專利名稱：中國南海線紋芋螺毒素s4.3的制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的中國南海線紋芋螺神經(jīng)毒素基因及其編碼的多肽S4. 3和該 多肽的制備技術(shù)，以及該多肽在制備促細(xì)胞生長工具藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
芋螺(Genus Conus)是一類分布廣、種類多的海洋生物。芋螺亦稱雞心螺，但由于 其外殼呈圓錐形且具有美麗花紋，成芋頭狀而得名“芋螺”。在分類學(xué)上，芋螺屬于軟體動(dòng)物 門，腹足綱，前腮亞綱，新腹足目，芋螺超科，芋螺科。芋螺多數(shù)生活在太平洋和印度洋等熱 帶海洋中的淺水區(qū)，少數(shù)在水深幾米至200余米的深水區(qū)。白晝或退潮后在海藻下或珊瑚 洞中棲息，夜晚外出覓食，春夏繁殖。目前全世界發(fā)現(xiàn)的芋螺超過700種，其中我國熱帶和亞熱帶海域目前已經(jīng)有詳細(xì) 記錄的芋螺有70余種，主要分布在南沙群島、西沙群島、海南島南部及臺(tái)灣海域，少數(shù)在廣 東、廣西及海南沿海，其中部分種類為我國首次記錄。芋螺按其食性可分為三大類食魚性芋螺(piscivorous)，食軟體動(dòng)物性芋螺 (molluscivorous)和食蟲性芋螺(vermivorous)。其中食蟲性芋螺種類最多，占全部芋螺 種類的70%左右，而食魚性芋螺雖然占芋螺總數(shù)最少，但毒性最強(qiáng)，至今為止報(bào)道的芋螺致 死事件基本上是由該類芋螺造成的。芋螺毒素(conotoxin，CTX)是一類來源于芋螺毒液的活性多肽，對(duì)芋螺自身而 言，這些毒素主要用于捕食和防御。一般來說，每一種芋螺體內(nèi)都含有50-200種不同的芋 螺毒素，整個(gè)自然界中大約存在50，000-100, 000種不同的芋螺毒素。而迄今為止，只有很 少一部分的芋螺毒素被人類所發(fā)現(xiàn)，而具有確定功能的毒素則不足200個(gè)。芋螺毒素一般 具有以下幾個(gè)特點(diǎn)(1)序列短分子量小。80%以上的毒素序列在7-41個(gè)氨基酸之間，分 子量在5kDa以下。(2)結(jié)構(gòu)致密穩(wěn)定。由于芋螺毒素富含半胱氨酸，半胱氨酸的配對(duì)成鍵 決定了芋螺毒素的基本構(gòu)型，并使芋螺毒素形成致密而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。(3)在一級(jí)結(jié)構(gòu)上，半 胱氨酸之間的序列是高度可變的。(4)靶點(diǎn)廣泛但特異性強(qiáng)。芋螺毒素的靶點(diǎn)主要包括各 種電壓門控的離子通道(如鈉、鉀、鈣等離子通道)和神經(jīng)遞質(zhì)受體(乙酰膽堿受體、NMDA 受體及G蛋白偶聯(lián)受體等)，而一種毒素一般只作用于某受體的一到幾個(gè)亞型，特異性強(qiáng)。早在20世紀(jì)早期，人們就已經(jīng)開始對(duì)芋螺的毒管裝置進(jìn)行解剖學(xué)方面的研究。而 隨著之后60多年的深入探索，人們發(fā)現(xiàn)了越來越多的具有不同生物活性的芋螺毒素。當(dāng)人 們對(duì)這些毒素進(jìn)一步研究后驚奇地發(fā)現(xiàn)，芋螺毒素本身就是一個(gè)天然的龐大的藥源寶庫， 各種芋螺毒素在治療慢性頑固疼痛、急性疼痛、癲癇、神經(jīng)保護(hù)、心血管疾病、精神失常、運(yùn) 動(dòng)失調(diào)、痙攣癥、癌癥及中風(fēng)等疾病方面都具有廣闊應(yīng)用前景和潛在開發(fā)價(jià)值。因此，開展 我國南海芋螺毒素的生化、生理、藥理、尤其是分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域的探索研究，以 及開展芋螺毒素體外表達(dá)技術(shù)的研究，對(duì)于推動(dòng)我國多肽科學(xué)的發(fā)展，促進(jìn)多肽藥物的開 發(fā)，具有不容忽視的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的中國南海線紋芋螺毒素基因及其編碼的多肽 S4. 3。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的重組表達(dá)載體PTRX-S4. 3。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種新型的多肽高效表達(dá)方法，從表達(dá)、分離和純化 幾個(gè)方面對(duì)原有的多肽表達(dá)方法進(jìn)行改良。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供該多肽在制備促細(xì)胞生長藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明使用的線紋芋螺采自中國海南省三亞市。本發(fā)明通過構(gòu)建cDNA文庫和測序的方法，從中國南海線紋芋螺毒管中分離得到 新的A-超家族芋螺毒素基因。本發(fā)明將上述目的基因的cDNA序列分拆為3對(duì)互補(bǔ)序列，作為模板母鏈?zhǔn)褂昧?引物通過PCR擴(kuò)增出全長的線紋芋螺毒素基因，并在該基因的5’端和3’分別加入了限制 性內(nèi)切酶Kpn I和Not I的酶切位點(diǎn)(TAA)，另外在5’端加入了腸激酶Enterokinase的識(shí) 別位點(diǎn)，在3’端還加入了兩個(gè)終止密碼子。