專利名稱：突變型還原酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及突變型還原酶及其他。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及修飾的還原酶(其是具有使底物還原的能力的酶)、編碼其的多核苷酸及其應(yīng)用，所述還原酶可以用于還原反應(yīng)，尤其是用于α-酮酸的還原反應(yīng)。還原酶具有使底物還原的能力，并且近年來，其已經(jīng)用于生產(chǎn)例如用作藥物或農(nóng)藥的活性成分的化合物、或其中間體、并且特別是光學(xué)活性化合物或其中間體的有機合成反應(yīng)。作為這樣的還原酶，例如，包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列且具有使底物還原的能力的酶(野生型還原酶)是已知的(例如，參見ΕΡ1762625Α1)。
這樣的還原酶，在工業(yè)上用于生產(chǎn)光學(xué)活性化合物或其中間體等，其需要具有下述特性在使用該酶的還原反應(yīng)中反應(yīng)產(chǎn)物的光學(xué)純度高，該酶對底物的絕對構(gòu)型具有高識別能力，并且該酶在諸如溫度、pH、溶劑和壓力的各種反應(yīng)條件下具有高穩(wěn)定性。特別地，如果還原酶具有針對溫度的高穩(wěn)定性(即，熱穩(wěn)定性)，則升高反應(yīng)溫度將是可能的。因此，高的熱穩(wěn)定性可以不僅引起反應(yīng)速率升高而且減少反應(yīng)過程中還原酶的失活(例如，參見Applied Microbiology Biotechnology,80,805-812(2008))。

發(fā)明內(nèi)容
在這樣的情形中，強烈需要研發(fā)具有良好的熱穩(wěn)定性的還原酶以便縮短反應(yīng)時間并且提聞反應(yīng)效率。本發(fā)明提供還原酶，所述還原酶包含在特定的野生型還原酶的氨基酸序列中特定的氨基酸用不同的特定氨基酸置換的氨基酸序列并且具有良好的熱穩(wěn)定性(即，修飾的還原酶)。具體地，本發(fā)明提供下述I)至41)。I)酶，所述酶包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO: I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括下述氨基酸突變位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，或位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；并且所述酶具有使底物還原的能力；2)酶，所述酶包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO: I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變；并且所述酶具有使底物還原的能力(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的酶I)；
3)根據(jù)上述2)所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變；4)根據(jù)上述2)或3)所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變；5)根據(jù)上述2)至4)中任一項所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；6)根據(jù)上述2)至5)中任一項所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；7)根據(jù)上述2)所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變選自下述氨基酸突變組I :〈氨基酸突變組I> (1-1)下述兩個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變；(1-2)下述兩個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變；(1-3)下述兩個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；(1-4)下述兩個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；(1-5)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變；(1-6)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；(1-7)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；(1-8)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；(1-9)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的
氨基酸突變；(1-10)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；(1-11)下述四個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(d)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；(1-12)下述四個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(d)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；(1-13)下述四個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(d)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；(1-14)下述四個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(d)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；和
(1-15)下述五個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，(d)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(e)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；8)包含編碼上述2)至7)中任一項所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的多核苷酸I)；9)酶，所述酶包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO: I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，但不包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變；并且所述酶具有使底物還原的能力(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的酶2)；10)根據(jù)上述9)所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變；11)根據(jù)上述9)或10)所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置42
的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；12)根據(jù)上述9)至11)中任一項所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；13)根據(jù)上述11)所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變選自下述氨基酸突變組2 :<氨基酸突變組2>(2-1)下述兩個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變；(2-2)下述兩個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；(2-3)下述兩個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和(b)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；(2-4)下述三個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；(2-5)下述三個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；(2-6)下述三個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；和(2-7)下述四個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(d)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變； 14)包含編碼上述11)至13)中任一項所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的多核苷酸2)；15)酶，所述酶包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO: I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，但是既不包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，也不包括位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變；并且所述酶具有使底物還原的能力(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的酶3)；16)根據(jù)上述15)所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；17)根據(jù)上述15)或16)所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；18)根據(jù)上述15)所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變選自下述氨基酸突變組3 :<氨基酸突變組3>(3-1)下述兩個氨基酸突變(a)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；(3-2)下述兩個氨基酸突變(a)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和
(b)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；和(3-3)下述三個氨基酸突變(a)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，
(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；19)包含編碼上述15)至18)中任一項所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的多核苷酸3)；20)酶，所述酶包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO: I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，但是不包括下述任何氨基酸突變位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變；并且所述酶具有使底物還原的能力(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的酶4)；21)根據(jù)上述20)所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置25的蘇
氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；22)根據(jù)上述20)所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變是下述兩個氨基酸突變(a)位置42的組氨酸變?yōu)榱涟彼岬陌被嵬蛔?，?b)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；23)包含編碼上述20)至22)中任一項所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的多核苷酸4)；24)酶， 所述酶包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO: I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變，但是不包括下述氨基酸任何突變位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；并且所述酶具有使底物還原的能力(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的酶5)；25)包含編碼上述24)所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的多核苷酸5)；26)包含上述8)，14)，19)，23)，或25)所述的多核苷酸的載體(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的載體)；27)根據(jù)上述26)所述的載體，所述載體還包含下述多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼下述蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列，所述蛋白具有將氧化的β -煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或氧化的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)化為其還原形式的能力；28)包含上述8)，14)，19)，23)或25)所述的多核苷酸或上述26)或27)所述的載體的轉(zhuǎn)化體(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體)；29)生產(chǎn)(R) -2-羥基_4_苯基丁酸酯的方法，所述方法包括允許上述28)所述的轉(zhuǎn)化體或其處理的產(chǎn)物作用在2-氧代-4-苯基丁酸酯上的步驟(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的生產(chǎn)方法)；30)修飾包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括下述步驟在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中，將位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟，將位置115的纈氨酸置換為異亮氨酸的步驟，將位置27的色氨酸置換為精氨酸的步驟，將位置42的組氨酸置換為亮氨酸的步驟，或?qū)⑽恢?5的蘇氨酸置換為絲氨酸的步驟；31)修飾包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO I的氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的修飾酶的方法I);32)修飾包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO