專利名稱：能拮抗促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1的多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一組能與促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體I(CRFRl)特異性結(jié)合并拮抗其功能的多肽及其用途。
背景技術(shù)：
促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(Corticotropin-Releasing Factor, CRF)是由41個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)肽，協(xié)調(diào)應(yīng)激相關(guān)的自主神經(jīng)、免疫、生理和行為反應(yīng)，為參與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵因子。CRF在體內(nèi)分布廣泛，下丘腦的室旁核、大腦、小腦、杏仁-海馬復(fù)合體、腎上腺、腺垂體、胃腸道、胸腺、皮膚、胎盤及炎癥細(xì)胞中都有較高的表達(dá)。CRF主要通過促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體(CRFR)介導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)。CRFR是典型的G蛋白偶聯(lián)受體，膜內(nèi)的第3個(gè)環(huán)區(qū)是G蛋白的偶聯(lián)區(qū)，主要通過AC-cAMP-PKA、PLC-IP3、DAG-PKC、ERK-MAPK等信號(hào)途徑介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。CRFR主要有兩種亞型，即CRFRl和CRFR2。大量研究證實(shí)，CRF-CRFR1 信號(hào)途徑與應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)分泌、自主運(yùn)動(dòng)、行為改變以及內(nèi)臟反應(yīng)密切相關(guān)。應(yīng)激條件下，CRF由下丘腦室旁核釋放，經(jīng)垂體門脈系統(tǒng)到達(dá)垂體前葉，激活垂體前葉促皮質(zhì)素細(xì)胞上的CRFR1，誘導(dǎo)促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的分泌，ACTH進(jìn)入體循環(huán)后促使腎上腺皮質(zhì)分泌糖皮質(zhì)激素，即通過激活下丘腦-垂體-腎上腺軸(ΗΡΑ軸)發(fā)揮其生理功能。正常情況下，HPA軸存在負(fù)反饋抑制，血漿中的糖皮質(zhì)激素可通過海馬、下丘腦、垂體上的糖皮質(zhì)激素受體(GR)抑制過高的HPA軸活性，而長期處于應(yīng)激環(huán)境的條件下，CRF分泌過多，GR受體功能低下，HPA軸負(fù)反饋遇到障礙，引起HPA軸活性過高，從而參與抑郁癥等情感性疾病病理。臨床研究證明，重度抑郁癥患者HPA軸功能亢進(jìn)，腦脊液中CRF水平過高，并通過CRFIU介導(dǎo)了 HPA功能亢進(jìn)和抑郁樣行為。此外，CRFRl在許多人類腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，如人神經(jīng)母細(xì)胞瘤，乳腺癌細(xì)胞，淋巴瘤細(xì)胞等。CRF及其相關(guān)肽通過CRFRl刺激腫瘤血管的生成，激活procaspase-3，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。綜上所述，CRFRl有望成為抗抑郁癥和抗腫瘤治療的新靶標(biāo)。近幾十年來，多肽類藥物以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如活性高、用藥劑量小、毒副作用低 (代謝終產(chǎn)物為氨基酸)，較小的肽幾乎沒有免疫原性等優(yōu)點(diǎn)已引起科學(xué)界的高度重視。開發(fā)多肽類藥物最經(jīng)典和最有效的手段是噬菌體肽庫展示技術(shù)。該技術(shù)是將外源DNA通過基因工程技術(shù)克隆到適當(dāng)?shù)氖删w載體上，使外源DNA片段與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)在噬菌體表面。利用靶分子采用適當(dāng)?shù)奶韵捶椒ㄏ慈シ翘禺惤Y(jié)合的噬菌體，最終從噬菌體文庫中篩選出能特異結(jié)合靶分子的目的噬菌體。目前該技術(shù)已廣泛用于抗原表位分析、分子間相互識(shí)別、新型疫苗及藥物開發(fā)等各個(gè)方面。這項(xiàng)技術(shù)通過“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的親和篩選過程，可以將展示特異性外源肽的噬菌體從噬菌體肽庫篩選出來，經(jīng)擴(kuò)增可以得到上千倍乃至IO8倍的富集，從而可以很容易地對(duì)所篩選的克隆進(jìn)行序列測(cè)定，最終確定表達(dá)的外源肽的氨基酸序列。