專利名稱：一種氯代毒素修飾的腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，涉及腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物，具體涉及一種氯代毒素修飾的腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物及其制備方法。
背景技術：
腦膠質瘤是發(fā)病率最高的腦腫瘤，也是死亡率最高的10類腫瘤之一。由于腦膠質瘤自身的浸潤性生長特點以及血腦屏障的存在，使得目前常用的治療手段包括手術切除、 放療、化療等均難以達到良好的治療效果?；蛑委熓且环N極具潛力的治療手段，但是基因藥物難以自主向膠質瘤富集，需要構建具有主動靶向性質的基因遞釋載體，使得外源性基因藥物在病灶部位實現(xiàn)廣泛表達。陽離子高分子材料聚酰胺一胺樹狀分枝物(polyamidoamine，簡稱PAMAM)是近年來出現(xiàn)的一類新型納米級的合成高分子，高度分枝，呈單分散性，其末端氨基豐富，強正電性，并易于經(jīng)過適當?shù)男揎椷B接抗體等生物活性物質以增加載體的靶向性，同時內部具有大量的空腔，已有報道表明特定代數(shù)的PAMAM可以有效包載基因進入細胞。但是，單獨采用PAMAM具有一定的不足，如較強的溶血性等，因此經(jīng)過一定的修飾后在基因轉運方面有很大的應用潛力。研究顯示，在腦膠質瘤晚期，血腦屏障受到破壞，此時腦膠質瘤與其他腫瘤類似， 具有EPR效應，在此基礎上采用膠質瘤靶向頭基修飾基因遞釋復合物則能進一步提高藥物在膠質瘤細胞內的濃集。近年來有學者發(fā)現(xiàn)一段由36個氨基酸殘基組成的多肽氯代毒素(chlorotoxin， 簡稱CTX)。CTX具有良好的腫瘤靶向性，能夠特異性結合多種腫瘤細胞，如神經(jīng)膠質瘤、惡性肉瘤、腸癌以及前列腺癌等，特別是對于腦膠質瘤細胞有非常高的結合特異性。研究表明，CTX通過基質金屬蛋白酶-2 (MMP-2)介導進入腫瘤細胞，而MMP-2只在腫瘤細胞表面高量表達，正常細胞表面不表達，這就解釋了 CTX特異性結合腫瘤細胞的原因。同時，CTX雖然對無脊椎動物有強烈毒性，卻對哺乳動物無毒。目前已有利用CTX修飾的放射治療藥物 131I-TM-601，正在接受FDA審批，已進入II期臨床試驗階段。同時，有研究將CTX與熒光染料連接用于手術過程的腫瘤顯像等。因此，CTX可能成為一種腦膠質瘤特異性非常高的靶向頭基。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的缺陷和不足，提供新的腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物，尤其是提供一種氯代毒素修飾的腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物。本發(fā)明提供的腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物，由氯代毒素修飾的基因遞釋載體和治療基因質粒DNA構成，所述的氯代毒素修飾的基因遞釋載體由陽離子高分子材料、親水性聚合物和氯代毒素組成。本發(fā)明的靶向基因遞釋復合物中，采用氯代毒素作為靶向頭基，陽離子高分子材料為基礎載體，通過親水性聚合物連接氯代毒素構筑形成基因遞釋載體， 該基因遞釋載體與治療基因質粒DNA構筑形成50 400納米大小的基因遞釋復合物。本發(fā)明提供的腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物，為陽離子高分子材料一親水性聚合物一氯代毒素/DNA基因遞釋復合物，本發(fā)明通過親水性聚合物將氯代毒素修飾于陽離子高分子材料上，與質粒DNA通過靜電作用復合形成基因遞釋復合物。所述的基因遞釋復合物能明顯提高治療基因在腦膠質瘤病灶部位的轉染效率和表達水平。本發(fā)明的一種氯代毒素修飾的腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物通過以下技術方案實現(xiàn)
