專利名稱：中國南海線紋芋螺毒素S21a的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽及其編碼基因序列、其制備方法和應(yīng)用。尤其涉及一種芋螺毒素多肽及其編碼基因序列、其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
芋螺(cone snail)是一種生活在海洋淺水域的肉食動物，有毒，屬于軟體動物門腹足綱((Gastropoda)、前鰓亞綱(Prosobranchia)、芋螺科(Conidae)、芋螺屬(Conus)。目前估計全球有約500-700種芋螺，它們分布于熱帶海域的淺水區(qū)域，主要是印度洋和太平洋海域。芋螺按其食性可分為三大類食魚性芋螺(piscivorous)，食軟體動物性芋螺 (molluscivorous)和食蟲性芋螺(vermivorous)。其中食蟲性芋螺種類最多，占全部芋螺種類的70%左右，而食魚性芋螺雖然占芋螺總數(shù)最少，但毒性最強(qiáng)，至今為止報道的芋螺致死事件基本上是該類芋螺造成的。芋螺毒素(C0n0t0Xin，CTX)是一類來源于芋螺(Conus)毒液的活性多肽.對芋螺自身而言，CTx主要用于捕食與防御.近幾十年來的研究表明，它主要作用于細(xì)胞膜上各種離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)/激肽的受體，有很強(qiáng)的生物學(xué)活性。芋螺毒素有如下特點分子質(zhì)量小，富含二硫鍵；前導(dǎo)肽高度保守而成熟肽具有多樣性；作用靶點廣且具有高度組織選擇性芋螺毒素常被作為探針用于各種離子通道和受體的類型及亞型的分類和鑒定，也極有望直接開發(fā)成藥物或作為先導(dǎo)化合物用于新藥的研發(fā)。目前，國內(nèi)外已明確功能的芋螺毒素只占了整個毒素庫的很小一部分，但是對它們的生理功能已經(jīng)有了較為清晰的認(rèn)識。芋螺毒素二硫鍵骨架和結(jié)構(gòu)的不同，決定了它們功能靶位的差異，已經(jīng)清楚的靶位主要包括配體門控的離子通道、電壓門控的離子通道及G 蛋白偶聯(lián)的受體。芋螺毒素可用作神經(jīng)遞質(zhì)受體或離子通道研究的分子探針。乙酰膽堿受體是一個龐大的受體家族，10種α亞基和3種β亞基以不同的組合構(gòu)成乙酰膽堿受體的各種亞型廣泛分布神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉等各組織，它的生理和病理意義日益受到關(guān)注。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，不同突觸前nAChRs調(diào)節(jié)不同神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，如海馬區(qū)的去甲腎上腺素和紋狀體內(nèi)的多巴胺。由于缺乏選擇性配體這些nAChRs的亞基組成還不能清楚闡明。最近利用亞型特異性的α芋螺毒素和敲除小鼠解析了參與紋狀體中多巴胺釋放的主要乙酰膽堿受體亞型是 α 6 β 2 β 3 (ffhiteaker, 2002)。芋螺毒素有許多已經(jīng)被開發(fā)成藥物或者藥物先導(dǎo)物。如ω -CVID，GVIA，MVIIA在治療疼痛方面顯示極大的應(yīng)用價值(Smith, 2002 ；Scott, 202 ；Adams, 2003)。2005年12月， 美國FDA正式批準(zhǔn)ω-MVIIA (也叫Ziconotide，或I^railt)作為一個治療嚴(yán)重慢性疼痛的藥物。ω-CVID也特異作用于N型VSCC，顯示出治療神經(jīng)性疼痛的前景，現(xiàn)處于臨床II期試驗中。我國科學(xué)家從南海線紋芋螺中分離的S03與ω-MVIIA具有很高的同源性，只有7 個不同的殘基，動物實驗證明具有顯著的鎮(zhèn)痛效果，有望開發(fā)成我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的治療藥物(Wen，200 。這些鎮(zhèn)痛藥物與嗎啡相比具有特異性好、不成癮的優(yōu)點。缺氧缺血引起的神經(jīng)元病理損傷是由于突觸前后大量鈣內(nèi)流引起的，能阻斷突觸前后鈣離子內(nèi)流的 ω -MVIIA和NMDA受體拮抗劑conantokin能起到顯著的神經(jīng)保護(hù)功能。癲癇是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸能神經(jīng)傳導(dǎo)失調(diào)造成的，Conantokins特異阻斷NMDA受體亞型，可開發(fā)成抗驚厥、抗癲癇藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種中國南海線紋芋螺毒素基因S21. 