因此，利用噬菌體表面肽庫篩選到新的CRFRl激動(dòng)劑或拮抗劑具有重要的實(shí)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人利用噬菌體表面展示技術(shù)，通過表達(dá)、純化CRFRlN端胞外區(qū)，得到純化蛋白，然后以該蛋白為靶標(biāo)，篩選環(huán)七肽庫和十二肽庫，令人意外地得到了 7種與N端胞外區(qū)結(jié)合活性較高的多肽?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。第一方面，本發(fā)明涉及具有促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1結(jié)合活性的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述多肽的氨基酸序列為WLPVDWH、NPAFELM、FWGDDGY、LLWLDWH、 YLDAffENEVINF, DGYNGEPffIffQQ 或 YA⑶FWDLDALA。在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽的氨基酸序列為DGYNGEPWIWQQ。第二方面，本發(fā)明涉及一種融合肽，其可操作地連接有上述第一方面所述的一個(gè)或幾個(gè)肽，其中所述肽可以相同或不相同。第三方面，本發(fā)明涉及一種融合蛋白，其可操作地連接有上述第一方面所述的一個(gè)或幾個(gè)肽，以及一種起靶向作用的蛋白或方便純化的蛋白，其中所述肽可以相同或不相同。第四方面，本發(fā)明涉及DNA或RNA序列，其編碼上述第一方面任意一個(gè)實(shí)施方案所述的多肽。第五方面，本發(fā)明涉及一種載體，其含有上述第四方面任意一個(gè)實(shí)施方案所述的 DNA或RNA序列。第六方面，本發(fā)明涉及上述第一至第五方面任意一個(gè)實(shí)施方案所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽、融合肽、融合蛋白、DNA、RNA序列或載體在制備藥劑中的用途，所述藥劑用于促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1的靶向治療。第七方面，本發(fā)明涉及上述第一至第三方面任意一個(gè)實(shí)施方案所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽、融合肽或融合蛋白在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防或治療促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1介導(dǎo)的疾病或病況。在該方面的一個(gè)可替代的方面，本發(fā)明涉及一種預(yù)防或治療受試者中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1介導(dǎo)的疾病或病況的方法，其包括將有效預(yù)防或治療促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1介導(dǎo)的疾病或病況的量的上述第一至第三方面任意一個(gè)實(shí)施方案所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽、融合肽或融合蛋白給予所述受試者。在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1介導(dǎo)的疾病或病況是抑郁癥或腫瘤疾病。第八方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含第一至第三方面任意一個(gè)實(shí)施方案所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽、融合肽或融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以通過本領(lǐng)域中的已知技術(shù)和知識(shí)制備得到本發(fā)明的多肽、蛋白、DNA、RNA序列或載體、融合肽或融合蛋白以及藥物組合物。例如，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以通過多肽自動(dòng)合成儀，使用已知的方法和技術(shù)制備本發(fā)明的多肽。本發(fā)明中使用的各科技術(shù)語和短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義，但是對(duì)于在本說明書中有明確定義的科技術(shù)語和短語，如果所定義的含義與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義不一致，則以本說明書中定義的含義為準(zhǔn)。本發(fā)明多肽的氨基酸序列中的單字母代碼具有本領(lǐng)域中公認(rèn)的含義。例如，DGYNGEPffIffQQ表示天冬氨酸-甘氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-谷氨酸-脯氨酸-色氨酸-異亮氨酸-色氨酸-谷胺酰胺。本發(fā)明藥物組合物中可用的“藥學(xué)上可接受的賦形劑”可以是藥物制劑領(lǐng)域中任何常規(guī)的賦形劑。特定賦形劑的選擇將取決于用于治療特定患者的給藥方式或疾病類型和狀態(tài)。