專利名稱：：ω芋螺毒素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的co-芋螺毒素肽，更具體而言，涉及新的co-芋螺毒素肽和其用途以及提高co-芋螺毒素與N-型鈣通道的結(jié)合可逆性的方法。
背景技術(shù)：
：雞心螺(conesnail)代表使用毒液來(lái)獵食的海洋軟體動(dòng)物的多樣家族。各種類的毒液包含超過(guò)100種肽的獨(dú)特組合，其藥物潛力在很大程度上依舊是未被開(kāi)發(fā)的。不同種類的芋螺毒素已進(jìn)化成靶離子通道和受體，用于成功捕獲魚(yú)、軟體動(dòng)物或蟲(chóng)[1-6]。重要的一類，從食魚(yú)物種中分離的co-芋螺毒素，抑制在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元電壓敏感鈣通道(VSCC)。co-芋螺毒素具有N-型或P/Q-型VSCC的選擇性，這樣廣泛使用它們作為研究工具來(lái)闡明神經(jīng)元VSCC的分布和作用[7]。除它們作為研究工具的用途之外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已顯示靶向N-型VSCC的co-芋螺毒素在缺血性腦損傷和疼痛方面具有臨床潛力。然而，盡管co-芋螺毒素的選擇性和潛力以及突觸處的N-型VSCC在脊髓中傳遞傷害性信息的顯著作用，但是目前可用的co-芋螺毒素不是理想的治療劑。例如，強(qiáng)N-型VSCC選擇性阻斷劑，GVIA，從N-型VSCC緩慢分離，并因此難以在臨床環(huán)境中施用[8]。另一種co-芋螺毒素MVIIA引起多種原因不明的神經(jīng)副作用[9-11]。已報(bào)道，與對(duì)外周N-型亞型相比，MVIIA對(duì)中樞N-型亞型的特異性更高，盡管外周N-型亞型直接作用于疼痛信號(hào)。與對(duì)中樞亞型相比，CVID對(duì)外周亞型的選擇性更高，因此，CVID的副作用比MVIIA的副作用少[12-14]。其它的co-芋螺毒素對(duì)N-型VSCC的選擇性較低并且不被認(rèn)為是有用的治療候選者。在N-型VSCC阻斷劑的殘基掃描實(shí)驗(yàn)時(shí)，Tyr13、Lys2、Arg，Leu11、Arg21、N末端和C末端酰胺對(duì)與通道的親和性是重要的[7,15]。近來(lái)，已報(bào)道，Arg"對(duì)分子的可逆性具有重要作用。用Lys"替換Arg^顯著降低可逆性[14]。雖然可逆性與親和性密切相關(guān)，但是這兩種性質(zhì)的分離是可能的[16]。并且可逆性的改進(jìn)使其能夠成為更好的止痛藥。貫穿本申請(qǐng)，各種專利和出版物作為參考并且在括號(hào)內(nèi)給出引用出處。為了更加全面地描述本發(fā)明以及本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的狀況，在此通過(guò)引用方式將這些專利和出版物的公開(kāi)內(nèi)容全部并入本申請(qǐng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明人己進(jìn)行了深入研究以開(kāi)發(fā)出克服與常規(guī)co-芋螺毒素有關(guān)的問(wèn)題(尤其是與N-型鈣通道的低特異性以及低可逆性)的新的co-芋螺毒素。結(jié)果，我們已經(jīng)從韓國(guó)紫霞芋螺(Com^F/"W^^)中分離出了新的co-芋螺毒素，這種新的co-芋螺毒素完全沒(méi)有常規(guī)芋螺毒素的兩個(gè)缺點(diǎn)并且還顯示出作為N-型鈣通道的阻斷劑的顯著活性。另外，我們已經(jīng)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究以揭示新的co-芋螺毒素的結(jié)構(gòu)和功能，從而闡明co-芋螺毒素的可逆性的關(guān)鍵氨基酸殘基。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種提高co-芋螺毒素與N-型鈣通道的結(jié)合可逆性的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種分離的、合成的或重組的co-芋螺毒素肽。本發(fā)明的還一目的是提供一種編碼co-芋螺毒素肽的核酸分子。本發(fā)明的又一目的是提供一種預(yù)防或治療與N-型鈣通道活性有關(guān)的疾病、障礙或狀態(tài)的藥物組合物。本發(fā)明的再一目的是提供一種在被試者中預(yù)防或治療與N-型鈣通道活性有關(guān)的疾病、障礙或狀態(tài)的方法。本發(fā)明的另一目的是提供co-芋螺毒素用于制備預(yù)防或治療與N-型鈣通道活性有關(guān)的疾病、障礙或狀態(tài)的藥物的用途。連同所附權(quán)利要求書(shū)和附圖，從以下詳述的說(shuō)明中，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯。圖1A和1B表示線性、環(huán)化的(圖1A)以及純化的FVIA(圖1B)的反相HPLC色譜圖。環(huán)化條件線性肽0.02mM，GSSG0.1mM，GSH1mM，1mMEDTA,50mMNH4OAc,以及1M(NH4)2S04(pH7.8)。圖2A和2B表示FVIA(圖2A)及其類似物(圖2B)的CD光譜。以包括a6螺旋、反平行的卩折疊、平行的P折疊、(3轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則的五個(gè)主要二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)光譜為基礎(chǔ)，F(xiàn)VIA具有P轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)或反平行的卩折疊。氧化折疊適當(dāng)形成FVIA的二級(jí)結(jié)構(gòu)[18]。在圖2B中，D類似物、LM類似物、FM嵌合體和MF嵌合體分別對(duì)應(yīng)于表4中的FVIA[N14D]、FVIA[I11L,A12M]、嵌合體-FMFF和嵌合體-MFMM。圖3為MVIIA(A幅)和FVIA(B幅)的劑量抑制曲線。劑量范圍為0.1nMlpM。兩幅圖都顯示S形曲線并且在O.lpM飽和。各肽的ICso值分別為7.96±1.59nM和11.5±1.4nM。圖4為MVIIA(A幅)和FVIA(B幅)的電流電壓曲線。這些圖顯示電流抑制而沒(méi)有水平曲線移位。圖5為FVIA和MVIIA的恢復(fù)曲線。實(shí)線箭頭表示1芋螺毒素施用而虛線箭頭表示用緩沖液洗出。圖6表示在FVIA中觀察到的連續(xù)和中間范圍NOE連通(NOEconnectionvities)、4順.0^偶合和緩慢交換主鏈NH質(zhì)子的概括。這些結(jié)構(gòu)參數(shù)用于co-芋螺毒素FVIA中的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的序列特異性排布和鑒定。根據(jù)實(shí)心帶(filledbar)的高度，NOE分為強(qiáng)、中、弱和非常弱。實(shí)心圓(filledcircle)^8Hz)和開(kāi)環(huán)(openedcircle)5.5Hz)符號(hào)表示3JNH.Ca偶合常數(shù)的值。值為-l、0和+l的三進(jìn)制指數(shù)表示化學(xué)移位指數(shù)。-1和+1的值分別表示在高磁場(chǎng)和低磁場(chǎng)下從無(wú)規(guī)巻曲值的移位偏差大于0.1p.p.m.，而在無(wú)規(guī)巻曲值的范圍內(nèi)的那些表示為0。圖7A和7B表示FVIA與MVIIA主鏈結(jié)構(gòu)比較(A幅)以及FVIA和MVIIA在可逆性方面有效的殘基的位置(B幅)。在圖7B中，長(zhǎng)方形表示MVIIA的主要活性殘基。圖8A和8B表示通過(guò)甩尾試驗(yàn)(A幅)和足底痛覺(jué)試驗(yàn)(B幅)檢測(cè)的FVIA的鎮(zhèn)痛作用。記錄觀察到退縮行為的時(shí)間。圖9A、9B和9C表示FVIA對(duì)谷氨酸鹽(A幅)、物質(zhì)P(B幅)或乙酸(C幅)誘發(fā)的疼痛的鎮(zhèn)痛作用。柱，平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差；*，與對(duì)照相比的P值(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。圖10A和10B表示FVIA對(duì)5。/。福爾馬林注射誘發(fā)的疼痛的鎮(zhèn)痛作用。圖IOB表明FVIA的劑量依賴效應(yīng)。柱，平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差；*，與對(duì)照相比7的P{t(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。圖11A和11B表示FVIA在腿神經(jīng)損傷的神經(jīng)性疼痛模型中的鎮(zhèn)痛作用。鞘內(nèi)注射0.1ngFVIA。圖IIB是對(duì)應(yīng)于圖11A的結(jié)果的n/。MPE曲線圖。圖12A、12B和12C表示FVIA在尾神經(jīng)損傷的神經(jīng)性疼痛模型中的鎮(zhèn)痛作用。在神經(jīng)損傷操作14天之后，評(píng)價(jià)FVIA對(duì)機(jī)械性痛敏(A幅)、冷痛敏(B幅)和熱痛敏(C幅)的鎮(zhèn)痛作用。如果P值與FVIA注射前的值相比小于0.05，則用符號(hào)*表示。右方曲線圖是對(duì)應(yīng)于圖12A12C的結(jié)果的。/。MPE曲線圖。圖13表示在靜脈內(nèi)施用100嗎FVIA或MVIIA之后測(cè)量的平均動(dòng)脈壓(MAP)。柱，平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差；*，與對(duì)照相比的P值C^P〈0.05,^P〈0.01，***P<0.001)。具體實(shí)施例方式在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種提高co-芋螺毒素與N-型鈣通道的結(jié)合可逆性的方法，該方法包括制備第11和/或12位氨基酸為lie和/或Ala殘基的o)-芋螺毒素，所述殘基分別位于下列通式I所示的co-芋螺毒素的第2半胱氨酸殘基與第3半胱氨酸殘基之間的第二環(huán)內(nèi)，以使所制備的co-芋螺毒素與N-型鈣通道具有提高的結(jié)合可逆性通式Is-Cys-Xaaio-Xaa)!-Xaai2-Cys-Xaai3-Xaa'4-Xaa,5-Xaa,6-Cys其中，XaaiXaa16表示任意氨基酸殘基。本發(fā)明人已進(jìn)行了深入研究以開(kāi)發(fā)出克服與常規(guī)co-芋螺毒素有關(guān)的問(wèn)題(尤其是與N-型鈣通道的低特異性以及低可逆性)的新的o)-芋螺毒素。結(jié)果，我們已經(jīng)從韓國(guó)紫霞芋螺中分離出了新的co-芋螺毒素，這種新的co-芋螺毒素完全沒(méi)有常規(guī)芋螺毒素的兩個(gè)缺點(diǎn)并且還顯示出作為N-型鈣通道的阻斷劑的顯著活性。另外，我們已經(jīng)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究以揭示新的co-芋螺毒素的結(jié)構(gòu)和功能，從而闡明co-芋螺毒素的可逆性的關(guān)鍵氨基酸殘基。雖然此處用一種提高co-芋螺毒素與N-型鈣通道的結(jié)合可逆性的方法表達(dá)本方法，但是可以用一種制備與N-型鈣通道的結(jié)合可逆性提高的co-芋螺毒素的方法來(lái)替代表達(dá)它。8本文所用術(shù)語(yǔ)"可逆性"或"結(jié)合可逆性"用來(lái)表示co-芋螺毒素與N-型鈣通道的解離速率。通常通過(guò)如實(shí)施例中所述的洗出實(shí)驗(yàn)分析CO-芋螺毒素的可逆性。術(shù)語(yǔ)"可逆性"與"恢復(fù)"之間沒(méi)有區(qū)別并且這些術(shù)語(yǔ)將交替在本文中使用。雖然已經(jīng)提出了強(qiáng)烈抑制N-型鈣通道的CO-芋螺毒素，但是它們通常顯示出與N-型^通道較差的結(jié)合可逆性，從而在向哺乳動(dòng)物施用時(shí)很可能誘發(fā)副作用或不良作用，這樣嚴(yán)重限制向人施用他們。本發(fā)明旨在通過(guò)提供具有極大增強(qiáng)了的可逆性的新的co-芋螺毒素來(lái)克服常規(guī)芋螺毒素(例如，GVIA和MVIIA)的這些缺點(diǎn)。另外，本發(fā)明的(D-芋螺毒素對(duì)N-型鈣通道具有優(yōu)異的阻斷能力和特異性。同樣地，本發(fā)明的(D-芋螺毒素在可逆性和離子通道抑制活性兩方面的優(yōu)越性的理論基礎(chǔ)是以下科學(xué)發(fā)現(xiàn)雖然結(jié)合可逆性與親和性密切相關(guān)，但是這兩種性質(zhì)可以被分開(kāi)[16]。