專利名稱：：采用小分子捕獲技術(shù)的同型半胱氨酸檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及到成分和檢測(cè)方法，主要是針對(duì)于小分子的待檢測(cè)物?；谛》肿硬东@技術(shù)研制生產(chǎn)同型半胱氨酸的檢測(cè)方法，該方法使用基因突變酶與待測(cè)小分子物質(zhì)結(jié)合，這種基因突變酶稱為小分子捕獲酶，這些經(jīng)過突變、修飾的小分子捕獲酶保留甚至增強(qiáng)其對(duì)底物或待測(cè)小分子物質(zhì)的親和力，但是削弱其對(duì)底物或待測(cè)小分子物質(zhì)的親和力的催化、分解能力。基于小分子捕獲技術(shù)研制生產(chǎn)同型半胱氨酸(HCY)診斷試劑盒的方法提供這種，也提供突變的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶，特異性S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)捕獲酶可以充分地保留甚至增強(qiáng)其對(duì)或S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的親和力，但是削弱了其對(duì)HCY或S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)的催化能力。
背景技術(shù)：
：檢測(cè)物質(zhì)的方法有廣闊的應(yīng)用范圍。許多被檢測(cè)物質(zhì)包括一些小分子量的被檢測(cè)物是生物體和生物運(yùn)行過程的基本成分或是參與者。檢測(cè)這些物質(zhì)可用于監(jiān)測(cè)生物體系及其反應(yīng)過程或者用于診斷由于這些物質(zhì)的不均衡或缺乏引起的肌體失調(diào)或疾病以及預(yù)后。例如，同型半胱氨酸Hcy，一個(gè)帶硫基的氨基酸；葉酸，一種有機(jī)酸；膽固醇，一種對(duì)于診斷和預(yù)示廣泛的心血管疾病有重要作用的脂類。維生素對(duì)于診斷和預(yù)示維生素缺乏或紊亂癥是重要的。血糖，一種單糖，用于診斷和預(yù)示糖尿病的血糖水平。乙醇，監(jiān)測(cè)濫用酒精和潛在的肝臟損傷。膽汁酸或膽鹽是一種診斷和預(yù)示一些腫瘤如結(jié)腸癌的重要指標(biāo)。監(jiān)測(cè)尿酸是很重要的，因?yàn)楫惓８邼舛鹊哪蛩崾窃\斷高尿酸血癥導(dǎo)致痛風(fēng)的指標(biāo)，對(duì)腎臟有害。另外這種預(yù)示和診斷的應(yīng)用，這種檢測(cè)方法也適用于農(nóng)業(yè)，工業(yè)或環(huán)境保護(hù)方面，監(jiān)測(cè)目前的，特定區(qū)域的和被檢測(cè)物的濃度。同型半胱氨酸的檢測(cè)同型半胱氨酸是一種含硫基的氨基酸，來(lái)源于蛋氨酸通過S-腺苷蛋氨酸依賴的轉(zhuǎn)甲基作用。細(xì)胞內(nèi)的同型半胱氨酸再甲基化形成蛋氨酸或者進(jìn)行一系列的分解代謝生成半胱氨酸。細(xì)胞內(nèi)的同型半胱氨酸可以從細(xì)胞內(nèi)溢出細(xì)胞外的液體中如血液和尿液中，大多數(shù)以氧化形勢(shì)參加循環(huán)，多數(shù)與血漿中的蛋白結(jié)合(Refsumetal.，Annu.Rev.Medicine，4931-62(1998)).。血漿和尿中的同型半胱氨酸含量反應(yīng)同型半胱氨酸的生成和利用平衡狀態(tài)。這種平衡被破壞可能由于相關(guān)酶的遺傳缺陷包括同型半胱氨酸轉(zhuǎn)硫基和再甲基化的缺陷(例如胱硫醚β合成酶和N5，N10亞甲基四氫葉酸脫氫酶)或者同型半胱氨酸代謝需要的維生素飲食中缺乏(例如，維生素B6，B12和葉酸)(Baual，etal.，ClevelandClinicJournalofMedicine，64543-549(1997))。另外，血漿中的同型半胱氨酸水平同時(shí)受到一些治療癌癥或關(guān)節(jié)炎藥物的影響例如抗葉酸藥物甲基蝶呤(Foody，etal.，ClinicianReviews，8203-210(1998))。嚴(yán)重的高同型半胱氨酸血癥由于同型半胱氨酸新陳代謝方面的基因編碼出現(xiàn)了缺陷。這種情況中，這種酶的缺陷既包括HCY再甲基化中也包括轉(zhuǎn)硫基的酶類，從而導(dǎo)致血中和尿中的Hcy升高至50倍。最嚴(yán)重的HCY代謝紊亂，先天性的高同型半胱氨酸血癥由于缺乏遺傳編碼胱硫醚β合成酶的同合子。這些個(gè)體在早年時(shí)即出現(xiàn)血管栓塞，從而發(fā)生動(dòng)脈硬化，心肌梗死，腎血管高壓，間歇性跛行，腸系膜缺血和肺部栓塞。一些病人還存在智力缺陷和其它異常象器官異位和骨骼畸形(PerryT.，HomocysteineSelectedaspectsinNyhamW.L.ed.Hertabledisordersofaminoacidmetabolism.NewYork，JohnWiley&Sons，pp.419-451(1974))。眾所周知，孕婦體內(nèi)含有高濃度的Hcy會(huì)導(dǎo)致嬰兒出現(xiàn)神經(jīng)管關(guān)閉不全(Scottetal.，″Theetiologyofneuraltubedefects″inGraham，I.，Refsum，H.，Rosenberg，I.H.，andUrelandP.M.ed.″Homocysteinemetabolismfrombasicsciencetoclinicalmedicine″KluwerAcademicPublishers，Boston，pp.133-136(1995))。因此，Hcy的診斷應(yīng)用價(jià)值在臨床上有很多好的文獻(xiàn)。研究證明即使輕微或中度Hcy的水平升高也會(huì)導(dǎo)致冠心病的危險(xiǎn)，腦及外周動(dòng)脈和心血管疾病危險(xiǎn)的增加。(Boushey，etal.，JAMA，2741049-1057(1995)).。高同型半胱氨酸血癥的流行調(diào)查表明高Hcy病人中分別有42％，28％，30％的腦血管疾病，外周血管疾病和心血管疾病。(Moghadasian，etal.，Arch.Intern.Med.，1572299-2307(1997))。其中27個(gè)臨床研究中表明每增高5mu.M的Hcy水平，男性的冠心病發(fā)病率升高60％，女性升高80％，相對(duì)于血漿膽固醇升高20mg.multidot.dl.sup.-1(0.5mmol.multidot.dl.sup.-1)。因此Hcy做為一個(gè)危險(xiǎn)因子，與普通人中的膽固醇水平同樣危險(xiǎn)。從這項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥是心血管疾病的新的獨(dú)立的危險(xiǎn)因子，可能是那些無(wú)任何血管疾病危險(xiǎn)因素的心血管病人的原因。(e.g.，hypertension，hypercholesterolemia，cigarettesmoking，diabetesmellitus，markedobesityandphysicalactivity)。輕微的高同型半胱氨酸血癥主要由于酶基因是雜合子治病。四氫葉酸還原酶的基因上的多態(tài)性導(dǎo)致葉酸的缺乏從而影響同型半胱氨酸水平的靈敏(Boers，etal.，J.Inher.Metab.Dis.，20301-306(1997))。而且，血漿中的Hcy水平在心臟和腎臟移植的病人(Ueland，etal.，J.Lab.Clin.Med.，114473-501(1989))，帕金森氏綜合癥病人中(Jacobsen，etal.，Clin.Chem.，442238-2239(1998))，和非胰島素依賴的病人中急劇升高(Ducloux，etal.，Nephrol.Dial.Transplantl，132890-2893(1998))。越來(lái)越多的關(guān)于高同型半胱氨酸水平與心血管疾病關(guān)系的研究證據(jù)促進(jìn)了通過降低血漿中的Hcy水平來(lái)防止心血管疾病的雙盲隨機(jī)性有控制的多中心實(shí)驗(yàn)的開始(Diaz-Arrastia，etal.，Arch.Neurol，551407-1408(1998))。在不久的將來(lái)血漿中Hcy的檢測(cè)會(huì)成為一種常規(guī)的臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目。現(xiàn)在，心臟病專家已經(jīng)開始建議他們的病人檢測(cè)Hcy水平，尤其對(duì)于那些有心血管家族史的病人或患有心血管疾病但是其膽固醇水平正常并且沒有其它危險(xiǎn)因子存在的病人，還有那些超過60歲的病人。血清或血漿中的總Hcy以復(fù)雜的形式存在，70％的血漿中的Hcy以蛋白結(jié)合形式，20-30％以均衡的或不均衡的混合二硫化合物形式存在，游離形式的Hcy只有很少量的存在(Stehouwer，etal.，KidneyInternational，55308-314(1999))。做為心血管疾病的危險(xiǎn)因子，建議臨床檢測(cè)血漿中總Hcy(包括游離的，氧化型的，蛋白結(jié)合型的)(Hornberger，etal.，AmericanJ.ofPublicHealth，8861-67(1998))。自從1982年以來(lái)，出現(xiàn)了幾種檢測(cè)血漿中總Hcy的方法。(Mansoor，etal.，Anal.BioChem.，200218-229(1992)；Steir，etal.，Arch.Intern.Med.，1581301-1306(1998)；Ueland，etal.，Clin.Chem.，391764-177901993)；andUeland，etal.，″Plasmahomocysteineandcardiovasculardisease″inFrancis，R.B.Jr.eds.AtheroscleroticCardiovascularDisease，Hemostasis，andEndothelialFunction.NewYork，MarcelDokker，pp.183-236(1992)；see，also，Ueland，etal.，″Plasmahomocysteineandcardiovasculardisease″inFrancis，R.B.Jr.eds.AtheroscleroticCardiovascularDisease，Hemostasis，andEndothelialFunction.NewYork，MarcelDokker，pp.183-236(1992))。大多數(shù)方法需要精密的層析技術(shù)例如高壓液相技術(shù)，毛細(xì)管氣體層析技術(shù)，或者集合光譜測(cè)定技術(shù)(GC/MS)直接或間接(例如通過HPLC或TLC使SAH水解酶水解Hcy為SAH)檢測(cè)Hcy。另外還使用在薄層層析分離法TLC分離之前SAH水解酶水解放射性的Hcy轉(zhuǎn)化為放射性標(biāo)記的SAH。所有這些檢測(cè)方法的普遍特點(diǎn)包括以下4個(gè)步驟(1)氧化型Hcy轉(zhuǎn)化為還原性的Hcy；(2)進(jìn)層析分離柱之前Hcy誘導(dǎo)或酶反應(yīng)為SAH；(3)層析分離；(4)檢測(cè)Hcy衍生物或SAH。在這些檢測(cè)中層析分離是分析方法中最關(guān)鍵的步驟，這種方法通常浪費(fèi)時(shí)間，操作煩瑣。更特殊地是，這些方法需要高度專業(yè)化和精密的儀器以及受過良好訓(xùn)練的專業(yè)技術(shù)人員。普通的臨床科室一般沒有這種專門的儀器。眾所周知，免疫方法檢測(cè)Hcy使用單克隆抗SAH(Araki，etal.，J.Chromatog.，42243-52(1987)。這種方法基于Hcy轉(zhuǎn)化為SAH，然后使用單克隆抗體檢測(cè)SAH。研究單克隆抗白蛋白結(jié)合型Hcy從而能夠檢測(cè)血漿以主要形式存在的白蛋白結(jié)合型Hcy(Stabler，etal.，J.Clin.Invest.，81466-474(1988))。其它的免疫反應(yīng)方式也同樣其它的免疫物質(zhì)也同樣適用(see，e.g.，U.S.Pat.No.5,885,767andU.S.Pat.No.5,631,127)。雖然免疫檢測(cè)方法避免了浪費(fèi)時(shí)間的層析分離步驟和實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，但是單克隆抗體很昂貴，并且不容易得到經(jīng)常需要二抗或三抗參與檢測(cè)。不論免疫檢測(cè)方法是多么重要多么廣泛圍的應(yīng)用，目前這種方法面臨著下面幾種問題。第一，對(duì)于許多方法來(lái)說(shuō)，特異性地結(jié)合物不好制備，并且缺乏特異性從而影響檢測(cè)的特異性。雖然這個(gè)缺陷可以通過制備高分子物抗體，制備抗體尤其純化均一的單克隆抗體來(lái)彌補(bǔ)，但是這個(gè)過程需要大量的時(shí)間并且花費(fèi)很大。另外，對(duì)于一些小分子量的被檢測(cè)物，制備抗體的選擇變得不可行，因?yàn)樾》肿游镔|(zhì)具有微弱的抗原性。小分子物質(zhì)抗體的制備通常需要大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)結(jié)合，這樣導(dǎo)致抗體的表達(dá)更無(wú)效，更。第二，許多檢測(cè)方法尤其對(duì)于小分子物質(zhì)的檢測(cè)中，包括化學(xué)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化和層析分離步驟都需要大量的時(shí)間。第三，許多諸如此類的檢測(cè)方法需要使用精密、昂貴的專業(yè)分析儀器例如高壓液相色譜儀(HPLC)和氣相色譜儀(GC/MS)。因此，需要一種快速、簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法來(lái)彌補(bǔ)這種缺陷。同樣需要一種快速、簡(jiǎn)單的定量檢測(cè)體液、組織中Hcy的好方法。
發(fā)明內(nèi)容本檢測(cè)方法基于免疫的反應(yīng)格式，但是使用變異的檢測(cè)物結(jié)合酶代替抗體，這種酶充分保留甚至加強(qiáng)其對(duì)檢測(cè)物或即時(shí)酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物的親和力，但是削弱其催化能力。這種方法稱為小分子捕獲技術(shù)，這種酶稱為小分子捕獲酶。我們可以提供小分子捕獲酶和制備小分子捕獲酶的方法。小分子捕獲酶用于代替單克隆、多克隆、以及任何混合性的抗體，抗體在反應(yīng)中可以是反應(yīng)物。底物捕獲酶還可以扮演被檢測(cè)物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，去結(jié)合實(shí)體例如受體、其它的抗配基和其它的被檢測(cè)物。因此，底物捕獲酶可以代替例如競(jìng)爭(zhēng)性受體或受體活性調(diào)節(jié)器用于競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)中。在檢測(cè)過程或方法中尤其免疫分析方法中，抗體用于檢測(cè)目標(biāo)分析物，象上面所述被底物捕獲酶代替抗體。底物捕獲酶可以通過充分的削弱或清除其催化反應(yīng)而不影響或不會(huì)很影響修飾酶的對(duì)于被檢測(cè)物的親和力的技術(shù)制備。這種方法尤其適用于檢測(cè)一些用于指示新陳代謝疾病，先天性代謝缺陷疾病的物質(zhì)如甲狀腺機(jī)能減退，半乳糖血癥，苯丙酮尿癥，茶色尿疾病；以及檢測(cè)一些疾病的標(biāo)記物例如血糖水平，膽固醇水平，Hcy水平和其它哺乳動(dòng)物包括人類的體液和組織中的物質(zhì)。這種方法也可用于檢測(cè)食物中的污染，檢測(cè)食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，檢測(cè)血液。這種方法已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。因此，在此方法中，抗體參與反應(yīng)，其中使用底物捕獲酶來(lái)代替抗體。這種方法依賴于修飾酶與目標(biāo)檢測(cè)物的競(jìng)爭(zhēng)性抑制反應(yīng)。更具體地說(shuō)，這種方法檢測(cè)檢測(cè)樣本中的分析物尤其檢測(cè)小分子物質(zhì)的步驟a)變異的被檢測(cè)結(jié)合酶與樣本結(jié)合，此酶充分保留甚至加強(qiáng)其對(duì)檢測(cè)物或酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化的直接產(chǎn)物的親和力，但是削弱其催化能力；b)檢測(cè)分析物或酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化的直接產(chǎn)物結(jié)與變異的被檢測(cè)物結(jié)合酶結(jié)合物。小分子物質(zhì)的檢測(cè)方法可以檢測(cè)任何物質(zhì)包括無(wú)機(jī)物和有機(jī)物分子。做為特殊地是，檢測(cè)小分子物質(zhì)分子量大約或小于10,000道爾頓，尤其是分子量大約或小于5,000道爾頓。無(wú)機(jī)小分子包括但不局限于無(wú)機(jī)離子例如；鈉、鉀、鎂、鈣、氯、鐵、銅、鋅、錳、鈷、碘、鉬、釩、鎳、鉻、氟、硅、錫、硼、砷離子。有機(jī)分子物包括但是不局限于下列項(xiàng)目氨基酸、多肽、代表性地包含低于10個(gè)氨基酸的多肽，核苷，包括低于10個(gè)核苷的低聚核苷，維生素，單糖，包括低于10個(gè)單糖的低聚糖或脂類。氨基酸包括但是不限于下列項(xiàng)目D-型或L-型氨基酸，包括組成自然多肽和蛋白質(zhì)的氨基酸Ala(A)，Arg(R)，Asn(N)，Asp(D)，Cys(C)，Gln(Q)，Glu(E)，Gly(G)，His(H)，Ile(I)，Leu(L)，Lys(K)，Met(M)，Phe(F)，Pro(P)Ser(S)，Thr(T)，Trp(W)，Tyr(Y)andVal(V)。核苷酸包括但是不限于下列項(xiàng)目腺苷，鳥嘌呤核苷，胞啶核苷，胸腺嘧啶核苷，尿嘧啶核苷。核苷包括但是不限于下列項(xiàng)目AMP，GMP，CMP，UMP，ADP，GDP，CDP，UDP，ATP，GTP，CTP，UTP，dAMP，dGMP，dCMP，dTMP，dADP，dGDP，dCDP，dTDP，dATP，dGTP，dCTPanddTTP。