目的基因的核苷酸序列如序列表中<400>1序 列所示。上述基因所編碼的多肽S4. 3，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示。本發(fā)明利用Kpn I和Not I雙酶切法對(duì)pTRX_IL10質(zhì)粒進(jìn)行線性化制備，切除ILlO 片段，得到線性化的PTRX載體，同時(shí)將上一步PCR擴(kuò)增得到的目的基因的Oligo片斷進(jìn)行 磷酸化、退火與互補(bǔ)配對(duì)，然后將配對(duì)好的目的基因與PTRX載體進(jìn)行連接，構(gòu)建出重組表 達(dá)載體PTRX-S4.3并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ci中進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增后測序正確的重組表達(dá) 載體PTRX-S4. 3轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)。通過對(duì)培養(yǎng)條件的探索和優(yōu)化， 得到的重組融合蛋白的表達(dá)量較高，表達(dá)量為10mg/L菌液。本發(fā)明還優(yōu)化了重組融合蛋白的酶切和純化方法，表達(dá)產(chǎn)物的超聲裂解液采用 QIAGEN公司的Ni-NTA Superflow填料，以Ni2+為配體進(jìn)行親和層析，得到融合蛋白粗提產(chǎn) 物，該粗提產(chǎn)物再經(jīng)EK酶酶切、層析過濾和反相高效液相層析純化，可得到高純度的多肽 S4. 3。本發(fā)明獲得的多肽S4. 3具有促進(jìn)細(xì)胞生長的生物學(xué)活性。原核表達(dá)的多肽 S4. 310 μ M刺激實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞3株系及乳腺上皮細(xì)胞1株系作為對(duì)照，經(jīng)MTT法檢測細(xì)胞生 存率結(jié)果證實(shí)，在作用36h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組相比有明顯增加。因此，本發(fā)明的 多肽S4. 3可用于制備促進(jìn)細(xì)胞生長藥物。


圖1線性質(zhì)粒載體pcDNA3-SfiI的制備圖2線紋芋螺毒管雙鏈cDNA 1. 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖3線紋芋螺毒管cDNA文庫總質(zhì)粒PCR擴(kuò)增1 %瓊脂糖電泳結(jié)果
圖4線紋芋螺毒管cDNA文庫部分重組子PCR分析結(jié)果圖5線紋芋螺毒管cDNA文庫可讀序列長度分布圖6線紋芋螺毒管cDNA文庫基因簇中所含有的ESTs數(shù)目的分布情況圖7線紋芋螺毒管cDNA文庫ESTs分類
圖8線紋芋螺毒管cDNA文庫中毒素序列分類圖9表達(dá)質(zhì)粒pTRX的物理圖譜和多克隆位點(diǎn)
圖10重組表達(dá)載體pTRX-S4. 3構(gòu)建程序示意IlHPLC純化中國南海芋螺毒素多肽S4. 3實(shí)驗(yàn)12線紋芋螺毒素多肽S4. 3質(zhì)譜13為10 μ M S4. 3作用于Hela細(xì)胞36h的細(xì)胞形態(tài)圖。圖13a為正常Hela細(xì) 胞培養(yǎng)36h圖，圖13b為加IOuM S4. 3后Hela細(xì)胞培養(yǎng)36h圖。圖14MTT檢測細(xì)胞生存率圖
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明實(shí)驗(yàn)例1 中國南海線紋芋螺毒管cDNA文庫的構(gòu)建和鑒定1)材料11組織樣品線紋芋螺(Conus Straitus)采自中國海南三亞。1. 2質(zhì)粒和菌株質(zhì)粒載體pcDNA3購自Invitrogen公司大腸桿菌(Escherichia coli)DH5a由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)藥分子生物學(xué)實(shí) 驗(yàn)室保存，其基因型為DH5a :SupE44A lac U169 ( Φ 801acZ Δ M15) hsdR17recAlendAlgyrA96thi-lrelAl1.3RNA提取試劑DEPC水每IOOOml去離子水中加入Iml DEPC，終濃度為0. 1 %，充分混勻，37°C過 夜后，高壓滅菌。1. 4緩沖液1. 4. 1堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA所用緩沖液溶液I :50mM 葡萄糖，IOmM EDTA, 25mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)；溶液II 0. 2Ν NaOH，1. 0% SDS，使用前配制；溶液III :60ml 5M乙酸鉀，11. 5ml冰乙酸，28. 5ml H2O,所配成的溶液中鉀離子的 濃度為3M，乙酸根的濃度為5M ；TE IOmM Tris-HCl (ρΗ7· 4、ρΗ7· 6、ρΗ8· 0)，ImM EDTA (ρΗ8· 0)；STE :50mM Tris-HCl(pH 8. 0)，5mM EDTA(pH8. 0)，50mM NaCl ；STE (含溶菌酶)50mM Tris-HCl (pH8. 0), 5mM EDTA (ρΗ8. 0), 50mMNaCl, 70 μ g/ml 溶菌酶；10% SDS 在900ml水中溶解IOOg電泳級(jí)SDS，加熱至68 °C助溶，加水定容至 1，OOOml分裝備用；1. 4. 2PEG法提取質(zhì)粒所用緩沖液5M LiCl 30. 205g LiCl · H2O 溶于水，定容至 100ml，高壓滅菌。13% PEG8000 含 13% (w/v)PEG8000 的 1. 6M NaCl 溶液，過濾除菌。IOM乙酸銨把770g乙酸銨溶解于800ml水中，加水定容至1，OOOml后，過濾除菌。
