專利名稱：細胞外基質(zhì)蛋白1及其調(diào)節(jié)劑在制備過敏性疾病診斷或治療藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及細胞外基質(zhì)蛋白1及其調(diào)節(jié)劑在制備過敏性疾病診斷或治療藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在過去的二十年中，像哮喘等過敏性疾病在西方國家發(fā)病率已超過人口的25%， 而且呈穩(wěn)定的上升趨勢。而在中國的北京，上海和廣州等發(fā)達的城市，過敏性疾病的發(fā)病率也逐年增加。這不僅影響人們的生活質(zhì)量，特別是幼兒哮喘，直接影響了兒童身體的正常發(fā)育，還對國家經(jīng)濟的發(fā)展造成一定阻礙作用。當機體幼稚Th細胞被抗原遞呈細胞激活后，經(jīng)過克隆增殖與細胞分化，形成不同的細胞亞型如Thl，Th2, Thl7和Treg等。不同的細胞亞型介導(dǎo)不同的疾病，其中Th2細胞分泌大量的白介素4，5和13。Th2細胞功能為輔助B細胞增殖、分化，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答， 參與I型超敏反應(yīng)等，在抗寄生蟲以及過敏反應(yīng)中起到重要的作用。Th2細胞能夠介導(dǎo)過敏性哮喘、皮膚炎癥反應(yīng)、過敏性皮炎，寄生蟲感染等。作為Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的一種，過敏性哮喘是一種肺部的慢性炎癥疾病，它的主要特征有血清中IgE水平升高，肺部嗜酸性粒細胞等炎癥細胞浸潤，黏液分泌過多，呼吸道非特異性反應(yīng)增強。過敏性哮喘的發(fā)病機理可以簡單地概括為機體在呼吸道接觸到某種過敏原而發(fā)生免疫反應(yīng)產(chǎn)生針對該過敏原的特異性IgE類抗體，并且這些抗體通過受體結(jié)合于肥大細胞表面；當機體再次遇到相同過敏原時，該過敏原就能和特異性的 IgE結(jié)合，從而使肥大細胞表面的IgE發(fā)生橋聯(lián)，引起了肥大細胞的脫顆粒作用，釋放白三烯，組胺等介質(zhì)，招募炎癥細胞浸潤到肺組織，導(dǎo)致平滑肌收縮，血管擴張，氣管阻塞，肺部炎癥發(fā)生。從免疫學的層面上來講，過敏性哮喘是一個典型的Th2反應(yīng)。CD4陽性的輔助性 T細胞通過其表面的受體TCR識別過敏原，并釋放白細胞介素，趨化因子等細胞因子，表達一些共刺激因子，Th2細胞釋放的Th2類型的細胞因子IL-4和共刺激因子⑶40L能夠傳遞給B細胞進行抗體重鏈轉(zhuǎn)換的信號，從而使B細胞分泌IgE類抗體；它分泌的IL-4，IL-10 可以調(diào)節(jié)肥大細胞的功能，同時IL-5又是嗜酸性粒細胞浸潤和發(fā)揮功能必不可少的因素。雖然目前國內(nèi)外對Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的研究日益加深，但是有效的特異性治療手段卻相對甚少，其中很大一部分原因在于過敏原的多樣性和復(fù)雜性。目前的治療藥物如糖皮質(zhì)激素，β 2受體激動劑，茶堿，白三烯受體拮抗劑等都具有一定的負作用和耐受性。因此，如何針對炎癥發(fā)生的機制發(fā)展新的診斷和治療手段，研發(fā)出新的抗過敏藥物， 有著非常重要的科學意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供細胞外基質(zhì)蛋白1及其調(diào)節(jié)劑在制備Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病診斷或治療藥物中的應(yīng)用。
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在本發(fā)明的第一方面，提供一種細胞外基質(zhì)蛋白1的抑制劑的用途，用于制備防治或改善Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于抑制Th2細胞遷移出脾臟或淋巴結(jié)到達病灶部位；降低Th2免疫應(yīng)答；下調(diào)血清中IgE水平；減輕肺部的炎癥侵潤；降低趨化因子受體SlPl和CCR4表達；或降低轉(zhuǎn)錄因子klf2表達。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞外基質(zhì)蛋白1的抑制劑選自特異性干擾細胞外基質(zhì)蛋白1基因或其上游基因表達的干擾分子(如小干擾RNA 分子或反義核苷酸)；特異性與細胞外基質(zhì)蛋白1結(jié)合的抗體或配體。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞外基質(zhì)蛋白1基因的上游基因是gata3或stat6基因。在另一優(yōu)選例中，所述的細胞外基質(zhì)蛋白1的抑制劑是干擾分子，其選自序列如SEQ ID NO 2所示的寡核苷酸，或包含SEQ ID NO 2所示的寡核苷酸序列的表達載體(干擾gata3基因的表達)；或序列如SEQ ID NO 1所示的寡核苷酸，或包含SEQ ID NO 1所示的寡核苷酸序列的表達載體(干擾細胞外基質(zhì)蛋白1基因的表達)。在另一優(yōu)選例中，所述的包含SEQ ID NO :1或2所示的寡核苷酸序列的表達載體在進入體內(nèi)后能夠形成特異性干擾細胞外基質(zhì)蛋白1基因或其上游基因的表達的抑制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病選自(但不限于)過敏性哮喘，皮膚炎癥反應(yīng)，過敏性皮炎，寄生蟲感染。在本發(fā)明的另一方面，提供一種防治Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的干擾分子，選自序列如SEQ ID NO 2所示的寡核苷酸；或序列如SEQ ID NO 1所示的寡核苷酸。在本發(fā)明的另一方面，提供一種防治Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的抑制劑，所述抑制劑為重組表達載體，其含有SEQ ID NO 2所示的寡核苷酸序列；或SEQ ID NO 1所示的寡核苷酸序列；所述的重組表達載體在進入體內(nèi)后能夠特異性干擾細胞外基質(zhì)蛋白1基因或其上游基因的表達。在本發(fā)明的另一方面，提供一種細胞外基質(zhì)蛋白1的用途，用于篩選防治Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選防治Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括(1)用候選物質(zhì)處理表達細胞外基質(zhì)蛋白1的體系；和