對(duì)本發(fā)明的co-芋螺毒素的可逆性至關(guān)重要的氨基酸殘基位于通式I中第11和12位氨基酸。如在實(shí)施例中清楚顯示，只有當(dāng)co-芋螺毒素的第ll和12位氨基酸分別為lie和/或Ala殘基時(shí)，它們才與N-型鈣通道顯示出顯著高的可逆性。例如，在用相似的含有R基的Leu和Met分別替換Ile和Ala的情況下，co-芋螺毒素顯示極大降低的可逆性。多種先前發(fā)表的報(bào)告已提出Leu位于co-芋螺毒素的第11位氨基酸是造成其離子通道抑制活性較強(qiáng)的原因。相反，根據(jù)本發(fā)明，第ll位氨基酸為Ile而不是Leu的(o-芋螺毒素不僅顯示出與常規(guī)co-芋螺毒素相似的阻斷活性,而且顯示出比常規(guī)co-芋螺毒素高得多的可逆性。關(guān)于這一點(diǎn)，本發(fā)明在o芋螺毒素技術(shù)方面提供新的范例取得了巨大進(jìn)步。在通式I中，六個(gè)Cys殘基是co-芋螺毒素的決定因素。另外，所示的Lys2、Gl/和Tyr"殘基對(duì)于co-芋螺毒素的離子通道抑制活性是重要的。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，六個(gè)Cys殘基全部形成三個(gè)二硫鍵。更優(yōu)選地，二硫鍵形成于第一Cys與第四Cys殘基之間、第二Cys與第五Cys殘基之間以及第三Cys與第六Cys殘基之間。這些二硫鍵結(jié)構(gòu)是co-芋螺毒素代表性的并且對(duì)co-芋螺毒素的活性至關(guān)重要。co-芋螺毒素的結(jié)構(gòu)代表性描述具有四個(gè)環(huán)9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>下劃線顯示四個(gè)環(huán)。本發(fā)明意在提供一種有趣的發(fā)現(xiàn)，位于第11和/或12位氨基酸的lie和/或Ala殘基與co-芋螺毒素與N-型鈣通道的可逆性有關(guān)，所述殘基分別位于第2個(gè)半胱氨酸殘基與第3個(gè)半胱氨酸殘基之間的第二環(huán)內(nèi)。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，位于第11和12位氨基酸的兩個(gè)殘基分別是Ile和Ala。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，Xaa,是Gly、Ala或Ser;Xaa2是Thr、Ala、Lys或Arg;Xaa3是Lys或Ala;Xaa4是Ser、Pro、羥脯氨酸或Lys;Xaas是Ser或Arg;Xaa6是Arg或Lys;Xaa9是Asn或Asp;Xaa10是Thr或Ser;Xaa,是Gly、Ala或Ser;Xaa12是Ser、Gly、Ala或Thr;Xaa13是Arg或GIy-Arg;Xaa"是Ser或Arg;Xaa。是Gly、Ala或Ser;以及Xaa16是Lys或Arg。更優(yōu)選地，Xaag是Arg，Xaa，3是Arg。根據(jù)更加優(yōu)選的實(shí)施方式，Xaa,是Gly或Ser;Xaa2是Thr或Lys;Xaa3是Lys或Ala;Xaa4是Ser或Lys;Xaa5是Ser或Arg;Xaa6是Arg;Xaa9是Asn或Asp;Xaa10是Thr;Xaan是Gly;Xaa,2是Ser;Xaa13是Arg;Xaa!4是Ser;Xaa15是Gly;以及Xaa16是Lys或Arg。根據(jù)更加優(yōu)選的實(shí)施方式，Xaa2是Thr或Lys;Xaa3是Lys或Ala;Xaa4是Ser或Lys;Xaa5是Ser或Arg;Xaa6是Arg;Xaa9是Asn或Asp;Xaaio是Thr;Xaau是Gly;Xaa!2是Ser;Xaa^是Arg;Xaa^是Ser;Xaais是Gly;以及Xaa16是Lys或Arg。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，與N-型鈣通道具有提高的結(jié)合可逆性的co-芋螺毒素包含SEQIDNO:1、2或3所述的氨基酸序列。具體地，根據(jù)本發(fā)明，用Ile和Ala分別替換MVIIA的第ll和12位氨基酸殘基制備具有SEQIDNO:2所述的氨基酸序列的co-芋螺毒素。如實(shí)施例中所示，該類似物不僅顯示似乎可能的鈣通道抑制活性，而且顯示比MVIIA高約2倍的恢復(fù)。根據(jù)最優(yōu)選的實(shí)施方式，與N-型鈣通道具有提高的結(jié)合可逆性的co-芋螺毒素包含SEQIDNO:l所述的氨基酸序列。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，通式I中的CO-芋螺毒素具有酰胺修飾的C-末端(Cys殘基)。在本發(fā)明的另一方面，提供分離的、合成的或重組的①-芋螺毒素肽，其中，該co-芋螺毒素肽的第2個(gè)半胱氨酸殘基與第3個(gè)半胱氨酸殘基之間的第二環(huán)包含下列通式II:通式IIXaa5-Xaa6-Ile-Ala-Tyr-Xaa9其中，XaasXaa6和Xaa9表示任意氨基酸殘基?；谖覀兊陌l(fā)現(xiàn)位于第二環(huán)的lie和Ala殘基對(duì)增強(qiáng)與N-型鈣通道的結(jié)合可逆性是重要的，提供本發(fā)明的co-芋螺毒素。優(yōu)選地，本發(fā)明的(D-芋螺毒素的第一、第三和第四環(huán)各自對(duì)應(yīng)于天然產(chǎn)生的co-芋螺毒素肽的環(huán)。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，Xaa5是Ser或Arg;Xaae是Arg或Lys;以及Xaa9是Asn或Asp。更優(yōu)選地，Xaa5是Ser;Xaa6是Arg;以及Xaa9是Asn。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的O)-芋螺毒素肽包含下列通式III所示的氨基酸序列通式IIICys-Lys-Xaai-Xaa2-Gly-Xaa3-Xaa4-Cys-Xaa5-Xaa6-Ile-Ala-Tyr-Xaa9-Cys-Cys-Xaa,。-Xaa,)-Xaai2-Cys-Xaa!3-Xaa!4-Xaa，5-Xaa，6-Cys其中，Xaa,是Gly或Ser;以及Xaa2Xaa6和Xaa9Xaa16是任意氨基酸殘基。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，通式III中的六個(gè)Cys殘基全部形成三個(gè)二硫鍵。更優(yōu)選地，二硫鍵形成于第一Cys與第四Cys殘基之間、第二Cys與第五Cys殘基之間以及第三Cys與第六Cys殘基之間。這些二硫鍵結(jié)構(gòu)是co-芋螺毒素代表性的并且對(duì)co-芋螺毒素的活性至關(guān)重要。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，Xaa2是Thr、Ala、Lys或Arg;Xaa3是Lys或Ala;Xaa4是Ser、Pro、羥脯氨酸或Lys;Xaa5是Ser或Arg;Xaae是Arg或Lys;Xaag是Asn或Asp;Xaa,o是Thr或Ser;Xaan是Gly、Ala或Ser;Xaa,2是Ser、Gly、Ala或Thr;Xaa,3是Arg或Gly-Arg;Xaa14是Ser或Arg;Xaa15是Gly、Ala或Ser;以及Xaa16是Lys或Arg。更優(yōu)選地，Xaa6是Arg;以及Xaa^是Arg。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，Xaa2是Thr或Lys;Xaa3是Lys或Ala;Xaa4是Ser或Lys;Xaa5是Ser或Arg;Xaa6是Arg;Xaa9是Asn或Asp;Xaa10是Thr;Xaan是Gly;Xaa,2是Ser;Xaau是Arg;Xaa]4是Ser;Xaa^是Gly;以及Xaa"是Lys或Arg。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施方式，Xaa2是Thr或Lys;Xaa3是Lys或Ala;Xaa4是Ser或Lys;Xaa5是Ser或Arg;Xaa6是Arg;Xaa9是Asn或Asp;Xaa10是Thr;Xaau是Gly;Xaa^是Ser;Xaa、3是Arg;Xaa4是Ser;Xaai5是Gly以及Xaa]6是Lys或Arg。根據(jù)還更優(yōu)選的實(shí)施方式，co-芋螺毒素包含SEQIDNO:1、2或3所述的氨基酸序列。更優(yōu)選地，本發(fā)明的co-芋螺毒素包含SEQIDNO:1所述的氨基酸序列。本發(fā)明的co-芋螺毒素包括其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸具有側(cè)鏈修飾的肽。側(cè)鏈修飾的實(shí)例包括氨基的修飾，如被還原垸基化；使用乙亞氨酸甲酯的脒基化(amidination);使用乙酸酐的?；皇褂们杷猁}的氨基甲氨?；皇褂?,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)的三硝基卞化；使用琥珀酸酐和四氫化鄰苯二甲酸酐的氨基酰化；以及使用吡哆醛-5-磷酸的賴氨酸吡哆醛化(pyridoxylation)并接著使用NaBH4還原。使用如2,3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛的試劑通過(guò)形成雜環(huán)縮合產(chǎn)物可以修飾精氨酸殘基的胍基。經(jīng)由O-?；?O-acylisourea)形成隨后衍生化(derivitisation)通過(guò)碳二亞胺活化可以修飾羧基，例如修飾成相應(yīng)的酰胺。通過(guò)以下方法可以修飾氫硫基(Sulphydrylgroup):例如，使用碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化作用；過(guò)甲酸氧化成磺基丙氨酸；與其它硫醇化合物形成混合的二硫化物；與馬來(lái)酰亞胺、馬來(lái)酸酐或其它取代的馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)；使用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、苯基氯化汞、2-氯汞基-4-硝基酚和其它汞制劑形成汞的衍生物；在堿性pH下使用氰酸鹽的甲氨?；饔?。半胱氨酸殘基的任何修飾必須不影響肽形成必需的雙硫鍵的能力。還可以用硒等效物替代半胱氨酸的氫硫基以使該肽形成二硒鍵(diseleniumbond)代替一個(gè)或多個(gè)雙硫鍵。例如，通過(guò)使用溴代琥珀酰亞胺的氧化或者使用2-羥基-5-硝基芐基溴化物或磺酸苯基鹵化物(sulphenylhalide)的吲哚環(huán)的垸基化可以修飾色氨酸殘基。另一方面，通過(guò)使用四硝基甲垸硝化可以將酪氨酸殘基改變形成3-硝基酪氨酸衍生物。通過(guò)使用碘乙酸衍生物的烷基化或者使用焦碳酸二乙酯的N-乙?；饔每梢詫?shí)現(xiàn)組氨酸殘基的咪唑環(huán)的修飾。例如，通過(guò)在第4位的羥基化可以修飾脯氨酸殘基。本發(fā)明的co-芋螺毒素與N-型鈣通道特異結(jié)合以阻斷離子通道。離子通道阻斷劑分為孔阻斷劑和閘門(mén)調(diào)節(jié)物。本發(fā)明的Q)-芋螺毒素屬于孔阻斷劑。本發(fā)明的co-芋螺毒素可以根據(jù)多種方法制備。例如，它可以通過(guò)基因克隆方法或固相合成技術(shù)制成。更具體而言，將編碼co-芋螺毒素的核苷酸序列轉(zhuǎn)化到適合的宿主細(xì)胞中并表達(dá)產(chǎn)生co-芋螺毒素肽(參見(jiàn)Sambrook，J.etal.，Mo/ecw/arC/om'"g.爿丄"6orato^jM朋wa/，3rded.ColdSpringHarborPress(2001》。或者，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的固相合成技術(shù)可以制備本發(fā)明的co-芋螺毒素(Merrifield，/^merC7ze肌5bc85:2149-54(1963);Stewart,etal"尸/zose/ep"VfeSyw^ew's,2nd.ed.,PierceChem.Co.:Rockford,111(1984》。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，通式I中的co-芋螺毒素具有酰胺修飾的C-末端(Cys殘基)。本發(fā)明的①-芋螺毒素對(duì)N-型鈣通道的阻斷活性和特異性顯示出似乎可能的性質(zhì)，并且極大提高了與N-型鈣通道的結(jié)合可逆性。'本發(fā)明的Q)-芋螺毒素對(duì)發(fā)炎性和神經(jīng)性疼痛具有優(yōu)異的治療效果。不同的是，本發(fā)明的co-芋螺毒素更少涉及對(duì)傷害性疼痛的鎮(zhèn)痛作用。因?yàn)閭π蕴弁词菍?duì)抗外部有害刺激的防御機(jī)制之一，所以過(guò)分抑制傷害性疼痛是不合乎需要的。