例如，可以作為藥學(xué)上可接受的賦形劑包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、載體、填充劑、粘合齊 、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體和潤滑劑等。必要時(shí)，還可以在藥物組合物中加入香味劑、防腐劑和甜味劑等。用于特定給藥模式的合適藥物組合物的制備方法完全在藥物領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。本發(fā)明的化合物或藥物組合物可以通過本領(lǐng)域中常用的任意方式和任意形式給藥。例如，本發(fā)明的藥物組合物，可以通過口服、直腸、透皮、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和鼻內(nèi)等方式給予本發(fā)明的化合物或藥物組合物。一般而言，以有效預(yù)防或治療促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1介導(dǎo)的疾病或病況的量給予本發(fā)明的化合物。至于具體的精確量，臨床醫(yī)師可以根據(jù)相關(guān)情況，例如被治療的病癥、選擇的給藥途徑、實(shí)際給予的化合物、個(gè)體患者的年齡、體重和反應(yīng)以及患者癥狀的嚴(yán)重性等進(jìn)行確定。本發(fā)明中所述的“有效預(yù)防或治療促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1介導(dǎo)的疾病或病況的量”是指本發(fā)明的多肽，當(dāng)被給予有其需要的受試者時(shí)，能夠在臨床上實(shí)現(xiàn)所述促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1介導(dǎo)的疾病或病況的預(yù)防或治療的量。本發(fā)明的藥物組合物除了包含本發(fā)明的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽外，還可以進(jìn)一步包含其它的藥物活性成分。本發(fā)明人用HER293穩(wěn)定表達(dá)CRFRl，通過促cAMP釋放功能試驗(yàn)檢測(cè)了本發(fā)明多肽的活性，發(fā)現(xiàn)其可顯著拮抗CRF通過CRFRl刺激的促cAMP釋放功能。本發(fā)明篩選出的多肽對(duì)CRFRl具有較高的親和力并且對(duì)CRFRl功能有明顯的影響，提示這些多肽對(duì)以CRFRl為靶標(biāo)的疾病(即促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1介導(dǎo)的疾病或病況)的防治具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的多肽或蛋白還可以用于開展CRFRl相關(guān)的基礎(chǔ)研究，以及用于探索以其為靶標(biāo)治療相關(guān)疾病的可行性。


圖1表示SDS-PAGE檢測(cè)GST-CRFR1N片段的表達(dá)及純化圖2表示通過ELISA確認(rèn)篩選到的噬菌體克隆與GST-CRFR1N的結(jié)合。其中，上圖為12肽克隆，下圖為環(huán)7肽克隆。圖3表示通過ELISA確認(rèn)篩選到的與GST-CRFR1N的結(jié)合親和力較高的噬菌體克隆的結(jié)合飽和實(shí)驗(yàn)。圖4穩(wěn)定表達(dá)CRFRl的HEK293細(xì)胞株的表達(dá)鑒定及功能檢測(cè)。其中，圖A表示 Western blot鑒定蛋白的表達(dá)；圖B表示免疫熒光鑒定CRFRl蛋白的表達(dá)及膜定位。圖5為CRF促胞內(nèi)cAMP釋放標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6表示本發(fā)明多肽P6拮抗CRF刺激的cAMP釋放呈濃度依賴方式。
具體實(shí)施例方式下面將提供實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于舉例說明本發(fā)明，而不應(yīng)被視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1 =CRFRlN端胞外區(qū)的克降、表汰與純化1.實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌BL21 (DE3)菌株購自博邁德公司；GSTrap FF純化柱購自于Wiarmacia Biotech公司；溶菌酶購自于!Iomega公司；超聲波碎儀購自于寧波新芝科技有限公司，高保真Taq酶和內(nèi)切酶購自TAKARA公司。原核表達(dá)載體pGEX-4T2購自于Pharmacia Biotech 公司。人類 CRFRl 質(zhì)粒購自于 UMR cDNA Resource Center。2.實(shí)驗(yàn)方法(1) PCR和表達(dá)載體的構(gòu)建以CRFRl質(zhì)粒為模板進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物為5，-GCGCTCGAGTCAATTGAGGATCTCCTGG C-3，(SEQ No. 8)；下游引物為 5，-CGCGAATTC CCGTCTCTGCCTCCCTCC-3，(SEQ No. 9), PCR ψ 增程序?yàn)?5°C，5分鐘；94°C，1分鐘；55°C，1分鐘；72°C，1分鐘；35個(gè)循環(huán)。