1. 4. 3瓊脂糖凝膠電泳緩沖液50 X TAE :242g Tris，57. Iml 冰乙酸，18. 6g EDTA，定容至 1，OOOml。EB溶液100ml水中加入Ig溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時(shí)至完全溶解，分裝，室溫避
光保存。 DNA加樣緩沖液0. 25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，50%甘油(w/v)。RNA甲醛變性膠加樣緩沖液0. 25%溴酚藍(lán)，0. 25%二甲苯青，ImM EDTA(pH8. 0)， 50%甘油(w/v)，用DEPC水配制，高壓滅菌備用。5 X 甲酸變性膠電泳緩沖液0· IM MOPS (ρΗ7· 0)，40mM 乙酸鈉，5mM EDTA (ρΗ8· 0)， 用DEPC水配制，過濾除菌，室溫避光保存。淡黃色緩沖液可正常使用，深黃色應(yīng)棄用。甲醛變性膠的制備0. 336g瓊脂糖溶于20ml DEPC水中，冷卻至60°C，加入5ml 5X甲醛變性膠電泳緩沖液和5. 5ml的甲醛，在通風(fēng)櫥內(nèi)灌注凝膠，冷卻30min后使用。甲醛變性膠RNA樣品的制備適量RNA，5X甲醛變性膠電泳緩沖液0. 5 μ 1，甲醛 0. 7 μ 1，甲酰胺2μ 1，65°C加熱15min，迅速冰浴，加1μ 1上樣緩沖液和少量ΕΒ。1.4.4轉(zhuǎn)化緩沖液IOOmM CaCl2 :1.47g CaCl2 · 2H20 溶于去離子水，定容至 100ml，過濾除菌，4°C保存。1. 5培養(yǎng)基LB 液體培養(yǎng)基:Tryptone (蛋白胨)10g，Yeast Extract (酵母提取物)5g, NaCl 10g，加入800ml去離子水，用5M NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 2-7. 5，定容至1，000ml，分裝高壓滅菌，
4°C保存。LB固體培養(yǎng)基在LB液體培養(yǎng)基中加入菌用瓊脂粉至終濃度為1. 3-1. 5%，高壓 滅菌，灌注平板后4°C保存。SOB 培養(yǎng)基Tryptone 20g, Yeast Extract 5g，NaCl 0. 5g，力口入 800ml 去離子水， 加入250mMKCl溶液10ml，用5M NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 2-7. 5，定容至1，000ml，高壓滅菌，4°C保 存，使用前加入5ml滅菌的2M MgCl2溶液。SOB固體培養(yǎng)基含20mM MgSO4及1. 3-1. 5%的瓊脂粉的SOB培養(yǎng)基，高壓滅菌， 灌注平板后4°C保存。SOC培養(yǎng)基S0B培養(yǎng)基高壓滅菌后，當(dāng)溫度降至60°C以下時(shí)，加入20ml過濾除菌 的IM葡萄糖溶液，4°C保存。2X YT =Tryptone 16g, Yeast Extract 10g，NaCl 5g，力口入 800ml 去離子水，用 5M NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 2-7. 5，定容至1，000ml，高壓滅菌，4°C保存。1. 6試劑和酶TRIZOL LS 試劑購自 Gibcol BRL 公司；SMART cDNA Library Construction
Kit 為 CL0NTECH 公司產(chǎn)品；Gel Extraction Kit 和 Plasmid Miniprep Kit 購自 OMEGA BIOTEK 公司；Vitagene 96-easy plasmid Mini-prep Kit 購自 Vitagene Biochemical Technique 公 司；ABIPRISM Big-DyeTM Terminator v3. OReady Reaction Cycle Sequencing Kit購自 Applied Biosystems 公司；Bacto tryptone禾口Bacto yeast extract 購自O(shè)XOID公司；dNTP、RNaseA、DEPC、M0PS、重蒸酚和氨芐青霉素鈉鹽購自上海生工生物工 程公司；Taq DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶和T4DNA Ligase購自^ffiB公司；DNA ladder購自 Promega 公司；T7promoter sequencing primer、SP6promoter sequencing primer 等引 物由上海博亞公司合成；其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。1. 7其它溶液
