液PBS，制得水性混懸液；e.用對(duì)水性混懸液超聲3 5min，冷至室溫；f.將IOml的步驟a所得orexin-A原液加入超聲后的水性混懸液中室溫下磁力攪拌 30min, 0. 45 μ m濾膜過濾2次，即得orexin-A載藥脂質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的orexin-A載藥脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于，所述步驟a 中的orexin-A多肽的制備方法包括下述步驟；(1)將Ig的Rink-MBHAresin樹脂用IOml的DMF溶液溶脹40分鐘；(2)將溶脹后的上述Rink-MBHAresin樹脂用DMF溶液洗滌三次；(3)洗滌后的Rink-MBHAresin樹脂加入IOml的DMF溶液反應(yīng)20分鐘；(4)在步驟(3)反應(yīng)后的溶液中加入3倍于溶液質(zhì)量的Fmoc-L-Leu-OH，和4倍于溶液質(zhì)量的HOBT和DIC，以及IOml的DMF溶液，反應(yīng)45分鐘，得到連接有多肽分子的樹脂；(5)將步驟(4)連接有多肽分子的樹脂用甲醇清洗，凍干后用95%三氟乙酸溶液浸泡 1 2小時(shí)，將樹脂上的多肽分子切掉；將切掉多肽分子后的三氟乙酸溶液迅速倒入預(yù)冷的乙醚中，得到白色沉淀即為還原型orexin-A多肽；(6)將還原性orexin-A多肽以濃度為0.5-lmg/ml的量加入PH值為7. 2-7. 6的磷酸鹽緩沖液PBS中，并用1 %的H2A氧化，12-36小時(shí)后停止氧化，得到氧化的orexin-A多肽。
3.一種治療發(fā)作性睡眠的鼻噴劑，其特征在于，該鼻噴劑為對(duì)權(quán)利要求1所述的 orexin-A載藥脂質(zhì)體進(jìn)行冷凍干燥所得。
4.一種治療發(fā)作性睡眠的靜脈注射劑，其特征在于，該靜脈注射劑為對(duì)權(quán)利要求3所述的經(jīng)冷凍干燥所得鼻噴劑溶于生理鹽水中獲得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種orexin-A載藥脂質(zhì)體的制備方法及用于治療發(fā)作性睡眠的藥劑，所述orexin-A載藥脂質(zhì)體的制備方法包括下述步驟a.將orexin-A多肽準(zhǔn)確稱量，用磷酸鹽緩沖液配制成20μg/ml的orexin-A原液；b.稱取一定量的卵磷脂、膽固醇、膜材PEG2000-DSPE，溶解于三氯甲烷中得到混合液；c.將上述混合液在常溫水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；d.蒸干物中滴加磷酸鹽緩沖液，制得水性混懸液；e.用對(duì)水性混懸液超聲3～5min，冷至室溫；將步驟a所得orexin-A原液加入超聲后的水性混懸液中室溫下磁力攪拌30min，0.45μm濾膜過濾2次，即得orexin-A載藥脂質(zhì)體。對(duì)該orexin-A載藥脂質(zhì)體進(jìn)行冷凍干燥即得治療發(fā)作性睡眠的鼻噴劑將該鼻噴劑溶于生理鹽水中即得靜脈注射劑。
文檔編號(hào)A61P25/00GK102188381SQ20111010717
公開日2011年9月21日 申請(qǐng)日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者仝黎, 張昊鵬, 熊利澤, 董海龍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)