維生素包括但是不局限于下列項(xiàng)目，水溶性維生素例如，維生素B1，核黃素，煙堿酸，泛酸，維生素B6，維生素H，葉酸，維生素B12和維生素C；脂溶性維生素例如維生素A，維生素D，維生素E，維生素K。單糖包括但是不局限于下列項(xiàng)目，D-型或L-型單糖，三碳糖例如甘油醛，四碳糖例如赤蘚糖和蘇糖，五碳糖例如核糖，乳膠醛糖，木糖，來(lái)蘇糖，核酮糖，六碳糖例如阿洛糖，阿桌糖，葡萄糖，艾杜糖，半乳糖，塔羅糖，果糖，七碳糖例如景天庚酮糖。脂類包括但是不局限于下列項(xiàng)目，三酰甘油例如三硬脂酸甘油酯，棕櫚酸甘油酯，三油精，蠟；磷酸甘油酯例如磷脂酰乙醇胺，卵磷脂，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰肌醇，心磷脂；鞘脂類例如神經(jīng)鞘磷脂，腦苷脂，神經(jīng)節(jié)苷脂；固醇例如膽固醇和豆甾醇，固醇酸脂；脂肪酸可以是飽和性的脂肪酸例如月桂酸，肉豆蔻酸，棕櫚酸，硬脂酸，花生酸，二十四酸；或者可以是不飽和性的脂肪酸例如棕櫚炔酸，油酸，亞油酸，亞麻酸，花生四烯酸。更具體的表述來(lái)說(shuō)，變異的SAH水解酶，此酶充分保留甚至加強(qiáng)其對(duì)Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化能力。另外也可以提供方法，結(jié)合物，試劑盒和分析物檢測(cè)的商品化產(chǎn)品，尤其是小分子物質(zhì)的檢測(cè)例如無(wú)機(jī)離子，氨基酸(Hcy)，多肽，核苷酸，核苷，低聚核苷酸，維生素，單糖(如葡萄糖)，低聚糖，脂類(如膽固醇)，有機(jī)酸(如葉酸，膽汁酸，尿酸)。另外一個(gè)表述，如果變異性的SAH水解酶被純化，變異的SAH水解酶此酶充分保留甚至加強(qiáng)其對(duì)Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化能力。例如，變異的SAH水解酶削弱其催化作用是由于在SAH水解酶的NAD結(jié)合位點(diǎn)或SAH的催化位點(diǎn)變異或者在兩處同時(shí)變異；變異的SAH水解酶削弱5’-端SAH的水解作用但是充分保留3’-端的氧化作用；固定的結(jié)合SAH，對(duì)SAH的酶切速率大約或低于10.0.mu.M，對(duì)SAH的催化活性大約或低于0.1S-1；變異的SAH水解酶有一個(gè)或多個(gè)可插入，缺失或點(diǎn)突變的位點(diǎn)。更具體地說(shuō)，變異的SAH水解酶來(lái)源于SEQIDNo.1表述的氨基酸序列或者由SEQIDNo.2表述的核酸序列編碼的氨基酸但是包括下列一處或多處變異Phe302ofPhe302K，K186S，H301N，H353T，R343F，D190R，F(xiàn)82R，T157K，N181A，R431H和K426A的兩次變異，或者在低度，中度或高度的雜交，其酶切速率是野生型的10％最多的可達(dá)50％，但是削弱了其催化活性。單獨(dú)的核苷酸片段編碼上面所述的變異的SAH水解酶，更適宜質(zhì)粒和向量的表達(dá)。可以提供重組干細(xì)胞，尤其重組細(xì)菌細(xì)胞，酵母細(xì)胞，真菌細(xì)胞，植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞包括質(zhì)粒和向量。可以提供利用重組干細(xì)胞植被變異性SAH水解酶的方法。檢測(cè)Hcy及其相關(guān)代謝物的方法。Hcy，如上所述，是心血管疾病和其他疾病的危險(xiǎn)因子，我們可以提供檢測(cè)方法。同型半胱氨酸具體為，被檢測(cè)的小分子為Hcy，變異的檢測(cè)物結(jié)合酶是變異的Hcy結(jié)合酶，此酶充分甚至增強(qiáng)了對(duì)Hcy或Hcy的直接轉(zhuǎn)化物的親和力但是削弱了其催化能力。檢測(cè)中的變異的Hcy結(jié)合酶的變異包括削弱其催化活性由于在酶與輔酶的結(jié)合位點(diǎn)或與非Hcy底物結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生了變異或者在酶的催化活性位點(diǎn)發(fā)生了變異。具體表述，變異的酶為變異的胱硫醚β合成酶，削弱的催化活性由于誘變了胱硫醚β合成酶與吡哆醛5’-磷酸或L-絲氨酸結(jié)合的催化位點(diǎn)發(fā)生了變異或兩個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生了變異。具體表述，變異的酶為蛋氨酸合成酶，削弱的催化活性是由于誘變的蛋氨酸合成酶催化位點(diǎn)與維生素B12或5-甲基四氫葉酸結(jié)合的催化位點(diǎn)發(fā)生了變異，或兩個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生了變異。更值得一提的是，變異的蛋氨酸合成酶是一種大腸桿菌蛋氨酸合成酶，此酶有下列一個(gè)或多個(gè)變異His759Gly，Asp757Glu，Asp757Asn，andSer801。具體表述，變異的酶為蛋氨酶，削弱的催化活性是由于誘變的蛋氨酸合成酶的催化位點(diǎn)，此催化位點(diǎn)與R’SH混合物的結(jié)合位點(diǎn)，R’SH是指硫醇，R是烷基或炔基尤其指低鏈烷基或炔基(1-6個(gè)碳原子，尤其指1-3個(gè)碳原子，直鏈或支鏈)，雜芳環(huán)，這里雜原子是指氧原子O，硫原子S，氮原子N或者芳基等上述基團(tuán)被下列基團(tuán)取代烷基或炔基，尤其指低鏈烷基或炔基，或者h(yuǎn)al，或者未被取代尤其指芳基或含有一環(huán)或兩環(huán)、三環(huán)的雜環(huán)基尤指環(huán)中每個(gè)環(huán)中含有4-7個(gè)原子的基團(tuán)，或者變異發(fā)生在以上基團(tuán)組合中。更明白地表述，變異的酶為SAH水解酶，變異的SAH水解酶充分保留甚至加強(qiáng)其對(duì)Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化能力。變異的SAH水解酶在檢測(cè)體系中的應(yīng)用包括削弱其催化活性由于誘變的SAH水解酶的與NAD+或SAH水解酶的催化位點(diǎn)或者兩個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生了變異；削弱了5’端的水解活性但是充分地保留了3’端的氧化活性；固定的結(jié)合SAH，對(duì)SAH的酶切速率大約或低于10.0.mu.M，對(duì)SAH的催化活性大約或低于0.1S-1；變異的SAH水解酶有一個(gè)或多個(gè)可插入，缺失或點(diǎn)突變的位點(diǎn)。更具體地說(shuō)，變異的SAH水解酶來(lái)源于SEQIDNo.1表述的氨基酸序列或者由SEQIDNo.2表述的核酸序列編碼的氨基酸但是包括下列一處或多處變異Phe302ofPhe302K，K186S，H301N，H353T，R343F，D190R，F(xiàn)82R，T157K，N181A，R431H和K426A的兩次變異，或者在低度，中度或高度的雜交，其酶切速率是野生型的10％最多的可達(dá)50％，但是削弱了其催化活性。應(yīng)用SAH水解酶的表述，在樣本與變異的SAH水解酶結(jié)合之前，氧化型的Hcy要轉(zhuǎn)化為還原型的Hcy，氧化型Hcy轉(zhuǎn)化為還原型的Hcy使用的還原劑可以使用下面列出的還原劑但是不局限于僅僅使用下列還原劑磷酸三丁醇(TBP)，巰基乙醇(β-ME)，二硫赤蘚醇(DTT)，二硫赤蘚糖醇，巰基乙酸，谷胱甘肽，腈硼氫鈉，NaBH，KBH，金屬離子。具體表述使用SAH水解酶，在樣本與變異的SAH水解酶結(jié)合之前，樣本中的Hcy需要轉(zhuǎn)化為SAH。樣本中的Hcy轉(zhuǎn)化為SAH需要未變異的SAH水解酶水解。樣本中的SAH與變異的SAH水解酶結(jié)合過程中存在著SAH水解酶催化抑制劑例如，neplanocinA或thimersol，但不局限于上述兩種物質(zhì)。具體表述變異的SAH水解酶的應(yīng)用，在SAH與變異的SAH水解酶結(jié)合之前，需要去除或降解游離的腺苷，這種降解作用可以通過腺苷脫氨酶，嘌呤核苷磷酸化酶，黃嘌呤氧化酶來(lái)完成。具體表述變異的SAH水解酶的應(yīng)用，SAH與變異的SAH水解酶結(jié)合時(shí)，存在的標(biāo)記的SAH或其衍生物、類似物競(jìng)爭(zhēng)性地與SAH水解酶結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)程度與標(biāo)記的SAH的含量和樣本中的SAH的含量相關(guān)。必須指出，標(biāo)記的SAH衍生物或類似物是熒光標(biāo)記的腺苷半胱氨酸。具體表述變異的SAH水解酶的應(yīng)用，變異的SAH水解酶是標(biāo)記的SAH水解酶，標(biāo)記的SAH水解酶是由熒光標(biāo)記。具體表述，變異的酶為變異的甜菜堿—同型半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶，削弱其催化活性是由于甜菜堿—同型半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶與甜菜堿的結(jié)合位點(diǎn)及它的催化位點(diǎn)或者兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生了變異。具體表述，Hcy的檢測(cè)應(yīng)與其它心血管檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)合檢測(cè)，和或Hcy相關(guān)水平例如膽固醇或葉酸聯(lián)合檢測(cè)。葉酸具體表述，變異的酶為變異的蛋氨酸合成酶。在這個(gè)例子中，葉酸是5-甲基四氫葉酸中的元素，變異的含葉酸的結(jié)合酶是變異的蛋氨酸合成酶，削弱蛋氨酸合成酶的催化活性是由于其催化位點(diǎn)的誘變，及其結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合維生素B12，Hcy的變異或者這兩個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生了變異。具體表述，其中的葉酸是四氫葉酸，變異的含葉酸的結(jié)合酶為變異的四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶，削弱了四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶催化活性是由于其催化位點(diǎn)的誘變，及其此結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合絲氨酸的變異或兩個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生了變異。具體表述，含葉酸的物質(zhì)為5，10-亞甲基四氫葉酸，變異的含葉酸的結(jié)合酶為變異的亞甲基四氫葉酸還原酶，其催化活性的削弱由于其催化位點(diǎn)的變異。具體表述，含葉酸的物質(zhì)是5，10-亞甲基四氫葉酸，變異的含葉酸的結(jié)合酶為變異的葉酸多聚谷胱甘肽合成酶，其催化活性的削弱由于其催化位點(diǎn)的變異，以及結(jié)合ATP，L-谷氨酸，Mg2+的結(jié)合位點(diǎn)的變異或者兩者同時(shí)發(fā)生了變異。更具體地說(shuō)，含葉酸的物質(zhì)是二氫葉酸，變異的含葉酸的結(jié)合酶為變異的二氫葉酸還原酶，其催化活性的削弱由于其催化位點(diǎn)的變異，以及結(jié)合NAHPH的結(jié)合位點(diǎn)的變異或者兩者同時(shí)發(fā)生了變異。再具體地說(shuō)，變異的二氫葉酸還原酶是一種乳酸菌酪蛋白的二氫葉酸還原酶，發(fā)生了Arg43Ala到Trp21的變異(Basranetal.，ProteinEng.，10(7)815-2691997))。另外的例子，含葉酸的物質(zhì)是5，10-亞甲基四氫葉酸(5，10-亞甲基FH4)，變異的含葉酸的結(jié)合酶為變異的胸苷酸合成酶，其催化活性的削弱由于催化位點(diǎn)的變異，以及結(jié)合dUMP的結(jié)合位點(diǎn)變異或兩者均發(fā)生了變異。更具體地說(shuō)，變異的胸苷酸合成酶是人類胸苷酸合成酶，下列位點(diǎn)發(fā)生了變異Tyr6His，Glu214Ser，Ser216Ala，Ser216Leu，Asn229Ala和His199X，這里的X是指除了組氨酸以外的任何氨基酸(Schifferetal.，Biochemistry，34(50)16279-87(1995)；Steadmanetal.，Biochemistry，377089-7095(1998)；Williamsetal.，Biochemistry，37(20)7096-102(1998)；Finer-Mooreetal.，J.Mol.Biol.，276(1)113-29(1998)。再具體地說(shuō)，變異的胸苷酸合成酶是大腸桿菌胸苷酸合成酶，在Arg126Glu發(fā)生了變異(Stropetal.，ProteinSci.，6(12)2504-11(1997))oraLactobacilluscaseithymidylatesynthasehavingaV316Ammutation(Carrerasetal.，Biochemistry，31(26)6038-44(1992))。膽固醇具體表述，檢測(cè)中的膽固醇，變異的被檢測(cè)物結(jié)合酶是變異的膽固醇結(jié)合酶，此酶充分地保留甚至增強(qiáng)了對(duì)膽固醇的親和力，但是削弱了其催化能力。更具體地說(shuō)，變異的膽固醇結(jié)合酶是變異的膽固醇酯酶，其催化活性的削弱由于其催化位點(diǎn)的變異，以及結(jié)合H2O的位點(diǎn)的變異，或者兩者同時(shí)變異。再具體地說(shuō)，膽固醇酯酶是胰膽固醇酯酶，發(fā)生變異的位點(diǎn)是Ser194ThrorSer194Ala(DiPersioetal.，J.Biol.Chem.，265(28)16801-6(1990))。另外一個(gè)具體地說(shuō)，變異的膽固醇結(jié)合酶是膽固醇氧化酶，其催化活性的削弱由于其催化位點(diǎn)的變異，以及結(jié)合O2的結(jié)合位點(diǎn)的變異，或者兩者同時(shí)變異，更具體地說(shuō)，膽固醇氧化酶是sterolicum短桿菌膽固醇氧化酶，發(fā)生變異的位點(diǎn)是膽汁酸(鹽)具體地表述，小分子檢測(cè)物為膽汁酸(鹽)，變異的被檢測(cè)物結(jié)合酶是變異的膽汁酸結(jié)合酶，此酶充分保留甚至增強(qiáng)了與膽汁酸(鹽)的結(jié)合能力，但是削弱了其催化活性。更具體地說(shuō)，變異的膽汁酸(鹽)結(jié)合酶是變異的3-α-羥基類固醇脫氫酶，其催化活性的削弱由于其催化位點(diǎn)的變異，以及結(jié)合NAD+結(jié)合位點(diǎn)的變異或者兩者均發(fā)生變異。糖代謝紊亂的檢測(cè)AssaysforDisordersAssociatedwithGlucoseMetabolism具體地表述，小分子被檢測(cè)物是葡萄糖，變異的檢測(cè)物結(jié)合酶是變異的葡萄糖結(jié)合酶，變異的酶充分保留甚至增強(qiáng)了與血糖的結(jié)合，但是削弱了催化活性。更具體地說(shuō)，葡萄糖結(jié)合酶是thermosulfurogenes梭菌葡萄糖異構(gòu)酶，其變異位點(diǎn)從下列中產(chǎn)生His101Phe，His101Glu，His101Gln，His101AspandHis101Asn(Leeetal.，J.Biol.Chem.，265(31)19082-90(1990))。另一個(gè)具體的變異酶是變異的己糖激酶或葡萄糖激酶，其催化活性的削弱由于其催化位點(diǎn)的變異，以及結(jié)合ATP、Mg2+或者兩者均發(fā)生變異。另外一個(gè)具體的變異酶是葡萄糖氧化酶，其催化活性的削弱是由于其催化位點(diǎn)的變異，以及結(jié)合H2O或O2的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生了變異，或者兩者均發(fā)生變異。任何與葡萄糖代謝相關(guān)的代謝紊亂均可監(jiān)測(cè)。乙醇具體地表述，小分子被檢測(cè)物是乙醇，變異的檢測(cè)物結(jié)合酶是變異的乙醇結(jié)合酶，此酶充分保留甚至增強(qiáng)與乙醇的結(jié)合力，但是削弱了其催化活性。更具體地說(shuō)，變異的乙醇結(jié)合酶為變異的乙醇脫氫酶，其催化活性的削弱由于其催化位點(diǎn)的變異，以及結(jié)合NAD+或Zn2+的結(jié)合位點(diǎn)的變異，或者兩者均發(fā)生了變異。再具體地說(shuō)，變異的乙醇脫氫酶是人肝臟乙醇脫氫酶，在下列位點(diǎn)發(fā)生變異His51Gln(Ehrigetal.，Biochemistry，30(4)1062-8(1991))。另外一個(gè)具體說(shuō)明，變異的乙醇脫氫酶是馬的肝臟乙醇脫氫酶，在下列位點(diǎn)發(fā)生變異Phe93Trp或者Val203Ala(Bahnsonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.，94(24)12797-802(1997)；Colbyetal.，Biochemistry，37(26)9295-304(1998))。一些代謝紊亂如痛風(fēng)病，與尿酸代謝有關(guān)。具體地表述，小分子檢測(cè)物是尿酸，變異的檢測(cè)物結(jié)合酶是變異的尿酸結(jié)合酶，此酶充分保留甚至增強(qiáng)與尿酸的結(jié)合力，但是削弱了其催化活性。更具體地說(shuō)，變異的尿酸結(jié)合酶是變異的尿酸氧化酶，其催化活性的削弱由于其催化位點(diǎn)的變異，以及結(jié)合O2，H2O，Cu的結(jié)合位點(diǎn)的變異或者兩者均發(fā)生變異。再具體地說(shuō)，變異的尿酸氧化酶是兔尿酸氧化酶，其變異位點(diǎn)為下列位點(diǎn)H127Y，H129Y和F131S(Chuetal.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，804781-6(1996))。所有上面所述中，有代表性的檢測(cè)樣本是體液或組織包括但是不限于下列項(xiàng)目血液，尿液，腦脊液，滑膜液，羊水，組織細(xì)胞如活檢組織細(xì)胞。再具體地說(shuō)，體液指血液或尿液。更具體地說(shuō)，血液應(yīng)該分離出血漿或血清。在這里提到的結(jié)合物包括a)變異的檢測(cè)物結(jié)合酶，此變異酶充分保留甚至增強(qiáng)其親和力但是削弱其催化活性；b)試劑或變異的檢測(cè)結(jié)合酶與檢測(cè)物或者檢測(cè)物的酶轉(zhuǎn)化物結(jié)合的方法。更具體地說(shuō)，檢測(cè)物或檢測(cè)物的酶轉(zhuǎn)化物與變異的檢測(cè)物結(jié)合酶使用標(biāo)記檢測(cè)物，檢測(cè)標(biāo)記的檢測(cè)物直接轉(zhuǎn)化物或其衍生物或類似物，檢測(cè)標(biāo)記的變異的檢測(cè)物結(jié)合酶。再具體地說(shuō)，檢測(cè)中的結(jié)合物是Hcy甚至包括檢測(cè)膽固醇和或葉酸的試劑。最后，可以提供試劑盒和檢測(cè)說(shuō)明包括上面提到的結(jié)合物和及其說(shuō)明書。生產(chǎn)的程序包括標(biāo)記的變異的酶可以指示檢測(cè)系統(tǒng)中使用的酶，也可指示檢測(cè)系統(tǒng)中包含的酶類。特殊的合成物，結(jié)合物，試劑盒和檢測(cè)說(shuō)明書，尤其對(duì)于小分子物質(zhì)在下面分段介紹。A.說(shuō)明除非另外說(shuō)明，這里所用的所有的技術(shù)、科學(xué)術(shù)語(yǔ)與普通