I的氨基酸序列中位置115的纈氨酸置換為異亮氨酸的步驟，但不包括將所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的修飾酶的方法2)；33)修飾包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO I的氨基酸序列中位置27的色氨酸置換為精氨酸的步驟，但是既不包括將所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟，也不包括將所述氨基酸序列中位置115的纈氨酸置換為異亮氨酸的步驟(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的修飾酶的方法3)；34)修飾包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO I的氨基酸序列中位置42的組氨酸置換為亮氨酸的步驟，但是不包括下述任何步驟將所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟，將所述氨基酸序列中位置115的纈氨酸置換為異亮氨酸的步驟，和將所述氨基酸序列中位置27的色氨酸置換為精氨酸的步驟(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的修飾酶的方法4)；35)修飾包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO I的氨基酸序列中位置25的蘇氨酸置換為絲氨酸的步驟，但是不包括下述任何步驟將所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟，將所述氨基酸序列中位置115的·纈氨酸置換為異亮氨酸的步驟，將所述氨基酸序列中位置27的色氨酸置換為精氨酸的步驟，和將所述氨基酸序列中位置42的組氨酸置換為亮氨酸的步驟(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的修飾酶的方法5)；36)修飾包含編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟；將所述編碼SEQ ID NO : I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的步驟；將所述編碼SEQ ID NO 1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸79_81處編碼色氨酸的密碼子置換為編碼精氨酸的密碼子的步驟；將所述編碼SEQ ID NO : I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸124-126處編碼組氨酸的密碼子置換為編碼亮氨酸的密碼子的步驟；或?qū)⑺鼍幋aSEQ ID NO : I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73_75處編碼蘇氨酸的密碼子置換為編碼絲氨酸的密碼子的步驟；37)修飾包含編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明用于修飾多核苷酸的方法I);38)修飾包含編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的步驟，但不包括將所述核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明用于修飾多核苷酸的方法2)；39)修飾包含編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸79-81處編碼色氨酸的密碼子置換為編碼精氨酸的密碼子的步驟，但是既不包括將所述核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟，也不包括將所述核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的步驟(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明用于修飾多核苷酸的方法3)；40)修飾包含編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸124-126處編碼組氨酸的密碼子置 換為編碼亮氨酸的密碼子的步驟，但是不包括下述任何步驟將所述核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟，將所述核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的步驟，和將核苷酸序列中核苷酸79-81處編碼色氨酸的密碼子置換為編碼精氨酸的密碼子的步驟(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明用于修飾多核苷酸的方法4);以及41)修飾包含編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73-75處編碼蘇氨酸的密碼子置換為編碼絲氨酸的密碼子的步驟，但是不包括下述任何步驟將所述核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟，將所述核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的步驟，將所述核苷酸序列中核苷酸79-81處編碼色氨酸的密碼子置換為編碼精氨酸的密碼子的步驟，和將所述核苷酸序列中核苷酸124-126處編碼組氨酸的密碼子置換為編碼亮氨酸的密碼子的步驟(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明用于修飾多核苷酸的方法5)。根據(jù)本發(fā)明，可以提供具有良好的熱穩(wěn)定性的還原酶，該還原酶用于生產(chǎn)用作藥物或農(nóng)藥的活性成分的化合物、其中間體等、并且特別是光學(xué)活性化合物或其中間體及其他的有機合成反應(yīng)。在上述反應(yīng)中使用本發(fā)明的酶，減少反應(yīng)時間并且提高反應(yīng)效率將變得可能。實施本發(fā)明的方式本說明書中所述的發(fā)明不限于本文所述的具體的方法、流程和試劑，認為其是可以更改的。另外，本說明書中所用的術(shù)語僅用于描述具體的實施方案，并且它們不意欲限制本發(fā)明的范圍。本說明書中所用的所有的技術(shù)術(shù)語和化學(xué)數(shù)據(jù)具有與本發(fā)明所屬的領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的意思相同的意思，除非另外指明。與本說明書所述的那些方法和材料相似或等價的任何方法和材料都可以用來實施或檢驗本發(fā)明。下文將描述優(yōu)選的方法、裝置和材料。以下，將更詳細地描述本發(fā)明。在本申請中，例如，術(shù)語“G56C”意指包含除了具有SEQ ID NO :I的氨基酸序列中位置56 (“56”是從所述氨基酸序列的N端數(shù)起的位置號)的甘氨酸(“G”是表示甘氨酸的單個字母)置換為半胱氨酸(“C”是表示半胱氨酸的單個字母)的氨基酸突變之外與SEQID N01的氨基酸序列等價的氨基酸序列的酶。例如，術(shù)語“V115I”用來意指包含除了具有SEQ ID NO :I的氨基酸序列中位置115( “115”是從所述氨基酸序列的N端數(shù)起的位置號)的纈氨酸(“V”是表示纈氨酸的單個字母)置換為異亮氨酸(“I”是表示異亮氨酸的單個字母)的氨基酸突變之外與SEQID NO :1的氨基酸序列等價的氨基酸序列的酶。例如，術(shù)語“W27R”用來意指包含除了具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置27 ( “27”是從所述氨基酸序列的N端數(shù)起的位置號)的色氨酸(“W”是表示色氨酸的單個字母)置換為精氨酸(“R”是表示精氨酸的單個字母)的氨基酸突變之外與SEQ ID NO 1的氨基酸序列等價的氨基酸序列的酶。例如，術(shù)語“H42L”用來意指包含除了具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置42 ( “42”是從所述氨基酸序列的N端數(shù)起的位置號)的組氨酸(“H”是表示組氨酸的單個字母)置換為亮氨酸(“L”是表示亮氨酸的單個字母)的氨基酸突變之外與SEQ ID NO 1的氨基酸序列等價的氨基酸序列的酶。例如，術(shù)語“T25S”用來意指包含除了具有SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置25 ( “25”是從所述氨基酸序列的N端數(shù)起的位置號)的蘇氨酸(“T”是表示蘇氨酸的單個字母)置換為絲氨酸(“S”是表示絲氨酸的單個字母)的氨基酸突變之外與SEQ ID NO 1的氨基酸序列等價的氨基酸序列的酶。 本發(fā)明的酶的“使底物還原的能力”(以下還稱為還原酶活性)可以通過將所述酶與作為底物的α -酮酸(其中具體的實例是乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯)和NADPH在存在水的條件下混合，然后在30°C溫育該混合物，然后利用反應(yīng)溶液在340nm的吸光度作為指標來定量所得到的反應(yīng)溶液中消耗的NADPH的量而測量。在本發(fā)明中，術(shù)語“良好的熱穩(wěn)定性”用來意指，例如，在50°C進行溫育處理I小時后特定的還原酶殘余的還原酶活性比率高于以上述相同方式處理的野生型還原酶殘余的還原酶活性比率。本發(fā)明的酶包含除了在SEQ ID NO: I的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO: I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，所述一個或多個氨基酸突變包括下述氨基酸突變位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，或位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；并且具有使底物還原的能力。本發(fā)明的酶I包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO: I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變；并且具有使底物還原的能力。本發(fā)明的酶2包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO: I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，但是不包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變；并且具有使底物還原的能力。本發(fā)明的酶3包含除了在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO :1的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，但是不包括下述氨基酸突變位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，和位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變；并且具有使底物還原的能力。本發(fā)明的酶4包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO: I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，但是不包括下述氨基酸突變位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變；并且具有使底物還原的能力。本發(fā)明的酶5包含除了在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO: I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變，但是不包括下述氨基酸突變位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；并且具有使底物還原的能力。 應(yīng)該注意到，包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶(即，野生型還原酶)是已知的來源于商購的Yamadazyma farinosa IFO 0193菌株(其可從國家技術(shù)和評估學(xué)會(一個獨立的行政機構(gòu))獲得)。為了得到包含編碼本發(fā)明的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中還稱為本發(fā)明的多核苷酸)，例如，可以使用下述方法首先，得到包含編碼野生型還原酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(以下在一些情形中還稱為野生型多核苷酸)。例如，按照在由Cold Spring HarborLaboratory (冷泉港實驗室)1989 年出版的 J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis ；Molecular Cloning 2nd edition(分子克隆第2版)中所述的常規(guī)基因工程方法，可以從Yamadazyma farinosa IFO 0193菌株得到這樣的野生型多核苷酸。具體地，按照“Shin-Saibo Kogaku Jikken Protocols(New Cell Engineering ExperimentalProtocols (新細胞工程實驗方法))”(由東京大學(xué)(University of Tokyo)醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系、Shujunsha Co. ,Ltd. 1993 年編寫)所述的方法，由 Yamadazyma farinosa IFO 0193 菌株制備cDNA文庫。使用所制備的cDNA文庫作為模板，并且還使用適當(dāng)?shù)囊?，進行PCR，以擴增包含編碼SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，包含編碼關(guān)于SEQID N01的氨基酸序列具有一個或多個氨基酸缺失、置換或添加的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，包含SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸，包含關(guān)于SEQ ID N0:2的核苷酸序列具有一個或多個核苷酸缺失、置換或添加的核苷酸序列的多核苷酸等，由此制備本發(fā)明的多核苷酸。此處,如果使用來源于Yamadazyma farinosa IFO 0193菌株的cDNA文庫作為模板并且還使用包含SEQ ID NO :3的核苷酸序列的寡核苷酸和包含SEQ ID NO :4的核苷酸序列的寡核苷酸作為引物進行PCR，則擴增包含SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸。通過回收所擴增的多核苷酸，可以制備包含SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)。隨后，按照定點誘變，向包含SEQ ID NO 2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)中引入特定的定點突變，從而制備本發(fā)明的多核苷酸。