專利名稱：突變型人纖溶酶原kringle5及其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種突變型人纖溶酶原kringle5及其制備 方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管增生(angiogenesis)，即從已存在的毛細(xì)血管網(wǎng)上，生成大量新生 血管的過程。血管增生參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展(Folkman J. Nat Rev Drug Discov. 6:273-286,2007)。血管增生是包括腫瘤(Folkman J.N Eng 1 J Med ,285:1182-1186，1971)、糖尿病眼病(Campochiaro, et al. Expert Opin Biol Ther. 4:1395-1402, 2004)、糖尿病腎病(Yamamoto Y, et al. Diabetes. 53: 1831-1840. 2004)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Taylor P. C. et al. Curr Opin Rheumatol. 17:293-298, 2005) 在內(nèi)的70余種疾病的主要病理特征。全球范圍內(nèi)有5億人飽受因血管增生或血管形成障礙 導(dǎo)致的疾病困擾。在腫瘤治療領(lǐng)域，1971年i^olkman首次提出腫瘤血管形成理論，指出腫 瘤的生長和轉(zhuǎn)移均依賴于新生血管生成(Folkman J. N Eng 1 J Med，285: 1182-1186， 1971)。阻斷腫瘤新生血管形成的饑餓療法為減少腫瘤大小、克服腫瘤轉(zhuǎn)移和降低腫瘤復(fù)發(fā) 率提供了新的治療策略，有望成為今后腫瘤治療的突破口。血管新生受血管增生平衡的調(diào)節(jié)，血管增生平衡由血管生成刺激因子和抑制因子 構(gòu)成，目前臨床應(yīng)用血管生成刺激因子的拮抗劑成為治療腫瘤等血管增生類疾病的主要手 段。但因內(nèi)源性血管生成刺激因子作用廣泛，阻斷血管生成刺激因子的功能將導(dǎo)致較為 嚴(yán)重的并發(fā)癥。以抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體-貝伐單抗(Bevacizumab，商品名 Avastin)為例，Avastin已被美國FDA批準(zhǔn)與化療藥合用治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌、非小細(xì)胞性肺 癌和乳腺癌(Cabebe E, Wakelee H. Curr Treat Options Oncol. 8 (1) 15-27，2007)。但 臨床應(yīng)用與研究證明Avastin不僅阻斷了 VEGF促進(jìn)血管新生的功能還影響了 VEGF其他的 重要生理功能，導(dǎo)致出現(xiàn)肺栓塞、心肌梗死和腦血管意外等嚴(yán)重毒副反應(yīng)。另外，新生血管 形成受多種血管生成刺激因子的調(diào)控，當(dāng)一種刺激因子被長時間抑制后，腫瘤組織會代償 性產(chǎn)生其他刺激因子維持病理性的血管增生，所以僅僅針對一種刺激因子的長期治療效果 并不理想(Relf M, et al. Cancer Res. 57:963 - 969 ,1997·)。內(nèi)源性血管生成抑制因子是血管增生平衡的主要組成部分，在體內(nèi)以多肽或蛋白 質(zhì)分子的形式存在。內(nèi)源性血管生成抑制因子因其具有特異性抑制活化血管內(nèi)皮細(xì)胞、降 低血管增生刺激因子的表達(dá)和功能等作用，以及副作用小、不易產(chǎn)生抗藥性等臨床應(yīng)用優(yōu) 勢成為目前抗血管新生領(lǐng)域研發(fā)焦點。但因體外獲取內(nèi)源性血管生成抑制因子的方法有 限，所獲得的抑制因子常含有較長的外源序列、不具有天然構(gòu)象，此外獲得的重組抑制因子 穩(wěn)定性降低、生產(chǎn)過程復(fù)雜、成本過高、產(chǎn)率低等原因也限制了內(nèi)源性血管生成抑制因子的 應(yīng)用。以內(nèi)皮抑素(Endostatin)為例，Endostatin是膠原蛋白XVIII的裂解片段，具有較強(qiáng) 的抗血管增生作用，美國等國家經(jīng)抑制腫瘤的I期、II期臨床研究后，放棄了對Endostatin 的III期臨床研究，終止了 Endostatin的開發(fā)而未能上市。重要原因之一是大腸桿菌重組表達(dá)的Endostatin極易形成不可溶、無活性的包涵體，很難復(fù)性。美國一家公司改用畢氏酵 母代替大腸桿菌作為表達(dá)體系生產(chǎn)可溶Endostatin，但生產(chǎn)成本過高。我國山東麥得津公 司在1998年開始進(jìn)行血管內(nèi)皮抑素的研究，采用大腸桿菌表達(dá)體系生產(chǎn)出來一種新型的 重組人血管內(nèi)皮抑素(研發(fā)代號“YH-16”，商品名=Endostar恩度)。在N端添加了 9個氨 基酸，改善了穩(wěn)定性，半衰期延長、生物活性增加、提高了產(chǎn)品的純度、可以大規(guī)模生產(chǎn)，于 2005年9月12日獲得SFDA批準(zhǔn)頒發(fā)了“國家一類新藥證書”(國藥準(zhǔn)字S20050088)，成為 全球范圍內(nèi)第一個被批準(zhǔn)上市的血管新生抑制因子。盡管尚存在眾多的爭議，但恩度的活 性得到了包括發(fā)現(xiàn)Endostatin和Angiostatin而聞名的美國哈佛大學(xué)教授Judah Folkman 實驗室的肯定(ffhitworth A. Nat Biotechnol. 24(2) :117-8, 2006) 人纖溶酶原(plasminogen)含有5個環(huán)狀結(jié)構(gòu)域(kringles)，每個環(huán)由80個氨基 酸殘基組成，含3個二硫鍵，形成雙環(huán)狀構(gòu)象(Castellino, FT&McCance, S. G CibaFound Symp. , 212:46-60, 1997)。