采用陽離子高分子材料、親水性聚合物和氯代毒素為組分，三者以共價方式連接制備氯代毒素修飾的高分子基因遞釋載體；其中，親水性聚合物與陽離子高分子材料的分子比是廣20:1，氯代毒素與陽離子高分子材料的分子比為廣10:1 ； 本發(fā)明中，基因遞釋載體采用下述步驟制備
陽離子高分子材料和親水性聚合物以1 Γ20的分子比溶于pH值7. 8 8. 2磷酸鹽緩沖液中，室溫攪拌反應60 180分鐘，兩種分子中含有的基團發(fā)生特異性反應，生成陽離子高分子材料-親水性聚合物，超濾法除去未反應的親水性聚合物并更換為pH值6. 8 7. 2 磷酸鹽緩沖液；同時，氯代毒素與巰基化試劑反應后引入巰基，以1 10:1的分子比與陽離子高分子材料-親水性聚合物上的特異基團室溫攪拌反應12 36小時后生成陽離子高分子材料-親水性聚合物-氯代毒素，分子排阻色譜法除去未反應的氯代毒素。上述基因遞釋載體與治療基因質粒DNA形成50 400納米大小的基因遞釋復合物，其中的陽離子高分子材料與治療基因質粒DNA的質量比是廣20:1。本發(fā)明還提供了氯代毒素修飾的腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物的制備方法，其特征在于，其包括下述步驟
將制備的陽離子高分子材料-親水性聚合物-氯代毒素基因遞釋載體溶于PH值7. 3 7. 5磷酸鹽緩沖液中配制成所需濃度的溶液，將治療基因質粒DNA溶于50 mM硫酸鈉溶液中配制成所需濃度的溶液，室溫下兩者等體積漩渦30 s混勻制成基因遞釋復合物。本發(fā)明中，所述的陽離子高分子材料選自聚酰胺-胺型樹狀分枝物、樹枝狀聚賴氨酸、殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚賴氨酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙稀酰胺、聚氨基酰胺或陽離子脂質。所述的親水性聚合物選自聚乙二醇(polyethyleneglycol，簡稱PEG)、聚氧乙烯或聚-#-(2-羥丙基)-甲基丙稀酰胺。所述的治療基因質粒DNA選自編碼腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)的質粒 pORF-TRAIL 和腫瘤抑制基因 P53、 PTEN、P21 或P16。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，觀察不同濃度的CTX在腦膠質瘤C6細胞和腎上皮293細胞的攝取，熒光顯微鏡結果顯示，CTX在C6細胞上的攝取隨著濃度增加而增加，而對應濃度的CTX 在293細胞上則幾乎不攝取，說明在一定的范圍內，CTX在C6細胞上的攝取存在特異性和濃度依賴性，且CTX只被腦膠質瘤細胞攝取，表明CTX對腦膠質瘤細胞的特異靶向性。本發(fā)明中所述的CTX采用Traut’ s試劑進行巰基化，通過Ellman’ s試劑測定巰基化程度，測定結果顯示PAMAM-PEG-CTX的產率為82. 4%，表明成功合成高分子基因遞釋載體 PAMAM-PEG-CTXo本發(fā)明所合成的基因遞釋載體PAMAM-PEG-CTX在C6細胞和293細胞上的攝取結果顯示PAMAM-PEG-CTX在C6細胞上的攝取明顯增加，在293細胞上則無顯著變化，陽性對照載體PAMAM在C6細胞和293細胞上的攝取相當，表明經(jīng)CTX修飾后可增加腦膠質瘤細胞的攝取。本發(fā)明所制備的基因遞釋復合物在C6細胞的攝取結果顯示，經(jīng)CTX修飾后，基因遞釋復合物的細胞攝取顯著增加，進一步確證CTX的腦膠質瘤靶向作用。