上述定點突變包括將編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的定點突變；將編碼SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的定點突變；將編碼SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸79-81處編碼色氨酸的密碼子置換為編碼精氨酸的密碼子的定點突變；將編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸124-126處編碼組氨酸的密碼子置換為編碼亮氨酸的密碼子的定點突變；和將編碼SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73-75處編碼蘇氨酸的密碼子置換為編碼絲氨酸的密碼子的定點突變。本文所用的“定點誘變”的實例包括01fert Landt等人.(Gene (基因)96，125-128,1990), Smith 等人· (Genetic Engineering(基因工程)31Setlow, J.和Hollaender, A Plenum :New York), Vlasuk 等人· (Experimental Manipulation of Gene Expression (基因表達的實驗操作)，Inouye, M. Academic Press, New York), Hos. N. Hunt等人· (Gene 77, 51,1989)等的方法；和商購試劑盒如Mutan-Express Km(由 Takara ShuzoCo.，Ltd.制造)、TaKaRa La PCR 體外誘變試劑盒(由 Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)和QuickChange II定點誘變試劑盒(由Stratagene Corporation制造)的應(yīng)用。具體地，為了制備編碼除在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO :1的氨基酸序列等價的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述一個或多個氨基酸突變包括將位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的氨基酸突變，例如，通過使用Olfert Landt等人.(Gene (基因)96，125-128，1990)的方法制備，首先，按照例如由ColdSpring Harbor Laboratory (冷泉港實驗室)1989 年出版的 J. Sambrook, E. F. Fritsch,T. Maniatis !Molecular Cloning 2nd edition (分子克隆第2版)中所述的方法制備包含含有SEQ ID NO 2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的載體(DNA)。然后，將得到的載體(DNA)用作模板，并且，例如，使用包含編碼在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO :15的核苷酸序列的寡核苷酸)作為一條引物，并且還使用包含SEQID NO :3的核苷酸序列的寡核苷酸作為另一條引物，通過PCR擴增DNA片段。關(guān)于PCR反應(yīng)的條件，例如，進行在94°C溫育5分鐘,然后,進行在94°C溫育I分鐘、然后50°C 2分鐘、然后75°C 3分鐘的進行20個循環(huán)。最后，進行在75°C溫育8分鐘。純化這樣擴增的DNA片段。然后，將包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的載體(DNA)和包含SEQ ID NO 4的核苷酸序列的寡核苷酸引物添加到所得到的DNA片段中，然后通過PCR擴增DNA片段。將擴增的DNA片段消化，例如，用限制酶NcoI和XbaI消化，然后將這樣消化的片段連接到包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的載體(DNA)中，所述載體(DNA)已經(jīng)進行了用限制酶的相同消化，從而得到本發(fā)明所需要的多核苷酸I。本發(fā)明的酶I的氨基酸序列在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中包含一個或多個氨基酸突變，例如，1-5個氨基酸突變，優(yōu)選2-5個氨基酸突變，更優(yōu)選3-5個氨基酸突變，特別優(yōu)選4或5個氨基酸突變，或5個氨基酸突變。本發(fā)明的酶I的氨基酸序列可以不僅包括SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，而且還包括其他氨基酸突變，例如，1-4個其他氨基酸突變，優(yōu)選2-4個其他氨基酸突變，更優(yōu)選3或4個其他氨基酸突變，或4個其他氨基酸突變。
上述“其他氨基酸突變”的實例包括⑴在SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變；(2)在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變；(3)在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；和(4)在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。上述“一個或多個氨基酸突變”的實例包括一個氨基酸突變、兩個氨基酸突變、三個氨基酸突變、四個氨基酸突變和五個氨基酸突變。上述“一個氨基酸突變”的實例是SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變。本發(fā)明具有這樣“一個氨基酸突變”的酶I的具體實例是包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置56的氨基酸是半胱氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶。上述“兩個氨基酸突變”的實例包括(I)下述兩個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突·變；(2)下述兩個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變；(3)下述兩個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；和(4)下述兩個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。本發(fā)明具有這樣“兩個氨基酸突變”的酶I的具體實例包括(I)包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置56的氨基酸為半胱氨酸和位置115的氨基酸為異亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；(2)包含SEQ IDNO 1的氨基酸序列中位置56的氨基酸為半胱氨酸和位置27的氨基酸為精氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；(3)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置56的氨基酸為半胱氨酸和位置42的氨基酸為亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；和⑷包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置56的氨基酸為半胱氨酸和位置25的氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶。上述“三個氨基酸突變”的實例包括(I)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變；(2)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；(3)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；(4)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；(5)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；和(6)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。本發(fā)明具有這樣的“三個氨基酸突變”的酶I的具體實例包括(I)包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置56的氨基酸為半胱氨酸、位置115的氨基酸為異亮氨酸和位置27的氨基酸為精氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；(2)包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置56的氨基酸為半胱氨酸、位置115的氨基酸為異亮氨酸和位置42的氨基酸為亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；(3)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置56的氨基酸為半胱氨酸、位置115的氨基酸為異亮氨酸和位置25的氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；(4)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置56的氨基酸為半胱氨酸、位置27的氨基酸為精氨酸和位置42的氨基酸為亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；(5)包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置56的氨基酸為半胱氨酸、位置42的氨基酸為亮氨酸和位置25的氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；和(6)包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置56的氨基酸為半胱氨酸、位置27的氨基酸為精氨酸和位置25的氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶。上述“四個氨基酸突變”的實例包括⑴下述四個氨基酸 突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，
(c)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(d)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；(2)下述四個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(d)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；(3)下述四個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(d)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；和(4)下述四個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(d)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。本發(fā)明具有這樣的“四個氨基酸突變”的酶I的具體實例包括(I)包含SEQ ID NO I的氨基酸序列中位置56的氨基酸為半胱氨酸、位置115的氨基酸為異亮氨酸、位置27的氨基酸為精氨酸和位置42的氨基酸為亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；⑵包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置56的氨基酸為半胱氨酸、位置115的氨基酸為異亮氨酸、位置27的氨基酸為精氨酸和位置25的氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；(3)包含SEQ ID NO :I的氨基酸序列中位置56的氨基酸為半胱氨酸、位置115的氨基酸為異亮氨酸、位置42的氨基酸為亮氨酸和位置25的氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；和(4)包含SEQ ID NO :I的氨基酸序列中位置56的氨基酸為半胱氨酸、位置27的氨基酸為精氨酸、位置42的氨基酸為亮氨酸和位置25的氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶。上述“五個氨基酸突變”的實例是下述五個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(C)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，(d)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(e)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。本發(fā)明具有這樣的“五個氨基酸突變”的酶I的具體實例是⑴包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置56的氨基酸為半胱氨酸、位置115的氨基酸為異亮氨酸、位置27的氨基酸為精氨酸、位置42的氨基酸為亮氨酸和位置25的氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶。具體地，為了制備編碼除在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO :1的氨基酸序列等價的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，但是不包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，例如，通過使用Olfert Landt等人.(Gene (基因)96,125-128,1990)的方法制備,首先,按照例如由 Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港實驗室)1989 年出版的 J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis ；Molecular Cloning2nd edition (分子克隆第2版)中所述的方法制備包含含有SEQ ID NO 2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的載體(DNA)。然后，將得到的載體(DNA)用作模板，并且，例如，使用包含編碼在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置115的纈氨酸置換為異亮氨酸的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO :17的核苷酸序列的寡核苷酸)作為一條引物，并且還使用包含SEQID NO :3的核苷酸序列的寡核苷酸作為另一條引物，通過PCR擴增DNA片段。關(guān)于PCR反 應(yīng)的條件，例如，進行在94°C溫育5分鐘,然后,進行在94°C溫育I分鐘、然后50°C 2分鐘、然后75°C 3分鐘的進行20個循環(huán)。最后，進行在75°C溫育8分鐘。純化這樣擴增的DNA片段。然后，將包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的載體(DNA)和包含SEQ ID NO :4的核苷酸序列的寡核苷酸引物添加到所得到的DNA片段中，然后通過PCR擴增DNA片段。將擴增的DNA片段消化，例如，用限制酶NcoI和XbaI消化，然后將這樣消化的片段連接到包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的載體(DNA)中，所述載體(DNA)已經(jīng)進行了用限制酶的相同消化，從而得到本發(fā)明所需要的多核苷酸2。本發(fā)明的酶2的氨基酸序列在SEQ ID NO : I的氨基酸序列中包含一個或多個氨基酸突變，例如，1-4個氨基酸突變，優(yōu)選2-4個氨基酸突變，更優(yōu)選3或4個氨基酸突變，或4個氨基酸突變。本發(fā)明的酶2的氨基酸序列可以不僅包括SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，而且還包括其他氨基酸突變，例如，1-3個其他氨基酸突變，優(yōu)選2或3個其他氨基酸突變，或3個其他氨基酸突變，或4個其他氨基酸突變。然而，本發(fā)明的酶2不包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置56的甘氨酸被半胱