人纖溶酶原水解后可產(chǎn)生一組具有抑制血管增生作用的小分 子片段血管抑素(kringles 1-4), kringles 1-5, kringles 1-3 禾口 kringle 5 (K5)。 K5抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生的活性比血管抑素強(qiáng)(Cao，et al，1997; Cao, et al，1996; O'Reilly，et al, 1994)，此外，K5還具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移以及誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作 用(Ji, W. R. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 247: 414-419, 1998; Lu, H. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 258:668-673，1999)。在動物模型中，K5 有效預(yù) 防和阻斷視網(wǎng)膜血管增生大鼠模型中新生血管的形成(Zhang D. et al. Diabetologia,
2001.44(6) 757-765, 2001 ；Gao G. et al. J Biol Chem, 277(11) :9492-9497,
2002.Lu H. et al. Biochem Biophys Res Commun. 258:668—731，1999)；降低視網(wǎng)膜 血管增生模型和糖尿病大鼠模型的血管滲漏Zhang D, et al. Diabetologia, 44(6): 757-765,2001 ；，2004)；抑制兔堿燒傷角膜新生血管形成(.46(11) 4062-4071, 2005) 等。在腫瘤模型中，K5抑制多種腫瘤生長，諸如，肺癌(，1994)、胰腺癌》 ，C.Q.，et al. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 84(21) 1827-1832，2004)、腦膠質(zhì)瘤(，2005)、結(jié)直腸癌 Fan J. K. , et al. Biochem Biophys Res Commun, 374(2) : 198—203，2008)和月干癌(Yang X，et al. Cancer Biol Ther, 5(4) : 399-405，2006)等。因此，K5有望成為治療腫瘤等血管增 生性疾病的候選藥物。已有研究證明K5的抑制血管增生活性同kringle結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)，而kringle結(jié) 構(gòu)域由分子中二硫鍵的位置和數(shù)量所決定。我們根據(jù)K5蛋白的結(jié)構(gòu)特征和二硫鍵分布特 點，用基因缺失的方法構(gòu)建了 K5的缺失突變體。其中，K5 mutl刪除了 K5 kringle結(jié)構(gòu)域 外環(huán)兩端的氨基酸殘基，但保留完整的由三個二硫鍵構(gòu)成的kringle結(jié)構(gòu)域；K5 mut2是在 K5 mutl的基礎(chǔ)上將K5第一個二硫鍵打開。體內(nèi)外實驗結(jié)果提示，與K5相比，K5mutl具有 更強(qiáng)的抑制血管新生的活性，而打開了 kringle環(huán)后的突變體一K5mut2喪失了抗血管新生 活性。提示完整的kringle結(jié)構(gòu)域是K5發(fā)揮生物學(xué)活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，但對于為什么K5mutl 的抗血管新生活性強(qiáng)于K5，我們推測可能原因是K5蛋白N端10個氨基酸殘基中含有5個 帶負(fù)電荷的酸性氨基酸(Asp2，Glu4，Glu8，Glu9，AsplO)，通過與Kringle環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)帶正電 荷的氨基酸殘基相互作用，從而遮擋和掩蓋了 K5蛋白中與內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合的功能域， 因此影響了 K5的活性，提示有必要提供一種K5結(jié)構(gòu)改造的方法，獲得具有更強(qiáng)抗血管增生 活性的K5，為其臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
在分析核苷酸編碼序列的基礎(chǔ)上，Cao Y等人進(jìn)一步利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá) 了可溶性的鼠源性重組K5 (recombinant mouse kringle 5，rmK5)分子，但因種屬特異性， 不能用于臨床應(yīng)用?，F(xiàn)有技術(shù)也報導(dǎo)了使用酵母(巴斯德畢赤酵母)系統(tǒng)克隆和表達(dá)可溶形 式的K5的方法。盡管能夠獲得可溶性的、有功能的K5，但使用巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)不 僅投資巨大，而且甲醇毒性，啟動子調(diào)控困難，篩選標(biāo)記太少，糖基化方式與天然蛋白不同 等問題仍然無法解決。此外，還有一些應(yīng)用其他真核細(xì)胞系獲得K5的方法，如利用重組桿 狀病毒，在草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞中表達(dá)人纖溶酶原K5，但因表達(dá)產(chǎn)量低、工藝復(fù)雜而沒有得 到廣泛的應(yīng)用。目前因為應(yīng)用已知的方法不能在體外獲得產(chǎn)率高、外源氨基酸少、活性強(qiáng)的 K5，K5的臨床前研究及臨床試用受到了限制，因此有必要提供一種改良的，以更高的產(chǎn)率和 更簡單的純化工藝生產(chǎn)人纖溶酶原Κ5的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，提供一種人纖溶酶原kringle 5的突變型基因mK5，和帶有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)記的mK5基因，以下簡稱為 GST-mK5。