實驗中，采用本發(fā)明提供的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物對荷腦膠質瘤裸鼠尾靜脈注射，劑量為50 mg DNA/只小鼠，2小時置于Maestro 2活體成像儀中進行觀察， 隨后取出腦、心、肝、脾、肺、腎等臟器進行離體觀察，結果表明，與未經(jīng)修飾的PAMAM/DNA基因遞釋復合物比較，經(jīng)CTX修飾的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物能夠有效提高基因在腦部的攝取，同時減少肝臟和腎臟的攝取。在腫瘤模型建立后第12天，采用本發(fā)明的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物對荷腦膠質瘤ICR小鼠尾靜脈注射，注射劑量為50 ygDNA。注射48小時后，小鼠乙醚麻醉， 迅速斷頭取腦，4%多聚甲醛固定48 h，相繼置于15%和30%蔗糖中脫水至下沉，OCT包埋后-20 °C冷凍，作膠質瘤部位的連續(xù)冰凍冠狀切片，切片厚度為20 μπι。切片和DAPI(300 ηΜ)室溫孵育10 min染核，PBS洗2次，倒置熒光顯微鏡觀察腦膠質瘤病灶部位的基因表達。 結果顯示，與未經(jīng)修飾的PAMAM/DNA基因遞釋復合物比較，經(jīng)CTX修飾的PAMAM-PEG-CTX/ DNA基因遞釋復合物在膠質瘤內部表達顯著增多。在腫瘤模型建立后第8天、第10天和第12天，分別采用本發(fā)明的PAMAM-PEG-CTX/ DNA基因遞釋復合物對荷腦膠質瘤ICR小鼠尾靜脈注射，每次劑量為50 mg DNA/只小鼠，記錄小鼠存活時間，結果表明，與未經(jīng)修飾的PAMAM/DNA基因遞釋復合物比較，經(jīng)CTX修飾的 PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物能夠有效延長荷瘤小鼠的存活時間。在腫瘤模型建立后第8天、第10天和第12天，分別采用本發(fā)明的PAMAM-PEG-CTX/ DNA基因遞釋復合物對荷腦膠質瘤ICR小鼠尾靜脈注射，每次劑量為50 mg DNA/只小鼠， 第15天取全腦，4°C、4%的多聚甲醛溶液中固定48小時，4°C、15 %的蔗糖溶液中脫水6小時，4°C、30%的蔗糖溶液中脫水M小時，包埋、冷凍后進行冰凍切片，厚度為20 mm，隨后進行TUNEL原位凋亡檢測，結果表明，與未經(jīng)修飾的PAMAM/DNA基因遞釋復合物比較，經(jīng)CTX 修飾的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物能夠更有效誘導膠質瘤細胞發(fā)生大量凋亡。本發(fā)明的突出優(yōu)點在于，采用極具臨床應用潛力的腦膠質瘤靶向頭基——氯代毒素修飾陽離子高分子材料，增加基因在腦膠質瘤細胞的轉染效率和表達水平，特別是，通過無創(chuàng)傷的靜脈注射方式給藥后顯著提高基因遞釋復合物在腦膠質瘤病灶部位的表達。另外，本發(fā)明選用近年來出現(xiàn)的新型陽離子高分子材料PAMAM為基礎載體，利用該樹型高分子材料自身的一些優(yōu)勢如單分散性、無免疫原性、模擬體內分子特性等，使該基因遞釋復合物的轉染效率較高且相對安全。本發(fā)明的氯代毒素修飾的基因遞釋復合物還可用于轉染人體來源和動物來源的內皮細胞、上皮細胞、各種組織實質細胞和/或神經(jīng)細胞。


圖1是本發(fā)明中不同濃度CTX在C6和293細胞上的攝取結果圖； 其中，CTX使用熒光染料BODIPY標記
A-D為C6細胞攝取結果
E-H為293細胞攝取結果 A，E =CTX 的濃度為 1 μ g/ml B，F(xiàn):CTX 的濃度為 2 μ g/ml C，G:CTX 的濃度為 5 μ g/ml D，H :CTX 的濃度為 10 μ g/ml。圖2是本發(fā)明中PAMAM和PAMAM-PEG-CTX在C6和293細胞上的攝取結果圖； 其中，PAMAM使用熒光染料BODIPY標記