(2)檢測所述體系中細胞外基質(zhì)蛋白1的表達或活性；其中，若所述候選物質(zhì)可降低細胞外基質(zhì)蛋白1的表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是防治Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)包括在測試組中，將候選物質(zhì)加入到表達細胞外基質(zhì)蛋白1的體系中；和/或步驟(2)包括檢測測試組的體系中細胞外基質(zhì)蛋白1的表達或活性，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達細胞外基質(zhì)蛋白1的體系；如果測試組中細胞外基質(zhì)蛋白1的表達或活性在統(tǒng)計學上低于(優(yōu)選顯著低于， 如低20%以上，較佳的低50%以上；更佳的低80%以上)對照組，就表明該候選物是防治 Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的體系中還表達GATA3或STAT6蛋白，所述方法還包括檢測所述體系中GATA3或STAT6蛋白的表達或活性；其中，若所述候選物質(zhì)可降低(優(yōu)選顯著降低，如低20%以上，較佳的低50%以上；更佳的低80%以上)GATA3或STAT6蛋白的表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是防治Th2 細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的體系選自細胞體系(或細胞培養(yǎng)物體系)、亞細胞體系、 溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從候選物質(zhì)中進一步選擇和確定對于防治Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病有用的物質(zhì)。在本發(fā)明的另一方面，提供特異性識別細胞外基質(zhì)蛋白1或與細胞外基質(zhì)蛋白1 結(jié)合的物質(zhì)的用途，用于制備診斷Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的試劑或試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的特異性識別細胞外基質(zhì)蛋白1或與細胞外基質(zhì)蛋白1結(jié)合的物質(zhì)通過判斷待測樣品(如血清和痰液)中細胞外基質(zhì)蛋白1的表達量來診斷Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病。若細胞外基質(zhì)蛋白1的表達量高于標準值，則診斷為Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病。所述的標準值為正常人表達細胞外基質(zhì)蛋白1的平均值。在本發(fā)明的另一方面，提供一種防治Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的方法，所述方法包括下調(diào)所述哺乳動物體內(nèi)細胞外基質(zhì)蛋白1或其上游蛋白的表達或活性。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、C57BL/6小鼠的幼稚⑶4+輔助性T細胞，在外加Thl或Th2條件下培養(yǎng)分化，在1 5天時間里收細胞進行Real-time PCR(a)和Western blot (b)，檢測ECMl的表達情況；對Th細胞的5種不同亞型分別進行real-time PCR(c)，Western blot (d)和上清 ELISA (e)檢測ECMl表達情況；對其它免疫細胞檢測ECMl表達情況(f)。圖2、ECMl被經(jīng)典的Th2信號通路所上調(diào)。(a) STAT6分子敲除(KO)后，ECMl表達情況。(b)通過逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)再轉(zhuǎn)入持續(xù)性表達的STAT6 (STAT6-CA)，ECMl表達情況。
( c)用RNAi技術(shù)下調(diào)GATA3，ECMl表達情況。(d) CHIP實驗驗證GATA3是否能直接結(jié)合在ECMl的啟動子上。圖3、ECMl基因敲除小鼠顯示體內(nèi)Th2免疫應(yīng)答降低。(a)過繼轉(zhuǎn)移了野生型(WT)以及ECMl基因敲除小鼠(KO)的骨髓細胞后的小鼠在誘導(dǎo)哮喘后肺泡灌洗液中的免疫細胞數(shù)目。(b)ELISA方法檢測過繼轉(zhuǎn)移了野生型(WT)以及ECMl基因敲除小鼠(KO)的骨髓細胞后的小鼠在誘導(dǎo)哮喘后血清中的OVA特異性IgE。以未誘導(dǎo)哮喘組(PBS)作為對照。(c)肺組織切片顯示過繼轉(zhuǎn)移了野生型(WT)以及ECMl基因敲除小鼠(KO)的骨髓細胞后的小鼠在誘導(dǎo)哮喘后肺部的炎癥侵潤情況。以未誘導(dǎo)哮喘組(PBS)作為對照。(d)檢測脾臟，縱膈淋巴結(jié)(LLN)中免疫細胞數(shù)量。(e)淋巴結(jié)細胞如果經(jīng)體外重刺激96小時后，其分泌的Th2細胞因子(IL_4， IL-5, IL-13)和 IFN-Y 情況。圖4、將Thl和Th2細胞經(jīng)CFSE標記后靜脈注射給RAG-I基因敲除小鼠 (RAG-l-/-)，24小時后檢測血液，腸系膜淋巴結(jié)(MLN)，腹股溝淋巴結(jié)(iLN)中的CFSE陽性細胞數(shù)目。圖5、ECMl的缺失導(dǎo)致趨化因子受體SlPl和CCR4表達降低。(a) Realtime-PCR檢測Thl和Th2細胞中各趨化因子受體的表達情況。(b) Realtime-PCR檢測與SlPl表達相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子klf2的表達情況。(c)在敲除ECMl基因的細胞(K0 mock)中過表達ECMl (K0 ecml)，SlPl和klf2的表達情況。(d-g)體外遷移實驗驗證ECMl與趨化因子受體SlPl的遷移功能相關(guān)，其中d為配體SlP體外誘導(dǎo)細胞遷移的實驗，敲除ECMl基因的細胞遷移明顯降低；e和f為將體外不同染色的野生型與ECMl基因敲除的Th2細胞共培養(yǎng)，再用流式細胞方法將兩者分開，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后，野生型細胞能恢復(fù)基因敲除細胞的遷移能力，g為共培養(yǎng)后野生型細胞能恢復(fù)基因敲除細胞的SlPl和Klf2分子的表達。圖6、野生型(WT mock)和ECMl基因敲除型小鼠(K0 mock) Th2細胞分別過表達 ECMl (K0 ECM1)或者 SlPl (K0 S1P1)，klf2 (K0 klf2)后再過繼轉(zhuǎn)移給 RAGl 敲除小鼠，M 小時后檢測血液，脾臟，腸系膜淋巴結(jié)(MLN)和腹股溝淋巴結(jié)(iLN)中的細胞數(shù)。證明3者有相同的作用，都可以促進細胞遷移出淋巴結(jié)。圖 7、Western blot 驗證 ecml 基因設(shè)計的 siRNA 分子(SEQ ID NO 1)抑制 ECMl 表達的能力。其中，RNAi control為無關(guān)序列。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次揭示細胞外基質(zhì)蛋白 1 (ExtracellularMatrix Protein 1，ECM1)可調(diào)節(jié)Th2細胞的遷移，與Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的發(fā)生或發(fā)展密切相關(guān)。在Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病動物模型的染色體中敲除 ECMl基因后，ECMl缺陷動物發(fā)生的過敏性癥狀顯著減輕，因此可知ECMl蛋白是一種在Th2 細胞介導(dǎo)的過敏性疾病發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用的因素，從而可以作為藥物靶點開發(fā)預(yù)防或治療過敏性疾病的藥物。