本發(fā)明的另一目的是提供上述兩種基因編碼的蛋白mK5重組蛋白和GST_mK5融合 蛋白。本發(fā)明的又一目的是提供上述兩種蛋白的制備方法。本發(fā)明的又一目的是提供上述兩種蛋白的應(yīng)用。一種突變型人纖溶酶原kringle5基因，是以人纖溶酶原kringle5的cDNA為基 礎(chǔ)，將N端5個酸性氨基酸密碼子替換為中性氨基酸密碼子。一種谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶修飾的突變型人纖溶酶原kringle5基因，是以人纖溶酶 原kringle5的cDNA為基礎(chǔ)，將N端5個酸性氨基酸密碼子替換為中性氨基酸密碼子，并且 N端附加谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因。以上所述兩種基因，優(yōu)選以人纖溶酶原kringle5的cDNA為基礎(chǔ)，將N端5個酸性
氨基酸密碼子替換為絲氨酸密碼子。上述酸性氨基酸為六印2，61114，61118，61119，4印10。上述中性氨基酸為甘氨酸，絲 氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸， 脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸中的一種或幾種。從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)理論出發(fā)，本發(fā)明中由 于在已知K5基因序列的N端五個酸性氨基酸的位置引入了中性氨基酸的替代突變，去除了 酸性氨基酸對K5活性區(qū)域中兩個關(guān)鍵的帶正電荷精氨酸殘基Arg69和賴氨酸殘基Lys70 的電荷遮蔽作用，能夠充分暴露活性基團(tuán)，增強(qiáng)K5的生物活性。一種擴(kuò)增突變型人纖溶酶原kringle5基因的引物，其特征在于上游引物核苷酸 序列如SEQ ID NO: 1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。一種mK5重組蛋白，是由突變型人纖溶酶原kringle5基因編碼得到的蛋白。一種GST_mK5融合蛋白，是由谷胱甘肽_S_轉(zhuǎn)移酶修飾的突變型人纖溶酶原 kringle5基因編碼得到的蛋白。上述mK5重組蛋白的制備方法，包括以下步驟
(1)以人纖溶酶原kringle5的cDNA為基礎(chǔ)，將N端5個酸性氨基酸密碼子替換為中性氨基酸密碼子，得到mK5的核苷酸編碼序列；
(2)將步驟(1)得到的mK5基因的核苷酸序列連接到表達(dá)載體，即可以編碼GST融合蛋 白的質(zhì)粒，得到重組表達(dá)載體；
(3)將步驟(2)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；
(4)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基和宿主細(xì)胞內(nèi)回收表達(dá)產(chǎn)物，純化，得到GST-mK5融合蛋白；
(5)將GST-mK5融合蛋白經(jīng)過凝血酶切割，獲得單純mK5重組蛋白。作為本領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)蛋白步驟，上述mK5重組蛋白也可以通過以下方法制備
(1)以人纖溶酶原kringle5的cDNA為基礎(chǔ)，將N端5個酸性氨基酸密碼子替換為中性 氨基酸密碼子，得到mK5的核苷酸編碼序列；
(2)將步驟(1)得到的mK5基因的核苷酸序列連接到表達(dá)載體，得到重組表達(dá)載體；
(3)將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；
(4)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基和宿主細(xì)胞內(nèi)回收表達(dá)產(chǎn)物，純化，得到單純mK5重組蛋白。其中步驟(3)中所述的宿主細(xì)胞可以是大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞 等常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)，步驟(2)中所述的表達(dá)載體是指與這些表達(dá)系統(tǒng)相應(yīng)的表達(dá)載體。
上述GST-mK5融合蛋白的制備方法，包括以下步驟
(1)以人纖溶酶原kringle5的cDNA為基礎(chǔ)，將N端5個酸性氨基酸密碼子替換為中性 氨基酸密碼子，得到mK5的核苷酸編碼序列；
(2)將步驟(1)得到的mK5基因的核苷酸序列連接到表達(dá)載體，即可以編碼GST融合蛋 白的質(zhì)粒，得到重組表達(dá)載體；
(3)將步驟(2)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；
(4)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基和宿主細(xì)胞內(nèi)回收表達(dá)產(chǎn)物，純化，得到GST-mK5融合蛋白。上述GST_mK5融合蛋白的制備方法中步驟(3)中所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌，所 述GST融合蛋白是指谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白。突變型人纖溶酶原kringle5基因或谷胱甘肽_S_轉(zhuǎn)移酶修飾的突變型人纖溶酶 原kringle5基因在制備治療血管增生性疾病藥物中的應(yīng)用。mK5重組蛋白或GST_mK5融合蛋白在制備治療血管增生性疾病藥物中的應(yīng)用。上述兩種蛋白在制備治療血管增生性疾病藥物中的應(yīng)用。其中血管增生性疾病包 括但不限于心血管病、腫瘤、糖尿病、眼病以及糖尿病腎病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。