A:PAMAM 在 C6 細胞上的攝取結果，PAMAM:DNA (3:1，w/w)； B :PAMAM-PEG-CTX 在 C6 細胞上的攝取結果，PAMAMDNA (3:1，w/w)； C =PAMAM在四3細胞上的攝取結果，PAMAMDNA (3:1，w/w)； D :PAMAM-PEG-CTX 在 293 細胞上的攝取結果，PAMAMDNA (3 1，w/w)。圖3是本發(fā)明中不同溫度下PAMAM和PAMAM-PEG-CTX在C6細胞上的攝取結果圖； 其中，PAMAM使用熒光染料BODIPY標記
A 37 0C 時 PAMAM 的攝取結果，PAMAMDNA (3:1，w/w)； B 37 0C 時 PAMAM-PEG-CTX 的攝取結果，PAMAMDNA (3:1，w/w)； C :4 °C 時 PAMAM 的攝取結果，PAMAMDNA (3:1，w/w)； D :4 °C 時 PAMAM-PEG-CTX 的攝取結果，PAMAMDNA (3:1，w/w)。圖4是本發(fā)明中活體成像考察經(jīng)CTX修飾前后的基因遞釋復合物靶向腦膠質瘤的效率結果其中，質粒DNA使用熒光染料EMA標記
A :PAMAM/DNA基因遞釋復合物在荷腦膠質瘤裸鼠腦部的蓄積情況； B :PAMAM/DNA基因遞釋復合物在荷腦膠質瘤裸鼠主要臟器(腦、心、肝、脾、肺和腎)的蓄積情況；
C :PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物在荷腦膠質瘤裸鼠腦部的蓄積情況； D :PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物在荷腦膠質瘤裸鼠主要臟器(腦、心、肝、脾、肺和腎)的蓄積情況。圖5是本發(fā)明中冰凍切片考察不同基因遞釋復合物在腦膠質瘤的表達情況圖其中，所載質粒DNA為編碼綠色熒光蛋白的pEGFP質粒DNA ；
線條圈出區(qū)域為腦膠質瘤病灶部位；
A-C :PAMAM/DNA基因遞釋復合物在荷腦膠質瘤ICR小鼠腦膠質瘤病灶部位的表達結
果；
D-F :PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物在荷腦膠質瘤ICR小鼠腦膠質瘤病灶部位的表達結果；
A，D =DAPI染細胞核的切片 B，E 綠色熒光表達的切片 C :A和B的疊加圖片F(xiàn) :D和E的疊加圖片。圖6是本發(fā)明中荷腦膠質瘤ICR小鼠經(jīng)不同治療后的生存曲線圖、
圖7是本發(fā)明中原位TUNEL檢測荷腦膠質瘤ICR小鼠腦內膠質瘤凋亡情況圖； 其中，線條指示腦膠質瘤邊緣，箭頭指示凋亡區(qū)域 A 生理鹽水
B :PAMAM-PEG-CTX/pGL2基因遞釋復合物 C 替莫唑胺膠囊 D 游離 pORF-TRAIL 質粒 DNA E :PAMAM/pORF-TRAIL基因遞釋復合物 F :PAMAM-PEG-CTX/pORF-TRAIL 基因遞釋復合物。
具體實施例方式實施例1.
PAMAM和含有雙功能基團的PEG按照分子比1:2溶于pH 8.0的磷酸鹽緩沖液(簡稱 PBS)中，室溫攪拌反應120分鐘，生成PAMAM-PEG，超濾除去未反應的PEG并更換緩沖液為 PH 7.0的PBS。與此同時，氯代毒素與Traut’s巰基化試劑反應后引入巰基基團，純化后與 PAMAM-PEG按照1 1分子比混合，室溫攪拌反應M小時后生成PAMAM-PEG-CTX，分子排阻色譜法除去未反應的氯代毒素即得PAMAM-PEG-CTX。實施例2.
PAMAM和含有雙功能基團的PEG按照分子比1:6溶于pH 8. 0的PBS中，室溫攪拌反應 120分鐘，生成PAMAM-PEG，超濾除去未反應的PEG并更換緩沖液為pH 7. 0的PBS。與此同時，氯代毒素與Traut’ s巰基化試劑反應后引入巰基基團，純化后與PAMAM-PEG按照3:1分子比混合，室溫攪拌反應M小時后生成PAMAM-PEG-CTX，分子排阻色譜法除去未反應的氯代毒素即得PAMAM-PEG-CTX。實施例3.