ECMl及其用途ECMl是最早利用雙向電泳的方法發(fā)現(xiàn)于間質(zhì)成骨細胞細胞系MN7，它是一個85KD 的蛋白，并且在序列分析中發(fā)現(xiàn)ECMl存在糖基化修飾。在小鼠中克隆到ECMl基因以后，很快就在人類的基因組中找到了同源性很高的對應(yīng)基因。并且，對于人類的ECMl基因的研究發(fā)現(xiàn)，ECMl對軟骨成骨的形成，內(nèi)皮細胞的增生和血管發(fā)生都起到重要的調(diào)節(jié)作用。在 2002年皮膚病病人的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 ECMl的突變體，正是由于ECMl的突變導(dǎo)致了常染色體隱性遺傳的皮膚病類脂質(zhì)蛋白質(zhì)沉積癥(lipoid proteinosis).另外隨后發(fā)現(xiàn)在苔癬硬化癥(lichen sclerosus)病人的體內(nèi)能產(chǎn)生自發(fā)性的ECMl的抗體，從而導(dǎo)致ECMl功能的喪失和疾病的發(fā)生。至今為止絕大部分的研究都集中在人類皮膚病的研究中，并且認為ECMl 在人類一些皮膚病中起到了主要的作用，并且作為一種疾病的檢測指標，但是其對免疫細胞的功能以及在免疫性疾病中的作用卻很少有報道。任何適合的ECMl蛋白均包括在本發(fā)明中。所述的ECMl蛋白包括全長的ECMl蛋白或其生物活性片段。優(yōu)選的，所述的ECMl蛋白的氨基酸序列可以與GenBank登錄號 NP_0319252基本上相同。編碼所述的ECMl蛋白的核苷酸序列可以與GenBank登錄號匪 007899. 2或該序列的簡并的序列基本上相同。經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的ECMl蛋白的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。ECMl蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。例如，所述的ECMl蛋白可以是來自于鼠(如小鼠)的，也可以是來自于人或其它哺乳動物的、氨基酸序列接近或基本相同的(如相同性大于70%，較佳的相同性大于80% ；更佳的相同性大于85% ；最佳的相同性大于90% )、且生物活性與小鼠ECMl蛋白的生物活性相同(如對于Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的發(fā)生或發(fā)展具有重要作用)的蛋白。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，ECMl選擇性地被Th2細胞表達，并且在Th2細胞分化的晚期達到一個高峰。并可調(diào)節(jié)Th2細胞的遷移。接著，利用轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)得到了 ECMl基因高表達和基因敲除小鼠。研究表明在由Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病如哮喘模型中，發(fā)現(xiàn)來自 ECMl基因敲除小鼠的Th2細胞在體內(nèi)的分布，發(fā)生了很大的改變。這些細胞在淋巴結(jié)和脾臟中大量堆積，而外周血中的比例卻大大降低，說明ECMl對Th2細胞的遷移具有重要的調(diào)控功能。深入研究揭示ECMl能通過調(diào)控趨化因子受體SlPl和CXCR4的表達，從而影響了 Th2細胞的遷移。ECMl和它的中和性抗體可開發(fā)成診斷和治療Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病藥物。通過上述的研究工作可知，ECMl是一個新的、對過敏性相關(guān)疾病有保護作用的藥物靶點。針對ECMl的各種治療手段可以作為治療Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病及相關(guān)疾病的新穎和有效的手段。ECMl的抑制劑及其用途基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種ECMl的抑制劑的用途，用于制備抑制Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的組合物。所述的Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病包括但不限于過敏性哮喘，皮膚炎癥反應(yīng)，過敏性皮炎，寄生蟲感染等。所述的ECMl的抑制劑還用于促進Th2細胞遷移到脾臟、淋巴結(jié)；降低Th2免疫應(yīng)答；下調(diào)血清中IgE水平；減輕肺部的炎癥侵潤；降低趨化因子受體SlPl和CCR4表達；或降低轉(zhuǎn)錄因子klf2表達。
如本文所用，所述的ECMl基因或蛋白的抑制劑包括了拮抗劑、下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑等。更具體地，所述的ECMl基因或蛋白的抑制劑是指任何可降低ECMl蛋白的活性、降低ECMl基因或蛋白的穩(wěn)定性、下調(diào)ECMl蛋白的表達、減少ECMl蛋白有效作用時間、或抑制ECMl基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對于下調(diào)ECMl有用的物質(zhì)，從而可用于預(yù)防或治療Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病。例如，所述的拮抗劑是特異性干擾ECMl基因表達的小干擾RNA分子或反義核苷酸；或特異性與ECMl結(jié)合的抗體或配體。此外，一類ECMl基因的上游基因或蛋白的抑制劑也包括在所述的ECMl基因或蛋白的抑制劑的范圍內(nèi)。所述的ECMl基因的上游基因例如GATA3基因。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述的ECMl的抑制劑是一種特異性與ECMl結(jié)合的抗體。所述的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。可用ECMl蛋白免疫動物，如家兔， 小鼠，大鼠等來生產(chǎn)多克隆抗體；多種佐劑可用于增強免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。與之相似的，表達ECMl或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。所述的抗體也可以是單克隆抗體，此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler 等人，Nature 256 ；495，1975 ；Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6 :511，1976 ；Kohler 等人， Eur. J. Immunol. 6 :292,1976 ;Hammerling 等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y. ,1981)。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述的ECMl的抑制劑是一種特異性與ECMl上游蛋白結(jié)合的抗體或配體。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述的ECMl的抑制劑是一種ECMl特異性的小干擾 RNA 分子(siRNA)。如本文所用，所述的“小干擾 RNA(smallinterfering RNA, siRNA)” 是指一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA，這個過程就是RNA干擾(RNAinterference)過程。