上述步驟(1)中的核苷酸序列可以通過多種方法獲得，例如，可以使用本領(lǐng)域已知 自動合成系統(tǒng)合成上述完整核苷酸序列，或者分段合成不同的寡核苷酸，然后將其連接得 到所需序列；還可使用根據(jù)本發(fā)明目的以及K5的核苷酸序列設(shè)計的寡核苷酸引物，從基因 庫中獲得目的核苷酸序列。在第二種方法中，為方便起見，可以基于編碼K5的氨基酸序列 合成適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋?，包括正向引物和反向引物，?個突變的氨基酸編碼序列包含 于正向引物中，并在DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸的存在下，以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)合 成含有突變的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，所設(shè)計的引物中除加入編碼突變部分氨基酸的核 苷酸序列外，還可以根據(jù)所應(yīng)用的不同表達(dá)載體加入合適的限制性內(nèi)切酶的酶切位點。上述編碼K5的核苷酸片段制備完成后，在克隆載體中擴(kuò)增并進(jìn)一步鑒定，將其連 接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體如PGEX-4T-1上，并轉(zhuǎn)化入合適的大腸桿菌如BL21 (DE3 )中，培養(yǎng)細(xì) 胞并誘導(dǎo)表達(dá)所需的GST-mK5融合蛋白。
由于遺傳密碼的簡并性，可以在不改變其編碼的氨基酸序列的前提下，對本發(fā)明 的mK5的核苷酸編碼序列進(jìn)行許多不同的改動或改變。上述步驟(5)中，可以使用GST親和層析柱完成蛋白質(zhì)的分離純化。洗脫物在低溫 下制成凍干粉可以長期保存。使用凝血酶切割去除GST-mK5的GST蛋白部分，使用GST親 和層析柱或超濾的方式分離裂解片段，得到mK5純化蛋白。用上述方法獲得純化的GST_mK5和mK5蛋白后，使用1 聚丙烯酰胺凝膠電泳分 別對純化的GST-mK5和mK5蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析以及western blot鑒定。結(jié)果顯示 GST-mK5具有37KDa的表觀分子量，凝血酶切割后的mK5表觀分子量約為IOKDa ；使用GST 單克隆抗體或者抗K5血清進(jìn)行western blot分析顯示出明顯的免疫雜交帶，而且分子量 同SDS-PAGE分析一致，說明所獲得的蛋白是正確的?？梢允褂镁幋aK5的核苷酸序列，在適當(dāng)?shù)脑嘶蛘婧吮磉_(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)由之編碼 的N末端有五個酸性氨基酸突變的mK5，或者將這樣的核苷酸序列連接到質(zhì)粒或病毒載體 上，或包裹在脂質(zhì)微粒中，以其作為免疫原，并用適當(dāng)?shù)姆椒▽?dǎo)入人或哺乳動物體內(nèi)(如注 入肌肉內(nèi))，在體內(nèi)表達(dá)循環(huán)的血管生成抑制因子mK5并發(fā)揮其抗血管新生作用(即所謂基 因治療)，或者也可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶或RT-PCR技術(shù)合成適當(dāng)?shù)姆戳x核酸，用于腫瘤等血管新 生相關(guān)疾病的治療。這里所說的血管新生相關(guān)疾病包括但不只限于心血管病、腫瘤、糖尿 病、眼病以及糖尿病腎病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
(1)本發(fā)明通過改造人纖溶酶原K5的核苷酸編碼序列，顯著減少了基因工程方法獲得 重組K5蛋白分子中外源氨基酸的數(shù)目，即得到了較為純正的mK5蛋白。(2)本發(fā)明中由于在已知K5基因序列的N端五個酸性氨基酸的位置引入了中性 氨基酸的替代突變，去除了酸性氨基酸對K5活性區(qū)域中兩個關(guān)鍵的帶正電荷精氨酸殘基 Arg69和賴氨酸殘基Lys70的電荷遮蔽作用，充分暴露活性位點，提高了 K5的生物活性。為檢測所得蛋白是否具有K5的生物學(xué)活性，或者具有較K5更強(qiáng)的抗血管增生作 用，我們在體外實驗中分別檢測了 GST-mK5和mK5對血管內(nèi)皮細(xì)胞、正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞 增殖與凋亡的影響、在體內(nèi)實驗中檢測了 GST-mK5對裸鼠肝癌異位移植瘤生長和大鼠角膜 新生血管形成的作用。我們的初步實驗結(jié)果表明，在體外實驗中，本發(fā)明所制備的mK5具有 較K5更強(qiáng)的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的功能，而且同GST-mK5的功 能相當(dāng)；GST-mK5和mK5同K5 —致對正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞沒有生長抑制作用以及誘導(dǎo)凋 亡作用。在體內(nèi)實驗中，相同劑量下GST-mK5比K5具有更強(qiáng)地抑制裸鼠肝癌異位移植瘤生 長和抑制大鼠角膜新生血管形成的功能，此外，GST-mK5比K5更顯著改善損傷角膜的炎癥 反應(yīng)，說明所獲得的GST-mK5的活性強(qiáng)于K5。(3)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)保留了 GST-tag的GST_mK5融合蛋白具有同mK5相當(dāng)?shù)纳飳W(xué)活 性，而且GST-tag不具有免疫原性。在后續(xù)的生物學(xué)活性實驗中，我們選用GST-mK5作為檢 測蛋白，這樣即保持了 mK5的活性，又可以提高蛋白的穩(wěn)定性以及水溶性，并簡化了表達(dá)產(chǎn) 物的純化步驟，同時提高了產(chǎn)物的純度。(4)按照本發(fā)明的制備方法保留了 GST融合蛋白的形式，在N端加入GST序列，使 得所獲得的產(chǎn)物便于應(yīng)用親和層析的方法進(jìn)行純化，簡化了重組蛋白質(zhì)的純化步驟，同時 能夠獲得高產(chǎn)率和高純度的GST-mK5和mK5，這種方法具有操作簡單、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。按本發(fā)明方法制備的mK5蛋白僅含有2個外源氨基酸(Gly，kr)，這2個外源氨基酸對蛋白 質(zhì)分子的空間構(gòu)象沒有影響，因此不會產(chǎn)生免疫原性。