技術(shù)領(lǐng)域：
的理解有相同的含義。所有專利，申請(qǐng)表，公布的表格以及其他出版物和序列、其他數(shù)據(jù)全部由GenBank公司提供。這里所用的分析物指能特異結(jié)合到酶上的分子，它即可作為輔酶，也可作為輔助因子或者底物。這里所用的酶指一種特殊的蛋白質(zhì)，它可以催化和促進(jìn)特定的代謝反應(yīng)。一般地，酶是作為催化劑，但在這里，還包括酶在反應(yīng)中被修飾。酶被修飾后可使其催化活性清除或相當(dāng)大的清除。有些酶并不被如此修飾。這里所用的分析物結(jié)合酶是指用分析物作為其輔酶，輔助因子，唯一底物或者底物之一的酶。如同型半胱氨酸結(jié)合酶指用同型半胱氨酸作為它的輔酶，輔助因子，唯一底物或者底物之一的酶。同型半胱氨酸結(jié)合酶包括SAH水解酶，胱硫醚，beta-合成酶，蛋氨酸合成酶，甜菜堿-同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，蛋氨酶，用不改變酶活性的保守氨基酸替代作用圍繞同型半胱氨酸結(jié)合酶。適當(dāng)?shù)陌被岬谋Ｊ靥娲潜娝苤募夹g(shù)，氨基酸的保守替代可以不改變變異后的物質(zhì)的生物活性。這是科技界所認(rèn)可的。(see，e.g.，Watsonetal.MolecularBiologyoftheGene，4thEdition，1987，TheBejacmin/CummingsPub.co.，p.224)。氨基酸替代如表1表1原始?xì)埢Ｊ靥娲鶤la(A)Gly；SerArg(R)LysAsn(N)Gln；HisCys(C)SerGln(Q)AsnGlu(E)AspGly(G)Ala；ProHis(H)Asn；GlnIle(I)Leu；ValLeu(L)Ile；ValLys(K)Arg；Gln；GluMet(M)Leu；Tyr；IlePhe(F)Met；Leu；TyrSer(S)ThrThr(T)SerTrp(W)TyrTyr(Y)Trp；PheVal(V)Ile；Leu其它由經(jīng)驗(yàn)決定或已知的保守替代也是允許的。這里所用的氨基酸是指各種氨基酸序列，可根據(jù)常規(guī)已知的3字母縮寫或1字母縮寫識(shí)別，不同DNA片段中的核苷可根據(jù)通用的標(biāo)準(zhǔn)單字母法指定。這里所用的變異分析物結(jié)合酶指修飾酶和底物捕獲酶，其在反應(yīng)過程中能充分保留甚至增強(qiáng)分析物或分析物酶直接產(chǎn)物的結(jié)合力，具有代表性的相對(duì)于野生型配體至少保留結(jié)合力的10％，適宜地，保留了少于50％的結(jié)合力，更適宜地保留了對(duì)分析物或分析物酶的直接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物結(jié)合力的60％，70％，80％，90％，甚至100％，或者比其野生型配體具有更高的結(jié)合力。這里的變異分析物結(jié)合酶如“底物誘導(dǎo)酶”，特定結(jié)合于所選擇的分析物或目標(biāo)分子，但并不能促進(jìn)它們的轉(zhuǎn)化。分析物酶的直接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物通過特定分析物結(jié)合酶催化分析物而得到，例如SAH水解酶的直接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是SAH，胱硫醚β-合成酶的Hcy酶直接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是胱硫醚，蛋氨酸合成酶和甜菜堿-高半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶的直接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物是蛋氨酸這里所指的評(píng)價(jià)包括對(duì)分析物濃度和數(shù)量絕對(duì)值的定量的和定性的判斷，例如樣本中的同型半胱氨酸底物復(fù)合物，可通過其指標(biāo)數(shù)，所占比率，百分比，以及視覺或者其它數(shù)值指標(biāo)表示樣本中分析物的水平，評(píng)定可以是直接或間接的。這里所指的削弱催化活性是指變異分析物結(jié)合酶用做假抗體時(shí)僅保留非常低的催化活性，即在免疫實(shí)驗(yàn)中以小分子代替抗體。每個(gè)測(cè)試中所需降低催化活性的準(zhǔn)確度可由以往的經(jīng)驗(yàn)決定。有代表性的，酶類可保留其野生型所有催化活性或者催化活性之一的50％，或者不到50％；可取地，變異分析物結(jié)合酶僅保留不到其野生型總催化活性或催化活性之一的40％，30％，20％，10％，1％，0.1％，或0.01％，更適宜的，變異分析物結(jié)合酶喪失其所有催化活性或其催化活性之一。例如需要保留其催化活性或進(jìn)一步降低的催化活性，催化抑制劑可以影響反應(yīng)步驟，這些催化抑制劑包括重金屬，螯合劑或其它物質(zhì)。這里所指的大分子指不用結(jié)合其他分子就能產(chǎn)生與大分子結(jié)合的抗體。這里所指的小分子指不經(jīng)高度聚合或結(jié)合高分子或經(jīng)輔佐作用就不能產(chǎn)生能與其結(jié)合的抗體。小分子的分子量約為10,000D或小于10,000D，甚至一些小分子的分子量為5,000D或少于5,000D。這里所指的無(wú)機(jī)分子指不含碳?xì)浠衔锏姆肿幼?。這里所指的有機(jī)分子指含碳?xì)浠衔锏姆肿幼?。這里所指的維生素指生物體所需有機(jī)物，大部分的維生素可作為某些輔酶的組成成分。這里所指的生物分子通常指構(gòu)成生物體的有機(jī)化合物。這里所指的脂質(zhì)指非水溶性的，油狀的物質(zhì)，它可溶于非極性有機(jī)溶劑中，如氯仿。這里所指的同型半胱氨酸指由分子式為HSCH2CH2CH(NH2)COOH.的分子構(gòu)成。Hcy由蛋氨酸脫甲基生成，是蛋氨酸生成半胱氨酸的中間產(chǎn)物，Hcy包括游離Hcy和結(jié)合Hcy，Hcy能結(jié)合蛋白質(zhì)，肽，自身或二硫化物結(jié)合物的硫醇。這里所指的SAH水解酶指普遍存在于真核生物中的一種酶，在一些原核生物中也可發(fā)現(xiàn)。它可催化SAH水解為Hcy和Ado，SAH水解酶同時(shí)也促進(jìn)Hcy和Ado合成SAH。SAH水解酶有各種催化活性，它的輔酶是NAD+/NADH.，在水解作用方面，首先包括SAH的3-羥基族被NAD+(E-NAD+)氧化，接著將L-Hcy的β基傳給3′-酮-4′，5′-didehydro-5′-脫氧-Ado。5’-端的水基團(tuán)的緊密結(jié)合的中間產(chǎn)物提供給3’-酮-腺嘌呤的氫離子，從而使得3’-酮-腺嘌呤被NADH結(jié)合的酶還原為腺嘌呤。這里所指的SAH水解酶催化抑制劑是指抑制SAH水解酶一個(gè)或整個(gè)催化活性的作用物，例如，3′-氧化活性，5′-水解活性或3′-還原活性，但不影響SAH水解酶對(duì)Hcy和/或SAH的親和力。這里所指的胱硫醚-β-合成酶指不可逆的催化Hcy和絲氨酸合成胱硫醚的酶，胱硫醚-beta.-合成酶的輔酶是磷酸吡哆醛，用不改變酶活性的保守氨基酸圍繞胱硫醚-beta.-合成酶。這里所指的蛋氨酸合成酶是指不可逆催化Hcy和5-甲基四氫酸(5-CH3-THF)生成蛋氨酸的酶，胱硫醚-β-合成酶的輔酶是維生素B12，用不改變酶活性的保守氨基酸圍繞蛋氨酸合成酶。這里所指的甜菜堿-同型半胱氨酸-轉(zhuǎn)甲基酶指不可逆催化Hcy和甜菜堿生成蛋氨酸和二甲基-氨基乙酸的酶。用不改變酶活性的保守氨基酸圍繞甜菜堿-同型半胱氨酸-轉(zhuǎn)甲基酶。這里所指的蛋氨酶是指可催化S-替代氨基酸生成α.，β-和α，.leftbrkt-top-清除，也可催化各種β-和左端brkt-top-置換反應(yīng)的酶，根據(jù)下列平衡RSCH2CH(NH2)COOH+R′SH平衡R′SCH2CH(NH2)COOH+RSH(β-轉(zhuǎn)換)和RSCH2CH2CH(NH2)COOH+R′SH平衡R′SCH2CH2CH(NH2)COOH+RSH(.leftbrkt-top-exchange)，R′SH代表烷烴或取代硫基。獨(dú)立的R和R′從烷基，芳香基，炔基，環(huán)烷基，雜芳基，鏈烯基，氨基酸，蛋白質(zhì)或其混合物中被選擇。典型的，被替代或不替代的R和R′包少于50個(gè)原子。碳鏈可以是直鏈，有支鏈或環(huán)狀的。雜環(huán)原子含S，N，O。芳香基和雜芳基或其它環(huán)族可含有一個(gè)環(huán)，兩個(gè)環(huán)或者更多環(huán)。這里所指的腺苷脫氨酶指催化次黃苷脫氨基生成腺苷的酶，用不改變酶活性的保守氨基酸圍繞腺苷脫氨酶。這里所指的嘌呤核苷磷酸化酶指可催化水和次黃苷生成次黃嘌呤和D-核糖的酶，用不改變酶活性的保守氨基酸替代作用圍繞嘌呤核苷磷酸化酶。這里所指的黃嘌呤氧化酶指催化次黃嘌呤生成尿酸和黃嘌呤的酶，用不改變酶活性的保守氨基酸替代圍繞黃嘌呤氧化酶。這里所指的葉酸族指葉酸或維他命B族，化學(xué)式為N-[4-[[2-氨基1，4-二氫-4-氧-6-蝶啶)甲基]氨基]-benzxoyl]-L-谷氨酸或它的衍生物。葉酸衍生物包括二氫葉酸脫氫酶，四氫葉酸脫氫酶，5-甲基-四氫葉酸和5，10-亞甲基-四氫葉酸。這里所指的四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶指一種可催化四氫葉酸和絲氨酸生成5，10-亞甲基-四氫葉酸和氨基乙酸的酶。用不改變酶活性的保守氨基酸通過替代圍繞四氫葉酸轉(zhuǎn)甲基酶。這里所指的亞甲基四氫葉酸還原酶指可催化5，10-亞甲基-四氫葉酸生成5-甲基-四氫葉酸的酶，用的不改變酶活性的保守氨基酸通過替代作用包圍亞甲基四氫葉酸還原酶。這里所指的葉酸多聚谷胱甘肽合成酶指可催化5，10-亞甲基四氫葉酸-雙谷氨酸衍生物的生成的酶，其催化5，10-亞甲基四氫葉酸，L-谷氨酸鹽和ATP反應(yīng)生成ADP和磷酸。它的輔助因子是Mg.2+，用不改變酶活性的保守氨基酸通過替代圍繞葉酸多聚谷胱甘肽合成酶。這里所指的二氫葉酸還原酶指催化二氫葉酸，NADPH和H..+生成四氫葉酸和NADP+的酶，用不改變酶活性的保守氨基酸通過置換反應(yīng)包圍二氫葉酸還原酶。這里所指的胸苷酸合成酶是指催化5，10-亞甲基-四氫葉酸和dUMP生成二氫葉酸和dTMP的酶，用不改變酶活性的保守氨基酸通過替代作用包圍胸苷酸合成酶。這里所指的膽固醇酯酶是指催化膽固醇和水生成脂肪酸和膽固醇酯的酶，用不改變酶活性的保守氨基酸通過替代作用包圍膽固醇酯酶。這里所指的膽固醇氧化酶是指催化氧和膽固醇生成膽固醇-4-en-3-one和水的酶，用不改變酶活性的保守氨基酸通過替代作用包圍膽固醇氧化酶。這里所指的膽汁酸是指膽固醇在肝內(nèi)生成的酸性甾酮，膽汁酸隨膽汁進(jìn)入小腸，脂溶性維他命有利于脂質(zhì)的吸收，人體中膽汁酸含量最大的是膽酸膽酸鹽指膽汁酸的鹽類，人體膽酸鹽大部分的是肝膽酸鹽和牛黃膽酸鈉。這里所指的3-α-羥基-類固醇脫氫酶是指可催化3-alpha-羥基-類固醇和NAD+生成3-氧-膽汁酸和H.+和NADH的酶，用不改變酶活性的保守氨基酸通過替代作用包圍3-alpha-羥基-類固醇脫氫酶。這里所指的葡萄糖異構(gòu)酶指一種可催化D-葡萄糖和D-果糖之間的相互轉(zhuǎn)化的酶，用保守的不改變其活性的氨基酸替代作用包圍葡萄糖異構(gòu)酶。這里所指的己糖激酶或葡萄糖氧化酶是指可催化α.-D-葡萄糖和ATP生成D-葡萄糖-6-磷酸的酶，己糖激酶或葡萄糖氧化酶輔助因子是Mg.2+，用不改變酶活性的保守氨基酸替代包圍己糖激酶或葡萄糖氧化酶。這里所指的葡萄糖氧化酶是一種可催化葡萄糖，水和氧生成葡糖酸的酶，用不改變酶活性的保守氨基酸替代包圍葡萄糖氧化酶。這里所指的乙醇脫氫酶催化乙醇和NAD+生成乙醛，NADH和H+的酶，用不改變酶活性的保守氨基酸替代包圍乙醇脫氫酶。這里所指的尿酸鹽氧化酶和尿酸酶催化尿酸，氧和水生成尿曩素的酶，輔助因子是銅，用不改變酶活性的保守氨基酸通過替代包圍尿酸鹽氧化酶和尿酸酶。這里所指的血清指血液除去血球和纖維蛋白的液體部分。它區(qū)別于循環(huán)血中的血漿。這里所指的血漿指一種液體組織，是血液中非細(xì)胞成分液體。它區(qū)別于離心做得的血清。這里所指的高純度″substantiallypure″是指高度相似，高度均一通過一些檢測(cè)純度的標(biāo)準(zhǔn)方法，如薄層層吸法，凝膠電泳和高效液相層吸法不能檢測(cè)到雜質(zhì)，或者指進(jìn)一步純化時(shí)不能檢測(cè)到其物理和化學(xué)性能的改變，如它的酶活性和生物活性。。。。但是化學(xué)純度高的物質(zhì)可以是立體異構(gòu)體，同分異構(gòu)體的混合，因此，進(jìn)一步純化可以增強(qiáng)合成物的特異性。這里所指的生物活性指化合物，合成物，混合物。生物活性也包括化合物，合成物，混合物的療效和藥物活性。生物活性在體外的試驗(yàn)可觀察到，如利用熒光素酶的氧化活性氧化底物，可以產(chǎn)生熒光。這里所指的受體指可結(jié)合特定配體的一種分子，受體可以是自然的或人工合成的。受體也可以作為抗-配體，受體和抗-配體可以相互轉(zhuǎn)變。受體可單獨(dú)使用或與其它種類結(jié)合為聚合體使用。受體可與其結(jié)合物進(jìn)行直接/間接的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合，或者是物理性結(jié)合。受體包括抗體，胞膜受體或胞內(nèi)受體，單克隆抗體，藥物，多核苷酸，核酸，肽，輔助因子，外源凝集素，糖，多糖，細(xì)胞，細(xì)胞膜，細(xì)胞器。受體的例子和應(yīng)用如下a)酶特異運(yùn)輸供微生物生存的蛋白質(zhì)或基礎(chǔ)酶，也可作為抗體(配體)的結(jié)合目標(biāo)。b)抗體通過辨認(rèn)抗體上與抗原表位結(jié)合的位點(diǎn)，確定擬抗原表位序列，可以發(fā)展疫苗或其它診斷產(chǎn)品以及自身免疫疾病治療的藥物。c)核酸配體的鑒定，如蛋白質(zhì)，RNA，結(jié)合點(diǎn)。d)具有催化作用的多肽聚合體，多肽，具有促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)的能力。多肽通常對(duì)一個(gè)反應(yīng)物或反應(yīng)中間產(chǎn)物和活性功能基團(tuán)至少有一個(gè)特異結(jié)合點(diǎn)。[see，e.q.，U.S.Pat.No.5,215,899]。e)激素受體與受體有高度親和力的配體可用于激素替代療法的開發(fā)，例如控制血壓藥物的開發(fā)。f)麻醉劑受體測(cè)定結(jié)合大腦鎮(zhèn)靜受體的配體可用于開發(fā)嗎啡和相關(guān)的低成癮藥物?？贵w包括抗體片段，如組成輕鏈和重鏈可變區(qū)的Fab片段。類人化抗體修飾包含“人”氨基酸序列的抗體以便使其不能激發(fā)人體的免疫反應(yīng)。例如單克隆抗體表達(dá)的雜交瘤通過基因重組技術(shù)所得而來(lái)，此技術(shù)表達(dá)的抗體的不變的氨基酸區(qū)域是人類抗體的區(qū)域。重組產(chǎn)品利用分子生物學(xué)的DNA基因重組技術(shù)生成的蛋白質(zhì)非常相同″substantiallyidentical″指產(chǎn)品非常相似，特性幾乎不變，因而，可用非常相似的產(chǎn)品取代這種產(chǎn)品。相同的，等價(jià)的″e(cuò)quivalent，″用于兩個(gè)序列的核酸，是指這兩個(gè)序列的核酸可以編譯出相同序列的氨基酸或相同的蛋白質(zhì)，也包括中度嚴(yán)格或高度嚴(yán)格條件下編碼所需蛋白質(zhì)的雜交。相同的，等價(jià)的″e(cuò)quivalent″用于指兩種蛋白質(zhì)或肽類，指兩種蛋白質(zhì)或肽類這含有充分相同的氨基酸序列只有被保守的氨基酸所取代，不會(huì)完全改變蛋白質(zhì)或肽類的活性或功能[see，e.g.，Table1，above]相同的，等價(jià)的″e(cuò)quivalent″指性能，特點(diǎn)時(shí)，特性不一定相同程度的出現(xiàn)(兩個(gè)肽分子的相同類型的酶活性可能表現(xiàn)出不同的速度)，但是活性非常相似。另外，可指兩列核苷酸的雜交能力。適宜的可以少于25％的錯(cuò)配，較適宜的，少于15％的錯(cuò)配，甚至可少于10％，最適宜的，在高度嚴(yán)格條件下雜交，兩個(gè)相對(duì)氨基酸之間沒有錯(cuò)配。雜交的嚴(yán)格性由錯(cuò)配百分率決定，如下1)高度嚴(yán)格0.1.times.SSPE，0.1％SDS，65℃。2)中度嚴(yán)格0.2.times.SSPE，0.1％SDS，50℃。3)低嚴(yán)格性1.0.times.SSPE，0.1％SDS，50℃。嚴(yán)格度equivalentstringencies可以通過選擇緩沖液，鹽類和溫度來(lái)獲得。充分地，非常的″substantially″文章中相同的，相應(yīng)的或類似的改變是指至少70％，更進(jìn)一步指至少80％，再進(jìn)一步指至少90％，最多指95％。合成物指兩種或更多種產(chǎn)物或化合物組成的一種混合物，可以是一種溶液，懸乳液，粉劑，糊劑，水劑或是它們的任意組合。結(jié)合指兩種或更多物質(zhì)之間的結(jié)合作用。