本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知優(yōu)異的止痛藥物候選物顯示出對(duì)病理疼痛之一的發(fā)炎性和神經(jīng)性疼痛的選擇性緩解疼痛能力。在這些方面，本發(fā)明的co-芋螺毒素可突出成為有前途的的止痛藥物候選物。除此之外，如在實(shí)施例中所示，本發(fā)明的CO-芋螺毒素副作用小或無(wú)副作用，在這些方面，其極大提高了與N-型鈣通道的結(jié)合可逆性而對(duì)心血管系統(tǒng)的影響更小。在本發(fā)明的還一方面，提供一種包含編碼SEQIDNO:l的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子。本文中所用術(shù)語(yǔ)"核酸分子"指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚體(包括gDNA、cDNA和mRNA)，除另外指出外，包括已知的天然核苷酸的類似物(Scheit,A^c/eo^/e爿"a/ogs，JohnWiley,NewYork(1980);UhlmanandPeyman,ChemicalReviews,90:543-584(1990))。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，編碼本發(fā)明的(D-芋螺毒素的核酸分子包含SEQIDNO:4所述的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供一種攜帶包含編碼SEQIDNO:l的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子的載體。根據(jù)如Sambrook等人，分f克虔，實(shí)邀手I，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版物(2001)所述的本領(lǐng)域已知方法，可以構(gòu)建本發(fā)明的載體系統(tǒng)，將其通過(guò)引用方式并入本申請(qǐng)。通常，可以構(gòu)建用于克隆或表達(dá)的載體。另外，可以構(gòu)建在原核或真核宿主細(xì)胞中使用的載體。例如，在構(gòu)建用于原核細(xì)胞中表達(dá)的載體時(shí)，它通常攜帶用來(lái)起始轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子(例如，尸/啟動(dòng)子、尸/啟動(dòng)子、rac5啟動(dòng)子、kUV5啟動(dòng)子、/p/啟動(dòng)子、化;？啟動(dòng)子、amp啟動(dòng)子、red啟動(dòng)子、SP6啟動(dòng)子、/ac啟動(dòng)子、toc啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)或者翻譯起始以及轉(zhuǎn)錄/翻譯終止序列。尤其，在使用￡.co/!'作為宿主細(xì)胞時(shí)，可以利用五.co//中色氨酸生物合成操縱子中的啟動(dòng)子和操縱基因(Yanofsky，C.,J5a"m'o/.，158:1018-1024(1984))和A噬菌體的左向啟動(dòng)子(尸/promoter，Herskowitz,I.andHagen,D.,爿wiZev.14:399-445(1980))作為控制序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員己知用于原核細(xì)胞的很多常規(guī)載體，并且合適載體的選擇只是挑選問(wèn)題。本發(fā)明中使用的常規(guī)載體包括pSC101、pGV1106、pACYC177、ColEl、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFRl、pHV14、pGEX系列、pET系列、pUC19、Agt4AB、A-卡隆、義Azl和M13，但不限于此。例如，在構(gòu)建用于真核宿主細(xì)胞(特別是動(dòng)物細(xì)胞)的表達(dá)載體時(shí)，可以使用源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(例如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或者源于哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(例如，腺病毒后期啟動(dòng)子；痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子、SV40啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子和HSV汰^動(dòng)乃。載體通常包含轉(zhuǎn)錄物的多腺苷酸化位點(diǎn)。商用的基于病毒的載體的實(shí)例包括pcDNA3(Invitrogen;包含巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子和多腺苷酸化信號(hào))、pSI(Promega;包含SV40啟動(dòng)子和多腺苷酸化信號(hào))、pCI(Promega;包含巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子和多腺苷酸化信號(hào))和pREP7(Invitrogen;RSV啟動(dòng)子和SV40多腺苷酸化信號(hào))。另外，本發(fā)明的表達(dá)載體進(jìn)一步包含方便純化所表達(dá)的融合蛋白的核苷酸序列，該核苷酸序列包括但不限于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Pharmacia,USA)、麥芽糖結(jié)合蛋白(NEB，USA)、FLAG(IBI，USA)禾B6XHis(六組氨酸；Quiagen,USA)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，用親合色譜法純化融合蛋白。例如，在使用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的情況下，采用包含谷胱甘肽的洗脫緩沖液，而在使用6XHis的情況下，通常采用Ni-NTAHis結(jié)合樹(shù)脂(Novagen,USA)以快速可行的方式純化目的融合蛋白。優(yōu)選地，本發(fā)明的表達(dá)載體攜帶一個(gè)或多個(gè)能夠篩選轉(zhuǎn)化的宿主的標(biāo)記，例如，帶有對(duì)如氨芐西林、慶大霉素(gentamycine)、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、新霉素、遺傳霉素和四環(huán)素的抗生素抗性的基因；URA3基因；帶有對(duì)如某金屬離子的任意其它有毒化合物抗性的基因。在本發(fā)明的還一方面，提供一種包含所述載體的轉(zhuǎn)化體。本領(lǐng)域技術(shù)人員已眾所周知用于制備轉(zhuǎn)化體的宿主。例如，作為原核宿主，可以采用￡co//JM109、￡.coZ/BL21、五.co"RR1、￡.co//LE392、￡.co//B、五.co/ZX1776、co//W3110、棍教藩、i云金芽逸/f蘑、氏^"、/^^沙^^慮和各種假單胞菌屬、^^/f，卩^"^^W。作為真核細(xì)胞，可以使用酵母(J^^",鉤、昆蟲(chóng)細(xì)胞、人細(xì)胞(例如，CHO、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN和MDCK細(xì)胞系)和植物細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法可以進(jìn)行宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。例如，在使用原核細(xì)胞作為宿主的情況下，可以使用CaCl2方法(Cohen,S.N.etal.,Ato/.Jcac.Sc/.9:2110-2114(1973))、Hanahan方法(Cohen,S.N.etal.，Ato/.y4cac9:2110-2114(1973);和Hanahan,D.,/Mo/,S/o/.,166:557-580(1983))和電離子透入法(Dower,W丄etal.,A^c/e/c.fAi仏，16:6127-6145(1988))進(jìn)行轉(zhuǎn)化。同樣，在使用真核細(xì)胞作為宿主的情況下，可以使用顯微注射(Capecchi,M.R.,Ce〃，22:479(1980))、磷酸鈣沉淀(Graham,F丄.etal,,P7ra/ogy,52:456(1973))、電離子透入法(Neumann,E.etal.,EMSOJ,1:841(1982))、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wong,T.K.etal"G匿,10:87(1980))、DEAE-葡聚糖處理(Gopal,M/.Ce〃5/o/.，5:1188-1190(1985))和粒子轟擊(Yangetal.,A^/.Jew/.Sc/.，87:9568-9572(1990))進(jìn)行轉(zhuǎn)化。宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體表達(dá)目的"-芋螺毒素。例如，如果表達(dá)載體攜帶啟動(dòng)子，可以使用IPTG(異丙基-e-D-硫代半乳糖苷(is叩ropyl-e-D-thiogalactopyranoside))誘導(dǎo)表達(dá)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種預(yù)防或治療與N-型鈣通道活性有關(guān)的疾病、障礙或狀態(tài)的藥物組合物，該組合物包含(a)治療有效量的本發(fā)明的co-芋螺毒素和(b)可藥用載體。在本發(fā)明的又一方面，提供一種在被試者中預(yù)防或治療與N-型鈣通道活性有關(guān)的疾病、障礙或狀態(tài)的方法，該方法包括向需要這種治療的被試者施用包含(a)治療有效量的本發(fā)明的Q)-芋螺毒素和(b)可藥用載體的藥物組合物。在本發(fā)明的另一方面，提供本發(fā)明的co-芋螺毒素用于制備預(yù)防或治療與N-型鈣通道活性有關(guān)的疾病、障礙或狀態(tài)的藥物的用途。因?yàn)楸舅幬锝M合物包含上述本發(fā)明的co-芋螺毒素，所以省略它們之間的一般說(shuō)明從而避免過(guò)度冗余而導(dǎo)致本說(shuō)明書(shū)太復(fù)雜。本發(fā)明的藥物組合物可以用于預(yù)防或治療與N-型鈣通道活性有關(guān)的各種疾病、障礙或狀態(tài)。N-型鈣通道的障礙或不合需要的活性引起與N-型鈣通道活性有關(guān)的各種疾病、障礙或狀態(tài)。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，本藥物組合物預(yù)防或治療的疾病、障礙或狀態(tài)為慢性疼痛狀態(tài)，例如神經(jīng)性疼痛、糖尿病外周神經(jīng)病變、皰疹后神經(jīng)痛、三叉神經(jīng)痛、AIDS有關(guān)的神經(jīng)病變、腫瘤疼痛、發(fā)炎性疼痛、骨關(guān)節(jié)炎疼痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疼痛和纖維肌痛；急性疼痛；術(shù)后疼痛；心境障礙；焦慮障礙，例如泛發(fā)的焦慮障礙、社會(huì)性焦慮障礙、驚恐性障礙、強(qiáng)制性障礙和創(chuàng)傷后緊張綜合病征；抑郁；成癮障礙，例如可卡因依賴和戒斷癥狀、類阿片依賴和戒斷癥狀、酒精依賴和戒斷癥狀以及尼古丁依賴和戒斷癥狀；胃腸疾病，例如腸炎疾病和過(guò)敏性腸綜合征；以及生殖泌尿疾病，例如尿失禁、間質(zhì)性大腸炎和性功能障礙；與低氧、缺氧或局部缺血有關(guān)的神經(jīng)毒性損傷，例如與中風(fēng)、腦血管意外、腦或脊髓外傷、心肌梗塞、物理外傷、溺、窒息、產(chǎn)期昏厥或血糖過(guò)低事件有關(guān)的神經(jīng)毒性損傷。最優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物用于緩解各種疼痛。特別是，針對(duì)發(fā)炎性或神經(jīng)性疼痛施用所述藥物組合物強(qiáng)于傷害性疼痛。在本發(fā)明的藥物組合物中包含的可藥用載體是通常在藥物配方中使用的，其包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡膠(rubberarable)、磷酸鉀、精氨酸鹽(arginate)、明膠、硅酸鉀、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖槳、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包含潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、甜味劑、調(diào)味劑、乳化劑、混懸劑和防腐劑。