圖1 編碼GST_mK5的核苷酸序列及其對應(yīng)的氨基酸序列，A為GST_mK5基因的核 苷酸序列，其中XXX代表編碼中性氨基酸的密碼子；B為GST-mK5融合蛋白的氨基酸序列。 其中X代表A中XXX對應(yīng)的中性氨基酸。圖2 本發(fā)明實施例1中N末端有五個酸性氨基酸突變?yōu)榻z氨酸密碼子的mK5的 核苷酸序列及其相應(yīng)的氨基酸序列，A為mK5的核苷酸序列，B為mK5的氨基酸序列。圖3 實施例1中mK5與K5的cDNA核苷酸序列和氨基酸序列比對結(jié)果，A為mK5 與K5核苷酸序列比對結(jié)果，B為mK5與K5氨基酸序列比對結(jié)果。圖4 :mK5重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。圖5:純化后GST- mK5蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中1為誘導(dǎo)前，2為誘導(dǎo)后，3為 洗脫液1，4為洗脫液2。圖6 應(yīng)用抗K5兔血清進(jìn)行Western Blot的蛋白鑒定圖，其中1為誘導(dǎo)前，2為誘 導(dǎo)后，3為洗脫液1，4為洗脫液2。圖7 應(yīng)用抗GST抗體進(jìn)行Western Blot的蛋白鑒定圖，其中1為誘導(dǎo)前，2為誘 導(dǎo)后，3為洗脫液1，4為洗脫液2。圖8 凝血酶酶切后mK5的SDS-PAGE電泳圖，其中1為GST_mK5融合蛋白(凝血酶 切割前)，2為凝血酶切割8小時，3為凝血酶切割10小時，4為凝血酶切割12小時。圖9 凝血酶酶切后mK5的flfestern-blot鑒定圖，應(yīng)用抗K5兔血清進(jìn)行Western Blot的蛋白鑒定圖，其中1為GST-mK5融合蛋白(凝血酶切割前)，2為凝血酶切割8小時，3 為凝血酶切割10小時，4為凝血酶切割12小時。圖10 應(yīng)用抗GST抗體進(jìn)行Wfestern Blot的蛋白鑒定圖，其中1為GST_mK5融合 蛋白(凝血酶切割前)，2為凝血酶切割8小時，3為凝血酶切割10小時，4為凝血酶切割12 小時。圖11 :GST-mK5蛋白和mK5蛋白對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用。圖12 :GST-mK5蛋白對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。圖13 :GST-mK5蛋白對正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞Bel7402增殖的影響。圖14 :GST-mK5蛋白對正常肝細(xì)胞2凋亡的影響。圖15 :GST-mK5蛋白對肝癌細(xì)胞Bel7402凋亡的影響。圖16 :GST-mK5蛋白對裸鼠肝癌實體瘤生長的影響，瘤組織直觀圖。圖17 :GST-mK5蛋白對裸鼠肝癌實體瘤生長影響的腫瘤生長曲線圖。圖18 :GST-mK5蛋白對裸鼠肝癌實體瘤生長影響的抑瘤率統(tǒng)計圖。圖19 :GST-mK5蛋白對堿燒傷后大鼠角膜新生血管和角膜炎癥影響的眼部直觀 圖。圖20 :GST-mK5蛋白對堿燒傷后大鼠角膜新生血管和角膜炎癥影響的受損角膜新 生血管面積統(tǒng)計圖。圖21 :GST-mK5蛋白對堿燒傷后大鼠角膜新生血管和角膜炎癥影響的角膜混濁度統(tǒng)計圖。圖22 :GST-mK5蛋白對堿燒傷后大鼠角膜新生血管和角膜炎癥影響的角膜炎癥反 應(yīng)統(tǒng)計圖。
具體實施例方式下列實施例旨在進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明的方法及其優(yōu)點，但這些實施例并不構(gòu)成 對本發(fā)明權(quán)利要求范圍的限制。實施例1 用于表達(dá)帶有GST標(biāo)記的mK5重組質(zhì)粒的構(gòu)建
mK5的核苷酸序列如圖2所示?；贙5序列設(shè)計合成引物，引物中含有N末端五個中 性氨基酸絲氨酸的核苷酸編碼序列及限制性內(nèi)切酶的酶切位點。上游引物5’_ACT GAATTC CCA TCT GTA TCG ACT CCT TCC TCA TCA TCC TGT ATG TTT GG-3，，其中包括BamHI 位點和 中性氨基酸(Ser)替代突變的氨基酸編碼序列；下游引物5’-TGCTGC CTCGAG TCA CGC ACA CTG AGG GAC ATC ACA GTA，其中包括終止密碼子以及其后的XhoI位點。以人肝細(xì)胞 cDNA為模板，采用PCR法得到mK5基因。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5分鐘，95°C、45秒， 55 0C、60秒，72 °C、60秒，共30個循環(huán)，72 °C延伸10分鐘。擴(kuò)增完成后，使用Pearl公司PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書進(jìn)行純化回收PCR產(chǎn)物。 PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物長度為^4bp。利用基因工程技術(shù)， 將目的基因克隆至PGEX-4T-1的BamHI和BioI位點。將重組質(zhì)粒pGEX-4T_l/mK5轉(zhuǎn)化到 感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中，取復(fù)蘇菌液100μ 1鋪于含50 μ g/ml氨芐的選擇性平 板上，室溫平放60min后，37°C倒置培養(yǎng)12 1 至單菌落形成。