氨酸置換的氨基酸突變。上述“其他氨基酸突變”的實例包括(I)在SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變；(2)在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；和(3)在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。上述“一個或多個氨基酸突變”的實例包括一個氨基酸突變、兩個氨基酸突變、三個氨基酸突變和四個氨基酸突變。上述“一個氨基酸突變”的實例是SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變。本發(fā)明具有這樣“一個氨基酸突變”的酶2的具體實例是包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置115的氨基酸是異亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶。
上述“兩個氨基酸突變”的實例包括(I)下述兩個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變；(2)下述兩個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；和(3)下述兩個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。本發(fā)明具有這樣“兩個氨基酸突變”的酶2的具體實例包括(I)包含SEQ ID NO :I的氨基酸序列中位置115的氨基酸為異亮氨酸和位置27的氨基酸為精氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；(2)包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置115的氨基酸為異亮氨酸和位置42的氨基酸為亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；和(3)包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置115的氨基酸為異亮氨酸和位置25的氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶。上述“三個氨基酸突變”的實例包括(I)下述三個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和
(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；(2)下述三個氨基酸突變(a)位置115 的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；和(3)下述三個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。本發(fā)明具有這樣“三個氨基酸突變”的酶2的具體實例包括⑴包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置115的氨基酸為異亮氨酸、位置27的氨基酸為精氨酸和位置42的氨基酸為亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；⑵包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置115的氨基酸為異亮氨酸、位置27的氨基酸為精氨酸和位置25的氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；和⑶包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置115的氨基酸為異亮氨酸、位置42的氨基酸為亮氨酸和位置25的氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶。上述“四個氨基酸突變”的實例是這樣的四個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，(C)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(d)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。本發(fā)明具有這樣的“四個氨基酸突變”的酶2的具體實例是包含SEQ ID N0:1的氨基酸序列中位置115的氨基酸為異亮氨酸、位置27的氨基酸為精氨酸、位置42的氨基酸為亮氨酸和位置25的氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶。具體地，為了制備編碼除在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO :1的氨基酸序列等價的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，例如，通過使用Olfert Landt等人.(Gene (基因)96，125-128，1990)的方法制備，首先，按照例如由ColdSpring Harbor Laboratory (冷泉港實驗室)1989 年出版的 J. Sambrook, E. F. Fritsch,T. Maniatis !Molecular Cloning 2nd edition (分子克隆第2版)中所述的方法制備包含含有SEQ ID NO 2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的載體(DNA)。然后，將得到的載體(DNA)用作模板，并且，例如，使用包含編碼在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置27的色氨酸置換為精氨酸的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的寡核苷酸)作為一條引物，并且還使用包含SEQ IDNO 3的核苷酸序列的寡核苷酸作為另一條引物，通過PCR擴增DNA片段。關(guān)于PCR反應(yīng)的條件，例如，進行在94°C溫育5分鐘，然后，進行在94°C溫育I分鐘、然后50°C 2分鐘、然后750C 3分鐘的進行20個循環(huán)。最后，進行在75°C溫育8分鐘。純化這樣擴增的DNA片段。然后，將包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的載體(DNA)和包含SEQ ID NO :4的核苷酸序列的寡核苷酸引物添加到所得到的DNA片段中，然后通過PCR擴增DNA片段。將擴增的DNA片段消化，例如，用限制酶NcoI和XbaI消化，然后將這樣消化的片段連接到包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的載體(DNA)中，所述載體(DNA)已經(jīng)進行了用限制酶的相同消化，從而得到本發(fā)明所需要的基因3。本發(fā)明的酶3的氨基酸序列在SEQ ID NO : I的氨基酸序列中包含一個或多個氨基酸突變，例如，1-3個氨基酸突變，優(yōu)選2或3個氨基酸突變，或3個氨基酸突變。本發(fā)明的酶3的氨基酸序列可以不僅包括SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，而且還包括其他氨基酸突變，例如，I或2個其他氨基酸突變，或2個其·他氨基酸突變。然而，本發(fā)明的酶3不包含下述氨基酸突變SEQ ID NO :I的氨基酸序列中位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變和位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變。上述“其他氨基酸突變”的實例包括(I)在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；和(2)在SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。上述“一個或多個氨基酸突變”的實例包括一個氨基酸突變、兩個氨基酸突變和三個氨基酸突變。上述“一個氨基酸突變”的實例是SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變。本發(fā)明具有這樣“一個氨基酸突變”的酶3的具體實例是包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置27的氨基酸是精氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶。上述“兩個氨基酸突變”的實例包括(I)下述兩個氨基酸突變(a)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；和(2)下述兩個氨基酸突變(a)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。本發(fā)明具有這樣“兩個氨基酸突變”的酶3的具體實例包括⑴包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置27的氨基酸為精氨酸和位置42的氨基酸為亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶；和(2)包含SEQ ID N01的氨基酸序列中位置27的氨基酸為精氨酸和位置25的氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶。上述“三個氨基酸突變”的實例是下述三個氨基酸突變(a)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。本發(fā)明具有這樣“三個氨基酸突變”的酶3的具體實例是包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置27的氨基酸為精氨酸、位置42的氨基酸為亮氨酸和位置25的氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶。具體地，為了制備編碼除在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO :1的氨基酸序列等價的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，例如，通過使用Olfert Landt等人.(Gene (基因)96，125-128，1990)的方法制備，首先，按照例如由ColdSpring Harbor Laboratory (冷泉港實驗室)1989 年出版的 J. Sambrook, E. F. Fritsch,T. Maniatis !Molecular Cloning 2nd edition (分子克隆第2版)中所述的方法制備包含含有SEQ ID NO 2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的載體(DNA)。然后，將得到的載體(DNA)用作模板，并且，例如，使用包含編碼在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置42的組氨酸置換為亮氨酸的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO :13的核苷酸序列的寡核苷酸)作為一條引物，并且還使用包含SEQ ID NO 3的核苷酸序列的寡核苷酸作為另一條引物，通過PCR擴增DNA片段。關(guān)于PCR反應(yīng)的條件，例如，進行在94°C溫育5分鐘，然后，進行在94°C溫育I分鐘、然后50°C 2分鐘、然后750C 3分鐘的進行20個循環(huán)。最后，進行在75°C溫育8分鐘。純化這樣擴增的DNA片段。然后，將包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的載體(DNA)和包含SEQ ID NO :4的核苷酸序列的寡核苷酸引物添加到所得到的DNA片段中，然后通過PCR擴增DNA片段。將擴增的DNA片段消化，例如，用限制酶NcoI和XbaI消化，然后將這樣消化的片段連接到包含含有SEQID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的載體(DNA)中，所述載體(DNA)已經(jīng)進行了用限制酶的相同消化，從而得到本發(fā)明所需要的多核苷酸4。本發(fā)明的酶4的氨基酸序列包含一個或多個氨基酸突變，例如，I或2個氨基酸突變，并且優(yōu)選2個氨基酸突變。本發(fā)明的酶4的氨基酸序列可以不僅包括SEQ ID N0:1的氨基酸序列中位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，而且還包括其他氨基酸突變，例如，另一個氨基酸突變。然而，本發(fā)明的酶4不包含下述氨基酸突變位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變。上述“其他氨基酸突變”的實例是SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置25的蘇氨酸