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可經(jīng)口或腸胃外給藥。對(duì)于非口服給藥，可以使用靜脈內(nèi)注射、皮下注射、鞘內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、大腦內(nèi)注射和肌內(nèi)注射。本發(fā)明的藥物組合物的適合的劑量可根據(jù)藥物配制方法，給藥方法，患者的年齡、體重、性別、發(fā)病狀態(tài)、飲食，給藥時(shí)間，給藥途徑，排泄率及對(duì)所用藥物組合物的敏感性而變化，并且本領(lǐng)域的普通技術(shù)醫(yī)師可以確定所需治療的藥物組合物的有效量。通常，用于人宿主的合適的劑量單位為以0.0001100mg/kg(體重)的量施用藥物組合物。本文連同co-芋螺毒素使用的術(shù)語(yǔ)"治療有效量"指預(yù)防或治療上文所述的與N-型鈣通道活性有關(guān)的疾病、障礙或狀態(tài)的足夠的劑量。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的常規(guī)技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明的包含重組腺病毒的藥物組合物可以用如上所述的可藥用載體和/或賦形劑配制，最終提供幾種形式的單劑量型和多劑量型。所述制劑的非限定性實(shí)例包括但不限于在油或水介質(zhì)中的溶液劑、混懸劑或乳劑，浸膏劑，酏劑，粉劑，顆粒劑，片劑和膠囊劑，并且可進(jìn)一步包含分散劑或穩(wěn)定劑。本發(fā)明的藥物組合物具有似乎可能的對(duì)N-型鈣通道的阻斷活性和對(duì)N-型鈣通道的特異性，并且極大提高與N-型鈣通道的結(jié)合可逆性。此外，該藥物組合物對(duì)與失調(diào)的N-型鈣通道活性有關(guān)的許多障礙和狀態(tài)(優(yōu)選地，疼痛)具有極好的治療效果。除此之外，如實(shí)施例中所述，本發(fā)明的藥物組合物具有很小的副作用或沒(méi)有副作用，在這些方面，其極大提高了與N-型鈣通道的結(jié)合可逆性而對(duì)心血管系統(tǒng)的影響更小。關(guān)于這些，本發(fā)明的藥物組合物可突出成為有前途的藥物的候選物，尤其是止痛藥物候選物?，F(xiàn)將通過(guò)實(shí)施例更加詳細(xì)描述本發(fā)明。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，這些實(shí)施例用來(lái)更加具體地解釋本發(fā)明在所附權(quán)利要求書(shū)中所述的范圍而不限于實(shí)施例或被實(shí)施例限制。實(shí)施例材料和方法從韓國(guó)濟(jì)州島的海岸收集紫靂^^凝。用30%乙酸/水提取毒液管、齒舌囊和壺腹內(nèi)容物并離心。使用前將上清液凍干并在-20°C儲(chǔ)存。在使用線性梯度為1%的溶劑B超過(guò)65分鐘(溶劑A100%H20，溶劑B包含0.1%三氟乙酸的100%乙腈)以14ml/分鐘洗脫的半制備的RP-HPLC柱(25X250mmC18,shimpack)上分餾一部分毒液粗提物。將毒液粗提物分成8部分，并且用RP-HPLC進(jìn)一步純化第三和第五部分。使用MALDI-MS(Shimadzu)測(cè)定肽的分子質(zhì)量。使用a-氰基-4-羥基肉桂酸作為基質(zhì)制備樣品。使用血管緊縮素進(jìn)行外部校準(zhǔn)。在加入1M4-乙烯吡啶存在的烷基化(RT進(jìn)行1小時(shí))之前，在40mMDTT禾B50mM碳酸氫銨pH7.5存在下還原該純化的肽(5(TC進(jìn)行30分鐘)。通過(guò)Edman化學(xué)在Procise491蛋白測(cè)序系統(tǒng)(AppliedBiosystem)上序列分析之前，用RP-HPLC再純化該烷基化肽?；l(xiāng)腦游分庸將chelyconusfulmen的冷凍組織(O.lg)加入到1ml細(xì)胞裂解緩沖液和硫氰酸胍(guanidiumthiocyanate)/EDTA/肌氨酰(GES)試劑中并且用玻璃勻槳器研磨。在室溫下在13,000rpm離心該混合物15分鐘并且將上清液用酚抽提一次且用氯仿抽提一次。由此得到的提取物在4°C在13,000rpm離心15分鐘。將無(wú)色的上部水相移至新試管中，用相同體積的異丙醇沉淀DNA以及在微量離心機(jī)內(nèi)以13,000rpm離心10分鐘。用70%乙醇洗滌并干燥片狀沉淀。然后，通過(guò)加入50微升10mMTris-HCl(pH8.5)再懸浮該片狀沉淀。使用作為模板的基因組DNA和引物通過(guò)T叫DNA聚合酶擴(kuò)增芋螺毒素肽基因。引物中，基于在co-芋螺毒素前多肽原的毒素區(qū)域之前的內(nèi)含子3'端設(shè)計(jì)5，引物5'-CTCTCTCTCTCTCTGCTGGAC-3'。基于co-芋螺毒素前多肽原的3'UTR序歹U設(shè)計(jì)3'引物5'-CAGAAAAGGATAGAGCACAGAAGG-3'。PCR條件為94°C，30秒；55°C，30秒；和70。C,45秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。使用高純PCR產(chǎn)物純化試劑盒(RocheDiagnostics)純化擴(kuò)增的DNA片段。將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pGEMT-easy載體(Promega)上并通過(guò)電穿孔導(dǎo)入(JM109)。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞平鋪到包含氨節(jié)西林的LB培養(yǎng)皿上并在37。C培養(yǎng)24小時(shí)以篩選克隆。從培養(yǎng)的克隆中分離質(zhì)粒并使用￡CORI消化來(lái)制備用于測(cè)序的300400bpDNA片段。靜使用ABIPRISM377自動(dòng)DNA測(cè)序儀(PERKINELMER)分析上述克隆的芋螺毒素cDNA的核苷酸序列。測(cè)序后，將沒(méi)有載體序列和引物序列的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列。我們確定了編碼w-芋螺毒素-特異半胱氨酸排布的核苷酸序列為chelyconusfulmen的芋螺毒素基因。,會(huì)成在AppliedBiosystem模型433A肽合成儀上進(jìn)行肽合成。通過(guò)起始于FmOC-NH2-Alko樹(shù)脂并且使用多種用于氨基酸保護(hù)的保護(hù)基團(tuán)的固相Fmoc化學(xué)合成FVIA的線性前體。在用三氟乙酸分裂后，用2M乙酸提取粗的線性肽，稀釋至最終肽濃度為在用NH4OH水溶液調(diào)節(jié)至pH8.0的0.33M乙酸銨、0.5M胍-HCl和2mM還原的/0.2mM氧化的谷胱甘肽的溶液中20uM，并且在4'C緩慢攪拌5天。用HPLC監(jiān)控折疊反應(yīng)。通過(guò)用CM-纖維素CM-52的連續(xù)色譜法和具有d8二氧化硅柱子的制備級(jí)HPLC純化粗的氧化產(chǎn)物。通過(guò)分析級(jí)HPLC和MALDI-TOF-MS測(cè)量法確定FVIA的純度。在JASCOJ-710分光旋光計(jì)上使用路徑長(zhǎng)度1mm的石英皿，在190250nm在濃度為0.05mM的20'C溶液(水中0.01M磷酸鈉，pH7.0)中測(cè)量CD光譜。所得的光譜為在20nm/分鐘的掃描速度下4次掃描的平均值。光譜以deg.cmldmor1表示成分子橢圓率(molecularellipticity)[8][18,19]。^遞遭冶魔游給f遝記錄在室溫使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)完成電生理記錄。將具有34MQ電阻的硼硅玻璃電極拔出并用Sylgard涂敷。對(duì)于N-型(^2+電流的記錄，采用標(biāo)準(zhǔn)全細(xì)胞膜片鉗方法。對(duì)于N-型Ca^電流的記錄，內(nèi)溶液的組成包含(以mM):130KC1、11EGTA、10Hepes和5Mg-ATP(pH7.4)，而外溶液包含140NaCl、2CaCl2、IO葡萄糖和10Hepes(pH7.4)。使用EPC-9放大器和Pulse/Pulsefit軟件程序(HEKA,德國(guó))得到電流記錄[20]。鍵,懂通過(guò)從-80mV的保持電位至OmV的200-ms電壓階躍引起電流。在2m1/分鐘的速度下灌流稀釋的肽毒素。進(jìn)行在洗出過(guò)程中的電流測(cè)量并繼續(xù)直到電流穩(wěn)定達(dá)5分鐘的時(shí)間。恰好在第一痕跡(^A鄉(xiāng)之前加入肽毒素。在毒素洗出過(guò)程中在相同的細(xì)胞內(nèi)記錄電流。以15秒間隔得到電流記錄。層i^懂在BrukerAVANCE600譜儀上記錄NMR波譜。用于NMR實(shí)驗(yàn)的樣品是在pH3.5溶于90%H20/10%2H20或者99.96%21120(對(duì)于同位素效應(yīng)未校正的)中的7mMFVIA。在288K和298K的溫度下使用標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列和相位循環(huán)進(jìn)行全部二維核磁共振實(shí)驗(yàn){即DQF-COSY、E-COSY、HOHAHA和NOESY}[21,22]。用80ms和100ms的混合時(shí)間記錄HOHAHA波譜。用100ms、150ms禾卩250ms的混合時(shí)間記錄NOESY波譜[23,24]。使用WATERGATE方案[25]完成在NOESY和TOCSY二者測(cè)量中的溶劑共振的抑制。記錄DQF-COSY[26]和PE-COSY[27]波譜分別得到扭轉(zhuǎn)角約束和立體特異性排布。在這種情況下，在松弛延遲時(shí)間期間通過(guò)選擇性輻射抑制溶劑共振。用于采集的數(shù)據(jù)大小對(duì)于DQF-COSY和PE-COSY為512(tl)X8192(t2)，而對(duì)于其它為512X2048。通過(guò)在時(shí)間量程為2小時(shí)30分鐘、5小時(shí)、7小時(shí)30分鐘、10小時(shí)和24小時(shí)時(shí)在99.96%2H20中記錄的TOCSY波譜分析鑒定緩慢交換主鏈酰胺質(zhì)子。化學(xué)移位參考用作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的TSP的甲基共振。在288K和298K(pH3.5)下記錄二維波譜的完全集。使用BrukerXWIN-NMR軟件處理和分析波譜。在傅立葉變換(Fouriertransformation)之前應(yīng)用相位移正弦平方的窗函數(shù)。除PE-COSY以外，最終矩陣尺度為2048X2048實(shí)點(diǎn)。高分辨率DQF-COSY和PE-COSY波譜為轉(zhuǎn)換成1024X8192的帶。魏A嫌贈(zèng)餅,交叉峰強(qiáng)度的定量測(cè)定基于等值線(contouringlevel)。觀察到的NOE數(shù)據(jù)分成四個(gè)距離范圍，1.82.7、1.83.5、1.85.0禾B1.86.0A，分別相對(duì)于強(qiáng)、中、弱和非常弱NOE值。假原子用于甲基質(zhì)子或非立體特異性排布的亞甲基質(zhì)子。將假原子使用的矯正因素加入到距離約束中[28]。另外，將0.5a加入到涉及甲基質(zhì)子的距離約束中[29]。對(duì)于每個(gè)二硫鍵，分別使用靶值設(shè)為2.02(±0.02)、2.99(土0.5)和2.99(±0.5)A的三個(gè)距離約束，S(i)-S①、S(i)-Ce(j)和S(j)-C、i)[30]。主鏈NH-CotH偶合常數(shù)從DQF-COSY波譜中評(píng)價(jià)并且根據(jù)下列規(guī)則變換成主鏈扭轉(zhuǎn)角①約束對(duì)于3麗《^小于5.5Hz，①角限制在-65±25°范圍內(nèi)；對(duì)于、H-caH大于8.0Hz，其限制在-120±40°范圍內(nèi)[31，32]。主鏈二面角約束不適用在5.5與8.0Hz之間的3j,-CaH值。使用與殘基內(nèi)的NH-CPHNOE結(jié)合的3J。p偶合常數(shù)得到x1側(cè)鏈扭轉(zhuǎn)角約束的范圍和前手性的P-亞甲基質(zhì)子的立體特異性排布[33]。在2H20中從PE-COSY波譜中確定3j。J禺合常數(shù)。對(duì)于在cr-ce鍵周圍的tY、g^s和gY構(gòu)象，x"則鏈扭轉(zhuǎn)角限制在-60±30°、60±30°禾H180±30°范圍內(nèi)[34]。