專利名稱：Sm33gi的突變酶gig138p及一種提高gi熱穩(wěn)定性的突變方案的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用蛋白質(zhì)工程的定點(diǎn)突變方法改良葡萄糖異構(gòu)酶技術(shù)領(lǐng)域。
葡萄糖異構(gòu)酶(Glucose Isomerase，簡(jiǎn)稱GI)，即木糖異構(gòu)酶(XyloseIsomerase，E.C.5.3.1.5.)。在體外一定條件下，該酶催化D-葡萄糖至D-果糖的異構(gòu)化反應(yīng)，它是工業(yè)上以淀粉制備高果糖漿的關(guān)鍵酶，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
從天然菌株分離純化得到的野生型GI早已商業(yè)化，并取得了巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。但是天然GI用于高果糖漿的生產(chǎn)還存在一定的局限性。中國(guó)《生物工程進(jìn)展》1993年第14卷第3期38頁(yè)指出GI在較高反應(yīng)溫度下的穩(wěn)定性還不夠理想，而異構(gòu)化反應(yīng)時(shí)，溫度越高，熱力學(xué)平衡越趨向于果糖方向。所以人們期望用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)GI進(jìn)行改造，提高其熱穩(wěn)定性，這將提高酶反應(yīng)速度、延長(zhǎng)酶壽命、增加反應(yīng)平衡過(guò)程中果糖的產(chǎn)量，以最終降低投資和生產(chǎn)成本、簡(jiǎn)化工藝流程。
GI是目前國(guó)際上公認(rèn)的建立完整的蛋白質(zhì)工程技術(shù)的最好模型之一。由于其重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和理論研究意義，美國(guó)、日本、英國(guó)、法國(guó)、比利時(shí)、荷蘭等發(fā)達(dá)國(guó)家，包括一些西歐和北美的大公司都在進(jìn)行著不同種屬來(lái)源GI的蛋白質(zhì)工程及其應(yīng)用研究。
在利用蛋白質(zhì)工程改良GI方面，已有數(shù)家機(jī)構(gòu)就不同菌株GI蛋白質(zhì)工程的技術(shù)方法或獲得的突變體申請(qǐng)了專利。例如1988年美國(guó)Cetus公司就銹赤鏈霉菌(S.rubiginosus)GI的一些突變體及提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的技術(shù)方法申請(qǐng)了國(guó)際專利PCT/US88/02765。他們報(bào)道了銹赤鏈霉菌GI的蛋白質(zhì)工程技術(shù)，提出了幾種加強(qiáng)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的理論方法，同時(shí)也提出了多種具體的改善該酶熱穩(wěn)定性的突變方案，但未見(jiàn)在該酶實(shí)施成功的具體實(shí)例；在荷蘭細(xì)菌遺傳公司(Gist-brocades)和比利時(shí)植物研究所(Plant Genetic Systems)等申請(qǐng)的專利EP89201892.0中，報(bào)道了數(shù)個(gè)密蘇里游動(dòng)放線菌(Actinoplanes missouriensis)GI的定點(diǎn)突變體及其制備過(guò)程，其中K253R是在提高GI熱穩(wěn)定性的眾多定點(diǎn)突變嘗試中、目前報(bào)道的唯一成功例子。在60℃、1M葡萄糖底物存在的條件下，它的熱失活半衰期比野生型酶提高了5倍，但在84℃、無(wú)底物的情況下，熱失活半衰期也只是野生型酶的1.1倍。國(guó)際專利PCT/GB89/00748報(bào)道了英國(guó)帝國(guó)理工學(xué)院的大衛(wèi)·布羅(Blow David)等人提出的上百個(gè)定點(diǎn)突變方案。到目前為止，他們根據(jù)這些方案在節(jié)桿菌NRRL B3728菌株(Arthrobacter strain NRRLB3728)GI進(jìn)行了大量具體試驗(yàn)，卻仍未見(jiàn)提高熱穩(wěn)定性成功的報(bào)道。
可見(jiàn)利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)獲得有意義突變體非常困難。這是因?yàn)榻?jīng)過(guò)自然界的長(zhǎng)期選擇，天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)已很具合理性，性質(zhì)已相當(dāng)完善，要想改良不容易。另外，蛋白質(zhì)作為整體發(fā)揮功能，其結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系目前還很不清楚，分子設(shè)計(jì)是蛋白質(zhì)工程的薄弱點(diǎn)。如何通過(guò)合理的分子設(shè)計(jì)來(lái)獲得熱穩(wěn)定提高的蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)工程技術(shù)中具有很大挑戰(zhàn)性的問(wèn)題。