挑取待測單菌落于含有 50 μ g/ml氨芐抗生素的LB培養(yǎng)液中，37°C振搖過夜，提取重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò) 增、雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定轉(zhuǎn)化結(jié)果。將重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序明確轉(zhuǎn)化是否 成功。測序結(jié)果表明目的基因片段與PGEX-4T-1連接無誤，閱讀框架正確，pGEX-4T-l/mK5 重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將插入片段(即mK5)的測序結(jié)果與K5的序列進(jìn)行序列比對，最終證實 插入序列為目的基因序列，見圖3。圖4為pGEX-4T-l/mK5重組質(zhì)粒的示意圖。實施例2 GST-mK5融合蛋白與單純mK5蛋白的表達(dá)與純化
取轉(zhuǎn)化成功的BL21 (DE3)菌株進(jìn)行擴(kuò)增，當(dāng)菌液OD6tltl達(dá)約0. 6 0. 8時加入IPTG至 終濃度為0.6 mmol/L,25 °C、220rpm振搖細(xì)菌他后離心收集細(xì)菌。細(xì)菌沉淀經(jīng)蒸餾水漂 洗后，離心，沉淀用磷酸鹽緩沖液PBS重懸后超聲破碎，4°C、IOOOOrpm離心30min，取上清用 0.45Mm濾膜4°C過濾，進(jìn)行親和層析。根據(jù)產(chǎn)品的操作手冊，將處理好的上清過濾液流過 Glutathione Sepharose 4B 親和層析柱，300 ml washing buffer 沖洗親和柱后，加入 20ml Elution buffer孵育Glutathione Sepharose 4B親和層析柱lOmin，分次收集洗脫液，每 次收集10ml，分別標(biāo)記為洗脫液1、洗脫液2 (含有GST-mK5蛋白)?？筛鶕?jù)洗脫情況，改變 洗脫體積和收集次數(shù)。以含有甘油的透析液透析洗脫液24h后進(jìn)行蛋白定量。采用BioRad DC試劑盒進(jìn)行蛋白定量，方法如下取3 5個已知濃度的BSA稀釋液制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 (推薦濃度為0. 5 2.0mg/ml)。取100 μ 1 GST_mK5蛋白及上述BSA稀釋液加于試管中，每 管加入500 μ 1試劑Α，混勻；加入試劑B混勻；15min后于波長750nm處比色(Ih內(nèi)顏 色是穩(wěn)定的)。根據(jù)BSA濃度與吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算GST-mK5融合蛋白的濃度。
取一定量純化后的GST_mK5蛋白進(jìn)行凝血酶切割，切割后以IOKD的超濾管超濾并 濃縮以去除GST標(biāo)簽，獲得單純mK5蛋白。實施例3 :GST-K5融合蛋白以及單純mK5蛋白的鑒定
將GST-mK5蛋白和mK5蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析與Western - blot鑒定。1. SDS-PAGE 分析按照文獻(xiàn)中已描述的方法(Sambrook et al, Molecular Cloning:A laboratory Manual, Cold Spring Harbour, 1989)，分別取上述洗脫后的 GST-mK5蛋白和單純mK5蛋白20 μ 1，加入4μ 1 6Χ上樣緩沖液(7. 2ml甘油+ 2. 076g SDS+lml β-巰基乙醇+7ml IM Tris PH6. 8+0. 01 (w/v)溴酚蘭適量，雙蒸水定容為20ml) 后，進(jìn)行沸水浴lOmin。將處理好的樣品與商品化的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)10μ 1依次加入 1 聚丙烯胺凝膠凝膠中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)G250溶液(配方 0. 25g G250,90ml甲醇水=1 :1，IOml冰乙酸)中染色4h，脫色后觀察電泳結(jié)果。GST_mK5 蛋白表觀分子量大約為37KDa，凝血酶切割后的mK5蛋白質(zhì)表觀分子量大約lOKDa，見圖5、 圖8。2. Western blot印跡分析SDS-PAGE電泳條件與1相同。①電轉(zhuǎn)印前先把與凝 膠大小一致的PVDF膜用甲醇完全浸泡2 ;3min后，以ddH20徹底漂洗三次。將Whatman 3MM濾紙、海綿墊和PVDF膜一起浸于pH 8. 3電轉(zhuǎn)印緩沖液(配方Tris-base3. 03g/L，甘氨 酸14.41g/L，甲醇200ml/l)中浸泡15min。②展開電轉(zhuǎn)印夾，轉(zhuǎn)膜時放置順序從陰極(黑 板)到陽極(白板)依次為海綿，濾紙，凝膠，PVDF膜，濾紙，海綿，排盡氣泡，制成電轉(zhuǎn)印“三 明治”結(jié)構(gòu)。③低溫下(置于冷藏柜或冰上)，100V電轉(zhuǎn)移lh。④轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將PVDF膜置 于含7%脫脂奶粉的TBST溶液中，室溫封閉lh，同時以0. 25%考馬斯亮蘭染色已轉(zhuǎn)過膜的 凝膠，觀察轉(zhuǎn)膜效果。棄去封閉液，將PVDF膜浸入含1:3000的抗GST-tag兔源性單克隆抗 體或者1 :6000的兔源性抗K5血清中，4°C孵育過夜。TBST洗膜3次后，加入含1:2000的 辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔多克隆抗體，室溫振蕩60min。TBST洗膜3次，于暗室中加入ECL 進(jìn)行化學(xué)發(fā)光獲得雜交條帶。分析結(jié)果表明，按本發(fā)明方法產(chǎn)生的GST-mK5蛋白與mK5蛋 白均被抗GST抗血清和兔源性抗K5血清識別，見圖6、圖7、圖9、圖10。實施例4 :GST-mK5融合蛋白以及mK5純合蛋白的生物學(xué)活性檢測