流體指任何能流動(dòng)的成分，包括，半固體，糊劑，溶液，水劑，凝膠體，洗劑，膏體和其他混合物的形態(tài)。載體(質(zhì)粒)指在細(xì)胞內(nèi)引入異種DNA進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。例如質(zhì)粒，重組病毒或其他載體可以插入適合的宿主細(xì)胞中，引起DNA的克隆。載體基因的表達(dá)包括在原核細(xì)胞和/或真核細(xì)胞和其他殘余游離基因或那些并入宿主細(xì)胞的基因。啟動(dòng)區(qū)或啟動(dòng)因素指可控制DNA或RNA轉(zhuǎn)錄的DNA或RNA片段，啟動(dòng)區(qū)包含能被RNA聚合酶識(shí)別，結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的特定序列。啟動(dòng)區(qū)的一部分作為啟動(dòng)子。另外，啟動(dòng)區(qū)還包括調(diào)節(jié)這些RNA聚合酶識(shí)別，結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄活性的序列。受體受自然法則的調(diào)控，效仿啟動(dòng)子被用于原核生物，包括抗菌素T7和T3啟動(dòng)子等。有效連接和有效結(jié)合指核酸序列影響和調(diào)節(jié)的DNA的功能的關(guān)系，核酸序列如，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止位點(diǎn)和其它信號(hào)序列。例如DNA與啟動(dòng)子的有效連接是指DNA和啟動(dòng)子的物理和功能關(guān)系，RNA聚合酶結(jié)合DNA啟動(dòng)區(qū)，通過特異辨認(rèn)并結(jié)合啟動(dòng)子，啟動(dòng)DNA的轉(zhuǎn)錄。在體外轉(zhuǎn)錄或表達(dá)中為了使其達(dá)到最優(yōu)化，需要除去，增加，或改變克隆5′-端非翻譯部分從而去除額外的、潛在地、不恰當(dāng)?shù)木哂羞x擇性的翻譯起始密碼子或其它序列，這些序列可能干擾或降低基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄或翻譯。做為可選擇的，核糖體結(jié)合點(diǎn)(see，e.g.，Kozak，J.Biol.Chem.，26619867-19870(1991))直接插入起始密碼的5′-端可以增強(qiáng)表達(dá)。上述所希望的修飾也可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行改變。樣本指實(shí)驗(yàn)中的分析物，可以是生物樣本，如生物的體液樣本或組織樣本。體液樣本包括尿液，血液，血漿，唾液，精液，大便，痰，腦脊液，淚液，黏液，羊水等。生物組織是由細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)構(gòu)成的集合體，可構(gòu)成人類，動(dòng)物，植物，細(xì)菌，真菌或病毒的結(jié)構(gòu)，包括接締組織，上皮細(xì)胞，肌肉和神經(jīng)組織，也包括瘤，器官，淋巴結(jié)，動(dòng)脈等。對(duì)于保護(hù)基團(tuán)，氨基酸和其他化合物的縮寫，如果不另行指出，均根據(jù)其通用公認(rèn)的縮寫或IUPAC-IUB組織關(guān)于生物化學(xué)命名法。.B.檢測(cè)項(xiàng)目的方法這里提供檢測(cè)樣本中項(xiàng)目的方法。任何把抗體作為一種試劑的檢測(cè)都可以用這里給出的方法加以修改用一種已被修改的酶來(lái)代替該抗體，這樣，它結(jié)合檢測(cè)項(xiàng)的能力得以保持，而催化活力大大降低(如，底物捕獲酶)。這里提供的檢測(cè)步驟包括a)樣品與結(jié)合于檢測(cè)項(xiàng)的變異或修改酶接觸；和b)用變異檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶探測(cè)檢測(cè)項(xiàng)或直接檢測(cè)項(xiàng)酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物間的結(jié)合。變異或修改酶仍然保留了結(jié)合力，對(duì)檢測(cè)項(xiàng)或直接檢測(cè)項(xiàng)酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)合力較原始型或未修改酶更為提高，但催化活性被削弱。1.檢測(cè)項(xiàng)任何能夠作為輔酶、輔助因子或底物特異結(jié)合于酶的檢測(cè)項(xiàng)，都可以用這個(gè)剛宣布的方法檢測(cè)。檢測(cè)項(xiàng)可以是任何分子，包括生物大分子和小分子、配子、反配子和其他種類。最好是小分子。比如，該小分子檢測(cè)項(xiàng)是個(gè)無(wú)機(jī)分子，那么最好是個(gè)無(wú)機(jī)離子，如鈉、鉀、鎂、鈣、氯、鐵、銅、鋅、錳、鈷、碘、鉬、釩、鎳、鉻、氟、硅、錫、硼或砷離子。另一個(gè)特別的例子是，小分子檢測(cè)項(xiàng)是個(gè)有機(jī)分子，那么最好是氨基酸、少于10個(gè)氨基酸的多肽、維生素、單糖、少于10個(gè)單糖的低聚糖或脂類。本法可檢測(cè)所有氨基酸。例如，可檢測(cè)D-和L-氨基酸。例外，還可檢測(cè)所有的自然界多肽和蛋白質(zhì)基團(tuán)，包括Ala(A)，Arg(R)，Asn(N)，Asp(D)，Cys(C)，Gln(Q)，Glu(E)，Gly(G)，His(H)，Ile(I)，Leu(L)，Lys(K)，Met(M)，Phe(F)，Pro(P)Ser(S)，Thr(T)，Trp(W)，Tyr(Y)andVal(V)。以及自然界氨基酸的所有衍生物，如Cys的衍生物Hcy。本法可檢測(cè)所有的核苷。如腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。本法可檢測(cè)所有的核苷酸。這樣的例子有，AMP，GMP，CMP，UMP，ADP，GDP，CDP，UDP，ATP，GTP，CTP，UTP，dAMP，dGMP，dCMP，dTMP，dADP，dGDP，dCDP，dTDP，dATP，dGTP，dCTP和dTTP。例外，還可檢測(cè)所有的少于10個(gè)這樣的或其他核苷酸的寡核苷酸。本法可檢測(cè)所有的維生素。如水溶性維生素有B1、核黃素(B2)、煙酸、泛酸(B3)、B6、生物素(H)、葉酸、維生素B12和抗壞血酸(C)，同樣檢測(cè)脂溶性維生素如，維生素A、D、E和K。本法可檢測(cè)所有單糖，無(wú)論D-還是L-單糖，醛糖還是酮糖。單糖的例子有丙糖如甘油醛、四糖如赤蘚糖和蘇糖，戊糖如核糖、阿拉伯糖、木糖、來(lái)蘇糖和核酮糖，己糖如阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔羅糖和果糖，庚糖如景天庚酮糖。本法可檢測(cè)所有的脂類。包括三酰甘油如(三)硬脂酸甘油酯、三甘油棕櫚酸酯、甘油三油酸酯、臘，磷脂如磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、磷脂酰肌醇和心磷脂，鞘脂類如鞘磷脂、腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂，固醇類如膽固醇和豆甾醇以及脂肪酸酯甾酮。脂肪酸可以是飽和脂肪酸如十二(烷)酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸和二十四烷酸，或可以是不飽和脂肪酸如棕櫚油酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸。還有其他特別的實(shí)例中，被檢測(cè)小分子的分子量大約或小于10,000道爾頓。分子量等于或小于5,000道爾頓更佳。本法可以檢測(cè)的(但不限于此)項(xiàng)目還包括，Hcy、葉酸族、膽固醇、葡萄糖、乙醇和尿酸。2.變異檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶(“底物捕獲酶”)任何能保留結(jié)合力或降低催化活力的變異檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶都可以用在本法。例如，如果Hcy作為待檢測(cè)項(xiàng)，可使用變異Hcy結(jié)合酶如變異胱硫醚-β-合酶、變異蛋氨酸合酶、變異甜菜堿-同型半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶、變異蛋氨酸酶和變異SAH水解酶。用常規(guī)變異方法可準(zhǔn)備有理想特性的變異酶。變異殘余可被系統(tǒng)變異殘余識(shí)別為不同殘余，且把催化活性降低理想的并對(duì)特殊底物保留有親和力的識(shí)別出來(lái)。另外，變異也可能基于預(yù)知或已知的酶3D結(jié)構(gòu)，包括預(yù)知各種變異的影響(見，如Turneretal.(1998)NatureStructuralBiol.5369-376；Ault-Richieetal.(1994)J.Biol.Chem.26931472-31478；Yuanetal.(1996)J.Biol.Chem.27128009-28016；Williamsetal.(1998)Biochemistry377096；Steadmanetal.(1998)Biochemistry377089-7095；Finer-Mooreetal.(1998)J.Mol.Biol.276113-129；Stropetal.(1997)ProteinSci.62504-2511；Finer-Mooreetal.(1996)Biochemistry355125-5136；Schifferetal.(1995)Biochemistry3416279-16287；Costietal.(1996)Biochemistry353944-3949；Gravesetal.(1992)Biochemistry3115-21；Carrerasetal.(1992)Biochemistry316038-6044)。這些預(yù)知也可以由化學(xué)計(jì)算技巧中取得。因此，對(duì)任何選定的酶，再試驗(yàn)決定變異需要抑制催化活力而保留結(jié)合力。a.核酸編碼檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶核酸編碼檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶可由已知方法中取得。檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶的已知核酸序列可被用于從自然界或其他來(lái)源分離核酸編碼檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶。另外，完整或部分的核酸編碼檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶可通過已知序列化學(xué)合成或商業(yè)及其他途徑獲得。真核細(xì)胞和原核細(xì)胞可作為核酸編碼檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶的核酸來(lái)源。其DNA可由已知的克隆DNA(如DNA“庫(kù)”)的標(biāo)準(zhǔn)程序、化學(xué)合成、cDNA克隆或染色體DNA或片斷克隆、從目標(biāo)細(xì)胞提純?nèi)〉谩?見，例如，Sambrooketal.，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2dEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.；Glover，D.M.(ed.)，1985，DNACloningAPracticalApproach，MRLPress，Ltd.，Oxford，U.K.Vol.I，II.)。從染色體DNA中克隆提取除了編碼區(qū)，還可含有特定的和內(nèi)DNA區(qū)；從cDNA或RNA中克隆提取僅含有外部序列。不管來(lái)源哪里，基因總按分子克隆為基因繁殖的適當(dāng)載體。從cDNA中基因分子克隆，cDNA可由已知的總細(xì)胞RNA或mRNA產(chǎn)生。也可從染色體DNA中獲得基因，DNA片斷即由染色體產(chǎn)生(如，用限制酶或機(jī)械剪)，有些DNA可編碼成理想基因。然后，線性DNA片斷可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被重排分離，包括但不限于，瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳和柱狀色譜分離。一旦生成DNA片斷，識(shí)別含所有或部分檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶的基因的特異性DNA片斷，有很多方法來(lái)完成。分離一個(gè)檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶基因的較好方法是用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，從染色體或cDNA庫(kù)，或未統(tǒng)一入庫(kù)的染色體DNA或cDNA擴(kuò)增理想的檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶序列，寡核苷酸引物與檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶序列雜交后可作為PCR的引物。另外，一部分(任何物種的)檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶基因或特異性RNA、或其片斷可被純化(或寡核苷酸合成)和標(biāo)記，生成的DNA片斷可用核酸雜交到標(biāo)記的探針來(lái)過篩。(Benton，W.andDavis，R.，1977，Science196180；Grunstein，M.AndHogness，D.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.723961)。那些與探針同族的DNA片斷則雜交。檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶核酸也可被表達(dá)克隆識(shí)別和分離，比如利用選擇性抗檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶抗體。除了以克隆或擴(kuò)增來(lái)獲得檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶DNA，包括但不僅限于，由已知檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶核酸序列化學(xué)合成，或使cDNA變成具有檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶編碼的mRNA。任何已知的適當(dāng)?shù)姆椒ǘ伎梢允褂谩５玫娇寺≈?，其特征可由核酸序?用已知方法)以及與已知檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶序列比較來(lái)證實(shí)。DNA序列分析可用已知的方法，包括但不限于，Maxam和Gilbert的方法(1980，Meth.Enzymol.65499-560)，theSangerdideoxy方法(Sanger，F(xiàn).，etal.，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.745463)，使用T7DNA聚合酶(TaborandRichardson，U.S.Pat.No.4,795,699)，使用自動(dòng)DNA序列器(e.g.，AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，Calif.)。與檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶核酸或核酸編碼檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶衍生物雜交的核酸，可在低、高或中等嚴(yán)格條件下，用核酸雜交分離出來(lái)。(ShiloandWeinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA786789-6792).b.選擇和生產(chǎn)變異檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶一旦獲得核酸編碼檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶，這些核酸可根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶被誘變、過篩和/或選擇，要求檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶保留或增強(qiáng)對(duì)檢測(cè)項(xiàng)或檢測(cè)項(xiàng)酶直接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)合力，而削弱了催化活力。插入、剪除或點(diǎn)突變都可以用來(lái)使核酸編碼出檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶。可使用已知的突變技術(shù)，包括但不限于，體外定點(diǎn)誘變(Hutchinsonetal.，1978，J.Biol.Chem2536551)，使用TAB.RTM.接頭(Pharmacia)，含突變的PCR引物，等等。不同的基因產(chǎn)物表型檢測(cè)可在突變發(fā)生后進(jìn)行。需要時(shí)，定點(diǎn)誘變程序可利用提供單鏈及雙鏈DNA的載體。一般來(lái)說(shuō)，帶這樣載體的突變程序如下合成突變引物，如補(bǔ)充欲改變序列的引物，但包括一個(gè)或幾個(gè)改變的、添加的或去除的堿基。引物在體外進(jìn)行DNA聚合酶擴(kuò)展，經(jīng)過一些附加操作之后，雙鏈DNA被轉(zhuǎn)到細(xì)菌細(xì)胞中。