通過(guò)分析初步計(jì)算的結(jié)構(gòu)鑒定對(duì)于緩慢交換的酰胺質(zhì)子的氫鍵受體[35,36]。將氫鍵的距離限制分別加入作為對(duì)于NH(i)-O(j)的1.8-2.3A的靶值和對(duì)于N(i)-O(j)的2.8-3.3A的靶值。使用X-PLOR3.851程序使用在SGI02工作站運(yùn)行的X-PLOR3.1程序完成全部計(jì)算[37]?；谄鹗加诰哂须S機(jī)化的主鏈O和W扭轉(zhuǎn)角的模板結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)模擬退火實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在實(shí)驗(yàn)上導(dǎo)出的距離和扭轉(zhuǎn)角約束，計(jì)算三維結(jié)構(gòu)。紛鄉(xiāng)伊份選擇具有最低能量和最小蘭納德-瓊斯范德華能量(Lennard-JonesvanderWasslsenergy)的最終20種結(jié)構(gòu)。根據(jù)結(jié)構(gòu)參數(shù)評(píng)價(jià)所計(jì)算的結(jié)構(gòu)的趨同。與實(shí)驗(yàn)距離和二面角約束，與和能量相關(guān)的統(tǒng)計(jì)(FNOE、Ft。nF叫e,和EL.j)，以及與理想化幾何位置存在RMS偏差。使用PROCHECK一NMR[38]、PROMOTIF—NMR[39]和MOLMOL程序[40]分析結(jié)構(gòu)。通過(guò)Ramachandran二面角圖的描述評(píng)價(jià)在最終聚合的結(jié)構(gòu)中主鏈二面角的分布，該圖表示與允許的(①，W)角的限度的偏差。使用角序參數(shù)迸一步評(píng)價(jià)在聚合的結(jié)構(gòu)中的角變化的度[5，41]。使用1.4A的溶劑半徑計(jì)算對(duì)于氨基酸殘基側(cè)鏈的溶劑可進(jìn)入表面面積。廂見(jiàn)射辯激,/雄游贈(zèng)、腦娜激微復(fù)藩以上述方法合成具有表5的氨基酸序列的FVIA的位點(diǎn)特異性類似物。根據(jù)上文描述的方法分析FVIA類似物的鈣通道阻斷能力和恢復(fù)。鎮(zhèn)離鵬動(dòng)激微入微動(dòng)激使用重量為2325g的ICR小鼠(IcrTacSam:ICR,MJCo.，首爾，韓國(guó))。將分成每籠五只小鼠的小鼠在受控溫度(22士2。C)和濕度(3050。/。)下適應(yīng)24小時(shí)并且無(wú)限制地供給水和固體飼料。在疼痛實(shí)驗(yàn)前2小時(shí)使全部實(shí)驗(yàn)小鼠習(xí)慣于周圍環(huán)境。在白天(AM10:00-PM17:00)進(jìn)行使用小鼠的實(shí)驗(yàn)以減小誤差。2游激膽浙根據(jù)先前報(bào)道的方法[50,51]使用具有30規(guī)格注射針頭的25pl哈密爾頓注射器進(jìn)行鞘內(nèi)注射毒素肽。通過(guò)觀察用1。/。亞甲藍(lán)染色的脊(spine)確定毒素肽的劑量。對(duì)于我們的實(shí)驗(yàn)，鞘內(nèi)注射5pl濃度為0.01|ig/5|il的FVIA肽。3.腦微在試驗(yàn)前，用5|ilFVIA肽(O.OlMl)鞘內(nèi)處理小鼠5分鐘。對(duì)照組僅用生理鹽水處理。使用模型TF6甩尾設(shè)備(EMDIEInstrumentCo.,MaidensVA)進(jìn)行甩尾試驗(yàn)。將小鼠身體用手固定而其尾巴平坦安置，隨后用強(qiáng)度為3.8mWatt/cm2的光照射尾巴下部來(lái)施加熱刺激。記錄使小鼠甩其尾巴花費(fèi)的時(shí)間。4贏微微在試驗(yàn)前，用5^FVIA肽(0.01嗎/5pl)鞘內(nèi)處理小鼠5分鐘。使用足底加熱設(shè)備(足底試驗(yàn)儀7371，UgoBasile,意大利)進(jìn)行足底痛覺(jué)試驗(yàn)以測(cè)量熱痛閾。在實(shí)驗(yàn)前，將小鼠置于小室中并適應(yīng)周圍環(huán)境。通過(guò)用強(qiáng)度為90mWatt/cm2的光照射腳爪的足底進(jìn)行熱刺激。測(cè)量腳爪退縮的反應(yīng)時(shí)間。5.微微艦,裙鄉(xiāng)在試驗(yàn)前，用5piFVIA肽(O.Olpl)鞘內(nèi)處理小鼠5分鐘而后向腹膜內(nèi)注射250^1.0%于鹽水(0.9%NaCl)中的乙酸，然后計(jì)算扭體反應(yīng)30分鐘。6.各、M^^A誘導(dǎo)游傷茅絲試殺在試驗(yàn)前，用5FVIA肽(O.Olpl)鞘內(nèi)處理小鼠5分鐘。然后，在谷氨酸鹽(20嗎/5pl)注射前，使小鼠習(xí)慣在小室內(nèi)至少30分鐘。鞘內(nèi)注射谷氨酸鹽(SigmaChemicalCo.,St.Louis，MO,美國(guó))之后，觀察在透明觀察小室(丙烯酸塑料，高20cm,直徑20cm)中的小鼠的傷害性行為(舔、咬或抓)。7.激廣尸誘導(dǎo)游傷夢(mèng)絲試驗(yàn)在試驗(yàn)前，用5plFVIA肽(O.Olpl)鞘內(nèi)處理小鼠5分鐘。然后，在物質(zhì)P(0.7pg/5nl)注射前，使小鼠習(xí)慣在小室內(nèi)至少30分鐘。鞘內(nèi)注射物質(zhì)P(TocrisCooksonLtd.,Bristol,英國(guó))之后，觀察在透明觀察小室(丙烯酸塑料，高20cm,直徑20cm)中的小鼠的傷害性行為(舔、咬或抓)。7.根據(jù)先前報(bào)道的Hunskaar方法[52]進(jìn)行福爾馬林試驗(yàn)。簡(jiǎn)言之，在試驗(yàn)前，用5i!lFVIA肽(0.01^ig/5^U)鞘內(nèi)處理小鼠5分鐘。然后，向小鼠左后爪的足底表面皮下注射10W5。/。于鹽水(0.9。/。NaCl)中的福爾馬林。在全部持續(xù)40分鐘的第一階段(0-5分鐘)和第二階段(20-40分鐘)注射之后立即記錄在透明觀察小室(丙烯酸塑料，高20cm,直徑20cm)中小鼠的行為活動(dòng)的計(jì)數(shù)。敘贈(zèng)絲鄉(xiāng)方鵬鎮(zhèn)虜/嫌。疆週摔經(jīng)銜資微,實(shí)殺動(dòng)激稀經(jīng)餅蘇發(fā)微全部實(shí)驗(yàn)遵照疼痛研究國(guó)際協(xié)會(huì)(InternationalAssociationfortheStudyofPain)的道德指南和韓國(guó)首爾大學(xué)牙科醫(yī)學(xué)學(xué)院的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)道德指南。在群體籠中容納重量為150200g的斯普拉-道來(lái)雄性大鼠(Sprague-Dawleymalerat)(OrientBioCo.,首爾,韓國(guó))并且無(wú)限制地供給標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的食物和水。采用12小時(shí)/12小時(shí)光暗循環(huán)，全部處理在循環(huán)的光照期期間(AMIO:OO-PM17:00)進(jìn)行。在受控溫度(20-24。C)和濕度(40-60。/。)下進(jìn)行疼痛行為的檢測(cè)。根據(jù)Kim和Chung方法[53]產(chǎn)生神經(jīng)性疼痛模型。簡(jiǎn)言之，使用23vol%恩氟垸麻醉大鼠并且削刮從背腰到臀區(qū)域的區(qū)域。沿中線切開(kāi)所刮區(qū)域，然后，從L4-S2位置處的額蝶突切除脊柱旁左側(cè)肌肉。在除去蝶骨翼突以便于能夠看到L4-L6脊神經(jīng)之后，L5和L6脊神經(jīng)顯露并且將兩個(gè)位置各自使用縫合絲線No.5-0綁扎牢固。在用生理鹽水灌流后，縫合肌肉和皮膚。在手術(shù)后第1、4、7和14天后，進(jìn)行疼痛反應(yīng)試驗(yàn)來(lái)選擇顯示出對(duì)于鞘內(nèi)導(dǎo)管插入不超過(guò)2.0g的50。/?；乇荛撝?avoidancethreshold)的大鼠。采用Yaksh等報(bào)道的方法[54]進(jìn)行鞘內(nèi)導(dǎo)管插入。簡(jiǎn)言之，用恩氟烷麻醉大鼠并且在立體定位架內(nèi)在兩個(gè)外耳道口處固定其頭部，隨后進(jìn)行硬膜切開(kāi)。然后，將導(dǎo)管(PE-10)插入至腰部膨大而另外的5-cm長(zhǎng)度緊閉用來(lái)作為藥物注射的路徑。在開(kāi)始試驗(yàn)之前，使動(dòng)物從外科手術(shù)中恢復(fù)。只有在鞘內(nèi)導(dǎo)管插入5天后沒(méi)有神經(jīng)缺陷以及在后腿處l(Hil注射1。/。利多卡因后具有運(yùn)動(dòng)麻痹的大鼠用于實(shí)驗(yàn)。利多卡因注射的第一天開(kāi)始，向大鼠施用芋螺毒素。3.教滅W層鄉(xiāng)藩通過(guò)在具有不銹網(wǎng)底的透明觀察小室(丙烯酸塑料，8X8X8cm)中容納大鼠并且使大鼠習(xí)慣大約30分鐘測(cè)量機(jī)械刺激的回避反應(yīng)(avoidanceresponse)。然后，根據(jù)Up&Down方法[55,57]，使用vonFray細(xì)絲法(vonFrayfilament)(彎曲力:0.41、0.70、1.20、2.00,、3.63、5.50、8.50和15,14g)刺激每只大鼠的腿的中央部來(lái)對(duì)大鼠進(jìn)行刺激。只有在神經(jīng)結(jié)扎前在三個(gè)獨(dú)立的疼痛反應(yīng)試驗(yàn)中顯示出不超過(guò)15.14g的50%回避閾值的大鼠用于本實(shí)驗(yàn)。在浙經(jīng)餅盧方鵬麟歸//。凝贈(zèng)微微,魏動(dòng)靜誘發(fā)鵬餅鄉(xiāng)條,在群體籠中容納重量為150200g的斯普拉-道來(lái)雄性大鼠并且無(wú)限制地供給標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的食物和水。采用12小時(shí)/12小時(shí)光暗循環(huán)，全部處理在循環(huán)的光照期期間進(jìn)行。在受控溫度(22-25。C)和12小時(shí)/12小時(shí)光暗循環(huán)下進(jìn)行疼痛行為的檢測(cè)。".//層經(jīng)棘顏發(fā)使用4%恩氟烷和95%氧氣的混合氣體麻醉大鼠。為了誘發(fā)尾部的神經(jīng)性疼痛，使存在于大鼠尾內(nèi)的高位和低位的尾部軀干暴露、謹(jǐn)慎地從外圍組織分離并且在Sl與S2脊神經(jīng)之間的位置處橫切。為了防止已切斷的軀干的近端與遠(yuǎn)端的可能的再結(jié)合，從近端移除軀干的2-mm的一塊。該手術(shù)通過(guò)高位與低位尾干排除了尾部的Sl脊神經(jīng)神經(jīng)分布[56]。7.2#經(jīng)絲^"#"療力^^澄#辟艮據(jù)沒(méi)有藥物施用知識(shí)的研究者的單盲試驗(yàn)(blindstudy)，進(jìn)行行為試驗(yàn)。教縱微斷f力微如Up-Down方法[55,57]在用弗萊毛(vonFreyhair)(彎曲力0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0禾t)15.0g)刺尾部之后，通過(guò)確定誘發(fā)50%回避反應(yīng)的弗萊毛勁度(克)評(píng)價(jià)機(jī)械性痛敏。與神經(jīng)損傷操作之前的那些相比，確定在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低的回避反應(yīng)閾作為機(jī)械性痛敏的出現(xiàn)。丄".冷微游/f力微通過(guò)將尾巴浸入冷水(4。C)中并記錄尾退縮時(shí)間進(jìn)行冷痛敏的試驗(yàn)。在尾巴浸入之后，在15秒的截止時(shí)間內(nèi)測(cè)量尾退縮的反應(yīng)時(shí)間。以5分鐘間隔重復(fù)五次冷痛敏試驗(yàn)。與操作前相比較快的退縮被視為歸因于冷痛敏。入".滅敏做K邀除了使用熱水(40。C)之外，以與上述用于冷痛敏的那些方式進(jìn)行熱痛敏的試驗(yàn)。在明顯確定與操作前相比較快的退縮的情況下，其被視為歸因于熱痛敏。在上述行為試驗(yàn)中，在神經(jīng)損傷之后，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的回避反應(yīng)被確定為歸因于疼痛誘導(dǎo)。2秀激蕭為了驗(yàn)證FVIA和MVIIA對(duì)慢性神經(jīng)病變的鎮(zhèn)痛作用，在神經(jīng)損傷操作后的14天期間進(jìn)行行為試驗(yàn)并且選擇顯示出疼痛誘導(dǎo)的大鼠用于藥物施用。將藥物懸浮于生理鹽水中并如下鞘內(nèi)施用。使用恩氟垸輕微麻醉大鼠并使用具有30規(guī)格注射針頭的25-|il哈密爾頓注射器給藥。將藥物經(jīng)由L5與L6脊神經(jīng)之間的硬膜注射到蛛網(wǎng)膜下隙。藥物的劑量為6.5、20、65或200ng/kg。