國(guó)內(nèi)自六十年代也已開(kāi)展了葡萄糖異構(gòu)酶應(yīng)用于果葡糖漿生產(chǎn)的研究。中國(guó)《山東輕工業(yè)科技》1982年第2期1-8頁(yè)報(bào)道的賀家明等人1979年篩選得到的7號(hào)淀粉酶鏈霉菌M1033，是國(guó)內(nèi)在這方面最具應(yīng)用價(jià)值的工業(yè)菌之一，但用于工業(yè)生產(chǎn)，特別是用于生產(chǎn)55％果葡糖漿，其GI熱穩(wěn)定性還不夠理想。本發(fā)明組克隆了7號(hào)淀粉酶鏈霉菌M1033菌株GI(簡(jiǎn)稱SM33GI)基因，并于1993年測(cè)定了其全基因序列，發(fā)表于中國(guó)《生物工程學(xué)報(bào)》1994年第10卷第2期120頁(yè)；構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pTKD-GI，實(shí)現(xiàn)了該基因于大腸桿菌中的高效表達(dá)，見(jiàn)中國(guó)《高技術(shù)通訊》1993年3(7)9-12頁(yè)；同時(shí)還生長(zhǎng)了SM33GI的晶體，分階段測(cè)定了其2.5埃與1.9埃晶體結(jié)構(gòu)，該文將發(fā)表于1996年的中國(guó)《中國(guó)科學(xué)》雜志。這些工作為采用蛋白質(zhì)工程改造SM33GI提供了良好基礎(chǔ)。
本發(fā)明的目的是利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)SM33GI進(jìn)行改造，以獲得熱穩(wěn)定性和最適反應(yīng)溫度提高的有意義突變體酶GIG138P，同時(shí)提供一種獲得熱穩(wěn)定性提高的GI有意義突變體的定點(diǎn)突變方案。
本發(fā)明SM33GI的突變體酶GIG138P，其特征在于將SM33GI的138位甘氨酸(Gly)突變成了脯氨酸(Pro)。該突變體酶的制備方法是根據(jù)SM33GI的基因序列，設(shè)計(jì)并合成引入Pro138密碼子的定點(diǎn)突變引物，對(duì)SM33GI基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，測(cè)定DNA序列，鑒定出Gly138密碼子變?yōu)镻ro138密碼子的突變體，將突變體基因進(jìn)行表達(dá)，分離純化突變體酶GIG138P。
本發(fā)明獲得熱穩(wěn)定性提高的GI有意義突變體的突變方案，其特征在于將GI的138位Gly或某些GI中在同源性比較上相當(dāng)于SM33GI Gly138的Gly替換成Pro。所述“某些GI中在同源性比較上相當(dāng)于SM33GI Gly138的Gly”是指枯草桿菌(Bacillus subtilis)GI的Gly196、嗜熱硫化氫梭狀芽孢桿菌(Clostridiumthermohydrosulfuricum)GI的Gly188、嗜熱產(chǎn)硫梭狀芽孢桿菌(Clostridiumthermosulfurogenes)GI的Gly189和大腸桿菌(Escherichia coli)GI的Gly189。
SM33GI的晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定顯示，Gly138位于一段無(wú)規(guī)則卷曲中，將Gly138替換成Pro138后，Pro的吡咯烷環(huán)可以增加酶空間結(jié)構(gòu)的剛性。同時(shí)，通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)模型模擬可見(jiàn)，Pro的吡咯環(huán)側(cè)鏈剛好能夠充填Gly138由于無(wú)側(cè)鏈基團(tuán)而留下的空洞，使得整個(gè)分子結(jié)構(gòu)更加緊密、合理。結(jié)果GIG138P的熱失活半衰期比野生型GI提高了0.9--1.1倍，最適反應(yīng)溫度提高了10--12℃，比活與野生型酶相當(dāng)。可見(jiàn)它是熱穩(wěn)定性和最適反應(yīng)溫度同時(shí)獲得改善的有意義突變體。
在SM33GIG138P構(gòu)建成功，并確證其為有意義突變體之后，對(duì)已知的16種GI的氨基酸序列(可參見(jiàn)中國(guó)《生物工程進(jìn)展》1994年第14卷第3期第37頁(yè))進(jìn)行比較。
附