氨芐青霉素溶液用無菌去離子水配成100mg/ml，分裝，-20°C保存，工作濃度為 ΙΟΟμ g/ml。RNaseA 溶液將 RNaseA 溶于 IOmM Tris-HCl (ρΗ7· 5)，15mM NaCl 溶液中，配成 10mg/ml的貯存濃度，100°C加熱15min，緩慢冷卻至室溫，分裝后在_20°C保存?zhèn)溆谩?0%甘油用去離子水配制50% (w/w)甘油，高壓滅菌后備用。dNTP 用滅菌超純水配制，分別含IOmM的dATP、dTTP、dCTP、dGTP，分裝后在_20°C 保存?zhèn)溆?。T7和SP6引物用滅菌超純水將引物配成50ρπιΟ1/μ 1的溶液，分裝后在-20°C保
存?zhèn)溆谩?)方法2. 1線紋芋螺毒管組織的處理取活螺體，使用喉閘破碎螺殼，暴露出螺肉，冰上小心并快速分離毒管組織，稱重 后迅速放入液氮并充分研磨，加入15倍重量體積的TRIZOL LS試劑(即Ig組織中加入
15ml)，冰浴中充分勻漿，-80°C冰箱中保存以備提取總RNA。2. 2總RNA的提取參照Gibcol BRL公司的TRIZOL LS試劑說明書進(jìn)行。取50_100mg組織樣品，
用0. 75ml TRIZOL LS試劑勻漿，15-30°C靜置5min。然后加入0. 2mL氯仿，劇烈振蕩15 秒后，15-30°C靜置2-15min。4°C、12，OOOrpm離心15min，取上層水相。加入0. 5ml異丙醇， 15-30°C靜置IOmin后，4°C、12，OOOrpm離心lOmin，棄上清。再加Iml 75%乙醇漂洗沉淀， 5，OOOrpm離心5min，棄上清，真空干燥去除樣品中痕量的乙醇，加入適量無RNase的去離子 水。取1 μ 1進(jìn)行1 %甲醛變性膠電泳，1 μ 1用紫外分光光度計(jì)分別測定樣品在260nm、280nm 波長上的光密度及初步估算RNA的純度，_20°C保存?zhèn)溆谩?. 3 RNA甲醛變性膠電泳加樣前，甲醛變性膠先預(yù)電泳5min，電壓降為5v/cm ；隨后將樣品加至凝膠孔，可 用已知大小的RNA作分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物，按3-4v/cm的電壓進(jìn)行電泳；紫外燈下觀察電泳結(jié)^ ο2. 4堿裂解法提取質(zhì)粒DNA從平板中隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化DH5 α單菌落于含Amp (終濃度為100 μ g/ml)的LB液體培 養(yǎng)基中，37°C、225rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取1. 5ml菌液于離心管中，4°C、12，OOOrpm離心lmin， 棄上清，用Iml STE溶液懸浮細(xì)菌沉淀，4°C、12，OOOrpm離心lmin，棄上清，加100 μ 1預(yù)冷 的溶液I重新懸浮菌體，室溫放置5min，加入200 μ 1現(xiàn)配的溶液II，輕緩混勻，冰上放置 5min，再加入150 μ 1溶液III，溫和顛倒震蕩10s，冰上放置3_5min，4°C、12，OOOrpm離心 5min，取上清，用等體積酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)及氯仿/異戊醇(24 1)各抽提 一次；水相加1/10體積3M NaAc (pH5. 2)和2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，顛倒混勻，室溫放置 IOmin, 12，OOOrpm離心5min，棄上清，再加Iml 75%乙醇漂洗沉淀，12，OOOrpm離心5min，棄上清，室溫干燥lOmin，加適量含RNaSeA(20ii g/ml)滅菌去離子水或TE緩沖液溶解，_20°C保存。2. 5PEG沉淀法純化質(zhì)粒DNA隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化菌落接種于50ml含Amp (終濃度為100 u g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C震搖培養(yǎng)過夜；取50ml細(xì)菌培養(yǎng)物，5，000rpm，4°C離心5min ；用10ml STE重新懸浮菌 體；5, 000rpm，4°C離心5min ；菌體重懸于3ml的溶液I中，加入6ml新配的溶液II，顛倒混 和均勻，冰浴5min ；加入4. 5ml溶液III，溫和地顛倒5次，冰浴15min ；5, 000rpm，4°C離心 30min ；將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0. 6倍體積的異丙醇，室溫放置lOmin ；5, OOOrpm, 室溫離心20min ；去上清，用75%乙醇洗滌沉淀，5，OOOrpm，室溫離心lOmin ；去乙醇?xì)堃?，?淀于室溫干燥后，用1.5ml TE溶解；轉(zhuǎn)移至7ml離心管中，加入等體積預(yù)冷的5M LiCl溶液， 充分混勻；10，OOOrpm，4°C離心lOmin ；將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇， 混和均勻后室溫放置lOmin ；室溫10，OOOrpm離心lOmin ；去上清，用75%乙醇洗滌DNA沉 淀；室溫10，OOOrpm離心lOmin ；去除乙醇?xì)堃海恋碓谑覝馗稍?；DNA沉淀用700 u 1TE溶解 后轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管中，加入RNaseA至終濃度為20ii g/ml，室溫放置30min ；加入等體積 的13% PEG8000溶液，充分混勻，室溫放置lOmin ；室溫12，OOOrpm離心lOmin ；去上清，沉 淀用500 yl TE充分溶解，經(jīng)等體積的酚氯仿異戊醇(25 24 1)及氯仿異戊醇 (24 1)各抽提一次后，將水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入1/4體積的10M乙酸銨和2倍體 積預(yù)冷的無水乙醇，顛倒混勻后室溫放置lOmin ；室溫，12，OOOrpm，4°C離心lOmin ；去上清， 沉淀用1ml 75%乙醇洗滌；4°C 12，OOOrpm離心5min ；去除乙醇?xì)堃?