接著，用各種方法識(shí)別理想的突變DNA，理想的蛋白從含突變序列的克隆中純化出來(lái)。對(duì)于長(zhǎng)序列，經(jīng)常需要額外的克隆步驟，因?yàn)樵谀切┹d體上插入長(zhǎng)序列(長(zhǎng)于2,000堿基)不易穩(wěn)定。很多生物技術(shù)公司提供已知的定點(diǎn)突變程序，例如美國(guó)的LifeScience，Inc.(ArlingtonHeights，III.)和StratageneCloningSystems(LaJolla，Calif.)。關(guān)于檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶的結(jié)構(gòu)-功能資料，可用于檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶的突變和選擇，該酶應(yīng)保留或增強(qiáng)對(duì)檢測(cè)項(xiàng)酶或檢測(cè)項(xiàng)酶直接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)合力而削弱催化活性。例如，突變可對(duì)其輔酶、輔助因子、非檢測(cè)項(xiàng)底物的酶結(jié)合位點(diǎn)或突變酶催化點(diǎn)或其合成物上形成。一旦一個(gè)突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶具有理想特性，如保留或增強(qiáng)了對(duì)檢測(cè)項(xiàng)酶或檢測(cè)項(xiàng)酶直接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)合力而削弱催化活性，被識(shí)別出來(lái)，該突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶可以由任何已知的方法獲得，包括重組表達(dá)、化學(xué)合成或兩者綜合。突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶最好由重組表達(dá)取得。為了重組表達(dá)，突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶基因或部分基因被插入到適當(dāng)?shù)目寺≥d體，在特殊的宿主細(xì)胞上表達(dá)。大量已知的載體宿主都可以使用?？赡艿妮d體包括但不限于，質(zhì)體或被修改的病毒體，但載體系統(tǒng)必須和使用的宿主細(xì)胞相兼容。這樣的載體包括但不限于，噬菌體如λ衍生物，或質(zhì)體如pBR322或pUC質(zhì)體衍生物或Bluescript載體(Stratagene)?？寺≥d體的插入，例如，可通過把DNA片斷綁入具有相應(yīng)粘著點(diǎn)的克隆載體。但是，克隆載體上如果不存在相應(yīng)的DNA片斷粘著點(diǎn)，DNA分子末尾可被酶解改變。另外，綁入核苷(接頭)序列到DNA粘著點(diǎn)可產(chǎn)生理想位點(diǎn)；這些被綁入的接頭可包括特殊的編碼限制核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的寡核苷酸。重組分子可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、傳染、電穿孔等方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞，這樣就產(chǎn)生了很多的基因序列。另一種方法中，理想的基因用“鳥槍”法插入到適當(dāng)?shù)目寺≥d體后可被識(shí)別并分離。在插入到克隆載體之前，理想基因可先增殖，例如按大小分級(jí)。在一些特例中，帶重組DNA分子與被分離的突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶基因、cDNA或合成DNA序列的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化使基因成倍復(fù)制。這樣，轉(zhuǎn)化株成長(zhǎng)、重組DNA分子自轉(zhuǎn)化株分離出來(lái)，并在必要時(shí)，從分離的重組DNA上找回插入基因，可以獲得大量基因。編碼突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶或功能活性類似物或片斷或其他延伸物的核苷序列，可被插入到一個(gè)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，如一個(gè)含有插入蛋白譯碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯必要因子。必要的轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)也可由本族突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶基因和/或其旁側(cè)區(qū)提供。不少宿主-載體系統(tǒng)可利用于蛋白譯碼序列表達(dá)。這些系統(tǒng)包括但不限于，感染了病毒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(如牛痘病毒、腺病毒等)；感染了病毒的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)(如桿狀病毒)；微生物如帶酵母載體的酵母菌，或轉(zhuǎn)化了耐藥力和特性的細(xì)菌。根據(jù)利用的宿主-載體系統(tǒng)，可以使用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯因子。前面描述過把DNA片斷插入到載體的方法，可以用于建立含有未知的含適當(dāng)轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)和蛋白譯碼序列的基因表達(dá)的載體。這些方法可包括體外重組DNA和合成技術(shù)以及體內(nèi)重組(基因重組)。編碼一個(gè)突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶或多肽的核酸表達(dá)，可用第二個(gè)核酸序列來(lái)調(diào)整，這樣，突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶或多肽就被表達(dá)到經(jīng)重組DNA分子的宿主中。例如，一個(gè)突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶的表達(dá)用被促進(jìn)因子/增強(qiáng)因子來(lái)控制?？捎脕?lái)控制突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶表達(dá)的促進(jìn)因子包括但不限于，SV40早期促進(jìn)區(qū)(BernoistandChambon，1981，Nature290304-310)，含于魯斯氏肉瘤病毒的重復(fù)3′長(zhǎng)端促進(jìn)因子(Yamamoto，etal.，1980，Cell22787-797)，皰疹腺嘧啶激酶促進(jìn)因子(Wagneretal.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445)，金屬硫蛋白基因的調(diào)整序列(Brinsteretal.，1982，Nature29639-42)；原核表達(dá)載體如β-內(nèi)酰胺酶促進(jìn)因子(Villa-Kamaroff，etal.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)，或tac促進(jìn)因子(DeBoer，etal.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)；也見于″Usefulproteinsfromrecombinantbacteria″inScientificAmerican，1980，24274-94；酵母或其他真菌的促進(jìn)因子如Gal4促進(jìn)因子，ADC(乙醇脫氫酶)促進(jìn)因子，PGK(磷酸甘油激酶)促進(jìn)因子，堿性磷酸酶促進(jìn)因子和某些動(dòng)物的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。例如，可使用載體如含有與核酸編碼有可用連接的促進(jìn)因子，具有一個(gè)或多個(gè)的復(fù)制起點(diǎn)，也可以是一個(gè)或多個(gè)可選的標(biāo)記(如一個(gè)抗生素耐藥基因)。具體地表述，表達(dá)構(gòu)造可用亞克隆一個(gè)突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶譯碼序列為EcoRI限制位點(diǎn)，三個(gè)pGEX載體中任意一個(gè)。(GlutathioneS-Transferaseexpressionvectors；SmithandJohnson，1988，Gene731-40)。這使突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶的表達(dá)可以在正確的讀碼時(shí)，由亞克隆生產(chǎn)。含一個(gè)突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶基因插入的表達(dá)載體可被三種普通途徑識(shí)別(a)核酸雜交，(b)“標(biāo)記”基因功能的存在或缺少，和(c)插入序列的表達(dá)。第一種途徑中，突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶基因插入到表達(dá)載體的存在，可用含與插入突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶同源的探針，通過核酸雜交來(lái)檢測(cè)。第二種途徑中，重組載體/宿主系統(tǒng)可被識(shí)別和選擇出來(lái)，基于某些“標(biāo)記”基因功能的存在或缺少(如腺嘧啶激酶活性，抗生素耐藥性，轉(zhuǎn)錄表型，桿狀病毒的封閉體型等)，在載體中插入突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶基因使這些功能產(chǎn)生變化。例如，如果突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶基因插在載體的標(biāo)記基因序列內(nèi)，含突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶插入的重組無(wú)可因缺少標(biāo)志基因功能而被識(shí)別出來(lái)。第三種途徑中，重組表達(dá)載體可由分析突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶產(chǎn)物通過重組表達(dá)識(shí)別出來(lái)。舉例說(shuō)明，這些分析可基于在體外分析系統(tǒng)中，突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶的物理或功能特性，如與抗突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶抗體結(jié)合。一旦一種特定的重組DNA分子被識(shí)別和分離出來(lái)，可用多種已知的方法來(lái)增殖它。一旦建立起適宜的宿主系統(tǒng)和生長(zhǎng)環(huán)境，重組表達(dá)載體就可被定量增殖和準(zhǔn)備。如前所述，可用的表達(dá)載體包括但不限于一下載體和其衍生物人體和動(dòng)物病毒如牛痘病毒或腺病毒；昆蟲病毒如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(如λ)，以及質(zhì)體和粘粒DNA載體和其他。另外，宿主細(xì)胞株可被選擇，按照特殊需要方式調(diào)整插入序列的表達(dá)，或修改和處理基因產(chǎn)物。從某些促進(jìn)因子來(lái)的表達(dá)，在某些引導(dǎo)物存在時(shí)可被提高。這樣，基因工程突變檢測(cè)項(xiàng)結(jié)合酶的表達(dá)可被控制。而且，不同的宿主細(xì)胞對(duì)蛋白的翻譯和后翻譯的處理和修改(如糖基化、磷酸化)有不同的特性和特殊機(jī)制。適當(dāng)?shù)募?xì)胞線或宿主系統(tǒng)可被選用以保證外來(lái)蛋白表達(dá)的理想修改和處理。例如，在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)可以用來(lái)生產(chǎn)無(wú)糖基化核心蛋白產(chǎn)物。在酵母中表達(dá)則生產(chǎn)糖基化產(chǎn)物。在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物細(xì)胞中表達(dá)可以用來(lái)保證異體蛋白的“本地”糖基化。而且，不同的載體/宿主表達(dá)系統(tǒng)可以影響反應(yīng)處理到不同程度。3.樣本收集以上所述的方法可以用來(lái)分析任何樣本檢測(cè)項(xiàng)。在此例中，待測(cè)標(biāo)本是從哺乳動(dòng)物，尤其是人的生物學(xué)樣本，如體液或組織。生物學(xué)體液包括但不限于，尿液、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、毛發(fā)和其他角蛋白樣本、腦脊液、眼淚、粘液和羊水。生物學(xué)組織可能包括但不限于，細(xì)胞集合，通常為一種特別的細(xì)胞和其用以形成支架結(jié)構(gòu)的胞間物質(zhì)，而形成的人類、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌或病毒的結(jié)構(gòu)，包括關(guān)節(jié)、上皮、肌肉和神經(jīng)組織、器官、腫瘤、淋巴結(jié)、動(dòng)脈以及單個(gè)細(xì)胞。在一個(gè)特例中，待測(cè)體液為尿液。在另一個(gè)特例中，待測(cè)體液為學(xué)業(yè)。血液樣本最好再分離為血漿或血清成分。血清或血漿可用任何已知的方法從采集的血液中取得。在一個(gè)特例中，血清和血漿通過離心采集血獲得。離心最好在有封閉劑的條件下進(jìn)行，封閉劑具有比血清和血漿重而比血球輕的重力特性，這樣血球會(huì)沉底，而經(jīng)過離心，封閉劑在血清或血漿之下、血球之上形成一個(gè)阻斷層。封閉劑可用于但不限于以下過程，苯乙烯粉(JapanesePatentPublicationNo.38841/1973)、交鏈聚合水凝膠小球或盤(U.S.Pat.No.3,647,070)、表面帶抗栓劑或濕潤(rùn)劑的聚苯乙烯小珠(U.S.Pat.No.3,464,890)和硅樹脂液(U.S.Pat.Nos.3,852,194and3,780,935)。最好的情況是，封閉劑為非替代的丙烯酸烷和/或異丁烯酸烷聚合物，其烷鏈應(yīng)不超過18個(gè)碳原子，聚合物重量約為1.03至1.08且在切變速度約1s-1粘度為5,000至1,000,000cps(25℃測(cè)量)(U.S.Pat.No.4,140,631)。具體地表述，過篩血液區(qū)的血清或血漿。血液最好用一層平均直徑約0.2-5mu密度約0.1-0.5g/cm3的玻璃纖維過濾，分離的血漿或血清總量最多約為玻璃纖維吸收量的50％；收集穿過玻璃纖維層的血清和血漿(U.S.Pat.No.4,477,575)。用灌注了聚丙烯酯衍生物和聚乙烯乙二醇的平均直徑0.5-2.5mu的玻璃纖維也不錯(cuò)(U.S.Pat.No.5,364,533)。聚丙烯酯衍生物為丁基丙烯酸聚合物、甲基丙烯酸聚合物或乙烷基丙烯酸聚合物，以及(a)丁基丙烯酸聚合物，(b)甲基丙烯酸聚合物或乙烷基丙烯酸聚合物和(c)聚乙烯乙二醇以(10-12)∶(1-4)∶(1-4)的比例混合使用更好。還有一個(gè)更好的實(shí)例，用含氧側(cè)鏈或側(cè)環(huán)的木脂體架(U.S.Pat.No.4,803,153)來(lái)處理血液獲得血清或血漿，如用d-芝麻素、l-芝麻素、泡桐素、d-asarinin，l-asarinin、2α-泡桐素、6α-泡桐素、pinoresinol，d-eudesmin，l-pinoresinol.beta.-D-glucoside，l-pinoresinol，l-pinoresinolmonomethylether.beta.-D-glucoside，epimagnolin，lirioresinol-B，syringaresinol(dl)，lirioresinonB-dimethylether，phillyrin，magnolin，lirioresinol-A，2.alpha.，6.alpha.-d-sesamin，d-diaeudesmin，lirioresinol-Cdimethylether(ddiayangambin)和sesamolin。凝血?jiǎng)┯昧繌募s0.01至50g/L血。C.同型半胱氨酸檢測(cè)方法目前也是檢測(cè)樣本中的HCY的方法。這個(gè)方法至少包含以下步驟a)使用突變的HCY結(jié)合酶與樣本結(jié)合，此突變的HCY結(jié)合酶充分保留或增強(qiáng)其與HCY的親和力，但是削弱其催化活性。b)檢測(cè)與突變的HCY結(jié)合酶結(jié)合的HCY或由HCY轉(zhuǎn)化酶即時(shí)轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物1.同型半胱氨酸的代謝同型半胱氨酸是蛋氨酸代謝為半胱氨酸的中間氨基酸產(chǎn)物。人體內(nèi)有兩條同型半胱氨酸快速代謝途徑(1)與絲氨酸縮合成胱硫醚，(2)重新轉(zhuǎn)化為蛋氨酸。如上所述，樣本中的同型半胱氨酸水平具有重要的臨床意義。同型半胱氨酸在含巰基氨基酸代謝中扮演著重要的角色；代謝產(chǎn)物在代謝路徑中提示有不同的問題，包括特殊的先天的代謝問題。因此，例如高胱氨酸尿(尿中不正常的HCY)是由于缺乏胱硫醚酶β-合成酶或轉(zhuǎn)甲基四氫葉酸甲基轉(zhuǎn)移酶促使HCY甲基化生成蛋氨酸，第二條路徑附有插圖##STR1##Inthesecondpathway，whichisillustratedasfollows##STR1##1是亞甲基合酶；2是四氫葉酸(FH4)轉(zhuǎn)甲基酶；3是甲基四氫葉酸還原酶；4是二氫葉酸還原酶；5是胸腺嘧啶合成酶；四氫葉酸和二氫葉酸與HCY水平是相關(guān)的，另外和維生素B12的水平也是相關(guān)的，在這條路徑中不同的酶可以影響HCY的水平。