將得到的PCR 產(chǎn)物純化，連接到PGEX-4T2，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE!3)菌株中。對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序。(2)表達(dá)菌株的培養(yǎng)與目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)取上述構(gòu)建好的載體菌株20微升接種于LB培養(yǎng)基中，37°C空氣搖床培養(yǎng)過夜，次日按5% (體積百分比)的比例轉(zhuǎn)種于LB培養(yǎng)基，37°C空氣搖床培養(yǎng)約3小時(shí)，當(dāng)OD6tltl值達(dá)到0. 7時(shí)，加入終濃度為ImM的IPTG誘導(dǎo)4_5小時(shí)，收獲細(xì)菌。(3) CRFRlN片段的純化將上述收獲的細(xì)菌離心后棄去上清，將菌體進(jìn)行超聲破碎，將超聲處理后的菌液于4°C，12，000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)形式，證明目的蛋白以可溶性形式存在，分子量約為36kD。將離心上清用GSTrap FF親和純化柱進(jìn)行純化。首先將樣品結(jié)合于純化柱，然后用10倍體積的PBS洗去非特異結(jié)合的雜蛋白，用lOmmol/L還原型谷胱甘肽(用50mMol/L的Tris-HCl緩沖液配制，pH 8. 0)洗脫目的蛋白。SDS-PAGE 檢測(cè)純化效果。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明，獲得了與預(yù)期分子量相符并且純度較高的靶標(biāo)蛋白(圖1)。實(shí)施例2 :CRFR1N端胞外區(qū)結(jié)合肽的篩選1.實(shí)驗(yàn)材料噬菌體隨機(jī)環(huán)七肽庫和十二肽庫均購自New England Biolab。2.實(shí)驗(yàn)方法在得到實(shí)施例1中純化的CRFRlN端胞外區(qū)蛋白的基礎(chǔ)上，以其為靶標(biāo)從噬菌體隨機(jī)環(huán)七肽庫和十二肽庫中，分別經(jīng)過三輪篩選得到了特異的與CRFRlN端胞外區(qū)蛋白結(jié)合的肽(篩選方法參照隨機(jī)肽庫說明書)。利用ELISA對(duì)篩選得到的結(jié)合肽噬菌體進(jìn)行鑒定。具體方法為用濃度為50 μ g/ml的GST-CRFR1N端胞外區(qū)融合蛋白和50 μ g/ml的GST蛋白100微升4°C包被過夜。10% 奶粉37°C封閉1小時(shí)；然后每孔各加100微升(約IO11PfuAil)單克隆噬菌體上清，37°C作 用1小吋；每孔加1 5000倍稀釋的HRP-抗M13 ニ抗100微升，37°C反應(yīng)1小吋；加入100 微升TMB顯色液顯色，反應(yīng)10分鐘后加50微升2M的H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)OD (450nm)值。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖2和圖3可以看出，有18個(gè)噬菌體克隆表現(xiàn)出了對(duì)靶標(biāo)融合蛋白較高的親和 力，與陰性對(duì)照(標(biāo)簽蛋白GST)的親和カ差異顯著，表明它們與CRFRlN端胞外區(qū)結(jié)合而不 是標(biāo)簽蛋白GST。通過DNA序列分析，得到其相應(yīng)的結(jié)合肽氨基酸序列，共得到了如下7種CRFRlN 端胞外區(qū)結(jié)合肽。
代號(hào)氨基酸序列序列號(hào)
plwlpvdwhseq no. 1
p2npafelmseq no. 2
p3fwgddgyseo no. 3
p4llwldwhseq no. 4
P5YLDAWENEVINFSEQ No. 5
P6DGYNGEPWIWQQSEQ No. 6
P7YAGDFWDLDALASEQ No. 7為進(jìn)一歩探索這些結(jié)合肽是否具有拮抗CRFRl的功能，選擇結(jié)合活性較好的P6進(jìn) 行后續(xù)的功能研究。實(shí)施例3 =CRFRl穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立為了進(jìn)一歩探索篩選到的多肽是否具有拮抗CRFRl的功能，需要建立CRFRl穩(wěn)定 表達(dá)細(xì)胞株。1.實(shí)驗(yàn)材料HEK293細(xì)胞購自中國醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫，人類CRFRl質(zhì)粒購自于UMR cDNA Resource Center。G418購自AMRESC0公司。HA抗體購自Sigma公司，HRP標(biāo)記和FITC標(biāo)記的山羊 抗小鼠ニ抗及β-肌動(dòng)蛋白抗體購自于北京中杉公司。蛋白Marker(High Range Protein Molecular Weight Marker)購自于全式金生物技術(shù)公司。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購 自hvitrogen公司。PVDF購自于Millipore公司。垂直式電泳槽購自于BIO-RAD公司。 熒光顯微鏡，德國CarlZeiss公司。2.實(shí)驗(yàn)方法(l)HEK293-hCRFRl穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000試劑說明書進(jìn)行。在轉(zhuǎn)染前一天，用無抗生素的培養(yǎng)基將對(duì)數(shù)生長期的HEK293細(xì)胞以2 4X IO5/ 孔接種于6孔板內(nèi)，置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)M小吋。當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)80 90%融合吋， 即可用于DNA轉(zhuǎn)染。