，沉淀室溫干燥片刻?加入適量的滅菌去離子水或TE緩沖液，-20°C保存?zhèn)溆谩?. 6線性質(zhì)粒載體pcDNA3_SfiI的制備pcDNA3-SfiI質(zhì)粒是經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)室改造的載體，改造過后在pcDNA3載體中引入了 新的Sfil酶切位點(diǎn)(圖1)。PEG沉淀法提取并純化pcDNA3-SfiI質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶 Sfil酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。按0MEGABI0TEK公司的Gel Extraction Kit說明書操 作，膠回收上述酶切線性載體DNA。重復(fù)酶切和回收操作各一次，線性載體DNA以50ng/ia 濃度保存?zhèn)溆谩?. 7線紋芋螺毒管CDNA的合成按CL0NTECH 公司 SMART cDNALibrary Construction Kit 說明書操作。其原理 是利用真核生物mRNA 5’端的甲基化G(m7G)且5’ -5’三磷酸鍵連接的特殊的帽子結(jié)構(gòu)和 3’端的PolyA尾的特點(diǎn)設(shè)計(jì)錨定引物，分別進(jìn)行第一鏈合成，LD PCR cDNA高保真擴(kuò)增，酶 切消化和柱回收cDNA，從而實(shí)現(xiàn)富集全長cDNA的目的。2. 7. lcDNA 第一鏈的合成在5 ill反應(yīng)體系中加入下列組分(冰上操作)1 P g總RNA，SMART III olignucleotide和CDS 111/3，PCR引物各lu 1,以超純水補(bǔ)齊體積，混勻，短暫離心。 72 °C溫育2min，冰浴2min，短暫離心，使混合物集于管底。再依次加入2 ill 5 X Fir st Strand Buffer>1 U 1 20mmol/L 的 DTTU U 1 lOmmol/L 的 dNTP Mix 禾口 1 ii 1 PowerScript RT(CLONTECH)后輕彈管壁，混勻并短暫離心。置PCR儀42。C反應(yīng)lhr逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈， 冰浴終止反應(yīng)，-40°C保存。2. 7. 2LD PCR 擴(kuò)增 cDNA 第二鏈
在lOOiil的反應(yīng)體系中加入下列組分2iU第一鏈產(chǎn)物，10 X Advantage 2PCR Buffer 10 u l,50XdNTPs Mix 2 ii 1，20 ii mol/L 上下游錨定引物各 2 ii 1，50XAdvantage 2Polymerase Mix 2u 1和超純水80 u 1補(bǔ)齊體積，混勻，放入預(yù)熱至95°C的PCR儀，運(yùn)行如 下反應(yīng)程序95°C變性lmin后，繼續(xù)循環(huán)程序95°C 15sec、68°C 6min共18個(gè)循環(huán)，冷卻至 4°C后取5 ill PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。剩余PCR產(chǎn)物于-20°C保存。2. 7. 3蛋白酶K消化在50iU 上一步的 PCR 產(chǎn)物(2-3 iig dscDNA)中加入 蛋白酶 K(20 y g/yl) 滅活DNA聚合酶，45°C溫育20min，再經(jīng)酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)和氯仿/異戊 醇(24 1)混合液各抽提一次，取上清，加入10 iU3M乙酸鈉，1.3 ill糖原(20 yg/ill)， 260 ill室溫放置的95%乙醇，室溫14，OOOrpm離心20min，用80%乙醇洗滌沉淀，空氣干 燥，加入79 yl去離子水充分溶解沉淀。2. 7. 4SfiI 酶切消化在100iil 酶切體系中加入下列組分79ii 1 的 dscDNA，10 ii 1 lOXSfil Buffer, lu 1 100XBSA和lOiil Sfil內(nèi)切酶。充分混勻，短暫離心。50°C溫育2hr后，加入2iil
的二甲苯腈藍(lán)混勻。2. 7. 5cDNA的分部柱回收將上一步酶切消化好的dscDNA上樣到預(yù)處理好的CHR0MASPIN-400柱，分管收 集大小不一的dscDNA，每管1滴，當(dāng)收集完16滴后，蓋上柱子上蓋；從每支收集管中取出 5ul樣品進(jìn)行電泳檢測，瓊脂糖凝膠電泳確定符合要求的收集管號(hào)，集中后加入0. 1倍 體積的3M NaAc (pH4. 8)U. 3u 1的20mg/ml糖原及2. 5倍體積的95%乙醇，-20°C放置 沉淀過夜；室溫14，OOOrpm離心20min ；吸去上清，沉淀用80%乙醇洗滌，室溫14，OOOrpm 離心5min，吸去上清，沉淀在空氣中干燥lOmin左右；用去離子水溶解干燥后的 dscDNA, -20°C保存?zhèn)溆?，也可直接與載體連接。2. 7. 