被絲氨酸置換的氨基酸突變。上述“一個或多個氨基酸突變”的實例包括一個氨基酸突變和兩個氨基酸突變。上述“一個氨基酸突變”的實例是SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變。本發(fā)明具有這樣“一個氨基酸突變”的酶4的具體實例是包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置42的氨基酸是亮氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶。上述“兩個氨基酸突變”的實例是下述兩個氨基酸突變(a)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。本發(fā)明具有這樣“兩個氨基酸突變”的酶4的具體實例是包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置42的氨基酸為亮氨酸和位置25的氨基酸為絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶。具體地，為了制備編碼除在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO :1的氨基酸序列等價的氨基酸序列的多核苷酸，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變，例如，通過使用Olfert Landt等人.(Gene (基因)96，125-128，1990)的方法制備，首先，按照例如由ColdSpring Harbor Laboratory (冷泉港實驗室)1989 年出版的 J. Sambrook, E. F. Fritsch,T. Maniatis !Molecular Cloning 2nd edition (分子克隆第2版)中所述的方法制備包含含有SEQ ID NO 2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的載體(DNA)。然后，將得到的載體(DNA)用作模板，并且，例如，使用包含編碼在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置25的蘇氨酸置換為絲氨酸的氨基酸序列的核苷酸序列的寡核苷酸(例如，包含SEQ ID NO :5的核苷酸序列的寡核苷酸)作為一條引物，并且還使用包含SEQ IDNO 3的核苷酸序列的寡核苷酸作為另一條引物，通過PCR擴增DNA片段。關(guān)于PCR反應(yīng)的條件，例如，進行在94°C溫育5分鐘，然后，進行在94°C溫育I分鐘、然后50°C 2分鐘、然后 750C 3分鐘的進行20個循環(huán)。最后，進行在75°C溫育8分鐘。純化這樣擴增的DNA片段。然后，將包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的載體(DNA)和包含SEQ ID NO :4的核苷酸序列的寡核苷酸引物添加到所得到的DNA片段中，然后通過PCR擴增DNA片段。將擴增的DNA片段消化，例如，用限制酶NcoI和XbaI消化，然后將這樣消化的片段連接到包含含有SEQ ID NO :2的核苷酸序列的多核苷酸(野生型多核苷酸)的載體(DNA)中，所述載體(DNA)已經(jīng)進行了用限制酶的相同消化，從而得到本發(fā)明所需要的多核苷酸5。本發(fā)明的酶5的氨基酸序列包含一個或多個氨基酸突變，例如，I個氨基酸突變。本發(fā)明的酶5的氨基酸序列可以不僅包括位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變，而且還包括其他氨基酸突變。然而，本發(fā)明的酶5不包含下述氨基酸突變位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變。上述“一個或多個氨基酸突變”的實例是一個氨基酸突變。上述“一個氨基酸突變”的實例是SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。本發(fā)明具有這樣“一個氨基酸突變”的酶5的具體實例是包含SEQ ID NO : I的氨基酸序列中位置25的氨基酸是絲氨酸的氨基酸序列并且具有使底物還原的能力的酶。為了得到本發(fā)明的酶，制備能夠在宿主細胞如微生物中表達本發(fā)明的多核苷酸的載體。然后，將這樣制備的載體引入到要轉(zhuǎn)化其的宿主細胞中，以制備轉(zhuǎn)化體。隨后，所制備的轉(zhuǎn)化體可以通過常規(guī)的細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。因此，本發(fā)明的酶可以大量生產(chǎn)并且可以獲得。本發(fā)明的載體包含本發(fā)明的多核苷酸。為了制備本發(fā)明的載體，按照常規(guī)的基因工程方法，本發(fā)明的多核苷酸可以結(jié)合在可用于要引入本發(fā)明的多核苷酸的宿主細胞的載體中，例如，結(jié)合在包含在宿主細胞中可復(fù)制的遺傳信息的載體中，可以自主復(fù)制，可以從該宿主細胞分離或純化，并且具有可檢測的標記(以下在一些情形中還稱為基本載體)，由此構(gòu)建本發(fā)明的載體。本文所用的“基本載體”的實例在使用大腸桿菌(Escherichia coli)作為宿主細胞的情形中包括載體PUC119 (由Takara Shuzo Co. ,Ltd.制造)和卩遼菌粒pBluescriptII (由Stratagene Corporation制造)。另外,在使用芽殖酵母作為宿主細胞的情形中，所述基本載體的實例包括載體 pGBT9, pGAD424 和 pACT2 (由 Clontech Laboratories, Inc.制造)。此外，在使用哺乳動物細胞作為宿主細胞的情形中，所述基本載體的實例包括載體，如pRc/RSV和pRc/CMV(由Invitrogen制造)；包括自主復(fù)制起點的病毒來源的載體，如牛乳頭瘤病毒載體pBPV (由Amersham Pharmacia Biotech Inc.制造)和EB病毒載體pCEP4(由Invitrogen制造)；以及病毒，如痘苗病毒。此外，在使用昆蟲細胞作為宿主細胞的情形中，所述基本載體的實例包括昆蟲病毒，如桿狀病毒。如果使用包含自主復(fù)制起點的載體(具體地，酵母載體PACT2，牛乳頭瘤病毒載體pBPV，EB病毒載體pCEP4等)構(gòu)建本發(fā)明的載體，則當(dāng)將其引入到宿主細胞中時，所構(gòu)建的載體在宿主細胞中保持為附加體。 本發(fā)明的載體可以進一步包含含有編碼具有將氧化的腺嘌呤二核苷酸磷酸或氧化的β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)化為其還原形式的能力的蛋自的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。使用這樣的載體，還可能制備轉(zhuǎn)化體，所述轉(zhuǎn)化體進一步包含含有編碼具有將氧化的腺嘌呤二核苷酸磷酸或氧化的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)化為其還原形式的能力的蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。將能夠允許本發(fā)明的多核苷酸在宿主細胞如微生物中表達的載體引入到要轉(zhuǎn)化其的宿主細胞中，以制備轉(zhuǎn)化體。隨后，所制備的轉(zhuǎn)化體可以通過常規(guī)的細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，以致本發(fā)明的酶可以大量生產(chǎn)并且可以獲得。能夠允許本發(fā)明的多核苷酸在諸如微生物的宿主細胞中表達的載體可以這樣制備通過將在諸如微生物的宿主細胞中有功能的啟動子以有功能的方式結(jié)合到本發(fā)明的多核苷酸的上游位點，然后將這樣得到的產(chǎn)物結(jié)合到上述基本載體中。表述“以有功能的方式結(jié)合……”用在此處意指將啟動子與本發(fā)明的多核苷酸結(jié)合，以使本發(fā)明的多核苷酸可以在該啟動子的控制下在引入本發(fā)明的多核苷酸的宿主細胞(諸如微生物)中表達。在宿主細胞中有功能的啟動子的實例是在引入該啟動子的宿主細胞中表現(xiàn)出啟動子活性的DNAο當(dāng)宿主細胞是大腸桿菌時,這樣的啟動子的實例包括大腸桿菌乳糖操縱子啟動子(IacP)，色氨酸操縱子啟動子(trpP)，精氨酸操縱子啟動子(argP)，半乳糖操縱子啟動子(galp)，tac啟動子，T7啟動子，T3啟動子，λ噬菌體啟動子(λ-PL，入-pR)。另外，當(dāng)宿主細胞是動物細胞或裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)時,啟動子的實例包括勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus, RSV)啟動子，巨細胞病毒(CMV)啟動子，猿猴病毒(SV40)早期或晚期啟動子，和小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子。并且，當(dāng)宿主細胞是芽殖酵母時，啟動子的實例是ADHl啟動子(其中所述ADHl啟動子可以通過常規(guī)的基因工程方法由包含ADHl啟動子或終止子的酵母表達載體pAAH5 [可獲自Washington ResearchFoundation ；Ammerer 等人，Method in Enzymology (酶學(xué)方法)，IOlpart (p. 192-201)]制備)。此外，當(dāng)使用原始包含在宿主細胞中有功能的啟動子的基本載體時，本發(fā)明的多核苷酸可以插入到上述啟動子的下游位點，以使上述啟動子可以以有功能的方式結(jié)合本發(fā)明的多核苷酸。例如，當(dāng)啟動子為pRc/RSV，pRc/CMV等時，克隆位點建立在動物細胞中有功能的啟動子的下游。將通過將本發(fā)明的多核苷酸插入到前述克隆位點中得到的載體引入到動物細胞中，以允許本發(fā)明的多核苷酸在所述動物細胞中表達。在這些載體中，先前已經(jīng)結(jié)合了 SV40自主復(fù)制起點(ori)。因此，如果將這樣的載體引入到已經(jīng)轉(zhuǎn)化了 ori-缺陷的SV40基因組的培養(yǎng)的細胞中，如COS細胞中，則在所述細胞中載體的拷貝數(shù)顯著增加，并且結(jié)果，結(jié)合在所述載體中 的本發(fā)明的多核苷酸可以大量表達。并且，前述酵母載體PACT2具有ADHl啟動子。因此，如果將本發(fā)明的多核苷酸插入到所述載體或其衍生物的ADHl啟動子的下游位點，則還可以構(gòu)建這樣的載體，所述載體允許本發(fā)明的多核苷酸在芽殖酵母如CG1945 (由 Clontech Laboratories, Inc.制造)中大量表達。在使用微生物作為宿主細胞的情形中，微生物的實例包括真核生物和原核生物。優(yōu)選的實例是大腸桿菌?？梢酝ㄟ^按照常規(guī)基因工程方法將上述載體引入到宿主細胞中而轉(zhuǎn)化該宿主細胞。作為將本發(fā)明的載體引入到宿主細胞中的方法，取決于所述宿主細胞的類型，可以應(yīng)用一般的引入方法。當(dāng)使用大腸桿菌作為宿主細胞時，可以應(yīng)用一般方法，如ColdSpring Harbor Laboratory (冷泉港實驗室)1989 年出版的 J. Sambrook, E. F. Frisch,T. Maniatis ,Molecular Cloning 2nd edition (分子克隆第2版)”中所述的氯化I丐法和電穿孔法。另外，當(dāng)使用哺乳動物細胞或昆蟲細胞作為宿主細胞時，可以應(yīng)用一般的基因轉(zhuǎn)移方法，諸如磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、電穿孔法和脂轉(zhuǎn)染法。并且，當(dāng)使用酵母作為宿主細胞時，可以應(yīng)用作為酵母轉(zhuǎn)化試劑盒(由Clontech Laboratories, Inc.制造)等中所用的鋰法的一般方法。此外，當(dāng)使用病毒作為載體時，可以按照上述一般的基因轉(zhuǎn)移方法將病毒基因組引入到宿主細胞中。備選地，還可以通過用包含已經(jīng)插入了本發(fā)明的基因的病毒基因組的病毒粒子感染宿主細胞而將這樣的病毒基因組引入到所述宿主細胞中。為了選擇本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，例如，其中與本發(fā)明的載體同時引入了標記基因的宿主細胞可以通過適于所述標記基因的特性的方法進行培養(yǎng)。例如，當(dāng)所述標記基因是賦予對所選的藥物的藥物抗性的基因時，所述所選的藥物對宿主細胞表現(xiàn)出致死活性，其中已經(jīng)引入了本發(fā)明的載體的宿主細胞可以在添加了所述所選藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。賦予藥物抗性的基因與所選藥物的這樣的組合的實例包括新霉素抗性-賦予基因和新霉素的組合，潮霉素抗性-賦予基因和潮霉素的組合，以及殺稻瘟素S抗性-賦予基因和殺稻瘟素S的組合。并且，當(dāng)所述標記基因是補充宿主細胞的營養(yǎng)缺陷的基因時，其中已經(jīng)引入了本發(fā)明的載體的細胞可以在不包含與所述營養(yǎng)缺陷相對應(yīng)的營養(yǎng)物的最低培養(yǎng)基中培養(yǎng)。此外，當(dāng)引入能夠允許本發(fā)明的多核苷酸在宿主細胞中表達的本發(fā)明的載體時，也可以應(yīng)用基于本發(fā)明的酶的酶活性的檢測方法。為了獲得本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，例如，其中本發(fā)明的多核苷酸位于宿主細胞的染色體中，首先將本發(fā)明的載體和包含標記基因的載體用限制酶等消化以使其轉(zhuǎn)化為線性形式。然后，將這些線性形式通過上述方法引入到宿主細胞中。隨后，一般將宿主細胞培養(yǎng)數(shù)周，并且可以基于所引入的標記基因的表達水平選擇目的轉(zhuǎn)化體，然后可以得到目的轉(zhuǎn)化體。備選地，將包含賦予上述所選的藥物抗性的基因作為標記基因的本發(fā)明的載體通過上述方法引入到宿主細胞中。隨后，將所述細胞在添加了所選藥物的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)數(shù)周或更多周，然后，將以群落形式存活的所選藥物抗性-克隆進行純化培養(yǎng)，以選擇并且得到本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體，其中本發(fā)明的多核苷酸被引入到所述宿主細胞的染色體中。為了驗證所引入的本發(fā)明的多核苷酸已經(jīng)結(jié)合到宿主細胞的染色體中，可以按照常規(guī)基因工程方法制備細胞的基因組DNA。然后，可以按照其中使用本發(fā)明的基因的部分核苷酸序列作為引物或探針的PCR、Southern雜交等在所制備的基因組DNA中檢測本發(fā)明的基因的存在。本轉(zhuǎn)化體可以以冷凍狀態(tài)保存，并且需要時，可以將其融化并使用。因此，可以省略為每次實驗制備轉(zhuǎn)化體的操作，并且還可以使用其特性和處理條件已經(jīng)提前驗證的轉(zhuǎn)化體進行檢測。包含本發(fā)明的多核苷酸或本發(fā)明的載體的轉(zhuǎn)化體(即，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體)可以按照常規(guī)細胞培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)。當(dāng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是微生物時，例如，其可以在各種類型的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基適當(dāng)?shù)匕ǔＴ谖⑸锏某Ｒ?guī)培養(yǎng)中所用的碳源、氮源、有機鹽或無機鹽等。碳源的實例包括糖如葡萄糖、糊精和蔗糖；糖醇如甘油；有機酸如延胡索酸、檸檬酸和丙酮酸；動物油；植物油；和糖蜜。這樣的碳源通常以基于培養(yǎng)液的總體積約O. 1% (w/v)至30% (w/v)的量添加到培養(yǎng)基中。氮源的實例包括天然有機氮源，如肉提取物，蛋白胨，酵母提取物，麥芽提取物，大豆粉，玉米漿(corn steep liquor)，棉籽粉，干酵母和酪蛋白氨基酸；無機酸如氨基酸的銨鹽和硝酸鈉；無機酸的銨鹽如氯化銨、硫酸銨和磷酸銨；有機酸的銨鹽如延胡索酸銨和檸檬酸銨；和尿素。這些物質(zhì)中，有機酸的銨鹽、天然有機氮源、氨基酸等在多種情形中也可以用作碳源。這樣的氮源通常以基于培養(yǎng)液的總體積約O. 1% (w/v)至30% (w/v)的量添加到培養(yǎng)基中。有機鹽和無機鹽的實例包括如鉀、鈉、鎂、鐵、錳、鈷和鋅的氯化物；硫酸鹽；乙酸鹽；碳酸鹽；和磷酸鹽。具體的實例包括氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵，硫酸錳，氯化鈷，硫酸鋅，硫酸銅，乙酸鈉，碳酸鈣，磷酸二氫鉀，和磷酸氫二鉀。這樣的有機鹽和/或無機鹽通常以基于培養(yǎng)液的總體積約O. 0001% (w/v)至5% (w/v)的量添加到培養(yǎng)基中。此外，在用這樣的基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體的情形中，在所述基因中，別乳糖-誘導(dǎo)型啟動子如tac啟動子、trc啟動子或Iac啟動子與本發(fā)明的多核苷酸可操作性連接,例如,可以向培養(yǎng)基中加入少量的異丙基硫代_β-D-半乳糖苷(IPTG)作為誘導(dǎo)劑用于誘導(dǎo)本發(fā)明的酶的生產(chǎn)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可以按照培養(yǎng)諸如微生物的宿主細胞中常規(guī)所用的方法進行培養(yǎng)。培養(yǎng)方法的實例包括液體培養(yǎng)如試管震蕩培養(yǎng)，往復(fù)振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵罐培養(yǎng)和池培養(yǎng)；和固體培養(yǎng)。培養(yǎng)的溫度可以在轉(zhuǎn)化體可以生長的范圍內(nèi)適當(dāng)變化。通常為約15°C至約40°C。培養(yǎng)基的PH優(yōu)選在約pH 6至約pH 8的范圍內(nèi)。培養(yǎng)時間取決于培養(yǎng)條件而不同。通常，優(yōu)選為約I天至約5天。作為從本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)產(chǎn)物中純化本發(fā)明的酶的方法，可以應(yīng)用蛋白的常規(guī)純化中所用的方法，例如，可以應(yīng)用下述方法。首先，通過離心等從轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)產(chǎn)物收集細胞。然后，通過物理分解法如超聲波處理、Dyno-磨處理(Dyno-mill treatment)和弗氏細胞壓碎器處理或通過用表面活性劑或裂解酶如溶菌酶的化學(xué)分解法或通過其他方法將所收集的細胞分解。通過離心、膜濾器過濾等將雜質(zhì)從得到的分解的細胞溶液中去除，以制備不含細胞的提取物，并且然后將制備的提取物通過適當(dāng)?shù)姆蛛x和純化方法如陽離子交換層析、陰離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾層析和金屬螯合層析分級，以純化本發(fā)明的酶。層析中所用的載體(carrier)的實例包括不溶的聚合物載體，諸如其中已經(jīng)引入羧甲基(CM)基團、二乙基氨基乙基(DEAE)基團、苯基基團或丁基基團的纖維素，糊精或瓊脂糖。也可以用商購的載體-填充柱。這樣的商購的載體-填充柱的實例包括Q-SepharoseFF,苯基 Sepharose HP (商品名，由 Amersham Pharmacia Biotech K. K.制造)和 TSK-凝膠 G3OOOSW (商品名，由 Tosoh Corporation 制造)。當(dāng)選擇包含本發(fā)明的酶的級分時，可以基于存在或不存在本發(fā)明的還原酶活性或其程度選擇所述級分。還可以通過測量不對稱地還原作為底物的α-酮酸(具體為乙基2-氧代-4-苯基丁酸酯等)以及優(yōu)先產(chǎn)生相對應(yīng)的羥酸的能力而選擇所述級分。本發(fā)明的生產(chǎn)方法包括允許本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體或其處理的產(chǎn)物作用在2-氧代-4-苯基丁酸酯上的步驟。 2-氧代-4-苯基丁酸酯的一個實例是由下式(I)所示的化合物[式I]