作為本發(fā)明的一種實施方式，所述的ECMl的抑制劑是一種特異性干擾ECMl基因的上游基因(如可啟動ECMl基因的表達的基因)表達的干擾分子。作為本發(fā)明的特別優(yōu)選的方式，提供了一種效果良好的小干擾RNA分子，所述的小干擾RNA分子可特異性的干擾ECMl基因上游的GATA3基因的表達，與其它的人類核酸序列沒有顯著的同源性；并且經(jīng)驗證，其具有良好的干擾GATA3基因的效果，從而下調(diào)ECMl 基因的表達，例如靶序列為ttcggatgtaagtcgagg的小干擾分子。作為本發(fā)明的特別優(yōu)選的方式，提供了另一種效果良好的小干擾RNA分子，其可特異性的干擾ECMl基因表達，與其它的人類核酸序列沒有顯著的同源性；并且經(jīng)驗證，其具有良好的干擾ECMl基因的效果，例如靶序列為ccttgtagagctgaccaag的小干擾分子。小干擾RNA可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個正義鏈和一個反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個雙鏈RNA復(fù)合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補的正義鏈和反義鏈是化學合成的，其后可通過退火雜交，產(chǎn)生合成的雙鏈RNA復(fù)合物。本發(fā)明對小干擾RNA的制備方法沒有特別的限制，包括但不限于化學合成法，體外轉(zhuǎn)錄法等。應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員在得知了 ECMl與Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的相關(guān)性以后，可以以各種途徑方便地制備出針對ECMl或其上游基因的小干擾RNA，從而用于抑制Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病。所述的小干擾RNA可通過采用適當?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到體內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到體內(nèi)。此外，小干擾RNA包含的正義鏈和反義鏈可通過一個或多個編碼正義鏈和反義鏈的表達盒來制備。當正義鏈和反義鏈由一個單獨的表達盒編碼時，它們可以從生成的轉(zhuǎn)錄物中斷裂形成分離的正義鏈和反義鏈，其后雜交生成雙鏈小干擾RNA。所述的小干擾RNA可通過采用適當?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細胞內(nèi)。組合物本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.00000 l-50Wt% ；較佳的 0. 00001-20wt% ；更佳的，0. 0001-10wt% )的所述的ECMl的抑制劑，以及藥學上可接受的載體。所述的組合物可用于抑制Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病。任何前述的ECMl的抑制劑均可用于組合物的制備。如本文所用，所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和 /或動物所接受的量。所述“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細胞轉(zhuǎn)染試齊LU在得知了所述ECMl基因或蛋白的抑制劑的用途后，可以采用本領(lǐng)域熟知的多種方法來將所述的抑制劑或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動物。包括但不限于皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。優(yōu)選的，可采用基因治療的手段進行。比如，可直接將ECMl的抑制劑通過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶ECMl的抑制劑的表達單位(比如表達載體或病毒等，或siRNA)遞送到靶點上，并使之表達活性的ECMl抑制劑，具體情況需視所述的抑制劑的類型而定，這些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明所述的ECMl的抑制劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于所述的ECMl基因或蛋白的抑制劑的藥代動力學參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當本發(fā)明的ECMl的抑制劑每天以約0. 00001mg-50mg/ kg動物體重(較佳的0. OOOlmg-lOmg/kg動物體重)的劑量給予，能得到令人滿意的效果。 例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。藥物篩選在得知了 ECMl與Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的密切相關(guān)性后，可以基于該特征來篩選抑制ECMl的表達或活性的物質(zhì)。可從所述的物質(zhì)中找到對于預(yù)防或治療Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病真正有用的藥物。因此，本發(fā)明提供一種篩選抑制Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的潛在物質(zhì)的方法， 所述的方法包括用候選物質(zhì)處理表達ECMl的體系；和檢測所述體系中ECMl的表達或活性；若所述候選物質(zhì)可抑制ECMl的表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是抑制Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的潛在物質(zhì)。所述的表達ECMl的體系例如可以是細胞(或細胞培養(yǎng)物)體系， 所述的細胞可以是內(nèi)源性表達ECMl的細胞；或可以是重組表達ECMl的細胞。所述的表達 ECMl的體系還可以是亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系(如動物模型，優(yōu)選非人哺乳動物的動物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進行篩選時，為了更易于觀察到ECMl的表達或活性的改變，還可設(shè)置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的表達ECMl的體系。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，所述的體系中還表達GATA3蛋白，所述方法還包括檢測所述體系中GATA3蛋白的表達或活性；其中，若所述候選物質(zhì)可降低GATA3蛋白的表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是防治Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的潛在物質(zhì)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以進一步選擇和確定對于抑制Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病真正有用的物質(zhì)。