6dscDNA與載體的連接建立如下三個(gè)連接反應(yīng)體系經(jīng)Sfil酶切的pcDNA3_SfiI載體DNA(50ii g/ ill)各取 1 yl，dscDNA 分別取 0.5、1.0、1.5iil，10X 連接緩沖液 lyl，T4DNA 連接酶 (lOOunits)O. 5iU，加無菌去離子水至體積為lOiU，設(shè)定自連對(duì)照反應(yīng)體系，16°C連接 16hr，以確定最佳比例。2. 7. 7線紋芋螺毒管CDNA文庫的電轉(zhuǎn)化DH5a電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備37°C劃線活化的E. coli DH5 a，挑取1個(gè)單菌 落，接種到LB培養(yǎng)基中37°C劇烈震蕩培養(yǎng)過夜。次日取新鮮LB液體培養(yǎng)基，按1 100的 比例擴(kuò)大培養(yǎng)至0D_ = 0. 6。將菌液迅速冰浴，30min后，4°C、4，800rpm離心lOmin收菌， 棄上清，分別用等菌液體積和一半體積的超純水洗滌菌體一次，每1升菌液以300 yl 10% 甘油重懸，按每管40iU分裝。連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞每40iU菌液加入1 yl連接產(chǎn)物或?qū)φ召|(zhì) 粒溶液，混勻，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)化杯，冰浴不超過5min，用卷紙擦干外壁，馬上置于BioRad電穿孔 儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)化參數(shù)電壓2. OkV ；電流25 ii F ；電阻200 Q ；電激時(shí)間4. 5mS。電擊 后立刻與800 yl 37°C預(yù)熱的SOB培養(yǎng)基混合，用槍混勻，盡量吸出杯內(nèi)菌液，裝于干凈無 菌的離心管中。37°C、225rpm復(fù)蘇細(xì)胞lhr，涂布于Amp+的LB平板上，37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16hr。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物則被分為兩部分，其中一部分作為cDNA文庫總庫保存于25%甘油 中，_80°C凍存；另一部分涂平板，4°C存放備用。2. 7. 8cDNA克隆序列測定
隨機(jī)挑取單克隆菌于96孔培養(yǎng)板中(孔中加有含Amp的培養(yǎng)基Iml)，塑料粘紙封 住板口，于搖床中37°C震蕩培養(yǎng)過夜。次日取100 μ 1菌液加100 μ 1 50%的甘油于96孔 細(xì)胞培養(yǎng)板中保種，每板兩份。一份用于測序，另一份_20°C保存?zhèn)溆?。利用Vitagene 96-easy plasmid Mini-prep Kit 提取線紋芋螺毒管 cDNA 文 庫質(zhì)粒。操作過程依照試劑盒說明書進(jìn)行。瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒濃度，以T7序列 (5，-TAATAC GAC TCA CTA TAG GGA-3，)為測序引物，依照 Applied Biosystems 公司提供 白勺 ABI PRISM Big-DyeTM Terminator v3. OReady Reaction Cycle Sequencing Kit 10M 書進(jìn)行5’端單向序列測定。在10μ 1的反應(yīng)體系中加入下列組分5XSequencing Buffer 2μ 1, Reaction Mix 1 μ 1，質(zhì)粒模板 200ng，T7 引物(3. 2pmol/μ 1) 1 μ 1 和滅菌去離子水 補(bǔ)齊體積，混勻反應(yīng)物，放入預(yù)熱至96°C的PCR儀，運(yùn)行如下反應(yīng)程序96°C 10s, 50°C 5s, 60°C 4min，循環(huán)30次，冷卻至4°C后取出反應(yīng)產(chǎn)物。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入96孔PCR純化板，力口 入70 %乙醇90 μ 1，封上粘膜，震蕩器上震蕩混勻，室溫避光放置20min，4°C、4，OOOrpm離 心40min，棄上清，再倒置PCR板(PCR板下墊有紙巾)，4°C、300rpm離心30sec，去掉痕量乙 醇。避光室溫干燥30min，用10 μ 1滅菌去離子水溶解沉淀。采用Perkin Elmer公司的ABI PRISM 3700自動(dòng)測序儀進(jìn)行序列測定。2. 7. 9序列分析和同源檢索測序結(jié)果輸入實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫，利用計(jì)算機(jī)程序去除各測序結(jié)果所含的載體 序列，對(duì)確定的序列進(jìn)行拼接，并將相同的EST序列聚類。然后，分別應(yīng)用BLASTX 禾口 BLASTN(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)搜索 National Center for Biotechnology Information(NCBI)的核酸和蛋白序列數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行序列相似性分析和檢 索同源序列。利用CLUSALW進(jìn)行序列比較，及DNAT00LS 6. 0分析序列開放讀碼框。通過網(wǎng) 站http://WWW. cbs. dtu. dk/services/SignalP并結(jié)合文獻(xiàn)分析預(yù)測蛋白信號(hào)肽序列。3)結(jié)果與分析3. 1線紋芋螺毒管RNA的提取用TRIZOL LS試劑提取的線紋芋螺毒管總RNA，1 %甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢
測，顯示樣品總RNA完整性良好。測得OD260 = 0. 100，OD280 = 0. 056，根據(jù)公式總RNA濃度 (μ g/ml) = A26tl X 30 (稀釋倍數(shù))X 40，計(jì)算出總RNA的濃度約為120μ g/ml ；總RNA樣品 的A26tlA28ci比值為1. 78，位于1. 7-2. 0之間，說明總RNA的純度較高。3. 2cDNA 的合成取約1 μ g總RNA直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈，取2 μ 1的第一鏈產(chǎn)物用LD PCR法 擴(kuò)增富集cDNA，cDNA的一半經(jīng)酶切消化和柱回收得到雙鏈cDNA 7 μ L· LD PCR產(chǎn)物電泳結(jié) 果呈現(xiàn)從大到小均勻的smear分布，大小在0. 3-2. Okb范圍內(nèi)，且主要集中于500bp以上， 但未見特征性亮帶(見圖2)。表明線紋芋螺毒管的成分多樣而且轉(zhuǎn)錄的mRNA較為復(fù)雜。3. 3線紋芋螺毒管cDNA文庫的構(gòu)建和鑒定取cDNAl μ 1用于連接反應(yīng)，反應(yīng)體系5 μ 1，轉(zhuǎn)化其中1 μ 1，取1/100體積轉(zhuǎn)化菌 液涂板，其余用于搖總庫菌落；隔日記數(shù)平板的平均單菌落數(shù)為949個(gè)。
通過計(jì)數(shù)平板的單菌落數(shù)，計(jì)算得到7ul線紋芋螺毒管雙鏈cDNA可獲得的cDNA 文庫克隆數(shù)為:949X 100X7X5/3 = 1. 107X 106。通過文庫總質(zhì)粒PCR分析結(jié)果，表明利用載體多克隆位點(diǎn)兩端的T7和SP6引物擴(kuò) 增的PCR產(chǎn)物電泳也出現(xiàn)呈現(xiàn)0. 3-2. Okb的均勻分布(見圖3)，這與cDNA的大小相互吻 合。隨機(jī)挑取50個(gè)單克隆，通過載體自連片段的特異引物PCR擴(kuò)增鑒定，重組率超過95% (48/50)。對(duì)已確定的重組子，利用載體多克隆位點(diǎn)兩端的T7和SP6引物擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)，大部 分的插入片段大于250bp(22/24)，平均插入片段長度約為600bp (見圖4)。減去上下游無 關(guān)序列，線紋芋螺毒管cDNA文庫平均插入子長度為405bp?？紤]到芋螺毒素分子的長度較小(7-41個(gè)氨基酸)，因此文庫中所包含的cDNA插 入序列也會(huì)相對(duì)較短。以上結(jié)果和分析可以顯示我們構(gòu)建的線紋芋螺毒管cDNA文庫在文 庫重組子數(shù)、重組率和插入片段大小等方面均符合良好文庫的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。3. 4線紋芋螺毒管cDNA文庫的序列測定和分布對(duì)500個(gè)隨機(jī)cDNA克隆使用T7引物進(jìn)行了單向的序列測定。將測序結(jié)果輸入本 實(shí)驗(yàn)室建立的生物信息學(xué)平臺(tái)的數(shù)據(jù)庫，通過質(zhì)檢去掉載體序列和不確定的模糊序列，并 對(duì)確定的序列進(jìn)行拼接，進(jìn)一步根據(jù)序列的相似性聚類為cluster，并與公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序 列同源性比較，其結(jié)果初步顯示了線紋芋螺毒管中所蘊(yùn)涵的基因信息可讀序列。根據(jù)質(zhì)檢的結(jié)果，有效的EST總數(shù)為429條，長度分布見圖5。得到的429個(gè) EST序列被聚成137個(gè)基因簇(cluster)，其中，有21個(gè)基因簇包括兩個(gè)以上的EST序列 (contig)，116個(gè)基因簇由唯一的EST序列組成(singleton)。由于線紋芋螺毒管cDNA文 庫是非均一化的原始文庫，所以其基因簇的分布在一定程度上能有效地反映相關(guān)mRNA的 多樣性。根據(jù)所含EST的數(shù)量，基因簇主要分五大類(如圖6所示)(1)有2個(gè)基因簇包含30個(gè)以上的EST序列，占總基因簇?cái)?shù)的1. 46% (2/137)，總 克隆數(shù)的20. 74% (89/429)。它們是線紋芋螺毒管cDNA文庫中表達(dá)量最高的兩種基因，分 別比對(duì)上芋螺毒素A-超家族的兩種前體序列。(2)有2個(gè)基因簇包含20至29個(gè)的EST序列，占總基因簇?cái)?shù)的1. 46% (2/137)， 總克隆數(shù)的11. 42% (49/429)。分別與線紋芋螺毒素《_SVIA突變體1的前體和線紋芋螺 毒素kA-SIVA前體具有較高的相似性。(3)有7個(gè)基因簇包含10至19個(gè)的EST序列，占總基因簇?cái)?shù)的5. 11% (7/137)， 總克隆數(shù)的22. 14% (95/429)。分別比對(duì)上線紋芋螺毒素《-SVIA突變體2的前體，線紋芋 螺毒素a -SII前體，線紋芋螺毒素S06前體，線紋芋螺毒素S05前體，以及18S核糖體RNA 和16S核糖體RNA序列。(4)有10個(gè)基因簇包含2至9個(gè)的EST序列，占總基因簇?cái)?shù)的7. 30% (10/137)， 總克隆數(shù)的6. 06% (26/429)。它們分別比對(duì)上線紋芋螺毒素《-SVIB的前體，織錦芋螺毒