將實施例1制備的PAMAM-PEG-CTX基因遞釋載體溶于適量pH 7. 4的PBS中配成300 mg/ml (以PAMAM的質量計算)的溶液，將pEGFP_N2綠色熒光蛋白治療基因質粒DNA溶于適量的50 mM硫酸鈉溶液中配制成100 mg/ml的溶液，室溫下兩者等體積漩渦30 s混勻制成 PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物。實施例4.
將實施例1制備的PAMAM-PEG-CTX基因遞釋載體溶于適量pH 7. 4的PBS中配成600 mg/ml (以PAMAM的質量計算)的溶液，將pEGFP_N2綠色熒光蛋白治療基因質粒DNA溶于適量的50 mM硫酸鈉溶液中配制成100 mg/ml的溶液，室溫下兩者等體積漩渦30 s混勻制成 PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物。實施例5.
將實施例1制備的PAMAM-PEG-CTX基因遞釋載體溶于適量pH 7.4的PBS中配成 300 mg/ml (以PAMAM的質量計算)的溶液，將pORF-TRAIL治療基因質粒DNA溶于適量的50 mM硫酸鈉溶液中配制成100 mg/ml的溶液，室溫下兩者等體積漩渦30 s混勻制成 PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物。
實施例6.
將實施例1制備的PAMAM-PEG-CTX基因遞釋載體溶于適量pH 7.4的PBS中配成 600 mg/ml (以PAMAM的質量計算)的溶液，將pORF_TRAIL治療基因質粒DNA溶于適量的50 mM硫酸鈉溶液中配制成100 mg/ml的溶液，室溫下兩者等體積漩渦30 s混勻制成 PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物。實施例7.
將實施例2制備的PAMAM-PEG-CTX基因遞釋載體溶于適量pH 7.4的PBS中配成 300 mg/ml (以PAMAM的質量計算)的溶液，將pORF_TRAIL治療基因質粒DNA溶于適量的50 mM硫酸鈉溶液中配制成100 mg/ml的溶液，室溫下兩者等體積漩渦30 s混勻制成 PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物。實施例8.
將實施例1制備的PAMAM-PEG-CTX使用綠色熒光染料BODIPY標記，稀釋成50 μ g/ml (以PAMAM計)，37 °C時與C6細胞孵育30 min后通過熒光顯微鏡觀察，結果顯示，與未經(jīng)修飾的PAMAM比較，PAMAM-PEG-CTX在C6細胞上的攝取明顯增加，表明經(jīng)CTX修飾后可增加腦膠質瘤細胞的攝取，結果如附圖2 A和B所示。實施例9.
將實施例1制備的PAMAM-PEG-CTX使用綠色熒光染料BODIPY標記，稀釋成50 μ g/ml (以PAMAM計)，37 °C時與293細胞孵育30 min后通過熒光顯微鏡觀察，結果顯示，經(jīng)CTX修飾前后，高分子基因遞釋載體在293細胞上的攝取相當，表明CTX修飾不增加正常細胞上基因遞釋載體的攝取，結果如附圖2 C和D所示。實施例10.
將實施例1制備的PAMAM-PEG-CTX使用綠色熒光染料BODIPY標記，稀釋成50 μ g/ml (以PAMAM計)，37 °C時與C6細胞孵育30 min后通過熒光顯微鏡觀察，結果顯示，37 °C時， 與未經(jīng)修飾的PAMAM比較，PAMAM-PEG-CTX在C6細胞上的攝取明顯增加，表明經(jīng)CTX修飾后可增加腦膠質瘤細胞的攝取，且此細胞攝取顯著高于4。C，表明其細胞攝是能量依賴性的過程，結果如附圖3 A和B所示。實施例11.
將實施例1制備的PAMAM-PEG-CTX使用綠色熒光染料BODIPY標記，稀釋成50 μ g/ml (以PAMAM計)，4 °C時與C6細胞孵育30 min后通過熒光顯微鏡觀察，結果顯示，4 °C時，經(jīng) CTX修飾前后，高分子基因遞釋載體在C6細胞上的攝取均非常少，表明其細胞攝取是能量依賴性的過程，結果如附圖3 C和D所示。實施例12.