本發(fā)明對于ECMl蛋白的表達、活性、存在量或分泌情況的檢測方法沒有特別的限制。可以采用常規(guī)的蛋白定量或半定量檢測技術(shù)，例如(但不限于)=SDS-PAGE法， Western-Blot 法等。另一方面，本發(fā)明還提供了采用所述篩選方法獲得的抑制Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的潛在物質(zhì)。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠?qū)τ谝种艵CMl的表達和活性，進而抑制Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病有用的物質(zhì)。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)首次揭示ECMl與Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的發(fā)生或發(fā)展密切相關(guān)，從而可以作為藥物靶點開發(fā)預(yù)防或治療Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的藥物。(2)基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)找到了可抑制ECMl的抑制劑，其可非常有效地抑制 ECMl的表達，從而抑制Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的發(fā)生。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。材料和方法動物C57BL/6，D011. 10轉(zhuǎn)基因小鼠，和STAT6-基因敲除小鼠均購自Jackson實驗室(為對外專賣轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠的公司)，RAG-I-/-由Jackson實驗室獲得)， ECMl轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠自己構(gòu)建。這些小鼠均飼養(yǎng)在中科院上海生化細胞所實驗動物中心(SPF級)。逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)的質(zhì)粒MSCV-IRES_GFP(獲自 UC Berkeley，Dr. XingxingZang 惠贈)。
siRNA系統(tǒng)的質(zhì)粒pBS/U6購自addgene公司?？贵w=APC標記抗小鼠IFN-g (XMG1. 2)從eBioscience購得。PE標記抗小鼠 IL-4 (BVD4-1D11)、PE 標記抗小鼠 CD8 α (53-6. 7)、FITC 標記抗小鼠 CD4 (GK1. 5)、APC 標記抗小鼠CD25 (PC61. 5)、APC標記抗小鼠CD122 (TM-bl)和PE標記抗小鼠CD132 (TUGm2)從BD Pharmingen 公司購買。^ Aktl/2/3 (H136), p-Akt 1/2/3 (Ser 473), p-Stat6 (Tyr 641-R) 和 Gata3 (HG3-31)抗體從 SantaCruz 購買?？?p-Stat5 (Tyr694)和總 Mat5 的抗體從 Cell Signaling公司購買。PI (3)K和mTOR信號抑制劑LY294002和 Rapamycin從Sigma-Aldrich 公司購買。細胞純化和體外分化細胞的誘導(dǎo)幼稚0)4+(0)4+0)44-0)621") T 細胞，CD4+T 細胞，CD8+T 細胞，CD19+B 細胞和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的陽性細胞(GFP+)均由FACSAria(BD Biosciences)流式分選獲得。陽性細胞純度通常高于95%。骨髓源樹突狀細胞(BM-DC)的培養(yǎng)采用最初來源于化油3 等的方法，經(jīng)過修改。具體地說，從小鼠股骨和脛腓骨中，沖出骨髓細胞，裂解紅細胞。細胞以每孔1. 5 X 106-2 X IO6細胞/Iml培養(yǎng)于M孔板中，培養(yǎng)基含有20ng/ml rGM-CSF。每隔一天非粘附細胞被小心移去，加入含有rGM-CSF的新鮮培養(yǎng)基。經(jīng)過6天培養(yǎng)，收集貼壁細胞，重新鋪在M孔板或60mm培養(yǎng)皿內(nèi)，24小時后進行轉(zhuǎn)染或刺激。在T細胞體外分化系統(tǒng)中，T細胞培養(yǎng)于加有10%胎牛血清(GIBCO)，谷氨酸鈉QmM)，β-ME(50mM)，青霉素 (50units/ml)，鏈霉素(50mg/ml)，丙酮酸鈉(ImM)和!fepes (IOOmM)的 RPMI 1640 培養(yǎng)液中。T細胞經(jīng)由5 μ g/ml包板anti-⑶3和2 μ g/ml可溶anti-OT^刺激，在如下誘導(dǎo)環(huán)境中朝著不同的方向進行分化ThO-----10 μ g/ml anti-IFN- γ , 10 μ g/ml anti_IL_12/23 禾口 10 μ g/ml
anti-IL-4 ；Thl-----lOng/ml IL—12 禾口 10 μ g/ml anti-IL-4 ；Th2-----lOng/ml IL-4,10 μ g/ml anti-IFN-y 和 10 μ g/ml anti-IL-12/23 ；Thl7-----lng/ml TGF-β 1，20ng/ml IL-6，lOng/ml IL-I α ,lOng/ml IL-23，
10 μ g/ml anti-IFN-y 禾口 10 μ g/ml anti-IL-4 ；iTreg-----lOng/ml hTGF-β 1 ；在ThO, Thl, Th2 和 iTreg 培養(yǎng)體系里還加入了 50U/ml IL-2。逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)用于制備逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，包括MSCV，MSCV-IRES-GFP, MSCV_IRES_hCD4，pCMV/ Eco-Envelope 和 pKF3-RSV/Gag_Pol 均獲自 UCBerkeley，Dr. Xingxing Zango ECMl (GenBank 登錄號AAI45382. 1)和STAT6-CA (GenBank登錄號AAA79006. 1)的全長cDNA被插入到 MSCV-IRES-GFP載體的NotI和Mil酶切位點中。過表達SlPl的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建用引物ACGCGTCGACATGGTGTCCACTAGCATCC (SEQ ID NO: 11)和 CCCATCGATTTAGGAAGAAGAATTGACGTT (SEQ ID NO 12)從幼稚 Th 細胞中 PCR獲得SlPl基因，插入到MSCV-IRES-GFP載體的Mil和ClaI的酶切位點中。 過表達klf2的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建用引物GAAGATCTACACACAGTCCCTGCCATGG ( SEQ ID NO: 13)和 CCATCGATCTGTTTGCAAGGGGACCGTG (SEQ ID NO :14)從幼稚 Th 細胞中 PCR 獲得klf2基因。插入到MSCV-IRES-GFP載體的BglII和ClaI的酶切位點中。