到注射后1小時(shí)為止以15分鐘的時(shí)間間隔、到注射后3小時(shí)為止以30分鐘的時(shí)間間隔、在注射后5小時(shí)以及在注射后24小時(shí)分別監(jiān)控對(duì)機(jī)械性痛敏的鎮(zhèn)痛作用。在注射之后，在1小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)和24小時(shí)檢測(cè)對(duì)冷和熱痛敏的鎮(zhèn)痛作用。W動(dòng)嚴(yán)雄,僮在群體籠中容納重量為150200g的斯普拉-道來(lái)雄性大鼠并且無(wú)限制地供給標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的食物和水。它們保持在12小時(shí)/12小時(shí)光暗循環(huán)、溫度(22土3。C)和濕度(40-60。/。)下。在用異氟垸麻醉下進(jìn)行全部操作。將導(dǎo)管(PE-IO)插入到股動(dòng)脈并且填充生理鹽水，接著連接到病人監(jiān)護(hù)儀(PhilipsMP30,Intellivue)上。向鼠側(cè)面尾靜脈施用MVIIA肽或FVIA肽。對(duì)于心電圖，將不銹鋼電極置于兩膝和后退皮膚下的部分。統(tǒng)W藩全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差平均值(SEM)。使用單因子重復(fù)測(cè)量變異數(shù)分析法(one-wayrepeatedmeasuredANOVA)禾。Bonferronit檢驗(yàn)比較和分析針對(duì)神經(jīng)性疼痛的藥物效應(yīng)。p值小于0.05被認(rèn)為是在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有效的。在藥物治療之后退縮閾值的增量評(píng)價(jià)鎮(zhèn)痛作用并且表示為最大可能作用的百分比(。/。MPE):%MPE=100x[(退縮閾值治療后)-(退縮閾值操作后)/(退縮閾值操作前)-(退縮閾值操怖)]。結(jié)果豬毒微游分庸使用生物化學(xué)方法(毒液提取和HPLC)，我們的團(tuán)隊(duì)表示了幾種芋螺毒素肽的特征。目前，我們使用DNA克隆從紫霞芋螺毒液管mRNA或gDNA中得到了另外的芋螺毒素肽。通過(guò)上述方法表示了約50種芋螺毒素肽的特征。這些包括O-超家族、A-超家族、M-超家族和其它超家族[l]。在具有特征的序列中，F(xiàn)VIA顯示與眾所周知的W-芋螺毒素肽MVIIA的高的序列同源性(76。/。)并且還具有保守殘基Tyr13、Ly^和Arg、表1)。在整個(gè)序列中只有6個(gè)殘基是不同的。FVIA的cDNA序列如SEQIDNO:4所述。表1.03-芋螺毒素FVIA與其它N-型轉(zhuǎn)通道阻斷劑的一級(jí)序列的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>進(jìn)行FVIA的固相化學(xué)合成提供肽的豐富供給并且平穩(wěn)進(jìn)行受保護(hù)的線性肽的合成。在TFA分裂之后，從20%乙酸中提取全部保護(hù)基已被除去的FVIA的線性前體。粗制的肽的空氣氧化提供作為主要產(chǎn)物的含有合適二硫鍵配對(duì)的肽，該肽通過(guò)離子交換色譜和反相HPLC純化。FVIA是在中性pH凈電荷為+5的強(qiáng)堿性肽，所以使用NH4OAc梯度緩沖液作為洗脫液，使用CM-纖維素CM52作為陽(yáng)離子交換色譜。通過(guò)分析級(jí)HPLC、氨基酸分析和MALDI-TOF-MS測(cè)量(圖l)確認(rèn)最終純化的產(chǎn)物。FVIA的CD光譜顯示在約205nm的兩個(gè)最小值(圖2A)。預(yù)期基于包括a螺旋、反平行的(3折疊、平行的(3折疊、(3轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則的五個(gè)主要二級(jí)結(jié)構(gòu)的二級(jí)結(jié)構(gòu)光譜[18]，F(xiàn)VIA具有p轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)或反平行的(3折疊。已證實(shí)，通過(guò)氧化折疊適當(dāng)形成FVIA的二級(jí)結(jié)構(gòu)[19]。FVIA類似物、嵌合體-FMFF、嵌合體-MFMM、FVIA[N14D]和FVIA[I11L,A12M]的CD光譜顯示它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)與FVIA的二級(jí)結(jié)構(gòu)幾乎相同，這說(shuō)明它們的活性的差異歸因于氨基酸殘基的不同(圖2B)。敬潘為了研究co-芋螺毒素的體外活性，進(jìn)行電生理研究[20]。IC5。值指co-芋螺毒素的效能并且從劑量抑制(應(yīng)答)曲線中計(jì)算出。劑量范圍為0.1nM1^M。合成的MVIIA和FVIA阻斷在人胚腎細(xì)胞中表達(dá)的人N-型轉(zhuǎn)通道，它們具有相似效能(圖3)。兩個(gè)圖顯示S形曲線并且在O.lpM飽和。每種肽的ICso值分別為7.96土1.59nM和11.5±1.4nM。第二實(shí)驗(yàn)是co-芋螺毒素的電流電壓測(cè)量。通道阻斷劑的機(jī)制可以分為孔阻斷和閘門(mén)修飾作用。眾所周知，包括MVIIA的co-芋螺毒素是孔阻斷劑并且結(jié)合到N-型鈣通道孔區(qū)域的前庭(vestitubule)。FVIA還顯示沒(méi)有水平曲線移位的曲線抑制(圖4)[42]。最后，我們驗(yàn)證從結(jié)合到N-型VSCC上的恢復(fù)。當(dāng)用1pM濃度使阻斷飽和時(shí)，洗出毒素。雖然FVIA顯示比MVIIA快的阻斷，與MVIIA洗出相比，F(xiàn)VIA顯示更好的分離(圖5)。層i力浙使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)設(shè)置co-芋螺毒素FVIA的二維'HNMR波譜[43]。峰值分散良好并且在第2和4環(huán)中有一些重疊(表2)。氨基酸自旋系統(tǒng)的鑒定基于在DQF-COSY和TOCSY實(shí)驗(yàn)中觀察到的標(biāo)量偶合模式，其由NOESY測(cè)量結(jié)果補(bǔ)足。通過(guò)在NOESY波譜上觀察到的堿基間順序的NOE(interresidues叫uentialNOE)沿著FVIA的一級(jí)結(jié)構(gòu)確定鑒定的自旋系統(tǒng)的次序。表3顯示NOESY波譜的化學(xué)位移。表2,在298K和pH3.5FVIA的化學(xué)位移<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>ArglO8扁4.1051.665CYH1.860Hell7.618，.1841.888CYH21.352，U59;CYH30.085Alal27.6984.3551.233-Tyrl37.8464.6283.164C2,6H6.852;C3,5H7,129Asnl48.257產(chǎn).779卩.672，2.832-Cysl58.3134細(xì)2.556,3.251-Cysl69.5904.4122.921,3.253-Thrl78.4414.472CYH1.119Glyl88.3603.820,4.097--Serl98.2014.7223.706,3.786-Cys208.7254.7112.829,2.899Arg218.6224.6441.841CYH1.634,1.544Ser229.3174,0473.900,4.127-Gly238,2244.152，3.786-—Lys247.7685.1201.632，1.520CYH1.260;CSH1.357Cys258.7124.8593.023,3.228—酰胺---NH28.441如圖6中所示，F(xiàn)VIA包含三個(gè)短的由第68、21和24殘基組成的卩鏈，其與幾個(gè)轉(zhuǎn)角以反平行的方式設(shè)置。使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范確定在P折疊結(jié)構(gòu)中(3鏈的范圍及其相對(duì)取向大的、H-ca偶合常數(shù)(Lys6、Cys8、Ser9、Arg1Q、Ile11、Ala12、Tyr13、Cys15、Cys2Q、Arg21和Lys24)，強(qiáng)連續(xù)的daN，鏈間NH-NH和NH-C"H連通，以及緩慢交換酰胺質(zhì)子(Lys6、Cys8、Ile11、Gly18、Gly23、Arg21和Lys24)。這些規(guī)范使在(3折疊內(nèi)的外周和中樞鏈能夠被識(shí)別。尸K"我們使用全部317個(gè)NMR實(shí)驗(yàn)約束計(jì)算FVIA的三維結(jié)構(gòu)，其包括301個(gè)實(shí)驗(yàn)距離約束和16個(gè)二面角約束，其相當(dāng)于每個(gè)殘基的12.68個(gè)約束的平均值。在285個(gè)距離約束中，有128個(gè)殘基內(nèi)、156個(gè)殘基間NOE距離約束，8個(gè)氫鍵約束(從氫-氘交換實(shí)驗(yàn)確定)和9個(gè)二硫鍵約束。涉及氫鍵的3個(gè)距29離約束為Gly5(NH)—Cys25(CO)、Lys6(NH)—Gly3(CO)、Cys8(NH)-Gly23(CO)、lie11(NH)—Ser9(OH)、Gly18(NH)—Cys15(CO)、Arg21(CO)-Lys24(NH)和Arg21(CO)-Lys24(NH)。我們進(jìn)行了以IOO個(gè)無(wú)規(guī)則FVIA結(jié)構(gòu)開(kāi)始的模擬退火計(jì)算，并且選擇了20個(gè)與NMR實(shí)驗(yàn)約束良好匹配的最終結(jié)構(gòu)，其中，NOE距離和扭轉(zhuǎn)角干擾分別小于0.3A和3°。根據(jù)結(jié)構(gòu)參數(shù)評(píng)價(jià)聚合結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)(表3)。表3.20個(gè)最低能量結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)統(tǒng)計(jì)與實(shí)驗(yàn)距離約束的RMS偏差(A)a'(301)與實(shí)驗(yàn)二面角約束的RMS偏差(deg.)a(17)0.037士0.0080.037±0.008與能量相關(guān)的統(tǒng)計(jì)(kcal/mol)bFN0E0.245±0.165FtOT5.021士0.359Frepel4.109±1.475￡w-54.690±6.728與理想化幾何位置的RMS偏差鍵(A)0.0033±0.0001角(deg)0.558±0.02不合適(deg)0.443±0.0156Ramanchandran分析(殘基2-30)c最有利的(％)42.9額外允許(。/。)56.3非常允許(％)0.8不許區(qū)域(。/。)0.0平均配對(duì)RMS差(A丌主鏈(殘基2-30)0.47±0.10全部重原子(殘基2-30)1.36±0.21a在括號(hào)中給出計(jì)算中使用的每個(gè)實(shí)驗(yàn)約束的數(shù)目。bFN0E、和Kepe,分別是與NOE干擾、扭轉(zhuǎn)角干擾和范徳華斥力項(xiàng)有關(guān)30的能量。用于這些項(xiàng)的力常數(shù)的值是在X-PLOR3.1手冊(cè)中描述的標(biāo)準(zhǔn)值。五w是用CHARMM實(shí)驗(yàn)?zāi)芰亢瘮?shù)計(jì)算的蘭納德-瓊斯范徳華能量，其不包括在模擬退火計(jì)算中。e程序procheck-nmr用于評(píng)價(jià)結(jié)構(gòu)的立體化學(xué)特性。_與理想化共價(jià)幾何位置的偏差非常小，并且蘭納德-瓊斯范徳華能量很大并且是負(fù)的，這說(shuō)明在保守結(jié)構(gòu)中沒(méi)有變形或非鍵合的不良接觸。關(guān)于全部序列的平均配位位置的原子RMS偏差為對(duì)于主鏈原子(N,Ca，C)0.47士0.10a而對(duì)于全部重原子1.36±0.21a。在整個(gè)序列中完全定義了全部序列的主鏈結(jié)構(gòu)；Ramachandran分析顯示主鏈二面角落入|3折疊區(qū)域內(nèi)或者通常允許的區(qū)域內(nèi)。游好碧賴FVIA的分子結(jié)構(gòu)由三鏈反平行的p折疊和四個(gè)鏈反轉(zhuǎn)(chainreversal)組成。FVIA的全部|3折疊拓?fù)錇?2x,-1，其常常與含有"抑制半胱氨酸節(jié)"折疊的毒肽和抑制肽有關(guān)[45]。三個(gè)卩鏈由殘基Se,-CysS②鏈I)、殘基Arg21((3鏈II)和殘基Gly23-Lys24((3鏈III)形成，|3鏈I通過(guò)二硫鍵(Cys8-Cys,拴系到(3鏈II上并且以約45。角的反平行方式與中樞卩鏈III相互作用。