O
COOR1 ( 1 )其中R1表示C1-C8烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基或辛基。2-氧代-4-苯基丁酸酯的具體實例包括甲基2-氧代-4-苯基丁酸酯，乙基2_氧代-4-苯基丁酸酯，丙基2-氧代-4-苯基丁酸酯，和辛基2-氧代-4-苯基丁酸酯。例如，這些酯可以通過Tetrahedron (1985) ,41 (2) ,467-72所述的方法或其等價的方法制備。(R) -2-羥基-4-苯基丁酸酯的一個實例是(R) -2-羥基_4_苯基丁酸的C1-C8烷基酯化合物，其中由式(I)所示的化合物的2-位的氧代基團被不對稱地還原成羥基基團。上述方法通常在存在水和還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下在一些情形中還稱為NADH)或還原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下在一些情形中還稱為NADPH)的條件下進行。在該步驟中所用的水可以是緩沖的水溶液。用于所述緩沖的水溶液的緩沖劑的實例包括堿金屬磷酸鹽如磷酸鈉和磷酸鉀；堿金屬乙酸鹽如乙酸鈉水溶液和乙酸鉀；以及它們的混合物。在上述方法中，有機溶劑可以與水共存?？梢耘c水共存的有機溶劑的實例包括醚類，如叔丁基甲醚、二異丙醚和四氫呋喃；酯類，如甲酸乙酯，乙酸乙酯，乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酸乙酯和丙酸丁酯；烴類，如甲苯、己烷、環(huán)己烷、庚烷和異辛烷；醇類，如甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇和叔丁醇；有機硫化合物，如二甲亞砜；酮類，如丙酮；腈類，如乙腈；以及它們的混合物。進行上述方法中的反應(yīng)，例如，在需要時進一步包含有機溶劑等的條件下，通過攪拌、震蕩等混合水、2-氧代-4-苯基丁酸酯和NADH或NADPH以及本發(fā)明的酶、生產(chǎn)本發(fā)明的酶的轉(zhuǎn)化體、或其處理的產(chǎn)物而進行?？梢赃m當(dāng)選擇在上述方法的反應(yīng)過程中的pH。通常在pH 3-10的范圍內(nèi)?？梢赃m當(dāng)選擇反應(yīng)溫度。從原料和產(chǎn)物的穩(wěn)定性以及反應(yīng)速率來看，通常在0°c至60°C的范圍內(nèi)。
反應(yīng)的終點可以通過液相色譜等追蹤反應(yīng)溶液中的2-氧代-4-苯基丁酸酯的量而確定?？梢赃m當(dāng)選擇反應(yīng)時間。通常在O. 5小時至10天的范圍內(nèi)?？梢酝ㄟ^通常已知的方法從反應(yīng)溶液回收(R)-2-羥基-4-苯基丁酸酯。從反應(yīng)溶液回收(R)-2-羥基-4-苯基丁酸酯的方法的實例是通過將反應(yīng)溶液進行諸如有機溶劑萃取和濃縮的后處理而純化反應(yīng)溶液的方法，需要時，后處理與柱層析、蒸餾等組合。本發(fā)明的酶、生產(chǎn)其的轉(zhuǎn)化體、或其處理的產(chǎn)物可以以各種形式用在上述方法中。具體形式的實例包括本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)產(chǎn)物、所述轉(zhuǎn)化體的處理的產(chǎn)物、不含細胞的提取物、粗純化的蛋白、純化的蛋白、及其固定的產(chǎn)物。此處，所述轉(zhuǎn)化體的處理的產(chǎn)物的實例包括凍干的轉(zhuǎn)化體、有機溶劑-處理的轉(zhuǎn)化體、干轉(zhuǎn)化體、轉(zhuǎn)化體-分解的產(chǎn)物、轉(zhuǎn)化體的自溶產(chǎn)物、轉(zhuǎn)化體的超聲波-處理的產(chǎn)物、轉(zhuǎn)化體提取物、和轉(zhuǎn)化體的堿-處理的 產(chǎn)物。得到的固定的產(chǎn)物的方法的實例包括載體結(jié)合(bonding)法(其是將本發(fā)明的酶等吸附到無機載體如硅膠或陶瓷、纖維素、離子交換樹脂上的方法)和截留法(其是將本發(fā)明的酶等截留在聚合物的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的方法，所述聚合物諸如聚丙烯酰胺、含硫的多糖凝膠(例如，交叉菜聚糖凝膠)、海藻酸凝膠、瓊脂凝膠等)。對于使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的工業(yè)生產(chǎn)，使用殺死的轉(zhuǎn)化體的產(chǎn)物的方法比使用未處理的轉(zhuǎn)化體的方法更優(yōu)選，因為前一種方法對生產(chǎn)儀器的限制很少。對于這一目的，殺死的方法的實例包括物理殺菌法(加熱、干燥、冷凍、光線、超聲波、過濾和配電)，以及使用化學(xué)藥物(喊、酸、鹵素、氧化劑、硫磺、硼、砷、金屬、醇、苯酚、胺、硫化物、醚、醛、酮、氰基(cyan)和抗生素)的殺菌法。通常，需要從前述殺菌方法中選擇這樣的處理方法，所述方法以盡可能低的水平使本發(fā)明的酶的還原酶活性失活，并且對反應(yīng)系統(tǒng)的影響很小，諸如殘留的作用和污染。本發(fā)明的生產(chǎn)方法在存在NADH或NADPH的條件下進行，并且隨著2_氧代_4_苯基丁酸酯的不對稱還原反應(yīng)的進展，NADH或NADPH被轉(zhuǎn)化為氧化的β -煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下稱為NAD+)或氧化的β -煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下稱為NADP+)。作為轉(zhuǎn)化的結(jié)果產(chǎn)生的NAD+或NADP+可以通過具有將NAD+或NADP+轉(zhuǎn)化為其還原形式(NADH或NADPH)的能力的蛋白恢復(fù)為初始的NADH或NADPH。因此，在上述方法中，這樣具有將NAD+或NADP+轉(zhuǎn)化為NADH或NADPH的能力的蛋白可以在反應(yīng)系統(tǒng)中共存。這樣具有將NAD+或NADP+轉(zhuǎn)化為NADH或NADPH的能力的蛋白的實例包括葡萄糖脫氫酶、甲酸脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、氨基酸脫氫酶和有機酸脫氫酶(蘋果酸脫氫酶
坐^
寸/ ο 當(dāng)具有將NAD+或NADP+轉(zhuǎn)化為NADH或NADPH的能力的蛋白是葡萄糖脫氫酶時，在一些情形中，該蛋白的活性可以通過在反應(yīng)系統(tǒng)中共存葡萄糖等而得以加強，并且，例如，葡萄糖等可以添加到反應(yīng)溶液中。所述蛋自可以本身是酶，或可以在反應(yīng)系統(tǒng)中以具有該酶的微生物的形式或所述微生物的處理的產(chǎn)物的形式共存。此外，也可以是包含具有編碼具有將NAD+或NADP+轉(zhuǎn)化為NADH或NADPH的能力的蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的轉(zhuǎn)化體或其處理的產(chǎn)物。此處,處理的產(chǎn)物意指關(guān)于“轉(zhuǎn)化體的處理的產(chǎn)物”所述的產(chǎn)物。本發(fā)明用于生產(chǎn)(R)-2_羥基-4-苯基丁酸酯的方法還可以使用包含具有編碼具有將NAD+或NADP+轉(zhuǎn)化為NADH或NADPH的能力的蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸和本發(fā)明的多核苷酸二者的轉(zhuǎn)化體進行，所述具有將NAD+或NADP+轉(zhuǎn)化為NADH或NADPH的能力的蛋白諸如葡萄糖脫氫酶、甲酸脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、氨基酸脫氫酶和有機酸脫氫酶(蘋果酸脫氫酶等)。將該轉(zhuǎn)化體的兩種多核苷酸引入到宿主細胞中的方法的實例包括將包含這兩種多核苷酸的單一載體引入宿主細胞的方法，和用通過將這兩種多核苷酸分別引入到不同來源的多個載體中制備的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法。此外，這兩種多核苷酸中的一種多核苷酸或兩種多核苷酸也可以被引入到宿主細胞的染色體中。作為將包含這兩種多核苷酸的單一載體引入到宿主細胞中的方法，例如，可以通 過將與表達控制相關(guān)的區(qū)域如啟動子或終止子與前述多核苷酸中的每一種連接而構(gòu)建重組載體。備選地，可以構(gòu)建重組載體來表達包含多個順反子的操縱子，諸如乳糖操縱子。用于修飾本發(fā)明的酶的方法是用于修飾包含SEQ ID NO :1的氨基酸序列的酶的方法。本發(fā)明的方法包括在SEQ ID NO :I的氨基酸序列中，將位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟，將位置115的纈氨酸置換為異亮氨酸的步驟，將位置27的色氨酸置換為精氨酸的步驟，將位置42的組氨酸置換為亮氨酸的步驟，或?qū)⑽恢?5的蘇氨酸置換為絲氨酸的步驟。用于修飾本發(fā)明的酶的方法I是用于修飾包含SEQ ID NO :I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟。用于修飾本發(fā)明的酶的方法2是用于修飾包含SEQ ID NO :I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置115的纈氨酸置換為異亮氨酸的步驟，但不包括將所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟。用于修飾本發(fā)明的酶的方法3是用于修飾包含SEQ ID NO :I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置27的色氨酸置換為精氨酸的步驟，但是不包括下述步驟將所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟，和將所述氨基酸序列中位置115的纈氨酸置換為異亮氨酸的步驟。用于修飾本發(fā)明的酶的方法4是用于修飾包含SEQ ID NO :I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置42的組氨酸置換為亮氨酸的步驟，但是不包括下述步驟將所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟，將所述氨基酸序列中位置115的纈氨酸置換為異亮氨酸的步驟，和將所述氨基酸序列中位置27的色氨酸置換為精氨酸的步驟。用于修飾本發(fā)明的酶的方法5是用于修飾包含SEQ ID NO :I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO :1的氨基酸序列中位置25的蘇氨酸置換為絲氨酸的步驟，但是不包括下述步驟將所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟，將所述氨基酸序列中位置115的纈氨酸置換為異亮氨酸的步驟，將所述氨基酸序列中位置27的色氨酸置換為精氨酸的步驟，和將所述氨基酸序列中位置42的組氨酸置換為亮氨酸的步驟。用于修飾本發(fā)明的酶的方法中所包括的步驟可以按照前述解釋(例如，關(guān)于制備本發(fā)明的酶和本發(fā)明的多核苷酸的解釋)和與前述實施例(例如，Productionof Polynucleotide of the Present Invention :Introduction of Site-DirectedMutations (本發(fā)明的多核苷酸的制備定點突變的介紹))中所述的那些方法相似的方法進行。用于修飾本發(fā)明的多核苷酸的方法是用于修飾包含編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟；將所述編碼SEQ ID NO : I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的步驟；將所述編碼SEQ ID NO 1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸79_81處編碼色氨酸的密碼子置換為編碼精氨酸的密碼子的步驟；將所述編碼SEQ ID NO : I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸124-126處編碼組·氨酸的密碼子置換為編碼亮氨酸的密碼子的步驟；或?qū)⑺鼍幋aSEQ ID NO : I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73_75處編碼蘇氨酸的密碼子置換為編碼絲氨酸的密碼子的步驟。用于修飾本發(fā)明的多核苷酸的方法I是一種用于修飾包含編碼SEQID NO 1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID N0:1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟。用于修飾本發(fā)明的多核苷酸的方法2是一種用于修飾包含編碼SEQ ID N0:1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID N0:1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的步驟，但不包括將所述核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟。用于修飾本發(fā)明的多核苷酸的方法3是一種用于修飾包含編碼SEQ ID N0:1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID N0:1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸79-81處編碼色氨酸的密碼子置換為編碼精氨酸的密碼子的步驟，但是不包括下述步驟將所述核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟，和將所述核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的步驟。用于修飾本發(fā)明的多核苷酸的方法4是一種用于修飾包含編碼SEQ ID N0:1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID N0:1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸124-126處編碼組氨酸的密碼子置換為編碼亮氨酸的密碼子的步驟，但是不包括下述步驟將所述核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟，將所述核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的步驟，和將核苷酸序列中核苷酸79-81處編碼色氨酸的密碼子置換為編碼精氨酸的密碼子的步驟。用于修飾本發(fā)明的多核苷酸的方法5是一種用于修飾包含編碼SEQ ID N0:1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID N0:1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73-75處編碼蘇氨酸的密碼子置換為編碼絲氨酸的密碼子的步驟，但是不包括下述步驟將所述核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟，將所述核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的步驟，將核苷酸序列中核苷酸79-81處編碼色氨酸的密碼子置換為編碼精氨酸的密碼子的步驟，和將所述核苷酸序列中核苷酸124-126處編碼組氨酸的密碼子置換為編碼亮氨酸的密碼子的步驟。用于修飾本發(fā)明的多核苷酸的方法中所包括的步驟可以按照前述解釋(例如，關(guān)于制備本發(fā)明的酶和本發(fā)明的多核苷酸的解釋)和與前述實施例(例如，Productionof Polynucleotide of the Present Invention :Introduction of Site-DirectedMutations (本發(fā)明的多核苷酸的制備定點突變的介紹))中所述的那些方法相似的方法進行。