o(5)有116個(gè)基因簇包含唯一的EST序列，即被稱為singletons，占總基因簇?cái)?shù)的 84. 67% (116/137)，總克隆數(shù)的 27. 04% (116/429)。3. 5線紋芋螺毒管cDNA的序列分類
將137個(gè)基因簇的序列提交到GenBank進(jìn)行BLAST X和BLAST N同源性分析。結(jié) 果表明，有對(duì)應(yīng)于300個(gè)克隆的63個(gè)基因簇(占總基因簇的45. 98% )與已知的功能蛋白 基因具有高度的同源性(E value < 10_4)。上述基因簇主要被分成三類(見圖7)。第一類 為毒素蛋白基因類，其成員最多，占到了總基因簇的一半以上。第二類為看家基因，例如，線 粒體RNA、核糖體蛋白基因等等。另有129個(gè)克隆與任何已知蛋白均無明顯相似性，缺乏足 夠的信息確定其功能，被列為第三類基因。這些未知基因可能是線紋芋螺毒管中特異表達(dá) 的基因，它們的多樣性揭示了線紋芋螺毒管中mRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)果的復(fù)雜性。由于線紋芋螺毒管是高度特性的組織，文庫主要研究 的對(duì)象是在其表達(dá)量中居于 主導(dǎo)地位的毒素蛋白序列(共計(jì)221個(gè)克隆)，又考慮到文庫測序中出現(xiàn)較多的重復(fù)序列， 因此，已有的測序數(shù)量已經(jīng)可以使得我們對(duì)線紋芋螺毒管組織中毒素的基因表達(dá)概況有一 個(gè)大致的了解。從圖8中我們可以看到A-超家族成員芋螺毒素和0-超家族成員芋螺毒素 在線紋芋螺毒素序列中占有相當(dāng)大的比例。其中，前者共有132個(gè)克隆，占毒素序列克隆總 數(shù)的59. 7 %，后者共有80個(gè)克隆，在毒素序列總數(shù)中所占的比例為36. 2 %。其它，如T-超 家族、M-超家族、S-超家族以及含有一對(duì)二硫鍵的Contryphan等芋螺毒素成員在文庫中也 有發(fā)現(xiàn)(見表1)。表1線紋芋螺毒管cDNA文庫中毒素序列主要代表
權(quán)利要求
一種從中國南海線紋芋螺毒管中分離得到的A 超家族芋螺毒素基因，其核苷酸序列如序列表<400>1中序列所示。
2.一種由權(quán)利要求1中所述基因編碼的多肽S4. 3，其特征在于該多肽的氨基酸序列 如序列表<400>2所示。
3.一種重組表達(dá)載體PTRX-S4. 3，其特征在于由pTRX載體和權(quán)利要求1所述的基因 融合重組而成，其中所述的PTRX載體經(jīng)Kpn I和Not I雙酶切法切除pTRX_IL10質(zhì)粒中的 ILlO片段并進(jìn)行線性化制備后得到。
4.權(quán)利要求2所述的多肽S4.3的制備方法，按照以下步驟進(jìn)行(1)將權(quán)利要求1中所述基因克隆到原核融合表達(dá)載體PTRX上，構(gòu)建出重組表達(dá)載體 PTRX-S4. 3并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)；(2)對(duì)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行培養(yǎng)；(3)對(duì)經(jīng)培養(yǎng)后的大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行超聲裂解，將離心分離出的包含表達(dá)產(chǎn)物 的裂解液進(jìn)行親和層析，得到重組融合蛋白；(4)重組融合蛋白經(jīng)EK酶酶切、層析過濾和反相高效液相層析純化，得到多肽S4.3。
5.權(quán)利要求2所述的多肽S4.3在制備促細(xì)胞生長藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中國南海線紋芋螺毒素基因及其編碼的多肽S4.3，該多肽的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明通過構(gòu)建cDNA文庫的方法，從線紋芋螺毒管中克隆得到A-超家族芋螺毒素基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。該基因編碼的多肽S4.3的氨基酸序列如序列表<400>2所示。該多肽的制備方法是構(gòu)建了重組表達(dá)載體pTRX-S4.3，并對(duì)培養(yǎng)方法和條件進(jìn)行探索和優(yōu)化，提高多肽S4.3的表達(dá)量。本發(fā)明的多肽S4.3的制備方法可用于改良現(xiàn)有的多肽生產(chǎn)方法。而本發(fā)明的多肽S4.3能促進(jìn)細(xì)胞快速生長，可用于制備促細(xì)胞生長類藥物。
文檔編號(hào)A61P43/00GK101979572SQ201010535309
公開日2011年2月23日 申請日期2010年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月8日
發(fā)明者任政華, 吳壽海, 徐安龍, 朱威, 王磊, 王菲菲, 陳尚武, 齊麟 申請人:中山大學(xué)