實施例5制備的基因遞釋復合物使用紅色熒光染料EMA標記，經(jīng)荷腦膠質瘤裸鼠尾靜脈注射，劑量為50 mg DNA/只小鼠。2小時后處死，取腦置于Maestro 2活體成像儀中進行觀察，結果表明，與未經(jīng)修飾的PAMAM/DNA基因遞釋復合物比較，經(jīng)CTX修飾的 PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物能夠有效提高基因在腦部的攝取，結果如附圖4 A和C 所示。實施例13.
實施例5制備的基因遞釋復合物使用紅色熒光染料EMA標記，經(jīng)荷腦膠質瘤裸鼠尾靜
8脈注射，劑量為50 mg DNA/只小鼠。2小時后處死，取出腦、心、肝、脾、肺、腎等臟器置于 Maestro 2活體成像儀中進行觀察，結果表明，與未經(jīng)修飾的PAMAM/DNA基因遞釋復合物比較，經(jīng)CTX修飾的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物不僅能夠有效提高基因在腦部的攝取，同時能減少肝臟和腎臟的攝取，結果如附圖4 B和D所示。實施例14.
實施例5制備的基因遞釋復合物于荷腦膠質瘤ICR小鼠腫瘤模型建立后第12天尾靜脈注射，注射劑量為50 yg DNA。注射48小時后，小鼠乙醚麻醉，迅速斷頭取腦，4%多聚甲醛固定48 h，相繼置于15%和30%蔗糖中脫水至下沉，OCT包埋后-20 °C冷凍，作膠質瘤部位的連續(xù)冰凍冠狀切片，切片厚度為20 ym0切片和DAPI (300 ηΜ)室溫孵育10 min 染核，PBS洗2次，倒置熒光顯微鏡觀察腦膠質瘤病灶部位的基因表達。結果顯示，與未經(jīng)修飾的PAMAM/DNA基因遞釋復合物比較，經(jīng)CTX修飾的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物在膠質瘤內部表達顯著增多，結果如附圖5所示。實施例Ιδ.
荷腦膠質瘤ICR小鼠在腫瘤模型建立后第8天、第10天、第12天分別尾靜脈注射實施例5制備的基因遞釋復合物，每次劑量為50 mg DNA/只小鼠，記錄小鼠存活時間，結果表明，與未經(jīng)修飾的PAMAM/DNA基因遞釋復合物比較，經(jīng)CTX修飾的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物能夠有效延長荷瘤小鼠的存活時間，結果如附圖6所示。實施例16.
荷腦膠質瘤ICR小鼠在腫瘤模型建立后第8天，第10天，第12天分別尾靜脈注射實施例5制備的基因遞釋復合物，每次劑量為50 mg DNA/只小鼠，第15天取全腦，4°C、4%的多聚甲醛溶液中固定48小時，4°C、15%的蔗糖溶液中脫水6小時，4°C、30%的蔗糖溶液中脫水M小時，包埋、冷凍后進行冰凍切片，厚度為20 mm,隨后進行TUNEL原位凋亡檢測，結果表明，與未經(jīng)修飾的PAMAM/DNA基因遞釋復合物比較，經(jīng)CTX修飾的PAMAM-PEG-CTX/DNA基因遞釋復合物能夠更有效誘導膠質瘤細胞發(fā)生大量凋亡，結果如附圖7所示。本發(fā)明上述實驗中采用的PAMAM購自Sigma公司，氯代毒素序列為MCMPCFTTDHQM ARK⑶DCCGGKGRGKCYGPQ，購自北京中昊時代生物有線公司，雙功能PEG購自北京鍵凱公司。通過上述實驗，結果表明，本發(fā)明采用極具臨床應用潛力的腦膠質瘤靶向頭基——氯代毒素修飾陽離子高分子材料，增加基因在腦膠質瘤細胞的轉染效率和表達水平，特別是，通過無創(chuàng)傷的靜脈注射方式給藥后顯著提高基因遞釋復合物在腦膠質瘤病灶部位的表達。
權利要求
1.一種氯代毒素修飾的腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物，其特征在于，由氯代毒素修飾的基因遞釋載體和治療基因質粒DNA構成，所述的氯代毒素修飾的基因遞釋載體由陽離子高分子材料、親水性聚合物和氯代毒素組成；其中，氯代毒素作為靶向頭基，陽離子高分子材料為基礎載體，通過親水性聚合物連接氯代毒素構筑形成基因遞釋載體，該基因遞釋載體與治療基因質粒DNA構筑成基因遞釋復合物；所述的親水性聚合物與陽離子高分子材料的分子比是廣20:1，氯代毒素與陽離子高分子材料的分子比為廣10:1，所述的陽離子高分子材料與治療基因質粒DNA的質量比是廣20:1。