1. GST-mK5蛋白以及mK5對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖與凋亡的影響。將HUVEC細(xì)胞接種于M孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔。待細(xì)胞生長至60_70%融合后， 用含不同濃度(0、20、40、80、160、320、640、1280nmol/L)的 GST_mK5 蛋白、mK5 蛋白以及 K5 蛋白分別處理細(xì)胞72h。處理結(jié)束后，向培養(yǎng)液中加入MTT溶液繼續(xù)孵育細(xì)胞2-4h。棄去 培養(yǎng)上清，每孔加入ImlDMSO溶解活細(xì)胞產(chǎn)生的紫色結(jié)晶，測量570nm處的吸光度，定量分 析各組存活內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。以GST蛋白處理作為陰性對照。實驗至少重復(fù)3次，用t檢驗法 分析各種蛋白對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果顯示，同對照組相比，K5、GST-mK5以 及mK5以劑量依賴性方式顯著抑制HUVEC細(xì)胞的增殖，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，GST_mK5同 mK5抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用效果相似，且均強(qiáng)于K5，見圖11。鑒于上述體外實驗結(jié)果，在 后續(xù)的生物學(xué)活性實驗中，我們選用GST-mK5作為檢測蛋白，這樣即保持了 mK5的活性，又 可以提高蛋白的穩(wěn)定性以及水溶性。將對數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)約24h左右，待細(xì)胞達(dá)到60-70%融合后分別加入GST-mK5蛋白(320nmol/L)和K5蛋白(320nmol/L), PBS (陰性對照組)以及25Mmol/L的秋水仙素(陽性對照組)處理細(xì)胞48h。 處理結(jié)束后以0. 05%胰酶消化細(xì)胞，離心500g、2min收集細(xì)胞。依照ArmexinV-FITC凋亡 試劑盒說明書，將細(xì)胞進(jìn)行ArmexinV和PI雙染，流式細(xì)胞儀定量分析凋亡細(xì)胞比例。結(jié) 果顯示，GST-mK5處理組和K5處理組的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率分別為17. 9% 士2. 6%和12. 76% 士 1.78%，顯著地高于PBS對照組的4. 8% 士 1.6%，見圖12，結(jié)果表明GST_mK5蛋白具有較 K5更強(qiáng)地誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。2. GST_mK5對正常肝細(xì)胞以及肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響
將正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞(Bel-7402)接種于M孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔。待細(xì)胞生長 至60-70%融合后，用不同濃度的GST-mK5蛋白處理細(xì)胞72h。實驗結(jié)束后，向培養(yǎng)液中加入 MTT溶液，向培養(yǎng)液中加入MTT溶液繼續(xù)孵育細(xì)胞2-4h。棄去培養(yǎng)上清，每孔加入ImlDMSO 溶解活細(xì)胞產(chǎn)生的紫色結(jié)晶，測量570nm處的吸光度，定量分析各組存活細(xì)胞數(shù)。以GST蛋 白處理作為陰性對照。實驗至少重復(fù)3次，用t檢驗法分析各種蛋白對正常肝細(xì)胞和肝癌 細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果顯示，同對照組相比，GST-mK5對正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖 沒有影響，見圖13。將對數(shù)生長期的正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞達(dá)到60-70% 融合后分別加入不同濃度的GST-mK5蛋白，GST蛋白作為陰性對照，處理細(xì)胞48h。處理結(jié) 束后向培養(yǎng)液中加入hoechst33258染色，分析細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞 相比，各GST-mK5蛋白劑量組未見明顯的凋亡現(xiàn)象，說明GST-mK5蛋白不能誘導(dǎo)的正常肝細(xì) 胞和肝癌細(xì)胞Bel-7402的凋亡，見圖14、圖15。3. GST-mK5融合蛋白抑制裸鼠肝癌模型中腫瘤的生長
取對數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞Bel-7402，以無菌的PBS溶液為溶劑，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液密度 為3' 106/0. Iml0以0. Iml/只接種于4周齡BALB/C裸鼠頸背部皮下，待裸鼠腫瘤體積達(dá) 到50mm3，隨機(jī)分成PBS對照組、GST_mK5蛋白處理組及K5蛋白處理組，分別腹腔注射PBS 溶液、GST-mK5蛋白溶液和K5蛋白溶液，隔日注射，共注射5次。接種Bel7402肝癌細(xì)胞 后第M天，肉眼可見PBS對照組、GST-mK5蛋白處理組及K5蛋白處理組裸鼠頸背部皮下 腫瘤生長體積大小出現(xiàn)差異。自腹腔注射GST-mK5蛋白第一次起連續(xù)觀察32天后處死裸 鼠，剝瘤稱重，計算和比較各組平均瘤重，結(jié)果顯示總劑量均為12. 5mg/kg的GST-mK5蛋白 及K5蛋白能顯著的抑制裸鼠肝癌(Bel7402)實體瘤的生長，抑瘤率分別為56. 91%士2. 2%、 28. 94%士3. 1%。GST-mK5與K5組之間的瘤重差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明GST_mK5蛋白較K5蛋 白組具有更強(qiáng)地抑制腫瘤生長的作用，見圖16、圖17、圖18。4. GST-mK5融合蛋白抑制大鼠角膜新生血管的形成與炎癥
