專利名稱：中國(guó)南海織錦芋螺毒素TxO10的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽及其編碼基因序列、其制備方法和應(yīng)用。屬于生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
芋螺(cone snail)是ー種生活在海洋淺水域的肉食動(dòng)物，有毒，屬于軟體動(dòng)物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、前觸亞綱(Prosobranchia)、芋螺科(Conidae)、芋螺屬(Conus)。目前估計(jì)全球有約500-700種芋螺，它們分布于熱帶海域的淺水區(qū)域，主要是印 度洋和太平洋海域。芋螺按其食性可分為三大類食魚性芋螺(piscivorous)，食軟體動(dòng)物性芋螺(molluscivorous)和食蟲性芋螺(vermivorous)。其中食蟲性芋螺種類最多，占全部芋螺種類的70%左右，而食魚性芋螺雖然占芋螺總數(shù)最少，但毒性最強(qiáng)，至今為止報(bào)道的芋螺致死事件基本上是該類芋螺造成的。芋螺毒素(conotoxin，CTx)是ー類來源于芋螺(Conus)毒液的活性多肽.對(duì)芋螺自身而言，CTx主要用于捕食與防御.。近幾十年來的研究表明，它主要作用于細(xì)胞膜上各種離子通道和神經(jīng)遞質(zhì)/激肽的受體，有很強(qiáng)的生物學(xué)活性。芋螺毒素具有有如下特點(diǎn)分子質(zhì)量小，富含ニ硫鍵；前導(dǎo)肽高度保守而成熟肽具有多祥性；作用靶點(diǎn)廣且具有高度組織選擇性。芋螺毒素常被作為探針用于各種離子通道和受體的類型及亞型的分類和鑒定，也極有望直接開發(fā)成藥物或作為先導(dǎo)化合物用于新藥的研發(fā)。目前，國(guó)內(nèi)外已明確功能的芋螺毒素只占了整個(gè)毒素庫的很小一部分，但是對(duì)它們的生理功能已經(jīng)有了較為清晰的認(rèn)識(shí)。芋螺毒素ニ硫鍵骨架和結(jié)構(gòu)的不同，決定了它們功能靶位的差異，已經(jīng)清楚的靶位主要包括配體門控的離子通道、電壓門控的離子通道及G蛋白偶聯(lián)的受體。二十世紀(jì)八十年代初，美國(guó)猶它大學(xué)Olivera BM學(xué)者實(shí)驗(yàn)室最早開展了芋螺毒素全面系統(tǒng)研究工作。芋螺毒素按照其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(前體肽中N端高度保守的信號(hào)肽區(qū)和C端的ニ硫鍵骨架)，可分為不同的超家族。至今已經(jīng)得到分離的芋螺毒素有近千種，數(shù)十種芋螺毒素已申請(qǐng)美國(guó)專利。它們?cè)阪?zhèn)痛、局部缺血性保護(hù)、癲癇治療、某些疾病診斷和受體研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，有的已進(jìn)入臨床研究或已被FDA正式批準(zhǔn)為治療新藥，用作特異診斷試劑和鎮(zhèn)痛藥。目前，由Elan公司進(jìn)行開發(fā)的ω-CTX MVIIA(SNXIII，商品名Ziconotide)，因其直接作用分布于神經(jīng)組織的N-型鈣離子通道，無需第二信使或蛋白，不成癮，已成為治療難治性神經(jīng)疼痛的新一代藥物，已通過了 III期臨床試驗(yàn)，正式被FDA批準(zhǔn)上市。而另ー個(gè)衍生于ω-CTX CVID的化合物AM336作用類似于Ziconotide，因其對(duì)N-鈣通道的選擇性更強(qiáng)，副作用更低，已經(jīng)批準(zhǔn)作為對(duì)抗嚴(yán)重抗嗎啡作用慢性疼痛的治療藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。此外,Conantokin-G作為NMDA受體高度選擇性的拮抗劑,對(duì)難以治療的癲癇有效，也已完成I期臨床試驗(yàn)。另ー方面，芋螺毒素作為研究離子通道和膜受體的極好探針或工具，已經(jīng)成為電壓門控型鈣離子通道(VSCCs)和N型こ酰膽堿受體(nAChRs)等通道、受體鑒定和診斷的標(biāo)準(zhǔn)工具，在神經(jīng)藥理學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種中國(guó)南海織錦芋螺韋素基因TxOltl,其基因序列如序列表中序列I所示。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供上述織錦芋螺毒素基因TxOltl編碼的多肽TxOltl,其氨基酸序列如序列表中序列2所示。本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供一種重組表達(dá)載體pTRX-Tx01(l。本發(fā)明的再ー個(gè)目的是提供一種多肽的表達(dá)方法，從表達(dá)、分離和純化幾個(gè)方面對(duì)原有的多肽表達(dá)方法進(jìn)行改良。