1，其基因序列如序列表<400>1所示。本發(fā)明的另一個目的是提供上述線紋芋螺毒素基因S21. 1編碼的多肽S21a，其氨基酸序列如序列表<400>2所示。本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組表達(dá)載體PTRX-S21. 1。本發(fā)明的再一個目的是提供一種多肽的表達(dá)方法，從表達(dá)、分離和純化幾個方面對原有的多肽表達(dá)方法進(jìn)行改良。本發(fā)明的再一個目的是提供上述芋螺毒素多肽S21a在神經(jīng)生物學(xué)研究及鎮(zhèn)痛藥物開發(fā)中的應(yīng)用。本發(fā)明使用的線紋芋螺采自中國海南省三亞市。本發(fā)明通過構(gòu)建cDNA文庫和測序的方法，從中國南海線紋芋螺毒管中分離得到中國南海線紋芋螺毒素基因S21. 1。本發(fā)明提供一種重組表達(dá)載體PTRX-S21. 1，通過以下方式合成首先，將芋螺毒素基因S21. 1的cDNA序列分拆為兩對互補(bǔ)序列作為模板母鏈，在該母鏈基因的5’端和3’端分別加入限制性內(nèi)切酶Kpn I和Not I的酶切位點；另外，在 5’端加入了 3C酶的識別位點，而在3'端還加入了兩個終止密碼子(TAA)，上述該兩對引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后分為互補(bǔ)配對的兩組分別進(jìn)行磷酸化與退火，合成出全長的芋螺毒素基因 S21. 1。其次，通過限制性內(nèi)切酶Kpn I和Not I雙酶切法對載體pTRX(載體pTRX為申請人自行構(gòu)建并申請中國專利，專利名稱為一種高效原核表達(dá)載體；專利號CN001M832.4， 授權(quán)公告號CN1189565)進(jìn)行酶切后得到線性化的載體pTRX。最后，利用T4DNA連接酶連接上述芋螺毒素基因S21. 1和上述線性化的載體pTRX， 得到重組表達(dá)載體PTRX-S21. 1。本發(fā)明還提供一種多肽的表達(dá)方法，具體實施步驟為(1)將重組表達(dá)質(zhì)粒pTRX-S21· 1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)；(2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BL21(DE3)；(3)對培養(yǎng)后的大腸桿菌BL21 (DE3)進(jìn)行超聲裂解，收集上清；上清液經(jīng)親和層析純化，得到重組融合蛋白；(4)重組融合蛋白經(jīng)3C酶酶切，酶切的產(chǎn)物經(jīng)層析過濾和HPLC純化得到目的蛋白——多肽S21a。上述多肽的表達(dá)方法使用重組表達(dá)載體pTRX-S21. 1作為表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)效率較高，且優(yōu)化了培養(yǎng)條件和純化分離方式，有效提高了多肽S21a的表達(dá)量。
本發(fā)明通過青蛙坐骨神經(jīng)-腓腸肌標(biāo)本肌肉收縮實驗和小鼠熱板法實驗發(fā)現(xiàn)，一定濃度的多肽S21a具有阻斷神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和鎮(zhèn)痛性能，因此，多肽S21a可用于制備神經(jīng)生物學(xué)研究及鎮(zhèn)痛藥物。


圖1表達(dá)質(zhì)粒pTRX的物理圖譜和多克隆位點圖2重組表達(dá)載體pTRX-S21. 1合成過程示意3重組表達(dá)載體pTRX-S21. 1的菌落PCR陽性克隆瓊脂糖凝膠4重組融合蛋白分離純化親和層析5重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化的SDS-PAGE電泳圖譜圖6酶切后的多肽S21a反相高效液相色譜7多肽S2Ia的MALDI-TOF質(zhì)譜8多肽S21a蛙坐骨神經(jīng)_腓腸肌標(biāo)本肌肉收縮抑制實驗結(jié)果分析9多肽S21a對小鼠熱板法的痛閾改變結(jié)果
