專利名稱：一種突變蛇毒纖溶酶基因及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，特別是涉及一種突變蛇毒纖溶酶基因及其制備方法。
背景技術(shù)：
周身動(dòng)脈硬化閉塞病(Peripherial Arterial Occlusive, PA0)是一種周圍動(dòng)脈 粥樣硬化導(dǎo)致動(dòng)脈狹窄，甚至發(fā)生閉塞，使遠(yuǎn)端組織出現(xiàn)相應(yīng)缺血痙攣或壞死的一種老年 人常見疾病。國內(nèi)外有關(guān)老年人口 PAO的患病率基本在12^-25%,且有逐年上漲的趨勢(shì)。Alfimeprase(ALF)是通過基因重組技術(shù)開發(fā)出的一種鋅金屬蛋白酶，是蝮蛇蛇毒 纖溶酶Fibrolase的N端突變體(前3個(gè)氨基酸QQR被S取代)，是一條含有201個(gè)氨基酸 的含鋅單鏈多肽，活性分子內(nèi)部有三對(duì)二硫鍵，與報(bào)道的其它鋅金屬蛋白酶有較高的同源 性。Alfim印rase與Fibrolase具有同樣的纖溶活性，可以不依賴于血漿酶原激活劑系統(tǒng)而 直接作用于纖維蛋白或纖維蛋白原α鏈?zhǔn)蛊浣到?，溶栓能力是血漿酶原激活劑的6倍。目前，國內(nèi)外已上市的溶栓累藥物較多，如重組鏈激酶，重組水蛭素，t-PA，葡激 酶，納豆激酶，以及從提取得到的尿激酶，蛇毒溶栓酶等等。這些藥物的療效經(jīng)臨床驗(yàn)證值 得肯定，但也存在著不少問題，諸如出血，機(jī)體氧化以及再栓塞，原料藥來源受限等等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種突變蛇毒纖溶酶基因及其制備方法。根據(jù)GeneBank 發(fā)表的 Fibrolase 序列(GenBank No. P28891)，同時(shí)將該蛋白的 N 端的QQR突變成S，其氨基酸序列SEQ No. 1所示，結(jié)合真核生物密碼子偏愛性，設(shè)計(jì)出其核 苷酸序列，如核苷酸序列如SEQ No. 2所示；本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供用于重疊擴(kuò)增蛇毒溶血酶基因的引物，其序列如SEQ ID No. 3 16所示。其中SEQ ID No. 3所示的引物有EcoR I位點(diǎn)，HisX6標(biāo)簽和EK酶切 位點(diǎn)。SEQ ID No. 16所示的引物含有TAA終止密碼子和Not I酶切位點(diǎn)；本名的另一個(gè)目的在于提供重疊擴(kuò)增蛇毒溶血酶基因的方法，包括如下步驟先以兩個(gè)臨近的單鏈DNA片段互為引物進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，即分別以SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4，SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6，SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8，SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12，SEQ ID No. 13 和 SEQ ID No. 14，SEQ ID No. 15和SEQ ID No. 16為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到7個(gè)PCR產(chǎn)物，分別記為Si，S2，S3， S4，S5，S6，S7。再分別以 Si，S2 為模板，以 SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 6 為引物；以 S2，S3 為模板，以SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 8為引物；以S4, S5為模板，以SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 12為引物；以S6，S7為模板，以SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 16為模板進(jìn)行PCR反 應(yīng)，得到F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4片段；以F1，F(xiàn)2為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 8為引物，得 到Pl片段，以F3、F4為模板，以SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 16為引物，得到P2片段；再以 PI, P2為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 16為引物，得到全長片段。將PCR產(chǎn)物回收后TA克隆至pBS-T載體中，電轉(zhuǎn)化至XLl blue菌中，挑取陽性克隆提質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切驗(yàn)證正確的，送上海生物工程有限公司測(cè)序確認(rèn)為正確。將測(cè)序正確的克隆用甘油管保存與-80°C超低溫冰箱，備用，命名為pBS-Alf·。將獲得的蛇毒溶血酶基因構(gòu)建酵母表達(dá)載體，在酵母中表達(dá)的蛇毒溶血酶具有較 高的纖溶活性，表明獲得的蛇毒溶血酶基因能正常編碼突變蛇毒纖溶酶。本發(fā)明還提供含有突變蛇毒纖溶酶基因的載體和菌株。采用本發(fā)明可以較容易獲得Alfim印rase的編碼基因，從而免去了從mRNA反轉(zhuǎn)錄 成cDNA的繁瑣步驟，且可根據(jù)需要設(shè)計(jì)相應(yīng)的突變位點(diǎn)。