2.按權利要求1所述的氯代毒素修飾的腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物，其特征在于， 所述的復合物的尺寸為50 400納米。
3.按權利要求1所述的氯代毒素修飾的腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物，其特征在于， 所述的陽離子高分子材料選自聚酰胺-胺型樹狀分枝物、樹枝狀聚賴氨酸、殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚賴氨酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙稀酰胺、聚氨基酰胺或陽離子脂質。
4.按權利要求1所述的氯代毒素修飾的腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物，其特征在于， 所述的親水性聚合物選自聚乙二醇、聚氧乙烯或聚-N-(2-羥丙基)-甲基丙稀酰胺。
5.按權利要求1所述的氯代毒素修飾的腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物，其特征在于， 所述治療基因質粒DNA選自質粒pORF-TRAIL和腫瘤抑制基因P53、PTEN、P21或P16。
6.權利要求1所述的氯代毒素修飾的腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物的制備方法，其特征在于，其包括步驟將制備的陽離子高分子材料-親水性聚合物-氯代毒素基因遞釋載體溶于PH值7. 3 7. 5磷酸鹽緩沖液中配制成所需濃度的溶液，將治療基因質粒DNA溶于50 mM硫酸鈉溶液中配制成所需濃度的溶液，室溫下兩者等體積漩渦30 s混勻制成基因遞釋復合物。
7.按權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的基因遞釋復合物為50 400納米。
8.按權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的基因遞釋載體中，陽離子高分子材料、親水性聚合物和氯代毒素以共價方式連接。
9.按權利要求6所述的方法，其特征在于，所述的基因遞釋載體通過下述步驟制備陽離子高分子材料和親水性聚合物以1 Γ20的分子比溶于pH值7. 8 8. 2磷酸鹽緩沖液中，室溫攪拌反應60 180分鐘，兩種分子中含有的基團發(fā)生特異性反應，生成陽離子高分子材料-親水性聚合物，超濾法除去未反應的親水性聚合物并更換為pH值6. 8 7. 2 磷酸鹽緩沖液；同時，氯代毒素與巰基化試劑反應后引入巰基，以1 10:1的分子比與陽離子高分子材料-親水性聚合物上的特異基團室溫攪拌反應12 36小時后生成陽離子高分子材料-親水性聚合物-氯代毒素，分子排阻色譜法除去未反應的氯代毒素。全文摘要
本發(fā)明屬生物技術領域，涉及一種氯代毒素修飾的腦膠質瘤靶向基因遞釋復合物及其制備方法，本發(fā)明通過親水性聚合物將氯代毒素修飾于陽離子高分子材料上，與質粒DNA通過靜電作用復合形成基因遞釋復合物。本發(fā)明能有效增加基因在腦膠質瘤細胞的轉染效率和表達水平，特別是通過無創(chuàng)傷的靜脈注射方式給藥后顯著提高基因遞釋復合物在腦膠質瘤病灶部位的基因表達。本發(fā)明中的氯代毒素修飾的基因遞釋復合物還可用于轉染人體來源和動物來源的內皮細胞、上皮細胞、各種組織實質細胞和/或神經(jīng)細胞。
文檔編號A61K47/42GK102462846SQ20101053501
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月8日 優(yōu)先權日2010年11月8日
發(fā)明者柯偉倫, 蔣晨, 黃容琴 申請人:復旦大學