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)理解，以下實施例只用于說明本發(fā)明而不以任何形式限制本發(fā)明。實施例1 線紋芋螺毒管組織總RNA的提取及毒素cDNA克隆總RNA的提取參照Gibcol BRL公司的TRIZOL LS試劑說明書進(jìn)行。Taq DNA聚合酶、10XPCRBuffer和dNTP購自鼎國公司；PCR引物由hvitrogen公司合成；其他有機(jī)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，購自廣州化學(xué)試劑廠。取活螺體，用石工錘破碎螺殼，暴露出螺肉，冰上小心并快速分離毒管組織，稱重后迅速放入液氮并充分研磨，加入15倍重量體積的TRIZOL LS試劑(即Ig組織中加入15ml)，冰浴中充分勻漿，-80°C冰箱中保存以備提取總RNA。取50_100mg組織樣品，用 0. 75ml TRIZOL LS試劑勻漿，15_30°C靜置5min。然后加入0. 2mL氯仿，劇烈振蕩15秒后，15-30°C靜置2-15min。4°C、12，OOOrpm離心15min，取上層水相。加入0. 5ml異丙醇， 15-30°C靜置IOmin后，4°C、12，OOOrpm離心lOmin，棄上清。再加Iml 75%乙醇漂洗沉淀， 5，OOOrpm離心5min，棄上清，真空干燥去除樣品中痕量的乙醇，加入適量無RNase的去離子水。取1 μ 1進(jìn)行瓊脂糖膠電泳，1 μ 1用紫外分光光估算RNA的濃度與純度，_20°C保存l)cDNA第一鏈的合成cDNA第一鏈的合成使用 Clontech 公司的 SMART PCR cDNA Synthesis Kit，按照說明書進(jìn)行試驗。在5 μ 1反應(yīng)體系中加入下列組分(于冰上操作)1 μ g芋螺毒管總RNA， SMARTI11 olignucleotide和CDS 111/3，PCR引物各1 μ 1，以超純水補(bǔ)齊體積，混勻，短暫離心。72°C溫育2min，冰浴2min，短暫離心，使混合物集于管底。再依次加入2 μ 1 5 XFirst Strand BufferU μ 120mmol/L 的 DTTU μ 1 10mmol/L 的 dNTP Mix 禾口 1 μ 1 PowerScript RT(CLONTECH)后輕彈管壁，混勻并短暫離心。置PCR儀42 V反應(yīng)Ihr逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈， 冰浴終止反應(yīng)，-40°C保存。
2) A-超家族芋螺毒素的cDNA克隆PCR引物序列上游引物5，ATGGGCATGCGGATGAT 3，下游引物5，TGGACGATGTAATAACAGCAAG 3，
權(quán)利要求
1.一種中國南海線紋芋螺毒素基因S21. 1，其特征在于基因序列如序列表400<1>所示。
2.一種由根據(jù)權(quán)利要求1所述的芋螺毒素基因S21. 1編碼的多肽S21a，其特征在于 氨基酸序列如序列表400<2>所示。
3.—種重組表達(dá)載體PTRX-S21. 1，其特征在于由載體pTRX和根據(jù)權(quán)利要求1所述的芋螺毒素基因S21. 1連接組成。
4.一種多肽的表達(dá)方法，其特征在于實施步驟為(1)將重組表達(dá)載體PTRX-S21.1轉(zhuǎn)化宿主菌BL21 (DE3)；(2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主菌BL21(DE3)；(3)對培養(yǎng)后的大腸桿菌BL21(DE!3)進(jìn)行超聲裂解，收集上清；上清液經(jīng)親和層析純化，得到重組融合蛋白；(4)重組融合蛋白經(jīng)3C酶酶切，酶切的產(chǎn)物經(jīng)層析過濾和HPLC純化得到目的蛋白—— 多肽S21a。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽S21a在神經(jīng)生物學(xué)研究及鎮(zhèn)痛藥物開發(fā)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中國南海線紋芋螺毒素基因S21.1及其編碼的多肽S21a的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過構(gòu)建cDNA文庫，從中國南海線紋芋螺的毒管中克隆得到芋螺毒素基因S21.1。本發(fā)明提供一種多肽的制備方法，通過將芋螺毒素基因S21.1與載體pTRX連接得到重組表達(dá)載體pTRX-S21.1，將重組表達(dá)載體pTRX-S21.1轉(zhuǎn)化宿主菌并在宿主菌中培養(yǎng)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物重組融合蛋白經(jīng)分離純化得到目的蛋白——多肽S21a。本發(fā)明提供的多肽S21a具有阻斷神經(jīng)遞質(zhì)傳遞和中樞鎮(zhèn)痛作用，可用于制備神經(jīng)生物學(xué)研究的工具藥和鎮(zhèn)痛藥物。
文檔編號A61P25/04GK102154301SQ20101062013
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者任政華, 吳赟, 強(qiáng)媛媛, 徐安龍, 王磊, 覃夢穎 申請人:中山大學(xué)