巰基氨基酸代謝與維生素B12和葉酸有著密切的關(guān)系，在很多生化反應(yīng)中做為底物或輔助因子，HCY堆積指示依賴維生素B12和葉酸代謝的酶紊亂，或其它的功能紊亂，或與維生素B12和葉酸有關(guān)的疾病。HCY代謝也可能受到其它抗葉酸的藥物影響，如做為抗癌和治療哮喘的藥物氨甲葉酸，因?yàn)镠CY轉(zhuǎn)化成蛋氨酸需要S-甲基四氫葉酸提供甲基。HCY也可被用來(lái)監(jiān)測(cè)治療惡性疾病所用的抗葉酸藥物。血液中的同型半胱氨酸水平動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)(見Clarkeetal.，NewEng.J.Med.3241149-1155(1991))，中度高同型半胱氨酸血癥是動(dòng)脈和心臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)因子。因此檢測(cè)血液中的HCY對(duì)于檢測(cè)和治療心血管疾病是非常重要的。2.MutantHcy-bindingEnzymes突變的HCY結(jié)合酶在HCY實(shí)驗(yàn)中，任何突變的HCY結(jié)合酶充分保留或增強(qiáng)其與HCY或HCY酶的直接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的親和力但卻消弱了催化活性。例如突變型HCY結(jié)合酶包括胱硫醚β-合成酶，突變蛋氨酸合成酶，突變甜菜堿HCY轉(zhuǎn)甲基酶，突變蛋氨酶和突變SAH合成水解酶。a.選擇和生產(chǎn)HCY結(jié)合酶SelectingandProducingHcy-bindingEnzymes一旦HCY結(jié)合酶核酸編碼被破譯，這些核酸已經(jīng)能夠被誘變或遮蔽獲得，或直接由HCY或HCY酶轉(zhuǎn)化而篩選保持高親和力或提高親和力的突變HCY結(jié)合酶但是削弱催化活性。利用常用的技術(shù)和在C2c中敘述的方法插入、缺失或點(diǎn)突變可能被引入到核酸編碼的HCY結(jié)合酶中與結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的HCY結(jié)合酶用于突變，選擇的Hcy變異酶充分保留甚至增強(qiáng)了其結(jié)合Hcy或Hcy酶轉(zhuǎn)化直接產(chǎn)物的親和力，但削弱了其催化活性。例如，酶的變異位點(diǎn)是與下列物質(zhì)結(jié)合的位點(diǎn)輔酶，輔助因子，非Hcy底物，變異的酶催化位點(diǎn)，或上述的聯(lián)合位點(diǎn)。具體地表述，誘變胱硫醚β-合成酶，突變可能發(fā)生在胱硫醚β-合成酶的維生素B65′-磷酸或L絲氨酸或兩者同時(shí)變異(Kimetal.，Proc.Nat.Acad.Sci.，71(2)4821-4825(1974))。例如，人類胱硫醚β-合成酶的Lys119可能被刪除或誘變成一個(gè)中性或酸性的氨基酸殘基(Keryetal.，Biochemistry，38(9)2716-24(1999))。另外地具體表述中，蛋氨酸合成酶被誘變，可能被突變發(fā)生在蛋氨酸合成酶的VB12或5甲基四氫葉酸(5-CH3-THF)或兩者同時(shí)變異，例如人類蛋氨酸合成酶的Asp946，Glu1097，Arg1134，Ala1136，Gly1138，Tyr1139andTyr1189可能被刪除或突變成不同的氨基酸殘基，Asp和Glu被突變成中性或基礎(chǔ)殘基i.e，Arg被突變成中性或酸性殘基，Ala和Glu被突變成有大側(cè)鏈的中性殘基，Tyr被突變成沒有芳香族側(cè)鏈的殘基(Dixonetal.，Structure，4(11)1263-75(1996))。包含有下列氨基酸序列(在SEQIDNo.3中有表述)的大腸桿菌蛋氨酸合成酶用于Hcy的檢測(cè)His759Gly，Asp757Glu，Asp757Asn，或Ser810Ala(Amaratungaetal.，Biochemistry，35(7)2453-63(1996))。另外的具體表述，SAH水解酶被誘變，突變可能生成在SAH合成水解酶的NAD+或SAH水解催化酶，如5′-水解活性位點(diǎn)，或兩者同時(shí)變異。另外具體表述，甜菜堿Hcy甲基轉(zhuǎn)移酶被誘變，突變可能發(fā)生在甜菜堿Hcy甲基轉(zhuǎn)移酶的Zn.+甜菜堿位點(diǎn)上。例如人類甜菜堿Hcy甲基轉(zhuǎn)移酶的Cys299和Cys300可能缺失或突變成沒有SH-側(cè)鏈的氨基酸殘基，如絲氨酸(MillianandGarrow，Arch.Biochem.Biophys.，356(1)93-8(1998)).。另外的具體表述，蛋氨酶被誘變，突變可能發(fā)生在蛋氨合成酶的R′SH位點(diǎn)上，增加一個(gè)硫醇烷基或取代一個(gè)硫羥基(Itoetal.，J.Biochem.，(Tokyo)80(6)1327-34(1976))。一旦HCY結(jié)合酶發(fā)生預(yù)先設(shè)定的突變，則保留或增強(qiáng)對(duì)Hcy和Hcy酶直接轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的親和力，而削弱其催化活性，突變的HCY結(jié)合酶就可以用B章節(jié)敘述的包括基因重組，化學(xué)合成，或兼用二種方法制備，用基因重組的方法獲得突變的Hcy結(jié)合酶。b.變異的SAH水解酶和核酸編碼變異的SAH水解酶SAH水解酶存在于哺乳動(dòng)物，分子量大約180-190KD，包含有4分子的作為輔酶的緊密結(jié)合NAD+，酶的催化過程包括2個(gè)連續(xù)的反應(yīng)，伴隨著NAD+轉(zhuǎn)變成NADH，底物由3′氧轉(zhuǎn)變成3′酮；然后5′-水解生成Hcy和腺嘧啶Ado(Refsum，etal.，Clin.Chem.，31624-628(1985))。SAH水解酶C端非常容易被保存，包含有水解酶催化作用所必需的氨基酸殘基。最近檢測(cè)與底物類似物抑制劑混合的人類SAH水解酶的晶體結(jié)構(gòu)。SAH水解酶的X-線結(jié)構(gòu)表明最少20個(gè)氨基酸殘基直接或間接的與底物類似物抑制劑有關(guān)，氨基酸殘基的輔酶NAD+變異可以是位點(diǎn)的直接變異，此殘基直接或間接的與底物結(jié)合，直接影響其催化活性，變異的酶的基因序列可以與野生型的酶的序列比較，從而來(lái)確證此酶為所希望的變異的酶。假設(shè)這里是純化的變異的SAH水解酶，充分保留甚至增強(qiáng)它對(duì)Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化活性。具體地表述，變異的SAH水解酶結(jié)合NAD+的結(jié)合位點(diǎn)或催化位點(diǎn)發(fā)生了變異，或兩者均發(fā)生了變異，可以導(dǎo)致充分保留甚至增強(qiáng)它對(duì)Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化活性。另外具體地表述，變異型SAH水解酶削弱了5′端的水解活性，但保留了3′端的氧化活性。在其他的特異表型中，變異的SAH水解酶固定的結(jié)合SAH。具體的表述，變異的SAH水解酶的酶切速率大約或低于10.0mu.M，變異的SAH水解酶對(duì)SAH的酶切速率大約為或低于1.0mu.M。具體的表述，變異的SAH水解酶對(duì)SAH的酶催化活性大約或低于0.1S-。具體的表述，變異的SAH水解酶有一個(gè)或多個(gè)可插入，缺失或點(diǎn)突變的位點(diǎn)。更具體地說(shuō)，變異的SAH水解酶來(lái)源于SEQIDNo.1表述的氨基酸序列或者由SEQIDNo.2表述的核酸序列編碼的氨基酸但是包括下列一處或多處變異Phe302ofPhe302K，K186S，H301N，H353T，R343F，D190R，F(xiàn)82R，T157K，N181A，R431H和K426A的兩次變異。提供單獨(dú)的核酸片斷或者DNA，或者RNA，包括編碼變異的SAH水解酶的核酸序列，變異的SAH水解酶充分保留甚至增強(qiáng)它對(duì)Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化活性。具體地表述，獨(dú)立的核酸片斷編碼變異的SAH水解酶，其催化活性的削弱由于結(jié)合NAD+的結(jié)合位點(diǎn)或其催化位點(diǎn)發(fā)生了變異或兩者同時(shí)發(fā)生變異。具體地表述，變異型SAH水解酶，變異的SAH水解酶削弱了5′水解，活性；但仍保留3′端的氧化活性具體地表述，獨(dú)立的核酸片斷編碼變異型SAH水解酶，其固定的結(jié)合SAH。具體地表述，獨(dú)立的核酸片斷編碼變異型SAH水解酶，變異的SAH水解酶的酶切速率大約或低于10.0mu.M，變異的SAH水解酶對(duì)SAH的酶切速率大約為或低于1.0mu.M。具體地表述，獨(dú)立的核酸片斷編碼變異型SAH水解酶，變異的SAH水解酶對(duì)SAH的酶催化活性大約或低于0.1S-。具體地表述，獨(dú)立的核酸片斷編碼變異型SAH水解酶，變異的SAH水解酶有一個(gè)或多個(gè)可插入，缺失或點(diǎn)突變的位點(diǎn)。更具體地說(shuō)，變異的SAH水解酶來(lái)源于SEQIDNo.1表述的氨基酸序列或者由SEQIDNo.2表述的核酸序列編碼的氨基酸但是包括下列一處或多處變異Phe302ofPhe302K，K186S，H301N，H353T，R343F，D190R，F(xiàn)82R，T157K，N181A，R431H和K426A的兩次變異。進(jìn)一步還提供質(zhì)粒，包括編碼上述變異水解酶的核酸片斷。更具體地說(shuō)，此質(zhì)粒是一種表達(dá)載體包含有下列核酸編碼的序列a)啟動(dòng)子區(qū)域，b)變異的SAH水解酶，其充分保留甚至增強(qiáng)它對(duì)Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化活性。核酸編碼變異的SAH水解酶的序列與啟動(dòng)子相關(guān)，表達(dá)SAH水解酶。更具體地說(shuō)，此質(zhì)粒包括可選擇的標(biāo)記。本發(fā)明提供包含上述質(zhì)粒的重組宿主細(xì)胞。重組的宿住細(xì)胞可以是下列宿主細(xì)胞但不局限于細(xì)菌細(xì)胞，酵母細(xì)胞，真菌細(xì)胞，植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明提供制備變異的SAH水解酶方法。重組的宿主細(xì)胞可以在一定的環(huán)境中生長(zhǎng)，變異的SAH在其中通過細(xì)胞表達(dá)。表達(dá)的變異的SAH水解酶被分離或復(fù)原。另外變異的SAH水解酶，按照已知的技術(shù)制備，包括B部分的舉例中。上述的變異的SAH水解酶此酶充分保留甚至增強(qiáng)它對(duì)Hcy或SAH的親和力，但是削弱其催化活性可用于樣本中Hcy的檢測(cè)。3.使用變異的SAH水解酶檢測(cè)Hcy具體地表述，變異的Hcy結(jié)合酶在Hcy實(shí)驗(yàn)中使用的是變異的SAH水解酶，它保留或增強(qiáng)對(duì)Hcy和SAH的親和力，但是催化活性被削弱。這個(gè)實(shí)驗(yàn)下面具體表述。Hcy檢測(cè)系統(tǒng)可以降解Hcy，可以利用變異的SAH水解酶與Hcy的結(jié)合來(lái)定量或檢測(cè)，野生型的SAH水解酶使得Hcy轉(zhuǎn)化為SAH。如上面所述，使用底物捕獲技術(shù)來(lái)代替使用單克隆抗體來(lái)定量檢測(cè)(見，e.g.，U.S.Pat.No.5,885,767andU.S.Pat.No.5,631,127)。使用熒光標(biāo)記的捕獲目標(biāo)S-腺苷半胱氨以競(jìng)爭(zhēng)形式結(jié)合，變異的SAH用來(lái)捕獲底物。任何合適的標(biāo)記物的合適的定量檢測(cè)都可以使用底物捕獲方法。下面有舉例以微孔板形式的反應(yīng)；以及使用熒光標(biāo)記腺苷半胱氨酸的標(biāo)記舉例。具體地表述，SAH水解酶的催化活性由于變異的SAH水解酶的結(jié)合NAD+的位點(diǎn)或其催化位點(diǎn)發(fā)生了變異或兩者同時(shí)發(fā)生變異。具體地表述，變異的SAH水解酶削弱5′水解活性，但仍保留3′氧化活性。具體地表述，變異的SAH水解酶可以固定結(jié)合SAH。具體地表述，變異的SAH水解酶的酶切速率Km小于或等于為10.0.mu.M.，更具體地說(shuō)，變異的SAH水解酶對(duì)SAH的酶切速率大約或小于1.0.mu.。具體地表述，變異的SAH水解酶對(duì)SAH的酶催化活性大約或低于0.1S-1。具體地表述，變異的SAH水解酶有一個(gè)或多個(gè)可插入，缺失或點(diǎn)突變的位點(diǎn)。更具體地說(shuō)，變異的SAH水解酶來(lái)源于SEQIDNo.1表述的氨基酸序列或者由SEQIDNo.2表述的核酸序列編碼的氨基酸但是包括下列一處或多處變異Phe302，Phe302K，K186S，H301N，H353T，R343F，D190R，F(xiàn)82R，T157K，N181A，R431H和K426A的兩次變異。樣品和變異的SAH水解酶反應(yīng)前，必須預(yù)先用還原劑將氧化型Hcy轉(zhuǎn)化成還原型Hcy，還原劑如磷酸三丁酯(TBP)，β-ME(巰基乙醇)，二硫赤鮮醇(DTT)，二硫赤鮮糖醇，巰基乙酸，谷胱苷肽，Tris磷酸，腈硼氫鈉，NaBH4，KBH4和金屬離子。具體地表述，樣品和變異的SAH水解酶接觸反應(yīng)前，需要去除或降解游離的腺苷，腺苷通過腺苷脫氨酶，嘌呤核苷磷酸酶和黃嘌呤氧化酶被降解。具體實(shí)施例方式下面舉例說(shuō)明但是不僅僅局限于下面發(fā)明的范圍。例一準(zhǔn)備變異的SAH水解酶編碼核酸人類的SAH水解酶基因編碼(SEQIDNo.1)EcoRI作用重組復(fù)制表達(dá)質(zhì)粒PKK223-3(PharmaciaBiotech，Piscataway，N.J.)。質(zhì)粒PKK223-3包括強(qiáng)的TAC啟動(dòng)子，此啟動(dòng)子位于多克隆位點(diǎn)的上游，還包括強(qiáng)的rrnB核醣體終端，此終端位于下游，控制蛋白質(zhì)的表達(dá)。包含SAH水解酶基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄到E.coli單鏈JM109上(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)。SAH水解酶位點(diǎn)的直接變異通過下列兩種形式1)M13方法單鏈DNA變異2)PCP方法雙鏈DNA變異。單鏈DNA變異單鏈DNA變異是Tayloretal，NucleicAcidsRes.，138765-8785(1985)創(chuàng)建的方法，使用無(wú)活性的Ncil解開含硫基的DNA鏈。使用了Sculptor.TM.體外變異系統(tǒng)RPN1526(AmershamLifescience，UK)。pKK223-3質(zhì)粒包含包含有SAH水解酶野生基因，此質(zhì)粒準(zhǔn)備用于減弱堿性的方法中，此方法用Promega’sDNA純化試劑盒純化質(zhì)粒(WizardplusMinipreps，Promega，MadisonWis.)。純化的質(zhì)粒由限制性內(nèi)切酶水解，37℃孵育2小時(shí)，使PromegaDNA用PromegaDNA純化試劑盒通過瓊脂糖凝膠電泳得EcoRI切隔片斷。純化的EcoRI切隔片斷由T4DNA連接酶克隆到M13mp19DNA中(PharmaciaBiotechPiscataway，N.J.)。連接酶在One-phor-All緩沖液(10mMtris-Ac，pH7.5，10mMMg(Ac)2，50mMKAc；PharmaciaLKBBiotechnologyAB，Uppsala，Sweden)中4℃過夜。90.mu.l的TG1細(xì)胞與10.mu.l的M13在0℃孵育30分鐘，42℃孵育75秒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄到TG1細(xì)胞中(Stratagene，LaJolla，Calif.)。冷卻到0℃2分鐘，500.mu.l的2XYT加入到細(xì)胞中，37℃孵育10分鐘。200.mu.l未轉(zhuǎn)錄的TG1細(xì)胞于轉(zhuǎn)錄的TG1細(xì)胞混合，加入2.5ml的42℃的軟瓊脂中?；旌系募?xì)胞立即加入預(yù)熱的LB瓊脂盤中，37℃孵育過夜。噬菌體克隆株用于檢測(cè)SAH水解酶的插入，定位DNA的序列，從而限制酶的分析活性。選擇的噬菌體克隆株用于準(zhǔn)備單鏈DNA的模版的準(zhǔn)備。包含有SAH水解酶基因的M13噬菌體TG1細(xì)胞在3ml的2XYT界質(zhì)中孵育過夜。在30ml的2XYT中加入一滴對(duì)數(shù)成長(zhǎng)的TG1細(xì)胞。細(xì)胞孵育8小時(shí)并且不斷振搖。離心，收集上清液，即是純化的單鏈模版DNA。根據(jù)Amersham生命科學(xué)的操作程序進(jìn)行純化。點(diǎn)突變的引體通過CruaChem(Sterling，Va.)合成低聚核酸(15-30個(gè)堿基)，低聚核酸的順序預(yù)計(jì)用于補(bǔ)充包括變異位點(diǎn)的區(qū)域的順序，例如，Lys變異為glu426。用于引子的低聚核酸包含下列順序GGCCCCTTCGAGCCGGATCACTACCGC(SEQIDNo.63)，其中的GAG編碼glu，從而代替原始的AAG編碼lys。Oligonucleotides(15-30bases)weresynthesizedbyCmaChem(Sterling，Va.)。變異位點(diǎn)的選擇基因人類SAH水解酶的X線照射的底物結(jié)合位點(diǎn)和輔酶結(jié)合位點(diǎn)(Tumeretal.，NatureStructuralBiology，5369-376(1998))。氨基酸殘基例如Thr157，Asp131，His301，Lys186，Asn191，Glu156，Asp190，Phe362，Phe302，Asn181，His353，Glu59，Ser83，His55，Leu54，Cys79，His301，Arg343，Asp303，Leu344，Asn80，Asn346，Asp107和完整的C端殘基能夠成為變異的靶子(請(qǐng)看下列Table2的特殊變異發(fā)生表)結(jié)合輔酶的區(qū)域包括從Tyr193到Asn346的殘基。