操作步驟①準(zhǔn)備兩個(gè)無菌EP管，每個(gè)加入250微升無血清培養(yǎng)基。其中一管加入4微克 hCRFRl質(zhì)?；旌?，另一管加入10微升脂質(zhì)體混合。室溫孵育5分鐘。②將稀釋好的質(zhì)粒DNA與稀釋好脂質(zhì)體混合，輕柔混勻，室溫孵育20分鐘。③將質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體混合物500微升加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，前后左右方向輕柔混勻。④37°C孵育4 6小時(shí)，換新鮮的完全培養(yǎng)基，2毫升/孔，繼續(xù)培養(yǎng)。⑤48小時(shí)后，換含800 μ g/ml G418的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，3天更換一次選擇培養(yǎng)基。約3周后挑取單克隆鑒定。(2)HEK293-hCRFRl穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的鑒定①Western blot法鑒定CRFRl蛋白的表達(dá)蛋白提取將待處理細(xì)胞用冰冷的PBS浸洗兩遍，于冰上用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下， 2000rpm離心2分鐘，棄上清，離心間隙配制裂解液100微升RAPI加蛋白酶抑制劑混合物 PMSF ImM，抑肽酶，亮肽素(Ieup印tin)，胃蛋白酶抑制劑各lmg/ml。將裂解液加入細(xì)胞沉淀中，吹打均勻，冰浴中緩搖20 30分鐘后，4°C 12500g，離心30分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至另一干凈的EP管中，取5微升測(cè)定蛋白濃度，剩余樣品凍存于_70°C冰箱。電泳與轉(zhuǎn)膜各樣品加入2X上樣緩沖液，煮沸5分鐘。12% SDS-PAGE凝膠電泳分離(每孔蛋白上樣量為35微克)。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電流為150mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為60 分鐘。封閉5%脫脂奶粉做封閉液，室溫緩慢搖動(dòng)，封閉2小時(shí)。與一抗HA抗體或β -肌動(dòng)蛋白抗體雜交將封閉后的PVDF膜用 T-TBS(TBS+0. 05%吐溫)洗液振蕩洗滌3次，每次10分鐘。洗滌后的膜置于一抗中4°C過夜(一抗稀釋度為1 1000)。與HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗雜交=T-TBS振搖洗膜3次，每次10分鐘。之后，將膜與二抗(稀釋度1 5000)孵育，室溫下緩慢搖動(dòng)1小時(shí)。酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光法顯色T-TBS振搖洗膜3次，每次10分鐘。洗滌后的PVDF膜與發(fā)光反應(yīng)液置于雜交袋中，暗室中輕搖2分鐘；X-膠片曝光1分鐘；顯影、定影，流水沖洗，干燥保存。檢測(cè)結(jié)果見圖4A，CRFRl蛋白的分子量與文獻(xiàn)報(bào)道相符。②免疫熒光法鑒定CRFRl蛋白的表達(dá)將轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞提前接種于鋪有多聚賴氨酸玻片的二十四孔板中。3%多聚甲醛-20°C固定15分鐘 30分鐘后用PBS清洗，F(xiàn)BS 4°C封閉過夜。加入HA—抗(用3% BSAWl 100 1 200稀釋)37°C孵育1小時(shí)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(用3% BSA以1. 34 100稀釋)，室溫避光孵育45分鐘。加入PBS，熒光顯微鏡檢測(cè)。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)結(jié)果見圖4B，與陰性對(duì)照空載體組相比，可見明顯的胞質(zhì)及膜定位紅色熒光， 與文獻(xiàn)報(bào)道相符。以上結(jié)果表明，已成功建立穩(wěn)定高表達(dá)CRFRl的細(xì)胞株。實(shí)施例4 :P6對(duì)CRF刺激CRFRl釋放cAMP的影響