選取體重150g 180g的雌性SPF級Sprague-DawIey(SD)大鼠40只，裂隙燈檢查排 除眼表疾病，造模前3天每天1次雙眼滴妥布霉素滴眼液。按照％il/kg體重腹腔注射 10%水合氯醛溶液全身麻醉，鹽酸丙美卡因眼表麻醉。將直徑為3. 5mm的濾紙片浸入IN 的NaOH溶液中備用。用棉簽擦干大鼠眼表，夾取濾紙片，輕放在大鼠左眼角膜中央，燒灼 40s，立即用50ml生理鹽水沖洗燒傷區(qū)域，可見角膜中央形成一個圓形灰白色燒灼斑，單眼 燒傷。將大鼠隨機(jī)分為4組。每天分別在8:00am、12:00pm、4:00pm和8:00pm滴眼給藥， 每次每眼20 μ 1。陰性對照為PBS組，陽性對照為0. 1%地塞米松組，Κ5蛋白組藥物濃度為 1250nmol/L,GST-mK5蛋白組藥物濃度為1250nmol/L。堿燒傷后第1、3、5、7、9、11天于裂隙
11燈下測量新生血管長度，計算新生血管面積(Ormerod LD, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30(10) :2148-53, 1989)；同時觀察角膜炎癥反應(yīng)(包括結(jié)膜充血、角膜水腫和眼內(nèi)滲出 或出血三項之和)與角膜混濁度。結(jié)果顯示GST-mK5蛋白和K5蛋白均能顯著抑制SD大鼠 角膜血管新生，改善堿燒傷所引起的炎癥反應(yīng)；GST-mK5蛋白抑制角膜新生血管形成與角 膜炎癥反應(yīng)的作用明顯強(qiáng)于K5蛋白，見圖19、圖20、圖21、圖22。
權(quán)利要求
1.一種突變型人纖溶酶原kringle5基因，其特征在于是以人纖溶酶原kringle 5的 cDNA為基礎(chǔ)，將N端5個酸性氨基酸密碼子替換為中性氨基酸密碼子。
2.一種擴(kuò)增突變型人纖溶酶原kringle 5基因的引物，其特征在于上游引物核苷酸序 列如SEQ ID NO: 1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.—種谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶修飾的突變型人纖溶酶原kringle5基因，其特征在于是以 人纖溶酶原kringle 5的cDNA為基礎(chǔ)，將N端5個酸性氨基酸密碼子替換為中性氨基酸密 碼子，并且N端附加谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的基因，其特征在于是以人纖溶酶原kringle5的cDNA為 基礎(chǔ)，將N端5個酸性氨基酸密碼子替換為絲氨酸密碼子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述酸性氨基酸為Asp2，Glu4，Glu8，Glu9， AsplO0
6.一種mK5重組蛋白，其特征在于是由權(quán)利要求1所述的基因編碼得到的蛋白。
7.—種GST-mK5融合蛋白，其特征在于是由權(quán)利要求3所述的基因編碼得到的蛋白。
8.權(quán)利要求6所述mK5重組蛋白的制備方法，包括以下步驟(1)根據(jù)已知人纖溶酶原kringle5的cDNA序列，設(shè)計擴(kuò)增引物，合成權(quán)利要求1所述 mK5基因的核苷酸編碼序列；(2)將步驟(1)得到的mK5基因的核苷酸序列連接到具有編碼GST融合蛋白功能的質(zhì) 粒中，得到重組表達(dá)載體；(3)將步驟(2)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(4)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基和宿主細(xì)胞內(nèi)回收表達(dá)產(chǎn)物，純化，得到GST-mK5融合蛋白；(5)將GST-mK5融合蛋白經(jīng)過凝血酶切割，獲得單純mK5重組蛋白。
9.權(quán)利要求7所述GST-mK5融合蛋白的制備方法，包括以下步驟(1)根據(jù)已知人纖溶酶原kringle5的cDNA序列，設(shè)計擴(kuò)增引物，合成權(quán)利要求1所述 mK5基因的核苷酸編碼序列；(2)將步驟(1)得到的mK5基因的核苷酸序列連接到具有編碼GST融合蛋白的質(zhì)粒中， 得到重組表達(dá)載體；(3)將步驟(2)得到的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(4)從宿主細(xì)胞培養(yǎng)基和宿主細(xì)胞內(nèi)回收表達(dá)產(chǎn)物，純化，得到GST-mK5融合蛋白。
10.權(quán)利要求1或3所述任一基因在制備治療血管增生性疾病藥物中的應(yīng)用。全文摘要
本發(fā)明公開了一種突變型人纖溶酶原kringle5基因mK5以及mK5基因的一種擴(kuò)增引物，同時公開了在mK5基因前附加谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶修飾的突變型人纖溶酶原kringle5基因，本發(fā)明還公開了這兩種基因編碼的蛋白mK5重組蛋白、GST-mK5融合蛋白以及兩種蛋白的制備方法，本發(fā)明的mK5基因及GST-mK5基因可以應(yīng)用于制備治療血管增生性疾病的藥物。本發(fā)明顯著減少了基因工程方法獲得重組K5蛋白分子中外源氨基酸的數(shù)目，得到的mK5提高了K5的生物活性，并且GST-mK5融合蛋白在保持mK5活性的同時，提高了蛋白的穩(wěn)定性以及水溶性，簡化了表達(dá)產(chǎn)物的純化步驟，也提高了產(chǎn)物的純度。
文檔編號A61P13/12GK102121023SQ201010600078
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者李朝陽, 楊霞, 蔡衛(wèi)斌, 高國全 申請人:中山大學(xué)