低聚核酸在水中被溶解濃度為5ng/ml。低聚核酸溶液在多聚核酸激酶的催化下5’端被磷酸化，磷酸化作用與下列物質(zhì)混合2.5ml的低聚核酸(5ng/ml)，3ml的One-phor-all10倍濃度的激酶緩沖液(PharmaciaBiotech)，21.5ml的水，2ml的10mM的ATP，1ml多聚核酸激酶(100000U/ml)(PharmaciaBiotech)。反應(yīng)混合液37℃孵育30分鐘，加熱到70℃10分鐘，滅活酶的活性。表2人SAH水解酶的核酸變異位點(diǎn)密碼子MutantMutagenicoligonucleotide改變SEQIDK186AGACTTCGTCACCGCCAGCAAGTTTGGGAAG.fwdarw.GCC64F302SAACATTGGACACTCTGACGTGGAGATCTTT.fwdarw.TCT65H301DTGTAACATTGGAGACTTTGACGTGGAGCAC.fwdarw.GAC66H353STGTGCCATGGGCTCCCCCAGCTTCGTGCAC.fwdarw.TCC67R343ACTGGCCGAGGGTGCGCTGGTCAACCTGCGG.fwdarw.GCG68D190AAAGAGCAAGTTTGCCAACCTCTATGGCGAC.fwdarw.GCC69F82AAGCTGCAACATCGCCTCCACCCAGGACTTC.fwdarw.GCC70N181DAACCTCTATGGCGACCGGGAGTCCCTCAAT.fwdarwGAC71R431ACCGGATCACTACGCCTACTGAGAATTCCGC.fwdarw.GCC72K426RTGTGATGGCTTCCGCCCGGATCACTACAAG.fwdarw.CGC73C195SAACCTCTATGGCTCCCGGGAGTCCCTCTGC.fwdarw.TCC74.sub..DELTA.432GATCACTACCGCTGATGAGAATTCGAGATC.fwdarw.TGA75在低聚核酸∶模版為2∶1的比例中的退火緩沖液中，5’-磷酸化低聚核酸DNA與單鏈DNA(M13噬菌體包含有野生的SAH水解酶基因)退火，退火反應(yīng)70℃孵育3min，然后37℃30min，然后轉(zhuǎn)到55℃微量離心試管中打碎，冷卻到室溫。退火混合液17ml，19mldNTPA(α-S)混合，加入1.5mlT7DNA，室溫10分鐘，37℃30分鐘，加熱70℃15分鐘，使其喪失活性停止反應(yīng)，在反應(yīng)液中加入T5核酸外切酶(2000單位)和核酸外切酶緩沖液37℃，30分鐘從而去除單鏈非變異的DNA。然后加入70℃的Ncil中15min，然后在37℃，90min基因組合非變異的單鏈。非變異的單鏈被加入16單位外切酶III消化，37℃孵育30min，失去活性。多聚切口的DNA，dNTP混合B，3.5單位的DNA聚合酶I和2.5單位的T4DNA連接酶加入反應(yīng)中，37℃孵育1小時(shí)。M13噬菌體包含有SAH水解酶基因，通過熱振搖方法轉(zhuǎn)入目的TG1宿主細(xì)胞中。10ml的變異的M13噬菌體加入90ml水中，與目的TG1細(xì)胞在冰中混勻40min，TG1細(xì)胞42℃振勻孵育45秒，立即冷卻到0℃，5min。轉(zhuǎn)錄的TG1細(xì)胞升到室溫，與200ml正在生長(zhǎng)期的非轉(zhuǎn)錄TG1細(xì)胞(象菌胎細(xì)胞一樣切斷)，加入3ml熔化的熱瓊脂，混勻，立即倒入在L-型盤子的細(xì)胞中，37℃過夜。用牙簽挑起菌落放入3ml的2XYT的試管中，混勻過夜，離心收集細(xì)胞。雙鏈DNAM13噬菌體使用PromegaDNA純化試劑盒純化(WizardplusMinipreps)。離心得到的上清液用于純化單鏈M13DNA。使用SEQ2.0(UnitesStatesBiochemical)的單鏈M13DNA發(fā)生變異。選擇雙鏈M13DNA包含正確的變異順序，用EcorI限制性內(nèi)切酶消化。EcorI限制性內(nèi)切酶包含有SAH水解酶基因，利用瓊脂糖電泳使用QlaquickGelExtractionkit清除法純化。純化的EcoRI片段使用T4連接酶克隆表達(dá)Pkk223-3載體，在10ml純化的變異插入DNA中，處理過的2ml的EcoRI和5’-脫磷酸Pkk223-3載體孵育10分鐘，在載體中以2∶1比例插入。連接酶反應(yīng)在包含0.01M的ATP的One-phore-All緩沖液中，16℃過夜。包含有SAH水解酶基因的連接載體通過熱振搖的方法轉(zhuǎn)入目標(biāo)E.ColiJM109細(xì)胞中。選擇抗氨芐青霉素的轉(zhuǎn)錄細(xì)胞。挑取耐氨芐青霉素菌株，在10ml含有35ml/mi的氨芐青霉素的2XYT界質(zhì)中，37℃生長(zhǎng)2小時(shí)，1mM的IPTG中誘變，37℃過夜生長(zhǎng)。離心收集細(xì)胞，加入0.8ml，50mM的Tris-Hcl，PH7.5的緩沖液中，含有2mM的EDTA的緩沖液中。細(xì)胞由于快速凍融而溶解。4℃，13500轉(zhuǎn)離心1小時(shí)，收集上清夜；通過SDS-PAGE分析表達(dá)SAH水解酶變異蛋白。大約分子量圍47000道爾頓的重蛋白帶即為SAH水解酶蛋白質(zhì)的表達(dá)。利用PCR技術(shù)變異方法使用ExSitePCR直接位點(diǎn)變異試劑盒(Stratagene，LaJolla，Calif.)利用PCR技術(shù)變異。ExSite方法使用增高的模板濃度，進(jìn)行小于10個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增。使用DpnI和PfuDNA聚合酶處理模板DNA，重新合成的DNA，雜合親代或重新合成的DNA混合物。DpnI外部消化甲基化的親代模板和雜交的DNA，PfuDNA聚合酶修飾末端產(chǎn)生鈍端PCR產(chǎn)物。末端修飾的PCR產(chǎn)物分子內(nèi)連接轉(zhuǎn)錄到E.coli細(xì)胞中。具體的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物如下描述在微量離心管中加入0.5pmol的DNA模板，2.5ml的10倍濃度的變異緩沖液，1ml的25mM的dNTP混合，每個(gè)啟動(dòng)子15pml，加水使容量達(dá)到24ml。在反應(yīng)混合液中然后加入1ml的ExsiteDNA聚合酶混合物(5U/ml)。反應(yīng)液用20ml的石油覆蓋，然后經(jīng)過7012次熱循環(huán)擴(kuò)增DAN。擴(kuò)增參數(shù)見表3。表3突變生成的循環(huán)參數(shù)(MutagenesisCyclingParameters)片段循環(huán)溫度(攝氏度)時(shí)間11944min.502min.722min.28941min.562min.721min.725min.3725min.擴(kuò)增后，反應(yīng)管放到冰中2分鐘，冷卻反應(yīng)降到低于37℃，在反應(yīng)管中加入1ml的DpnI限制酶(10IU/ml)和0.5ml的克隆PfuDNA聚合酶(2.5U/ml)，37℃孵育30分鐘，加熱到72℃，30分鐘終止擴(kuò)增。連接產(chǎn)物，在反應(yīng)管中加入100ml重蒸水，10ml10倍濃度的變異緩沖液，5ml10mM的rATP。10ml上述反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入1ml的T4DNA連接酶(4U/ml)，連接液37℃孵育1小時(shí)。2ml的連接DNA加入80ml的EpicurianColiXL1-Blue冰的上清夜細(xì)胞中，孵育30分鐘，然后42℃孵育45秒，冰中2分鐘。轉(zhuǎn)移細(xì)胞立即轉(zhuǎn)入LB氨芐青霉素瓊脂培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基其中有20ml10％X-galDMF和20ml100M的IOTG的水中，37℃過夜，選取蘭色菌落，此菌落含有變異的噬菌體。選取的菌落含有DNA序列，蛋白質(zhì)表達(dá)和底物捕獲的篩選如上所述。含有SAH水解酶的雙鏈PKK233-3用PromegaDNA純化試劑盒(WizardplusMinipreps)從50ml的E.coliJM109培養(yǎng)基中純化。純化的質(zhì)粒被包含有希望變異序列的PCP啟動(dòng)子退火。使用ExSitePCR直接位點(diǎn)變異試劑盒進(jìn)行缺失和插入變異。兩種變異或混合變異使用變異的或缺失DNA的模版來(lái)進(jìn)行，對(duì)于第二次變異或缺失使用M13的突變或PCP突變方法。鑒別底物捕獲SAH水解酶從可誘導(dǎo)表達(dá)SAH水解酶蛋白的菌株中萃取的細(xì)胞，利用FPLC系統(tǒng)進(jìn)行套色復(fù)制。使用0到1M的10mM的磷酸鈉洗滌。在同一或相近的時(shí)間中，洗滌的主要蛋白峰是野生型的SAH水解酶收集。收集了大部分的SAH水解酶(1-10.mu.g)與SAH(10mCi/mmole，200.mu.M)，30mM的DTNB室溫孵育5-30分鐘。反應(yīng)液通過一種分界限30000的；濾過膜離心過濾，過濾液經(jīng)1ml50mM的PH7.0的磷酸緩沖液洗滌，在412nm處測(cè)定HCY(酶活性)，膜上3H的放射活性的檢測(cè)，既在膜上有高放射活性，在與野生型酶類過濾液中有低的吸光度的變性水解酶被選為候選者。因?yàn)槠涮匦杂忻杆俾实臋z測(cè)活性下能夠結(jié)合酶。變異型SAH水解酶于SAH反應(yīng)低于(10mCi/mmole，200.mu.M)的酶切速率，酶活性低于0.1kat/s，這樣的酶可以有高量的表達(dá)(1-2L的大腸桿菌培養(yǎng)基)酶蛋白的純化結(jié)合SDA-PAGE來(lái)判斷。例2大批量表達(dá)和純化野生型和變異型的SAH水解酶純化IPTG誘變E.ColiJM109培養(yǎng)基在(PKK-223-3載體中結(jié)合SAH水解酶基因)的細(xì)胞萃取液與DEAE-cellulose(Sigma，St.Louis，Mo.)混合，與0.1M鈉磷酸，PH7.2，包含1mM的EDTA的緩沖液平衡細(xì)胞萃取液和DEAE-cellulose的混合液真空過濾，用3體積的BufferA沖洗。用氨基酸鹽沉淀過濾液。過濾蛋白用13000轉(zhuǎn)離心收集，重新溶于50mMPH7.2含1mMEDTA的磷酸緩沖液中。此蛋白通過DEAE-sephrose離子交換柱(2.5times，100cm)(PharmacialBiotech，Piscataway，N.J.)層染，然后用不通梯度濃度的NaclDEAE-Sepharose離子交換柱(2.5.times.30cm)沖洗，從DEAE-Sepharose離子交換洗脫的主要的蛋白峰通過SDS-PAGE檢測(cè)，大多數(shù)情況下純化后的反應(yīng)液在通過SDS-PAGE檢測(cè)應(yīng)該得到單一的蛋白帶，有些情況下可以分析其他小的蛋白帶，如果出現(xiàn)這種情況，應(yīng)重新通過DEAE-sephrose離子交換柱層染，從而保證得到純化的蛋白質(zhì)。SAH水解酶活性或3HSAH結(jié)合活性通過蛋白峰來(lái)確定。純化后SAH水解酶的保存純化的野生型和變異型SAH水解酶在5mM的PH7.2的PB中，4℃透析6小時(shí)。然后在液氮中冷凍，真空或凍干粉保存。凍干粉在-70℃保存可以穩(wěn)定2年。純化后的蛋白也可在20％的甘油中-20℃保存。對(duì)于野生型酶類，加入含有5mol腺嘌呤的20％的甘油，酶活性會(huì)更加的穩(wěn)定。酶活性的檢測(cè)直接檢測(cè)水解反應(yīng)來(lái)檢測(cè)SAH水解酶活性(Yuanetal.，J.BiolChem.，27128008-28016，1996).檢測(cè)SAH水解腺嘌呤和Hcy的能力。反應(yīng)產(chǎn)物Hcy由硫代的DTNB發(fā)生有色的變化，在412nm處檢測(cè)。SAH水解酶可以利用HPLC檢測(cè)(see，Yuanetal.，J.Biol.Chem.，26817030-17037(1993)。一個(gè)單位的酶活性定義為水解或合成1μmol的min/mgSAH酶量。親和力活性的檢測(cè)對(duì)于變異型酶，酶活性完全喪失，親和力使用濾膜分析平衡技術(shù)檢測(cè)，此檢測(cè)使用3H標(biāo)記的SAH和Spectrum5-cellEquilibrium分析儀(Spectrum，Houston，Tex.)。過濾膜為25000。例3試劑準(zhǔn)備準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的腺嘌呤和SAH類似物方法1ADO-5′-羧酸(Sigma，St.Louis，Mo.)來(lái)源于9-羥甲基蒽(HMA)(Fluka，Buchs，Switzerland)，加入50mgHOBT，在氮?dú)庵羞M(jìn)行干化學(xué)染色，加入300mgN-ethyl-N′(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride在300ml氯仿中，在加入5ml的三乙胺。上述液體在0℃放置30分鐘，加入200mgHMA、100ml氯仿，混合液室溫放置10分鐘，在氮?dú)饬髦懈稍?，殘?jiān)苡?0mlHPLC流動(dòng)液相中(甲醇∶水＝90∶10)。1ml的上述液體注入一個(gè)半-prepative柱中(Econosphere，C18，7.times.300mm，Alltech，Dearfield，Ill.)，使用平衡過濾方法，流速為2m/min，260nm為檢測(cè)峰，熒光分析在415nm和365nm，在260nm和熒光吸收峰處的物質(zhì)為HMA標(biāo)記的Ado-5′-酯。方法2Ado-5′caroboxylicacid和4-bromomethyl-7-methoxycoumarin(Br-Mmc)(Sigma，St.Louis，Mo.)以1∶3比例溶于乙酰乙酸(ethylacetate)中，25ml反應(yīng)液中加入2gK2CO3，然后冷卻，反應(yīng)液中加入到C18柱中(Econosphere，C18，7.times.300mm，Alltech，Dearfield，Ill.)HPLC分離，過濾，使用不通梯度甲醇洗脫20-100％的濃度，洗脫30分鐘，流速2ml/min。方法3腺苷-L-半胱氨酸和4-溴甲基-7-甲基氧化香豆素以1∶3比例溶于乙酰乙酸中，最后溶液為25ml(ca，1mgAdo-Cys)，加入200mg的K2CO3，此溶液在80℃回流1小時(shí)，冷卻，反應(yīng)液中加入到C18柱中(Econosphere，C18，7.times.300mm，Alltech，Dearfield，Ill.)HPLC分離，過濾，使用不通梯度甲醇洗脫20-100％的濃度，洗脫30分鐘，流速2ml/min。方法4Ado-Cys溶液PH9.0，1mmol/l的CB中，異硫氰酸熒光素(FITC)，溶于5ml的DMSO中，用PH9.0，1M的CB稀釋等體積的Ado-Cys和FITC，混勻，室溫溫育1小時(shí)。Ado-Cys-FITC結(jié)合物用C18標(biāo)記，用HPLC分離(Econsphere，C18，Alltech，Dearfield，Ill.)，過濾液在260nm處檢測(cè)，484nm，520nm用熒光檢測(cè)。流動(dòng)相是水和甲酚的不同梯度濃度溶液，從0到80％，35分鐘洗脫。微孔板上包被變異的SAH水解酶變異的SAH水解酶(F302S)包被于96微孔板上(DynexTechnologies，Chantilly，Va.)，每孔200μl，F(xiàn)302S水解酶20μg/ml，磷酸緩沖液50mmol/l，PH7.6，4℃過夜，倒空，用10mM的PBS(NaCL0.05％，0.05％的T-20)洗滌3次，排干。4℃保存?zhèn)溆?。?biāo)準(zhǔn)和化學(xué)試劑的準(zhǔn)備1.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線人白蛋白(FractionVpowder，Sigma)溶于PBS中，白蛋白的濃度于血漿中的濃度相同。10ml的白蛋白加入4ml的1％的TBP，室溫孵育15分鐘，經(jīng)過一定大小的(Sephacryl-S100，2.times.90cm)凝膠過濾，白蛋白濃度使用白蛋白濃度調(diào)整儀調(diào)整到于人血漿類似的濃度。L-Hcy的系列濃度已知，L-Hcy加入TBP處理人血漿白蛋白中的最終濃度為0-50μM，37度孵育1h后，L-Hcy結(jié)合的白蛋白每管中70ml，作為標(biāo)準(zhǔn)品，使用前-20℃保存。2.野生型SAH水解酶溶液野生型SAH水解酶溶液(20mU/50.mu.l)溶解于50mM磷酸緩沖液，PH7.2，1mMEDTA，0.25mMAdo和1mg/mlBSA.3.TBP溶液TBP(Sigma)溶于1％的DMF中。4.異硫氰酸熒光素溶液(FLAC)Br-Mmc-labeledAdo-Cys或FITC標(biāo)記的腺苷半胱氨酸溶于50mM磷酸緩沖液，PH7.2，濃度為0.5mM。5.SAH水解酶抑制劑稀釋液NeplanocinA，一種SAH水解酶抑制劑，腺苷脫氨酶的底物，溶于50mMPH7.2的PB中抑制劑溶液(50.mu.M)以1∶1.5使用。6.多酶溶液腺苷(0.2U/.mu.l)，核苷磷酸酶(0.2U/l)，黃嘌呤氧化酶(0.2U/.mu.l)溶解于50mM磷酸鹽緩沖液，PH7.2，所有的酶均來(lái)源于Sigma。7.洗液洗板液成分10mMPBS，pH7.2，，0.1MNaCl和0.05％Tween20。例4使用變異的SAH酶檢測(cè)血漿中的HCY檢測(cè)程序步驟1.HCY轉(zhuǎn)化為SAH微量離心管或未包被的96孔板中，50ul的血漿樣本加入20ulTBP和50ul稀釋液，25℃孵育15分鐘，加入20ul酶抑制劑，孵育10分鐘后加入無(wú)活性SAH水解酶。步驟2移去剩余的ADO和酶抑制劑。在步驟1的溶液中加入30ul的多酶稀釋液，室溫孵育15分鐘。步驟3使用變異的SAH水解酶誘捕SAH。150ul步驟2的溶液轉(zhuǎn)移到包被有變異的SAH水解酶的微孔板中，室溫孵育30分鐘，倒掉液體。步驟4，清洗液洗滌3遍，拍干。步驟5熒光標(biāo)記的Ado-Cys與變異的酶結(jié)合100ul熒光標(biāo)記的Ado-Cys或熒光標(biāo)記的Ado-5′酯加入到步驟4的微孔板中，室溫孵育20分鐘，清洗液清洗3次。步驟6檢測(cè)熒光標(biāo)記的Ado-Cys與變異的酶結(jié)合物。