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為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的RNAi載體，本發(fā)明人合成針對小鼠GATA3基因序列的互補寡核苷酸序列(序列是ttcggatgtaagtcgagg，SEQ ID NO :2)，然后將之克隆到pBS/TO 載體的ApaI和EcoRI酶切位點中。接著，分別從pEGFPcl (Clontech)的BglII和BioI酶切位點中切下EGFP編碼片段和從pBS/TO的BamHI和EcoRI酶切位點中切下在U6啟動子下表達GATA3 siRNA的元件，最后將這兩部分克隆進MSCV的相應(yīng)位點中(即BglII和BioI， BamHI 和 EcoRI)以獲得 MSCV-EGFP-GATA3 siRNA 載體。用Lipofectamineanvitrogen)將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染進細胞(ATCC)。 24小時后，將培養(yǎng)液由DMEM換為RPMI1640。48小時之后，收獲病毒上清，在加入 polybrene(6y g/ml)后用于感染已經(jīng)用anti_CD3和anti_CD28預(yù)激活了 30個小時的 ⑶4+T細胞。病毒感染時，培養(yǎng)板于室溫在ISOOrpm條件下離心90分鐘。然后，將培養(yǎng)板放入32°C的培養(yǎng)箱中12個小時。最后，去除掉病毒上清并更換新鮮的細胞分化培養(yǎng)液。Real-time PCR細胞用TRIZOL (Invitrogen)裂解后抽提總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自Takara) 得到cDNA。所有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的數(shù)量在ABI PRISM 7900HT序列檢測儀上(PEApplied Biosystems)用以SYBR Green Master Mix(ABI)為基礎(chǔ)的定量PCR的方法進行測定，每個樣本都檢測3個復(fù)孔，實驗數(shù)據(jù)用SDS 2. 2. 2軟件進行分析。用于real-time PCR analysis 的引物序列如下ECMlGCCAGCTCTGTGGAAGTGGASEQIDNO3
CCGGAATCTGTTTATGCTTGCSEQIDNO4
SlPlATCATGGGCTGGAACTGCATSEQIDNO5
GAGCACGGTGGAGCAGCTAGSEQIDNO6
CCR4GATCACGTGGTCAGTGGCTGSEQIDNO7
CTGAACAAGAGGCCTGGGAGSEQIDNO8
klf2GCCTTATCATTGCAACTGGGASEQIDNO9
TCAGAGCGCGCGAACTTCSEQIDNO10流式細胞檢測為了檢測細胞表面分子的表達水平，T細胞首先用針對Fc受體046 的抗體(購自eBioscience公司)進行孵育以降低非特異性抗體吸附，然后再用相應(yīng)的熒光素標記的單克隆抗體進行染色。為了檢測細胞內(nèi)的IFN-Y和IL-4的分泌，T細胞用PMA(50ng/ml)和 Ionomycin(ImM)重刺激6個小時，并在最后4個小時里往培液中加入Brefeldin Α(10μ g/ ml, Sigma-Aldrich)以阻斷細胞因子分泌到胞外。然后，收獲細胞，并經(jīng)洗滌，固定，破膜 (CALTAG FIX AND PERM)后，加入合適的熒光素標記的anti_IFN_ γ和anti_IL_4抗體進行染色。合適的熒光素標記的表型相配的無關(guān)抗體作為陰性對照。細胞經(jīng)由FACSCalibur流式細胞儀進行分析(BDBiosciences)。ELISA 實驗為了檢測細胞培養(yǎng)上清里的細胞因子濃度，IL-2，4，5，10，13和IFN-γ ELISA Duoset kits從R&D Systems購得并按照生產(chǎn)商相關(guān)方法手冊進行操作。骨髓重建
用MACS磁珠分離野生型小鼠和ECMl基因敲除小鼠的⑶4+細胞，通過尾靜脈注射打入照光過((950rad))的C57小鼠體內(nèi)。6_14周后檢測重建效果。動物免疫將10 μ g OVA(Sigma)和Img Alum混合在200 μ 1 PBS里，并在第1天和第14天分別對野生型C57BL/6和Dec2轉(zhuǎn)基因小鼠進行免疫。到第21天，處死小鼠并取縱隔淋巴結(jié)細胞用0VA(100yg/ml)在體外重刺激培養(yǎng)4天。然后，收獲上清以檢測相關(guān)細胞因子的分泌。免疫沉淀和Wfestern印跡細胞收集后置于冰上，用PBS洗滌一次后，加入含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA 緩沖液(20mM Tris-HCKpH 7. 4), 137mM NaCl, 10% (ν/ν)甘油，(ν/ν)NP-40，ImM 焦磷酸，2mM Na3VO4, IOmM NaF) (600 μ 1/孔)裂解細胞。冰上裂解5_10分鐘后，14，OOOrpm離心20分鐘，收集上清于EP管中。取40 μ 1上清與6X SDS樣品緩沖液混合，作為全細胞裂解液(Whole cell lysates, WCL)備用。剩余上清中加入25% (w/v)BSA終濃度至0. 2%， Protein A/G樹脂(30 μ 1)及相應(yīng)的抗體。4°C孵育3小時后，3000rpm正反離心30秒收集樹脂，用RIPA緩沖液洗3次后，將殘液抽吸干凈，之后加入20 μ 1 IXSDS樣品緩沖液，煮沸 5分鐘進行免疫印跡法印跡檢測。在SDS-PAGE膠中每孔上樣10_20 μ 1樣品。電泳后轉(zhuǎn)膜將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用TTBS洗膜一次，用5% (w/v)脫脂奶粉封閉膜1小時，用TTBS洗膜一次，將稀釋后的一抗與膜室溫雜交2小時或4°C過夜。用TTBS洗滌三次后將稀釋后的二抗與膜室溫雜交1小時，用TTBS洗滌后加入底物顯色，暗室曝光。ECMl的蛋白水平檢測1 X IO6T細胞收獲后，用新鮮加入了各種抑制劑(ImM Na orthovanadate， ImMPMSF, 10 μ g/ml Aprotinin, Leup印tin，胃酶抑素)的 20 μ 1 裂解液(50mM HEPES [pH7. 0], 1 % NP-40, 5mM EDTA,450mM NaCl, IOmM Na pyrophosphate 和 50mM NaF)在室溫下超聲處理后，加入β巰基乙醇，100°C中放置5分鐘。在SDS-PAGE膠中，每孔上樣10μ1樣品。電泳后轉(zhuǎn)膜將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用TTBS洗膜一次，用5%脫脂奶粉封閉膜1小時，用TTBS洗膜一次，將稀釋后的一抗與膜室溫雜交2小時或4°C過夜。用TTBS洗滌三次后將稀釋后的二抗與膜室溫雜交1小時，用TTBS洗滌后加入底物顯色，暗室曝光。小鼠過敏性哮喘模型的建立以及得病指標的檢測將10 μ g OVA(Sigma)和Img Alum混合在200 μ 1 PBS里，并在第1天和第14天分別對野生型和ECMl基因敲除小鼠進行腹腔免疫。到第21天，用重懸于PBS的(w/v) 的OVA噴霧重新刺激小鼠，共連續(xù)噴霧5天，每天30分鐘。而后在最后一次噴霧M小時后，處死動物，外周血血清用于抗體IgGl，IgGh和IgE的檢測。一半的肺組織用于制作病理切片，另一半用PBS盥洗肺部得到盥洗液(BAL)。