為詳細(xì)觀察篩選到的多肽對(duì)CRF刺激胞內(nèi)cAMP釋放的影響，首先觀察了不同濃度 CRF刺激cAMP釋放的曲線并進(jìn)行擬合，選擇EC8tl值(即產(chǎn)生80%效應(yīng)時(shí)所需的CRF濃度) 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的濃度。1.實(shí)驗(yàn)材料LANCE cAMP 384 試劑盒(AD0262-500 Assay points)，PerkinElmer 公司。酶標(biāo)儀，2104Envision PerkinElmer 公司。384 孔發(fā)光板，PerkinElmer 公司。CRF 購自 sigma 公司。P6由賽百盛公司合成。2.實(shí)驗(yàn)方法按照PerkinElmer 公司的 LANCE cAMP 384 試劑盒(AD0262-500 Assay points) 說明書進(jìn)行。所用的試劑除CRF外，均為試劑盒所帶。①上述穩(wěn)定表達(dá)CRFRl細(xì)胞用versene消化液消化3分鐘左右，以HBSS終止反應(yīng)。 離心，IOOOrpmX 5分鐘，用HBSS重懸細(xì)胞。②離心，IOOOrpmX 5分鐘，用反應(yīng)緩沖液(含終濃度為0. 5mM的IBMX)重懸細(xì)胞。 細(xì)胞計(jì)數(shù)，確保細(xì)胞數(shù)目為3000個(gè)/6微升。③加入抗體(1 100稀釋)溶液。384孔板中每孔分別加入6微升不同濃度的 CRF (或CRF與P6的混合物)，然后加入6微升含有抗體的細(xì)胞懸液(其中應(yīng)有3000 5000 個(gè)細(xì)胞)，避光室溫孵育30分鐘。④加入12微升檢測(cè)復(fù)合物，避光室溫孵育1-4小時(shí)，室溫下進(jìn)行熒光測(cè)定。⑤用5. 0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與擬合。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CRF的EC8tl值為32nM，見圖5。本發(fā)明多肽P6顯著拮抗CRF刺激的胞內(nèi)cAMP的釋放，其IC50約為0. InM，見圖6。
權(quán)利要求
1.具有促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1結(jié)合活性的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述多肽的氨基酸序列為 WLPVDWH、NPAFELM、FffGDDGY, LLffLDffH, YLDAffENEVINF, DGYNGEPffIffQQ 或 YA⑶FWDLDALA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述多肽的氨基酸序列為 DGYNGEPWIWQQ。
3.一種融合肽，其可操作地連接有權(quán)利要求1的一個(gè)或幾個(gè)肽，所述肽可以相同或不相同。
4.一種融合蛋白，其可操作地連接有權(quán)利要求1的一個(gè)或幾個(gè)肽，以及一種起靶向作用的蛋白或方便純化的蛋白，其中所述肽可以相同或不相同。
5.DNA或RNA序列，其編碼權(quán)利要求1所述的多肽。
6.一種載體，其含有權(quán)利要求5所述的DNA或RNA序列。
7.權(quán)利要求1或2所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防或治療促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1介導(dǎo)的疾病或病況。
8.權(quán)利要求3或4所述的融合肽或融合蛋白在制備藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防或治療促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1介導(dǎo)的疾病或病況。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的用途，其中所述藥物用于預(yù)防或治療抑郁癥或腫瘤疾病。
10.一種藥物組合物，其含有1或2所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽或權(quán)利要求3或 4所述的融合肽或融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及能拮抗促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體1的多肽及其用途。本發(fā)明的多肽具有如下氨基酸序列WLPVDWH、NPAFELM、FWGDDGY、LLWLDWH、YLDAWENEVINF、DGYNGEPWIWQQ或YAGDFWDLDALA。本發(fā)明還涉及這些多肽的變異體、編碼多肽的基因序列，以及這些多肽作為CRFR1拮抗劑和在制備CRFR1靶向治療藥物中的用途。本發(fā)明的多肽在探索CRFR1的生物學(xué)功能、研究CRFR1相關(guān)疾病的病理機(jī)制及其治療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61K38/08GK102558300SQ20101061121
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者于金梅, 鄭建全, 閆海濤, 馬曉蕓, 魏曉莉 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所