在殘基GlyS-Lys6處發(fā)生第一鏈反轉(zhuǎn)，其形成II型卩-轉(zhuǎn)角。在殘基Ser、Ala^與殘基Cys'5-Gly18處發(fā)生第二和第三反轉(zhuǎn)，其分別形成IV型(3轉(zhuǎn)角和I型(3轉(zhuǎn)角。在殘基Arg21-Lys24處發(fā)生最后的反轉(zhuǎn)并且在(3鏈II與(3鏈III之間形成顛倒主鏈方向的p發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)角(IV型(3轉(zhuǎn)角)。ffl4泣^特^欲/e游類敘激游溝建、齊遞道漸劍浙統(tǒng)復(fù)分叛為了驗(yàn)證對(duì)于FIVA活性和恢復(fù)至關(guān)重要的部分和殘基，制備表4中所示的位點(diǎn)特異取代的類似物。表4.FVIA類似物肽氨基酸序列fviackgtgkscsriayncctgscrsgkc-nh2mviiackgkgakcsrlmydcctgscrsgkc-nh2嵌合體-fmffckgtgkscsrlmydcctgscrsgkc-nh2嵌合體-mfmmckgkgakcsriayncctgscrsgkc-nh2fvia[ni4d;ickgtgkscsriaydcctgscrsgkc-nh231FVIA[111L,A12M]CKGTGKSCSRLMYNCCTGSCRSGKC-NH2分析FVIA類似物揭示其鈣通道阻斷潛力和恢復(fù)。對(duì)于該實(shí)驗(yàn)，使用30nMFVIA類似物。分析結(jié)構(gòu)總結(jié)于表5中。表5.FVIA類似物的鈣通道阻斷活性和恢復(fù)肽阻斷活性(％)遂1FVIA94,7±2.169.7±6.5MVIIA81.5±2.439.5±6.8嵌合體-FMFF84.2±2.924.7±1.1嵌合體-MFMM93.4±1.970.3±10.6FVIA[N14D]54.4±8.787,7±7.8FVIA[I11L,A12M]84.3士4.739.0±5.7如表5中所理解的，嵌合體-MFMM具有用FVIA在第1115位的氨基酸殘基替換的常規(guī)芋螺毒素MVIIA的主鏈，嵌合體-MFMM不僅顯示出顯著的鈣通道阻斷活性，而且顯示出比未修飾的MVIIA高幾乎2倍的恢復(fù)性能。因此，可以理解，第1115位范圍內(nèi)的氨基酸殘基是造成FVIA的可逆性急劇增強(qiáng)的原因。為了得到更多信息，將FIVA的第11位氨基酸和第12位氨基酸的Ile和Ala殘基分別突變成Leu和Met來(lái)分別制備FIVA[IllL,A12M]。分析該類似物具有與FIVA相似的鈣通道阻斷活性但卻顯示出顯著降低的可逆性。在這點(diǎn)上，可以理解，F(xiàn)IVA的第ll位氨基酸和第12位氨基酸的Ile和Ala殘基對(duì)于恢復(fù)(即可逆性)是至關(guān)重要的。辦柳游動(dòng)激微本肽FVIA被試驗(yàn)顯示對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用。如對(duì)于甩尾試驗(yàn)和足底痛覺(jué)試驗(yàn)的圖8A和8B所示，與對(duì)照相比，向小鼠施用的FVIA肽(O.Olpl)在提高退縮反應(yīng)時(shí)間方面是沒(méi)有效的。如在圖9A和9B中所示，觀察用谷氨酸鹽(20昭/5pl)或者物質(zhì)P(0.7昭/5pl)注射的對(duì)照小鼠發(fā)現(xiàn)敏銳的如舔、咬或抓30分鐘的行為反應(yīng)。相反，觀察施用FVIA的小鼠顯示明顯下降的累積疼痛反應(yīng)速率。對(duì)于施用生理鹽水的對(duì)照小鼠，腹膜內(nèi)注射250pl1.0%乙酸誘導(dǎo)70例扭體反應(yīng)。如圖9C中所示，比較起來(lái)，在施用FVIA的小鼠中的扭體反應(yīng)計(jì)32數(shù)明顯下降。如圖10A中所示，對(duì)于皮下注射10Hl的5%福爾馬林的小鼠，存在兩個(gè)不同階段第一階段，在福爾馬林注射后立即出現(xiàn)并且持續(xù)5分鐘；和第二階段，在福爾馬林施用后大約20分鐘出現(xiàn)并且持續(xù)2040分鐘。觀察小鼠顯示如舔、咬、抓或搖的疼痛行為活動(dòng)。與此相反，觀察施用FVIA的小鼠顯示在第一階段和第二階段都明顯下降的累積疼痛反應(yīng)速率。此外，揭示了FVIA在第二階段比第一階段更加有效。如圖10B中所示，本發(fā)明的肽FVIA已被闡明具有劑量依賴方式的鎮(zhèn)痛作用。FVIA的鎮(zhèn)痛作用隨著施用的FVIA的濃度的提高(3.2ng/5pl、10ng/5pl、32ng/5pl和100ng/5pl)而提高。有意思的是，施用100ng的FVIA完全阻止了第二階段中的疼痛行為。上述結(jié)果引導(dǎo)我們推斷FVIA肽成功地在動(dòng)物中顯示鎮(zhèn)痛作用。詹經(jīng)絲,麟鎮(zhèn)嬸鋪我們提出了兩種類型的神經(jīng)病變模型:L5和L6脊神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型；和Sl和S2脊神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型。觀察神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型以顯示神經(jīng)性疼痛和異常性疼痛。通過(guò)確定在用弗萊毛刺尾巴后誘發(fā)50%回避(退縮)反應(yīng)的弗萊毛的勁度(克)評(píng)價(jià)機(jī)械性痛敏。如圖11中所示，F(xiàn)VIA或MVIIA的施用經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間產(chǎn)生增加的50%退縮閾，然而，在注射后2小時(shí)之后，退縮閾下降。如圖12A中所示，還闡明了FVIA肽以劑量依賴方式(6.5、20、65和200ng/kg)誘導(dǎo)提高50%退縮閾。此外，如圖12B和12C所示，F(xiàn)IVA肽對(duì)冷和熱痛敏顯示出鎮(zhèn)痛作用。這些結(jié)果顯示，F(xiàn)IVA肽在兩種類型的神經(jīng)病變模型中顯示出優(yōu)異的鎮(zhèn)痛作用。對(duì)循,微靜虔/柳在施用劑量為100^g/kg的FVIA或MVIIA之后，監(jiān)測(cè)時(shí)間過(guò)程的平均動(dòng)脈壓(MAP)。如圖13中所示，MVIIA肽在初期引起MAP的急劇下降而隨著時(shí)間的過(guò)去引起MAP的緩慢恢復(fù)。然而還在施用了FVIA的組中觀察到了在初期MAP的急劇下降，F(xiàn)VIA肽顯示出MAP的好得多的恢復(fù)。進(jìn)一步討論33糊毒微微庳芋螺毒素肽由基于信號(hào)序列和Cys模式的不同家族組成。毒液成分寬泛地分成兩類富含二硫化物的芋螺毒素和缺乏多個(gè)二硫化物交聯(lián)的肽[l]。在這些家族中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的0和A超家族比其它超家族更加豐富。通過(guò)生物化學(xué)方法和基因克隆表示了26個(gè)O-超家族和18個(gè)A-超家族的特征。其它為五個(gè)M-超家族和沒(méi)有二硫化物的肽。為了表示芋螺毒素肽序列的特征，使用生物化學(xué)方法和基因克隆。生物化學(xué)方法需要20多個(gè)雞心螺和純化單肽的實(shí)驗(yàn)步驟。通過(guò)Edman降解和大量信息能夠識(shí)別新的翻譯后修飾(posttranslationalmodification)。另外，應(yīng)從天然的肽中確定原有的二硫化物結(jié)構(gòu)。在基因克隆方面，僅一個(gè)雞心螺就能滿足cDNA文庫(kù)克隆且產(chǎn)生出成熟的肽。兩種豐富彼此互補(bǔ)。從韓國(guó)雞心螺中識(shí)別了50多種肽。在這些肽中，本發(fā)明的FVIA是通過(guò)克隆基因組DNA得到的序列。/^X4潛教游謬布^7教菜序列對(duì)比用于得到完整的排布。通過(guò)COSY波譜中的對(duì)稱排列立即識(shí)別Gly殘基。并且在TOCSY波譜中也容易確認(rèn)Thr4和Ala12殘基。識(shí)別Asn14的NH2與Tyr13的3-質(zhì)子和s-質(zhì)子并用于排布。NH2，存在于TOCSY和COSY中，被定位于肽的酰胺化的C末端。但是存在峰重疊和加寬引起的困難。例如，Cys1、Lys2和Lys6的CaH(4.503ppm)與Thr17的NH和C末端的NH2(8.441ppm)重疊。Gly"和Gly23的峰加寬隱藏了環(huán)境峰。通過(guò)比較不同溫度、pH和混合時(shí)間的NOESY波譜克服這些問(wèn)題(表2)。在最終計(jì)算中使用的約束由128個(gè)殘基內(nèi)距離、72個(gè)序列距離、84個(gè)非序列距離、11個(gè)二面角約束和通過(guò)偶合常數(shù)測(cè)量得到的4^角約束組成?；?C'角偶合常數(shù)和CpH與NH之間的NOE產(chǎn)生的距離的組合得到p-亞甲基質(zhì)子的立體特異性排布。界經(jīng)/"麟賴話絲關(guān)系N-型鈣通道在控制來(lái)自神經(jīng)末梢的神經(jīng)遞質(zhì)釋放方面起到重要作用并且是治療疼痛和缺血性腦損傷的重要的藥物靶子。己報(bào)道了不同的亞型[46-48]。這些亞型的功能和器官分布是不同的并且特別是外周形式與減少疼痛具有重要關(guān)系。不同的芋螺毒素選擇性地阻斷電壓閘門(mén)的C^+通道并且它提供關(guān)于電壓34敏感通道的功能多樣性和結(jié)構(gòu)決定因素的有用信息。其中，在結(jié)構(gòu)域IIIS5-S6區(qū)域內(nèi)，ca-芋螺毒素GVIA和MVIIA作為孔阻斷劑選擇性結(jié)合到N-型鈣通道的外前庭[8,42,44]。MVIIA(SNXlll/齊考諾肽/Prialt;Elan)是眾所周知的FDA批準(zhǔn)的用于止痛的①-芋螺毒素。但是已報(bào)道了MVIIA的副作用并且澳地利研究組提出，基于洗出實(shí)驗(yàn)，與外周亞型相比，MVIIA與中樞亞型具有精密的特異性并且它是產(chǎn)生副作用的原因[14]。GVIA不可逆地結(jié)合到鈣通道上，所以將其排除在討論之外。因此，如果MVIIA獲得較好的可逆性，則它將是比目前的藥物更好的藥物。我們開(kāi)始研究關(guān)于這些見(jiàn)解的結(jié)構(gòu)和功能研究。我們的團(tuán)隊(duì)己經(jīng)通過(guò)基因克隆和毒液提取找到了具有C-C-CC-C-C基序的20多種O-超家族芋螺毒素。其中，F(xiàn)VIA是基因克隆最豐富的結(jié)果，所以在cDNA文庫(kù)中重復(fù)發(fā)現(xiàn)相同的序列。提取FVIA與MVIIA高度相似。在MVIIA和FVIA的第1和2環(huán)內(nèi)的六個(gè)殘基是不同的而其它的正好相同。這些殘基的差異預(yù)期是引起詳細(xì)的結(jié)構(gòu)差異和包括機(jī)制、效能和洗出之后的恢復(fù)的功能差異的原因。并且存在分別與效能和可逆性有關(guān)的分子決定因素。首先，我們檢驗(yàn)電生理實(shí)驗(yàn)的效能。所用的HEK293細(xì)胞表達(dá)直接與人疼痛信號(hào)有關(guān)的人N-型鈣通道并且通過(guò)劑量抑制(應(yīng)答)曲線的IC5Q值表示效能。MVIIA和FVIA的IC5o值以nM級(jí)非常相似。在FVIA中，具有重要功能的Lys2、Tyr13、Arg"和Arg21殘基是保守的(圖3)，所以這些結(jié)果是預(yù)期的。其次，進(jìn)行電流電壓曲線實(shí)驗(yàn)。這些結(jié)果顯示，HEK293中的鈣通道正確表達(dá)并且MVIIA和FVIA的孔阻斷機(jī)制是相同的(圖4)。最后，在毒素注射之后進(jìn)行洗出。繼續(xù)洗出直到到達(dá)定態(tài)。圖5顯示MVIIA(35n/o)的恢復(fù)與FVIA(75%)的恢復(fù)是明顯不同的。有意思的是，雖然效能相似，但是這些肽的可逆性是不同的。這些事實(shí)顯示，效能與可逆性的分離是可以的并且存在不同的分子決定因素(此處指殘基)(圖5)。為了確定結(jié)構(gòu)差異是否影響以上功能以及哪些殘基對(duì)這些功能和結(jié)構(gòu)是重要的，進(jìn)行'HNMR實(shí)驗(yàn)。我們預(yù)期，微小的結(jié)構(gòu)差異產(chǎn)生在第l環(huán)以及特別是第2環(huán)內(nèi)，其是由一級(jí)序列差異引起的結(jié)合環(huán)。正如我們所預(yù)期的，雖然整個(gè)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是相似的，但是第2環(huán)的局部結(jié)構(gòu)是些微不同的。35所以，我們認(rèn)為，第2環(huán)的結(jié)構(gòu)差異整體影響可逆性，而不是通過(guò)一個(gè)殘基的不同影響。通過(guò)3J,.ca偶合常數(shù)的不同數(shù)據(jù)預(yù)期結(jié)構(gòu)差異。