專利名稱：芋螺毒素的生物學制備方法及其產品和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及芋螺毒素的制備方法，尤其涉及一種芋螺毒素的生物學制備方法以及由該生物學方法制備得到的產品以及它們在鎮(zhèn)痛、神經(jīng)修復或戒斷毒癮中的醫(yī)藥用途，屬于芋螺毒素的生物學制備領域。
背景技術：
海洋毒素是近二十年一個新興的研究領域，其重要進展之一是發(fā)現(xiàn)了一些毒性極大的小肽類毒素，其中軟體動物芋螺(conus)分泌的芋螺毒素(conotoxin)是備受重視的一類神經(jīng)毒素，是迄今發(fā)現(xiàn)的最小核酸編碼的動物神經(jīng)毒素肽，也是二硫鍵密度最高的小肽。芋螺毒素具有化學結構新穎，生物活性強，作用靶位選擇性高等特點，已成為藥理學和神經(jīng)科學的有力工具和新藥開發(fā)的新來源。依照芋螺毒素對神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的作用部位，將其分為四類1、α -芋螺毒素(a-conotoxin):其與銀環(huán)蛇毒素相似,作用于神經(jīng)突觸后乙酰膽堿受體(AchR)起阻斷作用；2、μ-芋螺毒素(μ-conotoxin):其與河豚毒素相似，在·活化相起作用，專一抑制電壓敏感性鈉通道；3、ω-芋螺毒素(ω-conotoXin)，專一阻斷神經(jīng)末梢突觸前電壓敏感性鈣通道；4、δ-芋螺毒素(δ-conotoxin)，專一作用于電壓敏感性鈉通道，在非活化相起作用，延長動作電位持續(xù)時間。芋螺毒素對靶受體的作用具有高親和性和高特異性，可以區(qū)分不同的受體亞型。雖然不同的芋螺毒素的氨基酸序列變化非常大，但它們的結構上的差異不大，尤其是表達后加工的過程基本是一致的。a CTx(alpha conotoxin Tx)有望被直接開發(fā)成藥物或作為新藥的先導化合物。作用于N型VSCCs的芋螺毒素能抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的與痛覺相關的神經(jīng)遞質(如谷氨酸和P物質)釋放，從而減輕動物的神經(jīng)性疼痛，并引起了人們希望將其開發(fā)成為新的肽類止痛劑的濃厚興趣。a CTx有望用于慢性疼痛的治療，它相對于嗎啡，具有療效好、不成癮的獨特優(yōu)點；CTx具有比嗎啡藥效更強和持續(xù)時間更長的鎮(zhèn)痛效果，是通過阻斷外周初級傳入神經(jīng)元的nAChRs而發(fā)揮止痛作用，其給藥更方便(可肌注或脂肪注射)，同時也無嗎啡引起的副反應(如便秘、呼吸抑制等)，極有望開發(fā)成為高效止痛藥物。此外a CTx能選擇性阻斷nAChRs的某種亞型，除有止痛效果外，也有望開發(fā)成用于治療焦慮癥、帕金森氏病、肌肉緊張和高血壓等病癥的藥物。alpha A conotoxin Txl即是目前研究比較多的一種a CTx。迄今尚未見有芋螺毒素高活性的體外表達的文獻報道，可能原因有以下兩點1、在原核表達系統(tǒng)，無法加工去除N-端信號肽序列，無法解決C-端酰胺化問題；2、芋螺毒素分子小，堿性氨基酸較多，因此難于形成特定活性構象。由于以上原因，大部分實驗室為獲得具有生物活性的芋螺毒素只好轉向化學合成。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一是提供一種優(yōu)化的芋螺毒素a ACTl基因，該基因能夠在昆蟲宿主或細胞中高效表達具有生物學活性的芋螺毒素。本發(fā)明的目的之二是提供一種芋螺毒素的生物學制備方法。
本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的本發(fā)明將芋螺毒素a ACT的原始基因序列(GenBank AF146352. 1，其核苷酸序列為SEQ ID No. I所示，所編碼的氨基酸序列為SEQ IDNo. 3所示)根據(jù)家蠶和多角體病毒密碼子偏好性進行改造，采取了調整了 GC含量及不宜峰(以延長mRNA的半衰期)、去除常用限制性內切酶位點以及原始序列中含有串聯(lián)的稀有密碼子(減少翻譯序列甚至解除翻譯裝置)，破除那些影響mRNA穩(wěn)定性及其與核糖體結合的莖環(huán)結構等一系列優(yōu)化手段，得到優(yōu)化后的芋螺毒素基因(aACTl)，其核苷酸序列為SEQ ID No. 2所示，本發(fā)明進一步的在SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的5’端加上BamHI酶切位點和kozak序列，3’端加上EcoRI，得到SEQIDNo. 4所示的核苷酸序列。優(yōu)化后的芋螺毒素a ACTl基因能夠在家蠶等昆蟲宿主或細胞中高效表達具有生物學活性的芋螺毒素。本發(fā)明進一步提供了一種芋螺毒素的生物學制備方法，該方法包括以下步驟(I)將芋螺毒素基因克隆到桿狀病毒運載載體的表達盒中，構建得到重組轉移表達載體；(2)將所構建的重組轉移表達載體與桿狀病毒DNA共轉染昆蟲細胞，獲得重組桿狀 病毒；(3)用重組桿狀病毒感染昆蟲宿主或昆蟲細胞；培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主表達有活性的芋螺毒素；收獲并純化所表達的產物(即芋螺毒素)，即得。