本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供上述芋螺毒素多肽TxOltl在神經(jīng)生物學(xué)研究藥物開發(fā)中的應(yīng)用。本發(fā)明使用的織錦芋螺采自中國(guó)海南省三亞市。本發(fā)明通過構(gòu)建cDNA文庫和測(cè)序的方法，從中國(guó)南?？楀\芋螺毒管中分離得到中國(guó)南?？楀\芋螺毒素基因TxOltlt5本發(fā)明提供一種重組表達(dá)載體PTRX-TxO1。，通過以下方式合成首先，將織錦芋螺毒素基因TxOltl的cDNA序列分拆為兩對(duì)互補(bǔ)序列作為模板母鏈，在該母鏈基因的5’端和3’端分別加入限制性內(nèi)切酶KpnI和NotI的酶切位點(diǎn)；另外，在5’端加入了 Ek酶的識(shí)別位點(diǎn)，而在3’端還加入了兩個(gè)終止密碼子(TAA)，上述該兩對(duì)引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后分為互補(bǔ)配對(duì)的兩組分別進(jìn)行磷酸化與退火，合成出全長(zhǎng)的織錦芋螺毒素基因 Τχ010。其次，通過限制性內(nèi)切酶KpnI和NotI雙酶切法對(duì)質(zhì)粒pTRX_Neu5進(jìn)行酶切，切除Neu-5片段后得到線性化的載體pTRX。最后，利用T4DNA連接酶連接上述織錦芋螺毒素基因TxOltlfn上述線性化的載體pTRX，得到重組表達(dá)載體PTRX-TxOltl。本發(fā)明還提供一種多肽的表達(dá)方法，具體實(shí)施步驟為(I)將重組表達(dá)質(zhì)粒PTRX-TxOiq轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)；(2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BL21(DE3)；(3)對(duì)培養(yǎng)后的大腸桿菌BL21 (DE3)進(jìn)行超聲裂解，收集上清；上清液經(jīng)鎳柱親和層析純化，得到重組融合蛋白；(4)重組融合蛋白經(jīng)腸激酶(Enterokinase,EK酶)酶切，酶切的產(chǎn)物經(jīng)層析過濾和HPLC純化得到目的蛋白——芋螺毒素多肽Τχ01(ι。上述多肽的表達(dá)方法使用重組表達(dá)載體PTRX-TxOiq作為表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)效率較高，且優(yōu)化了培養(yǎng)條件和純化分離方式，有效提高了芋螺毒素多肽TxOltl的表達(dá)量。本發(fā)明通過青蛙坐骨神經(jīng)動(dòng)作電位實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一定濃度的芋螺毒素多肽TxO1。促進(jìn)動(dòng)作電位的作用，因此本發(fā)明還提供一種芋螺毒素多肽TxOltl在神經(jīng)生物學(xué)研究及藥物開發(fā)中的應(yīng)用。


圖I重組表達(dá)載體pTRX-Tx01(l合成過程示意2重組表達(dá)載體PTRX-TxOiq的菌落PCR陽性克隆瓊脂糖凝膠3重組表達(dá)載體PTRX-TxOiq的測(cè)序結(jié)果4重組融合蛋白分離純化親和層析5重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化的SDS-PAGE電泳圖譜
圖6酶切后的芋螺毒素多肽TxOltl反相高效液相色譜7芋螺毒素多肽TxOltl的MALDI-T0F質(zhì)譜8MTT法測(cè)定芋螺毒素多肽TxOltl對(duì)細(xì)胞存活率影響結(jié)果分析9芋螺毒素多肽TxOltl蛙坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析圖
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，來進(jìn)ー步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)理解，以下實(shí)施例只用于說明本發(fā)明而不以任何形式限制本發(fā)明。實(shí)施例I :織錦芋螺毒管組織總RNA的提取及毒素cDNA克隆總RNA的提取參照Gibcol BRL公司的TRIZOL LS試劑說明書進(jìn)行。LATaq DNA聚合酶、10XPCR Buffer, DNA ladder 購買自 TaKaRa 公司，dNTP 購自鼎國(guó)公司，pGEM-T EasyVector Systems購自Promega公司；PCR引物由Invitrogen公司合成；其他有機(jī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠。取活螺體，用石工錘破碎螺殼，暴露出螺肉，冰上小心并快速分離毒管組織，稱重后迅速放入液氮并充分研磨，加入15倍重量體積的TRIZOL LS試劑(即Ig組織中加入15ml)，冰浴中充分勻漿，-80°C冰箱中保存以備提取總RNA。取50_100mg組織樣品，用Iml TRIZOL LS試劑勻漿，15_30°C靜置5min。然后加入O. 3mL氯仿，劇烈振蕩3min后，15-30°C靜置lOmin。4°C、12，OOOrpm離心lOmin，取上層水相。加入O. 5ml異丙醇，冰上靜置IOmin 后，4°C、12, OOOrpm 離心 IOmin,棄上清。再カロ Iml 75% こ醇漂洗沉淀，4°C、7，500rpm離心5min，棄上清，真空干燥去除樣品中痕量的こ醇，加入適量無RNase的去離子水。取
Iμ I進(jìn)行I %瓊脂糖膠電泳，I μ I用紫外分光光估算RNA的濃度與純度，_80°C保存?zhèn)溆?。l)cDNA第一鏈的合成cDNA第一鏈的合成使用 Clontech 公司的 SMART PCR cDNA Synthesis Kit,按照說明書進(jìn)行試驗(yàn)。在5 μ I反應(yīng)體系中加入下列組分(于冰上操作)1 μ g螺毒管總RNA，SMART III olignucleotide和CDS III/3’PCR引物各I μ 1，以超純水補(bǔ)齊體積，混勻，短暫離心。72°C溫育2min,冰浴2min,短暫離心，使混合物集于管底。再依次加入2 μ I 5 XFirstStrand Buffer、I μ I 20mmol/L 的 DTT、1μ I lOmmol/L 的 dNTP Mix 和 I μ I PowerScriptRT (CL0NTECH)后輕彈管壁，混勻并短暫離心。置PCR儀42°C反應(yīng)Ih逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，冰浴終止反應(yīng)，_40°C保存。 2) O-超家族芋螺毒素的cDNA克隆PCR引物序列如下表I所示上游引物5 ’ CACTGTGTCTTTCGCATCA 3 ’下游引物5’TGTGCTGTCGCTTTATTTGG 3’表I
權(quán)利要求
1.一種中國(guó)南?？楀\芋螺毒素基因，其特征在于基因序列如序列表中序列〈1>所不。
2.一種由權(quán)利要求I所述的芋螺毒素基因編碼的多肽，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列2所示。
3.一種重組表達(dá)載體，其特征在于由載體PTRX和權(quán)利要求I所述的芋螺毒素基因連接組成。
4.一種多肽的表達(dá)方法，其特征在于實(shí)施步驟為 (1)將權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌； (2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主菌； (3)對(duì)培養(yǎng)后的宿主菌進(jìn)行超聲裂解，收集上清；上清液經(jīng)親和層析純化，得到重組融合蛋白； (4)重組融合蛋白經(jīng)腸激酶酶切，酶切的產(chǎn)物經(jīng)層析過濾和HPLC純化得到目的蛋白，螺毒素多肽。
5.權(quán)利要求2所述的多肽在神經(jīng)生物學(xué)研究藥物開發(fā)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中國(guó)南?？楀\芋螺毒素基因TxO10及其編碼的多肽TxO10的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過構(gòu)建cDNA文庫，從中國(guó)南海織錦芋螺的毒管中克隆得到毒素基因TxO10。本發(fā)明提供一種多肽的制備方法，通過將芋螺毒素基因TxO10與載體pTRX連接得到重組表達(dá)載體pTRX-TxO10，將重組表達(dá)載體pTRX-TxO10轉(zhuǎn)化宿主菌并在宿主菌中培養(yǎng)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物重組融合蛋白經(jīng)分離純化得到目的蛋白——多肽TxO10。本發(fā)明提供的多肽TxO10具有促進(jìn)坐骨神經(jīng)干動(dòng)作電位的作用，可用于制備神經(jīng)生物學(xué)研究的工具藥。
文檔編號(hào)A61P9/10GK102660548SQ201210081199
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者任政華, 吳赟, 周亮, 徐安龍, 戴清, 王磊, 覃夢(mèng)穎, 陳翠玲 申請(qǐng)人:中山大學(xué)