對(duì)于、H.c必大于8.0Hz，在FVIA和MVIIA中分別存在11和9[49]。其次，特異序列Asn"(Asp")和11eU(Leu")替換可引起功能差異。Asp"是帶負(fù)電的，所以靜電荷或局部電荷作用可以影響功能差異。MVIIA中的Leu"也是對(duì)活性重要的殘基[7]。Leu"的甲基的微小移位可使結(jié)合變?nèi)醪⑶沂蛊湟子趶耐ǖ酪来吾尫?。兩J纖潛條根據(jù)病因?qū)W機(jī)制，疼痛可以分為傷害性、發(fā)炎性和神經(jīng)性疼痛。傷害性疼痛由外部刺激引起并且在自我防御外部有害刺激方面起作用。發(fā)炎性疼痛由促炎癥反應(yīng)分子引起而神經(jīng)性疼痛由神經(jīng)損傷引起。已經(jīng)提出了大約50種動(dòng)物模型用來(lái)獲取這些疼痛。通過(guò)由熱引起的急性傷害性疼痛發(fā)展的甩尾試驗(yàn)和足底痛覺(jué)試驗(yàn)，驗(yàn)證FIVA肽具有對(duì)傷害性疼痛的鎮(zhèn)痛作用(圖8A和8B)。谷氨酸鹽和物質(zhì)P是疼痛信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵的神經(jīng)遞質(zhì)之一。鞘內(nèi)注射這些神經(jīng)遞質(zhì)誘發(fā)疼痛。在使用谷氨酸鹽和物質(zhì)P的試驗(yàn)中，F(xiàn)VIA顯示了在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的鎮(zhèn)痛作用(圖9A和9B)。1。/。乙酸的腹膜內(nèi)處理引起如扭體的傷害性行為。FVIA施用導(dǎo)致扭體計(jì)數(shù)的減少(圖9C)。對(duì)于福爾馬林試驗(yàn)，疼痛具有兩個(gè)不同的階段與傷害性疼痛有關(guān)的第一階段和與發(fā)炎性疼痛有關(guān)的第二階段。施用了FVIA的小鼠被觀察顯示出了對(duì)第一階段和第二階段兩個(gè)階段的明顯的鎮(zhèn)痛作用。此外，F(xiàn)VIA肽對(duì)與發(fā)炎性疼痛有關(guān)的第二階段比第一階段更加有效得多(圖IOA)。如圖10B中所示，F(xiàn)VIA肽顯示了以劑量依賴方式的鎮(zhèn)痛作用。有意思的是，施用100ng的FVIA完全阻止第二階段的疼痛。L5和L6脊神經(jīng)損傷或者Sl和S2脊神經(jīng)損傷的大鼠被誘發(fā)具有神經(jīng)性疼痛并且顯示痛覺(jué)過(guò)敏和異常性疼痛癥狀。取決于濃度，F(xiàn)VIA提高對(duì)于神經(jīng)損傷誘發(fā)的機(jī)械性痛敏的50。/。退縮閾(圖11和12A)。同樣，F(xiàn)VIA肽顯示了對(duì)冷/熱痛敏的鎮(zhèn)痛作用，同時(shí)其濃度依賴方式比機(jī)械性痛敏的濃度依賴方式弱(圖12B和12C)。己闡明6.5ngFVIA顯示出與200ngFVIA相似的抵抗冷/熱痛敏作用，這說(shuō)明，與其抵抗機(jī)械性痛敏作用相比，F(xiàn)VIA的抵抗冷/熱痛敏作用可以通過(guò)其它機(jī)制被顯示，并且是更加敏感的?？傊?，可以理解，F(xiàn)VIA肽對(duì)傷害性疼痛具有相對(duì)較弱的鎮(zhèn)痛作用，其可以通過(guò)甩尾試驗(yàn)、足底痛覺(jué)試驗(yàn)和福爾馬林試驗(yàn)的第一階段證實(shí)。不同的是，F(xiàn)VIA肽被證明是對(duì)于發(fā)炎性疼痛的重要的藥物候選物，其通過(guò)福爾馬林試驗(yàn)以及使用谷氨酸鹽、物質(zhì)p和乙酸的試驗(yàn)證實(shí)。在腿或尾神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型中，闡明了FVIA肽對(duì)痛敏具有明顯的鎮(zhèn)痛作用。因?yàn)閭π蕴弁词菍?duì)抗外部有害刺激的防御機(jī)制之一，所以過(guò)度抑制傷害性疼痛是不合需要的。通常本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，優(yōu)異的止痛藥物候選物顯示出選擇性針對(duì)發(fā)炎性和神經(jīng)性疼痛(病理疼痛之一)的緩解疼痛能力。基于上文中描述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以得出結(jié)論，源于韓國(guó)雞心螺的FVIA肽或其類似物是有前途的止痛藥物候選物。F「"脈虔微MVIIA是可商購(gòu)的FDA于2004年批準(zhǔn)的用于止痛的co-芋螺毒素之一(Prialt,Elan公司)。然而，MVIIA的嚴(yán)重副作用和給藥方式使其施用受到限制。例如，已報(bào)道MVIIA具有與(i)由抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的N-型VSCC引起的神經(jīng)系統(tǒng)和(ii)由抑制自主神經(jīng)系統(tǒng)以影響血壓和脈率的心血管系統(tǒng)有關(guān)的不良作用。在施用FVIA或MVIIA之后，我們監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(MAP)以獲取對(duì)心血管系統(tǒng)的不良作用。兩種肽被分析引起MAP在初期急劇下降。然而，隨著時(shí)間的過(guò)去，施用了FVIA的組的MAP顯示非常緩慢地到達(dá)最初的正常動(dòng)脈壓。相反，MVIIA肽顯示了較差的恢復(fù)并且導(dǎo)致相對(duì)約60mmHg的較低的動(dòng)脈壓。MVIIA的這種歸因于其低的可逆性。因此，這些結(jié)果激勵(lì)我們得出結(jié)論，F(xiàn)VIA肽或其類似物是優(yōu)異的止痛藥物候選物，就此而論，它們具有與MVIIA相似的鈣通道阻斷能力以及比MVIIA少得多的副作用。已經(jīng)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，應(yīng)該理解的是，落入本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)的變形和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，并且本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等效技術(shù)方案所確定。37參考文獻(xiàn)1.HeinrichTerlauandBaldomeroM.Olivera(2004)PhysiolRev84,41-682.WilliamR.Gray肌dBaldomeroM.Olivera(1988)Ann.Rev.Biochem.57,665-7003.RichardJ.LewisandMariaL.Garcia(2003)NatureDrugDisc.2,1-134.BaldomeroM.Olivera(1997)MolecularBiologyoftheCell8,2101-21095.BaldomeroM.Olivera(2002)A,.Rev.Ecol.Syst.33,25-476.D.AlonsoandB.G.Livett(2003)MiniReviewsinMedicinalChem.3，785-7877.KatherineJ.NielsenandRichardLewis(2000)J.Mol.Recognit.13,55-708.Zhong-PingFengandGeraldW.Zampoin(2003)丄Biol.Chem.278，20171-201789.Perm,R.D.andPaice，J.A.(2000)Pain.85,291-29610.Jain，K.K.(2000)Expert.Opin.lnvestig.Drugs9,2403-240111.Levin，TandBailine,S.(2002)Psychosomatics.43,63-6612.RichardJ.Lewis,KatherineJ.Nielsen,DavidJ.Craik,MarionL.Loughnan,DeniseA.Adams,IainA.Sharpe,TudorLuchian,DavidJ.Adams,TrudyBond,LindaThomas,AlunJones,Jodi-LeaMatheson,RogerDrinkwater,PeterR.Andrews,andPaulF.Alewood(2000)J.Biol.Chem.275,35335-3534413.DavidJ.Adams,AmandaB.Smith,ChristinaI.Schroeder,TakahiroYasuda,andRichardJ.Lewis(2003)J.Biol.Chem.278,4057-406214.JorgenMould,TakahiroYasuda,Christina1.Schroeder,AaronM.Beedle，Clinton丄Doering,GeraldW.Zamponi，DavidJ.Adams,andRichardJ.Lewis(2004)丄Biol.Chem.279，34705-3471415.LaszloNadasdiandJ.Ramachandran(1995)Biochemistry.34，8076-808116.H.JijakliandW.丄Malaisse(1996)PharmacologicalResearch.34,105-10817.JaeIIKimandKazukiSato(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Arg。14、根據(jù)權(quán)利要求11所述的co-芋螺毒素肽，其中，Xaa2是Thr或Lys;Xaa3是Lys或Ala;Xaa4是Ser或Lys;Xaa5是Ser或Arg;Xaae是Arg;Xaa9是Asn或Asp;XaaK)是Thr;Xaan是Gly;Xaa。是Ser;Xaa^是Arg;Xaa!4是Ser;Xaa15是Gly;以及Xaa16是Lys或Arg。15、根據(jù)權(quán)利要求ll所述的CO-芋螺毒素肽，其中，所述CO-芋螺毒素包含SEQIDNO:1、2或3所述的氨基酸序列。16、一種核酸分子，其包含編碼SEQIDNO:l的氨基酸序列的核苷酸序列。17、一種預(yù)防或治療與N-型鈣通道活性有關(guān)的疾病、障礙或狀態(tài)的藥物組合物，其包含(a)治療有效量的權(quán)利要求715中任一項(xiàng)所述的co-芋螺毒素；和(b)可藥用載體。18、根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中，所述疾病、障礙或狀態(tài)為慢性疼痛狀態(tài)，急性疼痛，術(shù)后疼痛，心境障礙，焦慮障礙，抑郁，成癮障礙，胃腸疾病，生殖泌尿疾病，與低氧、缺氧或局部缺血有關(guān)的神經(jīng)毒性損傷，或精神分裂癥。19、一種在被試者中預(yù)防或治療與N-型鈣通道活性有關(guān)的疾病、障礙或狀態(tài)的方法，其包括向需要這種治療的被試者施用包含(a)治療有效量的權(quán)利要求715中任一項(xiàng)所述的co-芋螺毒素；和(b)可藥用載體的藥物組合物。20、根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述疾病、障礙或狀態(tài)為慢性疼痛狀態(tài)，急性疼痛，術(shù)后疼痛，心境障礙，焦慮障礙，抑郁，成癮障礙，胃腸疾病，生殖泌尿疾病，與低氧、缺氧或局部缺血有關(guān)的神經(jīng)毒性損傷，或精神分裂癥。21、權(quán)利要求715中任一項(xiàng)所述的co-芋螺毒素用于制備預(yù)防或治療與N-型轉(zhuǎn)通道活性有關(guān)的疾病、障礙或狀態(tài)的藥物的用途。22、根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中，所述疾病、障礙或狀態(tài)為慢性疼痛狀態(tài)，急性疼痛，術(shù)后疼痛，心境障礙，焦慮障礙，抑郁，成癮障礙，胃腸疾病，生殖泌尿疾病，與低氧、缺氧或局部缺血有關(guān)的神經(jīng)毒性損傷，或精神分裂癥。全文摘要本發(fā)明涉及一種提高ω-芋螺毒素與N-型鈣通道的結(jié)合可逆性的方法，該方法包括制備第11和/或12位氨基酸為Ile和/或Ala殘基的ω-芋螺毒素，所述殘基分別位于通式I所示的ω-芋螺毒素的第2半胱氨酸殘基與第3半胱氨酸殘基之間的第二環(huán)內(nèi)，以使所制備的ω-芋螺毒素與N-型鈣通道具有提高的結(jié)合可逆性。另外，本發(fā)明涉及一種新的ω-芋螺毒素和藥物組合物，其對(duì)N-型鈣通道的阻斷活性和特異性具有似乎可能的性質(zhì)，并且具有極大提高的與N-型鈣通道的結(jié)合可逆性。文檔編號(hào)A61P25/00GK101557820SQ200780040969公開(kāi)日2009年10月14日申請(qǐng)日期2007年11月2日優(yōu)先權(quán)日2006年11月4日發(fā)明者俞英在,尹正我,徐洪源,李承奎,林惠媛,羅興植,金炫廷,金載一,魯星勛申請(qǐng)人:安奈根株式會(huì)社