實施例
以下，將在實施例中更詳細地描述本發(fā)明。然而，這些實施例不意欲限制本發(fā)明。對于基因克隆和質(zhì)粒構(gòu)建，可以引用"Molecular Cloning A LaboratoryManual 2nd edition (分子克隆實驗室手冊第2版)"(1989)，冷泉港實驗室出版，ISBN0-87969-309-6, " Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)方法)"(1987)，John Wiley & amp ；Sons, Inc. ISBN 0-471-50338-X 等中所述的方法作為參考。下面將詳細描述諸如克隆的步驟實施例I (制備編碼野生型還原酶的多核苷酸(即，野生型多核苷酸))(1-1)制備染色體 DNA(A)向兩個500-ml燒瓶的每一個中，加入IOOml培養(yǎng)基(培養(yǎng)基通過將2g葡萄糖、0. 5g聚胨、0. 3g酵母提取物和0. 3g麥芽提取物溶解在IOOml水中，然后用2N HCl將其pH調(diào)節(jié)為pH 6而制備)，然后將所述燒瓶在121°C滅菌15分鐘。向這些燒瓶的每一個中，力口入0. 3ml在相同組成的培養(yǎng)基中培養(yǎng)(30°C,48小時,振蕩培養(yǎng))的Yamadazyma farinosaIF0193菌株的培養(yǎng)液，然后在30°C振蕩培養(yǎng)72小時。然后，將得到的培養(yǎng)液離心(8000rpm，10分鐘)，并且收集所產(chǎn)生的沉淀物。將該沉淀物用50ml0. 85%鹽水洗滌并且回收，以得到3. 64g濕細胞。使用QIAprep Genomic-tip System(由 Qiagen K. K.制造)，從這樣得到的濕細胞得到細胞內(nèi)DNA(以下在一些情形中還稱為染色體DNA(A))。(1-2)制備包含編碼野生型還原酶的多核苷酸(即，野生型多核苷酸)的載體(構(gòu)建載體pTrcRyf)(I)制備本發(fā)明的載體使用包含SEQ ID NO :3的核苷酸序列的寡核苷酸引物和SEQ ID NO :4的寡核苷酸引物作為引物，并且還使用上述染色體DNA(A)作為模板，利用下述反應(yīng)溶液組成并在下述反應(yīng)條件下進行PCR(使用由Roche Diagnostics K. K.制造的擴增高保真度PLUS PCR系統(tǒng)(Expand High Fidelity PLUS PCR System))。[反應(yīng)溶液組成]cDNA文庫儲液I μ
dNTP (每種2.5 mM-混合物)4 μ
ff 義]丨物(50ρπ〗ο1/μ1)0.4 μ
反義]I 物(50 pmol/μ )0.4 μ
5 X緩沖液(含MgCl)10 μ
擴增高保真度PLUS Taq聚合酶0.5 μ (2.5 U)
超純水33.7 μ [反應(yīng)條件] 將包含上述組成的反應(yīng)溶液的容器放置在PERKIN ELMER-GeneAmp PCR系統(tǒng)9700上，并且加熱至94°C (2分鐘)，然后，重復(fù)下述循環(huán)10次94°C (O. 25分鐘)，55°C (O. 5分鐘)和720C (I. 5分鐘)，然后，重復(fù)下述循環(huán)20次94°C (O. 25分鐘)，55°C (O. 5分鐘)和720C (I. O分鐘+5秒/循環(huán))，再然后，將反應(yīng)溶液保持在72°C 7分鐘。然后，收集得到的PCR反應(yīng)溶液的等分試樣，然后進行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果，檢測到約IOOObp的DNA片段的條帶。將兩種類型的限制酶(NcoI和XbaI)添加到剩余的PCR反應(yīng)溶液中，并且將約IOOObp的DNA片段進行雙重消化。然后，純化酶消化的DNA片段。另一方面，將載體pTrc99A(由Pharmacia制造)用兩種類型的限制酶(NcoI和XbaI)雙重消化,然后純化酶消化的DNA片段。將通過上述純化得到的這樣的酶消化的兩種類型的DNA片段彼此混合，用T4 DNA連接酶彼此連接。然后，用得到的連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli)DH5a。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5 a在含有50 μ g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。將形成的菌落接種到滅菌的LB培養(yǎng)基(2ml)(含有50 μ g/ml氨芐青霉素)中，然后在試管中進行振蕩培養(yǎng)(37°C, 17小時)ο使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(由Qiagen制造)從得到的培養(yǎng)的細胞收集質(zhì)粒。將收集的質(zhì)粒的每份等分試樣分別用兩種類型的限制酶NcoI和XbaI雙重消化，然后將酶消化物進行電泳。結(jié)果，證實上述約IOOObp的DNA片段已經(jīng)插入到所收集的質(zhì)粒中(以下，該質(zhì)粒稱為“載體pTrcRYF”)。實施例2 (制備編碼輔酶-再生酶的多核苷酸)(2-1)制備包含編碼具有將氧化的β -煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉(zhuǎn)化為其還原形式的能力的蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的預(yù)備步驟將巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium) IFO 12108菌株在IOOml滅菌的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以得到O. 4g細胞。使用Qiagen Genomic Tip (由Qiagen制造)按照其中所包含的手冊所述的方法從所得到的細胞純化染色體DNA(以下還稱為染色體DNA(B))。(2-2)制備包含編碼具有將氧化的β -煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸轉(zhuǎn)化為其還原形式的能力的蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸基于Journal of Biological Chemistry (生物化學(xué)雜志)卷 264, No. 11,6381-6385(1989)所述的編碼來源于巨大芽孢桿菌IWG3的葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列的核苷酸序列，合成包含SEQ ID NO :6的核苷酸序列的寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO :7的核苷酸序列的寡核苷酸弓I物。使用包含SEQ ID NO :6的核苷酸序列的寡核苷酸引物和包含SEQ ID NO :7的核苷酸序列的寡核苷酸引物作為引物，并且還使用上述染色體DNA(B)作為模板，在下述反應(yīng)溶液組成和反應(yīng)條件下進行PCR(使用由Roche Diagnostics K. K.制造的Expand HighFidelity PCR System(擴增高保真度PCR系統(tǒng)))。[反應(yīng)溶液組成]
染色體DNA儲液Ιμ
dNTP (每種2.5 mM-混合物) 4 μ I物(20 ριηο1/μ1)每種 0.75 μ
IOx緩沖液(穴MgCl)5 μ
enz. expand Hi Fi (3.5 x 103 U/ral) 0.375 μ
超純水41.725 μ [PCR反應(yīng)條件]將包含上述組成的反應(yīng)溶液的容器放置在PERKIN ELMER-GeneAmp PCR系統(tǒng)2400上，并且加熱至97V (2分鐘)，然后，重復(fù)下述循環(huán)10次97°C (O. 25分鐘)，55°C (O. 5分鐘)和720C (I. 5分鐘)，然后，重復(fù)下述循環(huán)20次97°C (O. 25分鐘)，55°C (O. 5分鐘)和720C (2. 5分鐘)，再然后，將反應(yīng)溶液保持在72°C 7分鐘。然后，收集得到的PCR反應(yīng)溶液的等分試樣，然后進行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果，檢測到約950bp的DNA片段的條帶。使用得到的PCR反應(yīng)溶液和由Invitrogen制造的Τ0Ρ0ΤΜΤΑ克隆試劑盒Ver. Ejf作為PCR的結(jié)果得到的約950bp的DNA片段與pCR2. 1-T0P0載體的已存在的“PCR產(chǎn)物插入位點”連接，然后用得到連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5 α在含有50 μ g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在該培養(yǎng)基上已經(jīng)涂上了 30 μ I 4% X-gal水溶液和30 μ I O. 1MIPTG。從形成的菌落中分離一個白色的菌落，然后，將該菌落接種到滅菌的LB培養(yǎng)基(2ml)(含有50 μ g/ml氨芐青霉素)中，然后在試管中振蕩培養(yǎng)(30°C，24小時)。使用QIApr印Spin Miniprep試劑盒(由Qiagen制造)從得到的培養(yǎng)的細胞收集質(zhì)粒。將收集的質(zhì)粒的每份等分試樣分別用限制酶(EcoRI)消化，然后將酶消化物進行電泳。結(jié)果，證實上述約950bp的DNA片段已經(jīng)插入到所收集的質(zhì)粒中(以下，該質(zhì)粒稱為“載體PSDGDH12”)。分析插入到載體pSD⑶H12中的DNA片段的核苷酸序列。所得到的序列顯示在SEQID NO :8中。應(yīng)該注意，通過進行序列反應(yīng)來進行對插入到前述載體中的DNA片段的核苷酸序列的分析，其中將載體PSDGDH12用作模板，并且使用染料終止子循環(huán)測序FS現(xiàn)成的反應(yīng)試劑盒(Dye Terminator Cycle sequencing FS ready Reaction Kit)(由 PerkinElmer,Inc.制造)，然后用DNA測序儀373A(由PerkinElmer, Inc.制造)分析所得到的DNA的核苷酸序列。將所得到的載體pSD⑶H12的DNA用兩種類型的限制酶(BamHI和XbaI)雙重消化，然后純化酶消化的DNA片段。另一方面，將載體pTrc99A(由Pharmacia制造)用兩種類型的限制酶(BamHI和XbaI)雙重消化，然后純化酶消化的DNA片段。將通過上述純化得到的這樣的酶消化的兩種類型的DNA片段彼此混合，用T4DNA連接酶彼此連接。然后，用得到的連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5 α在含有50 μ g/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。將形成的菌落接種到滅菌的LB培養(yǎng)基(2ml)(含有50 μ g/ml氨芐青霉素)中，然后在試管中進行振蕩培養(yǎng)(37°C, 17小時)ο使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(由Qiagen制造)從得到的培養(yǎng)的細胞收集質(zhì)粒。將收集的質(zhì)粒的每份等分試樣分別用兩種類型的限制酶BamHI和XbaI雙重消化，然后將酶消化物進行電泳。結(jié)果，證實上述約950bp的DNA片段已經(jīng)插入到所收集的質(zhì)粒中(以下，該質(zhì)粒稱為“載體pTrcSD⑶H12”)。實施例3(制備本發(fā)明的多核苷酸I :定點突變介紹)(3-1)定點誘變的操作 關(guān)于用于將位置25的蘇氨酸轉(zhuǎn)化為絲氨酸、將位置27的色氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸、將位置42的組氨酸轉(zhuǎn)化為亮氨酸、將位置56的甘氨酸轉(zhuǎn)化為半胱氨酸、和將位置115的纈氨酸轉(zhuǎn)化為異亮氨酸的突變引物，基于SEQ ID NO :2的核苷酸序列，合成各種類型的合成的寡核苷酸(突變引物)，它們對應(yīng)如在SEQ ID NOs :5，9，10，11，12，13，14，15，16和17中所示的單個氨基酸。與所置換的氨基酸位點相對應(yīng)的SEQ ID NOs和核苷酸序列顯示在表I中。表I
權(quán)利要求
1.酶， 所述酶包含除了在SEQ ID NO: I的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO:I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括下述氨基酸突變位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，或位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；并且 所述酶具有使底物還原的能力。