圖1為重疊PCR擴(kuò)增Alfim印rase基因示意圖。圖2為每輪PCR擴(kuò)增條帶瓊脂糖凝膠電泳圖片。圖3為pBS-Alf克隆載體的構(gòu)建示意圖。圖4為酵母表達(dá)載體PPic9K-His6-Alf構(gòu)建示意圖。圖5為重組表達(dá)載體pPIC9K-His6_Alf的EcoR I和Sal I酶切鑒定。其中，泳道 1，2 :pPIC9K-His6-Alf 質(zhì)粒用 EcoR I and Sal I 酶切結(jié)果；泳道 3 :500bp DNA ladder圖6為pPIC9K-His6_Alf重組菌表達(dá)蛇毒纖溶酶的SDS-PAGE分析和Western Blotting鑒定。其中，M 分子量標(biāo)準(zhǔn)1 :GS115培養(yǎng)4天的上清液；2，3,4 甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后 3、4、5天上清液；5 純化的突變蛇毒纖溶酶；6 突變蛇毒纖溶酶雜交結(jié)果。圖7為重組突變蛇毒纖溶酶纖溶活性鑒定。其中，1 :GS115/pPIC9空白質(zhì)粒菌培養(yǎng) 上清，陰性對(duì)照；2 培養(yǎng)3天重組菌發(fā)酵液上清(濃縮50倍)；3 純化的突變蛇毒纖溶酶； 4 經(jīng)EK切割的突變蛇毒纖溶酶；5天pPIC9K-His6-Alf重組菌表達(dá)上清；5.培養(yǎng)5天重組 菌發(fā)酵液上清(濃縮50倍)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1利用美國國立生物技術(shù)中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫發(fā)表的銅斑蝮蛇(Agkistrodon contortrix)蛇毒Fibrolase蛋白氨基酸序列(GenBank No. P^891)，將其N端的QQR突變 成絲氨酸S，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。結(jié)合真核生物密碼子偏愛性，設(shè)計(jì)出其核 苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。采用四輪PCR反應(yīng)，得到含所需限制性酶切位點(diǎn)，HisX6標(biāo)簽，EK酶切位點(diǎn)的編碼 Alfimeprase的基因片段，其PCR示意圖如圖1所示。各輪PCR所采用的反應(yīng)體系如下第一輪PCR分別以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8，SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 10，SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12， SEQ ID No. 13 和 SEQ ID No. 14，SEQ ID No. 15 和 SEQ ID No. 16 為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得 到 7 個(gè) PCR 產(chǎn)物，分別記為 Si，S2，S3，S4，S5，S6，S7。反應(yīng)體系(20μ 1)IOx PCR 緩沖液2 μ 1dNTPs (2. 5mM)2 μ 12μ 1 2μ 1 2μ 1 0· 1 μ 1， 9. 9μ 1MgCl2 (25mM)引物1引物2pfuTaq 酶(5u/ μ 1)無菌水
94。C反應(yīng)程序
權(quán)利要求
1.一種突變蛇毒纖溶酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.重疊PCR擴(kuò)增權(quán)利要求1所述基因的引物，其特征在于，核苷酸序列如SEQID No. 3 SEQ ID No. 16 所示。
3.重疊PCR擴(kuò)增權(quán)利要求1所述基因的方法，其特征在于，包括如下步驟1)分別以SEQ ID No. 3 和 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 7 和 SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 11 和 SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 13 禾口 SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 15 禾口 SEQ ID No. 16 為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增、得到 7 個(gè) PCR 產(chǎn)物，分別記為 Si，S2，S3，S4，S5，S6，S7 ；2)再分別以S1，S2為模板，以SEQID No. 3和SEQ ID No. 6為引物；以S2，S3為模板， 以 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 8 為引物；以 S4，S5 為模板，以 SEQ ID No. 9 和 SEQ ID No. 12 為引物；以S6，S7為模板，以SEQ ID No. 13和SEQ ID No. 16為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到Fl， F2，F(xiàn)3，F(xiàn)4 片段；3)以Fl,F2為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 8為引物，得到Pl片段，以F3、F4 為模板，以SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 16為引物，得到P2片段；4)以PI,P2為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 16為引物，得到全長片段。
4.含有權(quán)利要求1所述基因的克隆載體。
5.含有權(quán)利要求4所述載體的菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種突變蛇毒纖溶酶基因的合成方法，特別是將目的基因分段合成，并利用重疊PCR技術(shù)人工合成全長目的基因片段。利用美國國立生物技術(shù)中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫發(fā)表的銅斑蝮蛇(Agkistrodon contortrix)蛇毒Fibrolase蛋白氨基酸序列(GenBank No.P28891)，設(shè)計(jì)了14段平均長度為60bp的核苷酸序列，序列如SEQ ID No.3～16所示，將合成的片段經(jīng)過PCR延伸、擴(kuò)增得到完整的目的基因。采用本發(fā)明可以較容易獲得Alfimeprase的編碼基因，從而免去了從mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的繁瑣步驟，且可根據(jù)需要設(shè)計(jì)相應(yīng)的突變位點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N9/68GK102080093SQ20101057178
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月1日
發(fā)明者盛太奎, 鞠嵐嵐, 黃熠, 黃飛 申請(qǐng)人:蚌埠豐原涂山制藥有限公司