分離肺部縱隔淋巴結(jié)細胞，用IOOyg/ ml OVA重新刺激，96小時后收集細胞上清，ELISA檢測細胞因子濃度。另外分離的淋巴結(jié)和脾臟在計數(shù)后⑶4和⑶8染色，從而得到⑶4+和⑶8+細胞的數(shù)目。3H增殖實驗純化的⑶4+T細胞在96孔板中用預(yù)包被anti-⑶3抗體進行刺激，每孔種入2 X IO5的細胞，用200 μ 1培養(yǎng)液培養(yǎng)72小時。當需要共刺激因子刺激細胞時，加入可溶性的 anti-OT^抗體終濃度為1 μ g/ml。在細胞培養(yǎng)的最后12小時每孔加入1 μ Ci的[3H]胸腺嘧啶，通過檢測[3H]胸腺嘧啶的摻入而反應(yīng)細胞的增殖狀況。每個標本各三個復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后用細胞收集儀收集細胞并用閃爍計數(shù)儀檢測『H]胸腺嘧啶的摻入量。細胞遷移實驗含重組趨化因子SlP (Sigma) 500 μ 1培養(yǎng)液加入M孔板(Corning Coster, Cambridge, ΜΑ) ο Transwell culture inserts (Corning Coster)(5. 0-um pore size)置于每個孔上。80ul T細胞懸液(5.0X105個細胞/孔)加入上室中。在37°C，5% (v/v) CO2 孵育3小時，收集遷移至下室的細胞，光鏡下計數(shù)。實施例實施例1、ECMl特異性高表達于II型輔助性T細胞(Th2)本發(fā)明人分離C57BL/6小鼠的幼稚⑶4+輔助性T細胞，在外加Thl或Th2條件下培養(yǎng)分化，在1 5天時間里收細胞進行Real-time PCR(圖la)和Western blot(圖lb) 檢測ECMl的表達情況，發(fā)現(xiàn)ECMl特異性高表達于Th2細胞，并于第4，5天達到高峰。本發(fā)明人又對Th細胞的5種不同亞型分別進行檢測，也發(fā)現(xiàn)ECMl只特異性高表達于II型輔助性T細胞(Th2) (real-time PCR(圖lc)，Western blot(圖Id)和上清 ELISA (圖 Ie))。其它免疫細胞的檢測發(fā)現(xiàn)ECMl只少量表達于樹突狀細胞，在B細胞和CD8+T細胞中幾乎沒有表達(圖If)。實施例2、ECMl被經(jīng)典的Th2信號通路所上調(diào)Th2細胞中，當把STAT6分子敲除(KO)后，ECMl表達也消失(圖2a)。如果通過逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)再轉(zhuǎn)入持續(xù)性表達的STAT6 (STAT6-CA)能回復(fù)ECMl (圖 2b)。當本發(fā)明人用RNAi技術(shù)下調(diào)GATA3，ECMl表達也隨之下調(diào)(圖2c)。為證明GATA3是否能直接結(jié)合在ECMl的啟動子上，進行了 CHIP實驗。結(jié)果證明 GATA3 能直接結(jié)合在 ECMl 5，端的 4 個 GATA-box 序列-1381 -1327、-940 _9；35、-708 -703、-42 -37(序列位點基于ECMl,GenBank登錄號AAI45382. 1的起始密碼子上游)上，特別是-1381 -1327序列結(jié)合得最明顯(圖2d)。實施例3、ECMl基因敲除小鼠顯示體內(nèi)Th2免疫應(yīng)答降低本發(fā)明人將C57BL/6小鼠經(jīng)Co60照光摧毀造血系統(tǒng)，再過繼轉(zhuǎn)移野生型的和ECMl 基因敲除型的小鼠骨髓細胞進行重構(gòu)(骨髓細胞從野生型和ECMl基因敲除小鼠中分離出來，并且用⑶4磁珠分離去掉⑶4陽性的細胞的干擾，再用RPMI1640 500 μ 1重懸IXlO7 骨髓細胞。受體老鼠用C57BL/6在致死吸收劑量8Gy (SOOrad)照光后M小時，將準備好的骨髓細胞從尾靜脈注入體內(nèi)。六周之后，取外周血白細胞驗證骨髓細胞重構(gòu)效果)。2個月后，小鼠免疫OVA和氫氧化鋁佐劑。2個月后，再次用OVA噴霧激發(fā)哮喘。對肺泡灌洗液中的免疫細胞進行計數(shù)，用ELISA方法檢測血清中的OVA特異性IgE，發(fā)現(xiàn)與對照小鼠相比，過繼轉(zhuǎn)移ECMl基因敲除小鼠骨髓細胞的小鼠肺泡灌洗液中的免疫細胞明顯減少(圖3a)，血清中的OVA特異性IgE也大大降低(圖北)。肺組織切片顯示肺部的炎癥侵潤明顯減輕(圖3c)，直接證明了降低ECMl的表達或活性能夠改善或治療過敏性哮喘。進一步對脾臟、淋巴結(jié)的檢測發(fā)現(xiàn)⑶4+T細胞堆積明顯(圖3d)。淋巴結(jié)細胞如果經(jīng)體外重刺激96小時后，其分泌的Th2細胞因子并沒有太大區(qū)別 (圖 3e)。這些結(jié)果提示，ECMl對Th細胞的細胞因子分泌沒有太大影響，但影響它的遷移 (促進細胞遷移出淋巴組織)。實施例4、過繼轉(zhuǎn)移實驗發(fā)現(xiàn)ECMl能控制Th2細胞的遷移前述實施例3獲得了來源于野生型(WT)和ECMl基因敲除型小鼠(KO)的Thl和 Th2細胞。本發(fā)明人將Thl和Th2細胞經(jīng)CFSE標記(將2. 5 X IO7細胞重懸于含5um CFSE 的40ml培液中，37°C孵育10分鐘，加10%血清終止)后靜脈注射給RAG-I基因敲除小鼠 (RAG-1-/-)，24小時后檢測血液，腸系膜淋巴結(jié)，腹股溝淋巴結(jié)中的CFSE陽性細胞，結(jié)果顯示過繼轉(zhuǎn)移的CFSE陽性細胞大量堆積在脾臟，淋巴結(jié)等淋巴器官，而在血液中的數(shù)量反而減少(圖4)。實施例5、ECMl的缺失導(dǎo)致趨化因子受體SlPl和CCR4表達降低本發(fā)明人利用Microarray方法檢測ECMl缺失(KO)后導(dǎo)致的Thl細胞和Th2細胞內(nèi)基因的一系列變化，再用realtime-PCR確認，發(fā)現(xiàn)趨化因子受體SlPl和CCR4表達降低(圖fe)。與SlPl表達相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子klf2也明顯降低(圖恥)。如果在敲除基因的細胞中再次過表達ECMl (通過逆轉(zhuǎn)錄病毒實現(xiàn)ECMl過表達)， 能夠回復(fù)SlPl和klf2的表達(圖5c)。配體SlP體外誘導(dǎo)細胞遷移的實驗證明，敲除ECMl基因的細胞遷移明顯降低(圖 5d)。將野生型的Th2細胞與ECMl基因敲除的Th2細胞共孵育后再分開分別做遷移實驗(圖5e)，前者能夠恢復(fù)后者的遷移能力(圖5f)以及SlPl和klf2的表達(圖5g)。實施例6、ECMl回復(fù)實驗也證明能回復(fù)體內(nèi)的Th2細胞遷移野生型和ECMl基因敲除型小鼠Th2細胞分別過表達ECMl或者SlPl，klf2。步驟
是將過表達ECMl或者S1P1，klf2的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清，在加入polybrane(6「g/ml)后用于感染已經(jīng)用anti-⑶3 and anti-OT^預(yù)激活了 30個小時的⑶4+T細胞。病毒感染時，培養(yǎng)板于室溫在ISOOrpm條件下離心100分鐘。然后，將培養(yǎng)板放入32°C的培養(yǎng)箱中12個小時。最后，將病毒上清更換為新鮮的細胞培養(yǎng)液。在如下誘導(dǎo)環(huán)境中朝著不同的方向進行分化 7 天10ng/ml IL-4，10「g/ml anti-IFN- γ 禾Π 10 (g/ml anti-IL-12/23。過表達的Th2細胞再過繼轉(zhuǎn)移(IX IO7細胞懸浮于500ul培液中尾靜脈注射小鼠) 給RAGl敲除小鼠二4小時后檢測血液和淋巴結(jié)中的細胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)的Th2細胞遷移得到了回復(fù)(圖6)。實施例7、抑制劑的制備及功能驗證(1)小干擾分子針對ecml基因的核酸序列，設(shè)計了 19bp的siRNA分子(該序列包含在 MSCV-IRES-GFP質(zhì)粒中)，靶序列如下