2.酶， 所述酶包含除了在SEQ ID NO: I的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO:I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變；并且 所述酶具有使底物還原的能力。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4中任一項所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至5中任一項所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變選自下述氨基酸突變組I <氨基酸突變組1> (1-1)下述兩個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變； (1-2)下述兩個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變； (1-3)下述兩個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變； (1-4)下述兩個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變； (1-5)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變； (1-6)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變； (1-7)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變； (1-8)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變； (1-9)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變； (1-10)下述三個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變； (1-11)下述四個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b) 位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(d)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變； (1-12)下述四個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(d)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變； (1-13)下述四個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(d)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變； (1-14)下述四個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(d)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；和 (1-15)下述五個氨基酸突變(a)位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(c)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，(d)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(e)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。
8.多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求2至7中任一項所述酶的氨基酸序列的核苷酸序列。
9.酶， 所述酶包含除了在SEQ ID NO: I的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO:I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，但不包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變；并且 所述酶具有使底物還原的能力。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變選自下述氨基酸突變組2 <氨基酸突變組2> (2-1)下述兩個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變； (2-2)下述兩個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；(2-3)下述兩個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變； (2-4)下述三個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變； (2-5)下述三個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變； (2-6)下述三個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；和 (2-7)下述四個氨基酸突變(a)位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，(c)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(d)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。
14.多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求11至13中任一項所述酶的氨基酸序列的核苷酸序列。
15.酶， 所述酶包含除了在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO:I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，但是既不包括位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，也不包括位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變；并且 所述酶具有使底物還原的能力。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。
18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變選自下述氨基酸突變組3 <氨基酸突變組3> (3-1)下述兩個氨基酸突變(a)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變； (3-2)下述兩個氨基酸突變(a)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變；和 (3-3)下述三個氨基酸突變(a)位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，(b)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，和(c)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。
19.多核苷酸,其包含編碼權(quán)利要求15至18中任一項所述酶的氨基酸序列的核苷酸序列。
20.酶， 所述酶包含除了在SEQ ID NO: I的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO:I的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變，但是不包括下述任何氨基酸突變位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，和位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變；并且所述酶具有使底物還原的能力。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變還包括位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的酶，其中所述一個或多個氨基酸突變是下述兩個氨基酸突變(a)位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變和(b)位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變。
23.多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求20至22中任一項所述酶的氨基酸序列的核苷酸序列。
24.酶， 所述酶包含除了在SEQ ID NO :1的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸突變之外與SEQ ID NO :1的氨基酸序列等價的氨基酸序列，其中所述一個或多個氨基酸突變包括位置25的蘇氨酸被絲氨酸置換的氨基酸突變，但是不包括下述任何氨基酸突變位置56的甘氨酸被半胱氨酸置換的氨基酸突變，位置115的纈氨酸被異亮氨酸置換的氨基酸突變，位置27的色氨酸被精氨酸置換的氨基酸突變，和位置42的組氨酸被亮氨酸置換的氨基酸突變；并且 所述酶具有使底物還原的能力。
25.多核苷酸，其包含編碼權(quán)利要求24所述酶的氨基酸序列的核苷酸序列。
26.包含權(quán)利要求8，14，19，23或25所述的多核苷酸的載體。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的載體，所述載體還包含下述多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列，所述蛋白具有將氧化的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或氧化的β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)化為其還原形式的能力。
28.包含權(quán)利要求8，14，19，23或25所述的多核苷酸或權(quán)利要求26或27所述的載體的轉(zhuǎn)化體。
29.生產(chǎn)(R)-2-羥基-4-苯基丁酸酯的方法，所述方法包括允許權(quán)利要求28所述的轉(zhuǎn)化體或其處理產(chǎn)物作用在2-氧代-4-苯基丁酸酯上的步驟。
30.修飾包含SEQID NO : I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括下述步驟在SEQID NO 1的氨基酸序列中，將位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟，將位置115的纈氨酸置換為異亮氨酸的步驟，將位置27的色氨酸置換為精氨酸的步驟，將位置42的組氨酸置換為亮氨酸的步驟，或?qū)⑽恢?5的蘇氨酸置換為絲氨酸的步驟。
31.修飾包含SEQID NO: I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟。
32.修飾包含SEQID NO : I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置115的纈氨酸置換為異亮氨酸的步驟，但不包括將所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟。
33.修飾包含SEQID NO: I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置27的色氨酸置換為精氨酸的步驟，但是既不包括將所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟，也不包括將所述氨基酸序列中位置115的纈氨酸置換為異亮氨酸的步驟。
34.修飾包含SEQID NO: I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID N0:1的氨基酸序列中位置42的組氨酸置換為亮氨酸的步驟，但是不包括下述任何步驟將所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟，將所述氨基酸序列中位置115的纈氨酸置換為異亮氨酸的步驟，和將所述氨基酸序列中位置27的色氨酸置換為精氨酸的步驟。
35.修飾包含SEQID NO: I的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括將SEQ ID NO 1的氨基酸序列中位置25的蘇氨酸置換為絲氨酸的步驟，但是不包括下述任何步驟將所述氨基酸序列中位置56的甘氨酸置換為半胱氨酸的步驟，將所述氨基酸序列中位置115的纈氨酸置換為異亮氨酸的步驟，將所述氨基酸序列中位置27的色氨酸置換為精氨酸的步驟，和將所述氨基酸序列中位置42的組氨酸置換為亮氨酸的步驟。
36.修飾包含編碼SEQID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括 將所述編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟； 將所述編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的步驟； 將所述編碼SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸79-81處編碼色氨酸的密碼子置換為編碼精氨酸的密碼子的步驟； 將所述編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸124-126處編碼組氨酸的密碼子置換為編碼亮氨酸的密碼子的步驟；或 將所述編碼SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73-75處編碼蘇氨酸的密碼子置換為編碼絲氨酸的密碼子的步驟。
37.修飾包含編碼SEQID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟。
38.修飾包含編碼SEQID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的步驟，但不包括將所述核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟。
39.修飾包含編碼SEQID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸79-81處編碼色氨酸的密碼子置換為編碼精氨酸的密碼子的步驟，但是既不包括將所述核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟，也不包括將所述核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的步驟。
40.修飾包含編碼SEQID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸124-126處編碼組氨酸的密碼子置換為編碼亮氨酸的密碼子的步驟，但是不包括下述任何步驟將所述核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟，將所述核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的步驟，和將所述核苷酸序列中核苷酸79-81處編碼色氨酸的密碼子置換為編碼精氨酸的密碼子的步驟。
41.修飾包含編碼SEQID NO :1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括將所述編碼SEQ ID NO: I的氨基酸序列的核苷酸序列中核苷酸73-75處編碼蘇氨酸的密碼子置換為編碼絲氨酸的密碼子的步驟，但是不包括下述任何步驟將所述核苷酸序列中核苷酸166-168處編碼甘氨酸的密碼子置換為編碼半胱氨酸的密碼子的步驟，將所述核苷酸序列中核苷酸343-345處編碼纈氨酸的密碼子置換為編碼異亮氨酸的密碼子的步驟，將所述核苷酸序列中核苷酸79-81處編碼色氨酸的密碼子置換為編碼精氨酸的密碼子的步驟，和將所述核苷酸序列中核苷酸124-126處編碼組氨酸的密碼子置換為編碼亮氨酸的密碼子的步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供包含這樣的氨基酸序列并且具有良好的熱穩(wěn)定性的還原酶及其他，在所述氨基酸序列中，野生型還原酶的氨基酸序列中的特定氨基酸被其他特定的氨基酸置換。
文檔編號C12N1/15GK102906261SQ201180024089
公開日2013年1月30日 申請日期2011年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月15日
發(fā)明者朝子弘之 申請人:住友化學(xué)株式會社