其中，所述的芋螺毒素基因的核苷酸序列可以是任何一種芋螺毒素基因的核苷酸序列，例如可以是α-芋螺毒素、μ-芋螺毒素、ω-芋螺毒素或δ-芋螺毒素中的任意一種；優(yōu)選為α -芋螺毒素，更優(yōu)選為SEQ ID NO :I所示的原始的芋螺毒素a ACT基因或SEQID NO :2所示的優(yōu)化后的芋螺毒素a ACTl基因，最優(yōu)選為SEQ ID NO :2所示的優(yōu)化后的芋螺毒素ct ACTl基因。本發(fā)明中所述的桿狀病毒運載載體的表達盒包括啟動子和增強子；所述的啟動子優(yōu)選為多角體蛋白啟動子、PlO啟動子或ie-l啟動子中的任意一種。本發(fā)明中所述的桿狀病毒選自BmNPV、AcMNPV, ApNPV, HaNPV, HzNPV, LdMNPV,MbMNPV,OpMNPV,SIMNPV,SeMNPV或SpltNPV中的任意一種；優(yōu)選的，所述桿狀病毒為家蠶桿狀病毒BmNPV，進一步優(yōu)選為家蠶桿狀病毒親本株Bm-NPV-ZJ8。本發(fā)明中所述的昆蟲宿主選自家蠶(Bombyx mori)、野蠶(Bombyx mandarina)、蓖麻香(Philosamia cynthia ricim)、樟香(Dictyoploca japanica)、樗香(Philosamiacynthia pryeri)、作香(Antheraea pernyi)、日本作香(Antheraea yamamai)、野天香(Antheraea polyphymus)、苜猜尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropisobliqua)、甘蘭夜蛾(Mamestra brassicae)、斜紋夜蛾(Spodoptera Iittoralis)、秋粘蟲(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)、行軍蟲(Thaumetopoeawilkinsoni) > 棉鈴蟲(Heliothis armigera) > 美國棉鈴蟲(Heliothis zea)、煙青蟲(Heliothis assulta)、煙草夜蛾(Heliothis virescens)、東方粘蟲(Pseudaletiaseparata)或舞毒蛾(Lymantria dispar);優(yōu)選的,所述桿狀病毒的昆蟲宿主為家蠶。本發(fā)明中所述的感染是將重組桿狀病毒通過口食來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體；優(yōu)選的，所述的感染是將重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細胞或將重組家蠶桿狀病毒穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲或蛹體，在感染3-6天后收集家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻漿，對樣品用超聲波破碎，然后5，OOOrpm離心3min，酸或溫度處理，經(jīng)O. 22微米濾膜過濾等，得芋螺毒素制品；其中，所述的蛹體優(yōu)選為1-2天的早期嫩蛹。本發(fā)明通過同源重組的方式將芋螺毒素原始基因或優(yōu)化后的芋螺毒素基因重組到桿狀病毒中獲得重組桿狀病毒；再將重組桿狀病毒感染家蠶，以家蠶作為生物反應器，在家蠶中高效表達具有鎮(zhèn)痛、神經(jīng)修復或毒癮戒斷等藥理活性的芋螺毒素產物。本發(fā)明方法采用桿狀病毒表達系統(tǒng)在昆蟲個體生物反應器中安全、高效的生產有活性的芋螺毒素，所制備的毒素純化后，安全性極高，可直接用于鎮(zhèn)痛等用途。本發(fā)明制備芋螺毒素的方法具有表達效率高、后加工完備、生物活性好、生產成本低、可實現(xiàn)規(guī)?；a等優(yōu)點。將有效量的本發(fā)明所制備的芋螺毒素與藥學上可接受的輔料或載體配伍在一起能夠獲得鎮(zhèn)痛、神經(jīng)修復或戒斷毒癮的藥物組合物。本發(fā)明所述的藥物組合物可以按照本領域的常規(guī)制備方法將其成臨床上可接受的藥物制劑，如口服制劑或注射制劑。作為一種優(yōu)選的實施方案，可以將本發(fā)明有效量的芋螺毒素與脂肪酸相混合，經(jīng)超聲波乳化后制備成口服制劑。所述脂肪酸在口服制劑中的終濃度為25-35% (g/ml)(更優(yōu)選為30%)，余量為純化的芋螺毒素溶液；其中，所述的脂肪 酸優(yōu)選由棕櫚酸、油酸和硬脂酸組成。


圖lpVL1393 示意圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。實驗材料I.菌株、病毒株與載體大腸桿菌株Bmbacmid和BmNPV的構建方法見有關文獻(發(fā)明專利申請
發(fā)明者張志芳, 李軼女, 易詠竹, 劉興健, 鄭學星, 邊大勇, 王國增, 江峰, 鐘魯龍 申請人:中國農業(yè)科學院生物技術研究所