將200ulPH7.2，50mM的磷酸緩沖液加入到步驟4的微孔板中，使用熒光儀讀取(MolecularDevices，fmax)，依據(jù)吸光度血漿中Hcy的濃度，可以依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中查找。選擇的Hcy檢測(cè)有選擇的，Hcy檢測(cè)可以用于預(yù)先包被SAH于微孔板中，使用熒光標(biāo)記變異的SAH水解酶，去競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合檢測(cè)，下面是詳細(xì)闡述1.預(yù)先包被SAH在微孔板上。2.在PCL3中50℃環(huán)境下，通過激活SAH3羧基基團(tuán)，SAH與多聚賴氨酸結(jié)合，SAH-多聚賴氨酸結(jié)合物通過HPLC純化，然后溶于溶于0.1MPH9.6的碳酸緩沖液中，每孔加入300ul100g/ml的SAH多聚核酸溶液，37℃孵育6小時(shí)，10mMPBS，0.1MNaCL洗板3次，然后拍干，使用前保存于4℃。熒光標(biāo)記的變異SAH水解酶Fluorophore-labeledMutantSAHHydrolase變異的SAH水解酶(e.g.，F(xiàn)302S)特異性標(biāo)記在Cys421的一個(gè)非本質(zhì)的半胱氨酸殘基，他位于蛋白質(zhì)表層，不包括在底物的結(jié)合和催化位點(diǎn)。Cys421殘基是硫代活化基團(tuán)，不影響酶結(jié)合活性的情況下被修飾。硫代反應(yīng)探針例如7-diethylamino-3(4′-maleimidylphenyl)-4-methylcoumarin(CPM)能夠標(biāo)記蛋白。變異的SAH水解酶(F302S)(0.5mg/ml)，加入PH7.250mM的PB緩沖液中用于保護(hù)其他底物結(jié)合位點(diǎn)的硫基的腺苷2ml，共同孵育使其最后濃度為50mM，反應(yīng)液室溫孵育30分鐘，加入一定大小的分離柱中進(jìn)行分離凝膠過濾(SephacrylS-300，4.5mm.times.60cm)，去除腺嘌呤和多余的CPM。CPM標(biāo)記的F302S變異的SAH水解酶(2mg/ml)放入50mMPB緩沖液中-20℃保存，其中含有20％的甘油。野生型的SAH與變異的F302S酶切速率和催化活性比較如下表4表4野生型的SAH與變異的F302S酶切速率和催化活性比較typeSAH水解酶酶Km(SAH)Kcat(SAH)野生型7.9.mu.M3.8S.sup.-1F302S1.0.mu.M0.1S.sup.-1血漿中Hcy的檢測(cè)程序2步驟1，Hcy轉(zhuǎn)化為SAH微量離心管或未包被的96孔板中，50ul的血漿樣本加入20ulTBP和50ul稀釋液，25℃孵育15分鐘，加入20ul酶抑制劑，孵育10分鐘后加入無(wú)活性SAH水解酶。步驟2，移去剩余的ADO和酶抑制劑。在步驟1的溶液中加入30ul的多酶稀釋液，室溫孵育15分鐘。步驟3，競(jìng)爭(zhēng)性地SAH與變異的SAH水解酶。100ul步驟2的溶液轉(zhuǎn)入預(yù)先包被多聚賴氨酸-SAH結(jié)合物的微孔板中，加入150ul的熒光標(biāo)記的變異的SAH水解酶。室溫孵育30分鐘，用清洗液清洗3遍，拍干。步驟4檢測(cè)微孔板中熒光標(biāo)記的SAH水解酶的結(jié)合。200ul的10nM的磷酸鹽緩沖液加入步驟3中的微孔板中，在390nm和460nm處用讀板機(jī)(MolecularDevices，fmax)讀數(shù)。血漿中的Hcy的濃度依照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。序列表<110>北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司<210>SEQIDNO1<211>長(zhǎng)度432<212>類型PRT<213>人<223>人S-腺苷同型半胱氨酸水解酶蛋白MetSerAspLysLeuProTyrLysValAlaAspIleGlyLeuAlaAla151015TrpGlyArgLysAlaLeuAspIleAlaGluAsnGluMetProGlyLeu202530MetArgMetArgGluArgTyrSerAlaSerLysProLeuLysGlyAla354045ArgIleAlaGlyCysLeuHisMetThrValGluThrAlaValLeuIle505560GluThrLeuValThrLeuGlyAlaGluValGlnTrpSerSerCysAsn65707580IlePheSerThrGlnAsnHisAlaAlaAlaAlaIleAlaLysAlaGly859095IleProValTyrAlaTrpLysGlyGluThrAspGluGluTyrLeuTrp100105110CysIleGluGlnThrLeuTyrPheLysAspGlyProLeuAsnMetIle115120125LeuAspAspGlyGlyAspLeuThrAsnLeuIleHisThrLysTyrPro130135140GlnLeuLeuProGlyIleArgGlyIleSerGluGluThrThrThrGly145150155160ValHisAsnLeuTyrLysMetMetAlaAsnGlyIleLeuLysValPro165170175AlaIleAsnValAsnAspSerValThrLysSerLysPheAspAsnLeu180185190TyrGlyCysArgGluSerLeuIleAspGlyIleLysArgAlaThrAsp195200205ValMetIleAlaGlyLysValAlaValValAlaGlyTyrGlyAspVal210215220GlyLysGlyCysAlaGlnAlaLeuArgGlyPheGlyAlaArgValIle225230235240IleThrGluIleAspProIleAsnAlaLeuGlnAlaAlaMetGluGly245250255TyrGluValThrThrMetAspGluAlaCysGlnGluGlyAsnIlePhe260265270ValThrThrThrGlyCysIleAspIleIleLeuGlyArgHisPheGlu275280285GlnMetLysAspAspAlaIleValCysAsnIleGlyHisPheAspVal290295300GluIleAspValLysTrpLeuAsnGluAsnAlaValGluLysValAsn305310315320IleLysProGlnValAspArgTyrArgLeuLysAsnGlyArgArgIle325330335IleLeuLeuAlaGluGlyArgLeuValAsnLeuGlyCysAlaMetGly340345350HisProSerPheValMetSerAsnSerPheThrAsnGlnValMetAla355360365GlnIleGluLeuTrpThrHisProAspLysTyrProValGlyValHis370375380PheLeuProLysLysLeuAspGluAlaValAlaGluAlaHisLeuGly385390395400LysLeuAsnValLysLeuThrLysLeuThrGluLysGlnAlaGlnTyr405410415LeuGlyMetSerCysAspGlyProPheLysProAspHisTyrArgTyr420425430<110>北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司<210>SEQIDNO2<211>長(zhǎng)度2211<212>類型DNA<213>人<223>人S-腺苷同型半胱氨酸水解酶cDNActgaggcccagcccccttcgcccgtttccatcacgagtgccgccagcatgtctgacaaac60tgccctacaaagtcgccgacatcggcctggctgcctggggacgcaaggccctggacattg120ctgagaacgagatgccgggcctgatgcgtatgcgggagcggtactcggcctccaagccac180tgaagggcgcccgcatcgctggctgcctgcacatgaccgtggagacggccgtcctcattg240agaccctcgtcaccctgggtgctgaggtgcagtggtccagctgcaacatcttctccaccc300agaaccatgcggcggctgccattgccaaggctggcattccggtgtatgcctggaagggcg360aaacggacgaggagtacctgtggtgcattgagcagaccctgtacttcaaggacgggcccc420tcaacatgattctggacgacgggggcgacctcaccaacctcatccacaccaagtacccgc480agcttctgccaggcatccgaggcatctctgaggagaccacgactggggtccacaacctct540acaagatgatggccaatgggatcctcaaggtgcctgccatcaatgtcaatgactccgtca600ccaagagcaagtttgacaacctctatggctgccgggagtccctcatagatggcatcaagc660gggccacagatgtgatgattgccggcaaggtagcggtggtagcaggctatggtgatgtgg720gcaagggctgtgcccaggccctgcggggtttcggagcccgcgtcatcatcaccgagattg780accccatcaacgcactgcaggctgccatggagggctatgaggtgaccaccatggatgagg840cctgtcaggagggcaacatctttgtcaccaccacaggctgtattgacatcatccttggcc900ggtaggtgccagatggggggtcccggggagtgagggaggagggcagagttgggacagctt960tctgtccctgacaatctcccacggtcttgggctgcctgacaggcactttgagcagatgaa1020ggatgatgccattgtgtgtaacattggacactttgacgtggagatcgatgtcaagtggct1080caacgagaacgccgtggagaaggtgaacatcaagccgcaggtggaccggtatcggttgaa1140gaatgggcgccgcatcatcctgctggccgagggtcggctggtcaacctgggttgtgccat1200gggccaccccagcttcgtgatgagtaactccttcaccaaccaggtgatggcgcagatcga1260gctgtggacccatccagacaagtaccccgttggggttcatttcctgcccaagaagctgga1320tgaggcagtggctgaagcccacctgggcaagctgaatgtgaagttgaccaagctaactga1380gaagcaagcccagtacctgggcatgtcctgtgatggccccttcaagccggatcactaccg1440ctactgagagccaggtctgcgtttcaccctccagctgctgtccttgcccaggccccacct1500ctcctccctaagagctaatggcaccaactttgtgattggtttgtcagtgtcccccatcga1560ctctctggggctgatcacttagtttttggcctctgctgcagccgtcatactgttccaaat1620gtggcagcgggaacagagtaccctcttcaagccccggtcatgatggaggtcccagccaca1680gggaaccatgagctcagtggtcttggaacagctcactaagtcagtccttccttagcctgg1740aagtcagtagtggagtcacaaagcccatgtgttttgccatctaggccttcacctggtctg1800tggacttatacctgtgtgcttggtttacaggtccagtggttcttcagcccatgacagatg1860agaaggggctatattgaagggcaaagaggaactgttgtttgaattttcctgagagcctgg1920cttagtgctgggccttctcttaaacctcattacaatgaggttagtacttttagtccctgt1980tttacaggggttagaatagactgttaaggggcaactgagaaagaacagagaagtgacagc2040taggggttgagaggggccagaaaaacatgaatgcaggcagatttcgtgaaatctgccacc2100actttataaccagatggttcctttcacaaccctgggtcaaaaagagaataatttggccta2160taatgttaaaagaaagcaggaaggtgggtaaataaaaatcttggtgcctgg權(quán)利要求1.檢測(cè)樣本中同型半胱氨酸(Hcy)的方法，包括a)樣本與變異的S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶結(jié)合，SAH水解酶在核苷酸序列NO.1中明確描述其氨基酸順序，包含一次或多次選擇性的變異，Phe302突變?yōu)長(zhǎng)ys(F302K)，Lys186突變?yōu)镾er(K186S)，His301突變?yōu)锳sn(H301N)，His353突變?yōu)門hr(H353T)，Arg343突變?yōu)镻he(R343F)，Asp190突變?yōu)锳rg(D190R)，Phe82突變?yōu)锳rg(F82R)，Thr157突變?yōu)長(zhǎng)ys(T157K)，Asn181突變?yōu)锳la(N181A)，和兩次突變Arg431突變?yōu)镠is(R431H)andLys426突變?yōu)锳la(K426A)；b)檢測(cè)與變異的SAH水解酶結(jié)合的HCY，SAH；從而檢測(cè)樣本中的Hcy的含量。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在樣本與變異的SAH水解酶結(jié)合之前，樣本中的氧化型或結(jié)合型的Hcy需要轉(zhuǎn)化成游離型的Hcy。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中在樣本與變異的SAH水解酶結(jié)合之前，樣本中的游離型的Hcy需要轉(zhuǎn)化成SAH。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中樣本中的Hcy被野生型的SAH水解酶轉(zhuǎn)化成SAH。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的SAH與變異的SAH水解酶結(jié)合過程中存在著SAH水解酶催化抑制劑。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中SAH與變異的SAH水解酶結(jié)合過程中標(biāo)記SAH或其派生物或類似物，因此標(biāo)記的SAH數(shù)量競(jìng)爭(zhēng)性地抑制變異性SAH水解酶與樣本中的SAH數(shù)量的作用。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的標(biāo)記SAH衍生物或類似物是一種熒光標(biāo)記。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中變異的SAH水解酶是一種標(biāo)記變異的SAH水解酶。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中標(biāo)記的變異性SAH水解酶是一種熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記的變異的SAH水解酶。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的樣本是體液或生物組織。11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中體液應(yīng)從下列中選擇尿液，血液，血漿，血清，唾液，精液，糞便，唾液，腦脊液，淚液，粘液和羊水。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中的體液是血液。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中的血液樣本需要進(jìn)一步分離出血漿或血清。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中的生物組織應(yīng)從下列組織中選擇關(guān)節(jié)組織，上皮組織，肌肉組織，神經(jīng)組織，器官，腫瘤，淋巴結(jié)，動(dòng)脈和單獨(dú)的細(xì)胞。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中的標(biāo)記SAH或其衍生物或類似物是固定的。16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中的變異的SAH水解酶是固定的。全文摘要基于小分子捕獲技術(shù)研制生產(chǎn)同型半胱氨酸診斷試劑盒的方法，該方法使用基因突變酶與待測(cè)小分子物質(zhì)結(jié)合，這種基因突變酶稱為小分子捕獲酶，這些經(jīng)過突變、修飾的小分子捕獲酶保留甚至增強(qiáng)其對(duì)底物或待測(cè)小分子物質(zhì)的親和力，但是削弱其對(duì)底物或待測(cè)小分子物質(zhì)的親和力的催化、分解能力?；谛》肿硬东@技術(shù)研制生產(chǎn)同型半胱氨酸(HCY)診斷試劑盒的方法提供這種，也提供突變的S－腺苷同型半胱氨酸水解酶，特異性S－腺苷同型半胱氨酸(SAH)捕獲酶可以充分地保留甚至增強(qiáng)其對(duì)或S－腺苷同型半胱氨酸(SAH)的親和力，但是削弱了其對(duì)HCY或S－腺苷同型半胱氨酸(SAH)的催化能力。該方法尤其適用于小分子物質(zhì)，如無(wú)機(jī)離子，氨基酸，多肽，核苷，寡核苷酸，維生素，單糖，低聚糖，脂類，有機(jī)酸。文檔編號(hào)G01N33/68GK1570135SQ0314597公開日2005年1月26日申請(qǐng)日期2003年7月18日優(yōu)先權(quán)日2003年7月18日發(fā)明者余凱茜申請(qǐng)人:北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司