CCTTGTAGAGCTGACCAAG(SEQ ID NO :1)。給予Th2細胞上述設(shè)計的SiRNA分子(通過制備發(fā)夾結(jié)構(gòu)的載體，轉(zhuǎn)入細胞，構(gòu)建方法同 GATA3 SiRNA 的設(shè)計將 CCTTGTAGAGCTGACCAAG 克隆到 pBS/U6 載體 ApaI 和 EcoRI 酶切位點中。接著，分別從pEGFPcl (Clontech)的BglII和BioI酶切位點中切下EGFP編碼片段和從pBS/TO BamHI和EcoRI的酶切位點中切下在U6啟動子下表達ECMl siRNA的元件，最后將這兩部分克隆進MSCV的相應(yīng)位點(即BglII和BioI,BamHI和EcoRI)中以獲得 MSCV-EGFP-ECM1 siRNA 載體。用Lipofectamineanvitrogen)將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染進細胞(ATCC)。 24小時后，將培養(yǎng)液由DMEM換為RPMI1640。48小時之后，收獲病毒上清，在加入 polybrene(6y g/ml)后用于感染已經(jīng)用anti_CD3和anti_CD28預(yù)激活了 30個小時的 ⑶4+T細胞。病毒感染時，培養(yǎng)板于室溫在ISOOrpm條件下離心90分鐘。然后，將培養(yǎng)板放入32°C的培養(yǎng)箱中12個小時。最后，去除掉病毒上清并更換新鮮的細胞分化培養(yǎng)液。檢測細胞內(nèi)ECMl表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白表達被抑制到本底水平，見圖7。(2)抗體將全長ECMl蛋白常規(guī)方法免疫兔子，獲得ECMl蛋白的多克隆抗體。體外實驗發(fā)現(xiàn)，該抗體結(jié)合ECMl的特異性良好，用其檢測ECMl SiRNA的效果發(fā)現(xiàn)抑制ECMl活性顯著，如圖7所示。實施例8、藥物篩選取正常小鼠的Th2細胞，該細胞可內(nèi)源性表達ECMl蛋白。將該種細胞作為用于篩選防治哺乳動物Th2介導(dǎo)的過敏性疾病的藥物的細胞模型。測試組用候選物質(zhì)處理的上述細胞的培養(yǎng)物；對照組不用候選物質(zhì)處理的上述細胞的培養(yǎng)物。在處理后適當時間，采用Real-time PCR和^festern blot方法測定所述細胞的 ECMl的表達。如果與對照組相比，測試組中的ECMl蛋白的表達顯著下降30%以上，則說明該候選物質(zhì)是潛在的防治哺乳動物Th2介導(dǎo)的過敏性疾病的物質(zhì)。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種細胞外基質(zhì)蛋白1的抑制劑的用途，用于制備防治Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的組合物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于 抑制Th2細胞遷移出脾臟或淋巴結(jié)到達病灶部位；降低Th2免疫應(yīng)答；下調(diào)血清中IgE水平；減輕肺部的炎癥侵潤；降低趨化因子受體SlPl和CCR4表達；或降低轉(zhuǎn)錄因子klf2表達。
3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的細胞外基質(zhì)蛋白1的抑制劑選自 特異性干擾細胞外基質(zhì)蛋白1基因或其上游基因表達的干擾分子；特異性與細胞外基質(zhì)蛋白1結(jié)合的抗體或配體。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的細胞外基質(zhì)蛋白1的抑制劑是干擾分子，其選自序列如SEQ ID NO :2所示的寡核苷酸，或包含SEQ ID NO :2所示的寡核苷酸序列的表達載體；或序列如SEQ ID NO :1所示的寡核苷酸，或包含SEQ ID NO :1所示的寡核苷酸序列的表達載體。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病選自過敏性哮喘，皮膚炎癥反應(yīng)，過敏性皮炎，寄生蟲感染。
6.一種防治Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的干擾分子，選自 序列如SEQ ID NO 2所示的寡核苷酸；或序列如SEQ ID NO :1所示的寡核苷酸。
7.一種防治Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的抑制劑，所述抑制劑為重組表達載體，其含有SEQ ID NO :2所示的寡核苷酸序列；或 SEQ ID NO 1所示的寡核苷酸序列；所述的重組表達載體在進入體內(nèi)后能夠特異性干擾細胞外基質(zhì)蛋白1基因或其上游基因的表達。
8.一種細胞外基質(zhì)蛋白1的用途，用于篩選防治Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的潛在物質(zhì)。
9.一種篩選防治Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括(1)用候選物質(zhì)處理表達細胞外基質(zhì)蛋白1的體系；和(2)檢測所述體系中細胞外基質(zhì)蛋白1的表達或活性；其中，若所述候選物質(zhì)可降低細胞外基質(zhì)蛋白1的表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是防治Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的潛在物質(zhì)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的體系中還表達GATA3或STAT6蛋白， 所述方法還包括檢測所述體系中GATA3或STAT6蛋白的表達或活性；其中，若所述候選物質(zhì)可降低GATA3或STAT6蛋白的表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是防治Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的潛在物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及細胞外基質(zhì)蛋白1(ECM1)及其調(diào)節(jié)劑在制備過敏性疾病診斷或治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次揭示ECM1可調(diào)節(jié)Th2細胞的遷移，與Th2細胞介導(dǎo)的過敏性疾病的發(fā)生或發(fā)展密切相關(guān)，從而ECM1可以作為藥物靶點開發(fā)預(yù)防或治療過敏性疾病的藥物。
文檔編號A61P17/00GK102552910SQ20101062010
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者吳曉東, 孫兵, 張淵, 李振虎 申請人:中國科學院上海生命科學研究院