圖1是不同種族來(lái)源GI的氨基酸序列比較圖。圖中(1)為7號(hào)淀粉酶鏈霉菌M1033菌株(Streptomyces diastaticus No.7 strain M1033)；(2)為深灰色鏈霉菌S-41菌株(S.griseofuscus S-41)；(3)為鼠灰色鏈霉菌DSM40091菌株(S.murinus DSM40091)；(4)為橄欖產(chǎn)色鏈霉菌(S.olivochromogenes)；(5)為銹赤鏈霉菌(S.rubiginosus)；(6)為熱普通鏈霉菌DSM40444菌株(S.thermovulgaris DSM40444)；(7)為紫黑色鏈霉菌CBS409.73菌株(S.violaceoniger CBS409.73)；(8)為紫黑色鏈霉菌變種LMG7183菌株(S.violaceoruber LMG7183)；(9)為嗜熱高溫菌(Thermus thermophilus)；(10)為密蘇里游動(dòng)放線菌(Actinoplanesmissouriensis)；(11)為小瓶屬3876菌株(Ampullariella strain3876)；(12)為節(jié)桿菌NRRL B3728菌株(Arthrobacter strain NRRL B3728)；(13)為枯草桿菌；(14)為嗜熱硫化氫梭狀芽孢桿菌；(15)為嗜熱產(chǎn)硫梭狀芽孢桿菌；(16)為大腸桿菌。方框內(nèi)為活性中心區(qū)氨基酸，＂*＂標(biāo)出的氨基酸是在所有16個(gè)GI序列中保守的，＂#＂標(biāo)出的氨基酸為除了嗜熱高溫菌XI以外，在其他15個(gè)GI序列中完全一樣，數(shù)字表示該數(shù)字的最前一位數(shù)下的氨基酸在GI中的位序。
由附圖1可見(jiàn)，同源性部位相當(dāng)于SM33 GI138位的Gly在除嗜熱高溫菌以外的其他15種GI中全都保守，嗜熱高溫菌GI的同源性部位，即137位恰恰是Pro，而嗜熱高溫菌GI是這些GI中熱穩(wěn)定性和最適反應(yīng)溫度最高的。中國(guó)《生物工程進(jìn)展》1994年第14卷第3期36頁(yè)指出，由GI的晶體結(jié)構(gòu)比較可見(jiàn)，不同種屬來(lái)源的GI在其α-碳原子骨架的空間結(jié)構(gòu)上都具有高度的相似性。在多肽鏈中，Gly的結(jié)構(gòu)柔性較大，Pro的構(gòu)型自由度較小，比其他氨基酸殘基更適合位于β-轉(zhuǎn)角或無(wú)規(guī)則卷曲中，使得β-轉(zhuǎn)角或無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。對(duì)于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)銀行(PDB)可提供晶體結(jié)構(gòu)模型的其他幾種GI，如銹赤鏈霉菌GI、節(jié)桿菌NRRL B3728菌株GI等，晶體結(jié)構(gòu)模擬顯示Pro138在它們的結(jié)構(gòu)中也能產(chǎn)生類似于在SM33GI中的效果。
實(shí)施例1SM33GIG138P的制備及其性質(zhì)分析(1)對(duì)SM33GI基因進(jìn)行定點(diǎn)誘變，構(gòu)建并獲得突變體酶GIG138P。
步驟如下①合成寡核苷酸點(diǎn)突變引物根據(jù)SM33GI基因序列，設(shè)計(jì)將Gly138的密碼子改成Pro138的密碼子的寡核苷酸點(diǎn)突變引物，如5’-TACGTCGCCTGGCCCGGCCGCCGAGG-3’，采用DNA合成法進(jìn)行合成。
②構(gòu)建重組M13DNA將重組表達(dá)質(zhì)粒pTKD-GI和M13mp19 RF用EcoRI+SphI雙酶解，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分別從膠中抽提0.9kb和7.2kb片段，T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)染大腸桿菌XL1-blue。
③定點(diǎn)誘變采用雙引物法，步驟簡(jiǎn)述如下a.制備重組M13DNA的參U單鏈模板于大腸桿菌CJ236中完成；
b.磷酸化寡核苷酸點(diǎn)突變引物；c.將磷酸化點(diǎn)突變引物、通用引物與參U單鏈模板退火，進(jìn)行體外延伸與連接；d.轉(zhuǎn)染突變反應(yīng)液于XL1-blue感受態(tài)細(xì)胞。
具體過(guò)程可參見(jiàn)中國(guó)《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)》1995年27(5)470頁(yè)。
然后挑取噬菌斑，小規(guī)模抽提單鏈，測(cè)定DNA序列，鑒定出Gly138的密碼子變成Pro138的密碼子的突變體。
④表達(dá)突變體基因?qū)⑼蛔凅w基因克隆回原重組表達(dá)質(zhì)粒pTKD-GI，轉(zhuǎn)化大腸桿菌K38/pGP1-2，可采用中國(guó)《高技術(shù)通訊》1993年第3卷第7期第10頁(yè)所述的方法，培養(yǎng)表達(dá)出GIG138P。
⑤分離純化可采用中國(guó)《生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)》1995年27(5)470頁(yè)介紹的方法，用瑞典發(fā)瑪西爾(Pharmacia)公司產(chǎn)的DEAE-Sepharose FF和Sephacryl HR S-300，對(duì)上述大腸桿菌表達(dá)的酶進(jìn)行分離純化，獲得GIG138P純酶。
(2)測(cè)定SM33 GIG138P的性質(zhì)①熱穩(wěn)定性的測(cè)定將1mg野生型GI和GIG138P分別溶解于2ml 100mM MgCl2/50mMTris-HClpH7.0的緩沖液中，同時(shí)置80℃水浴中保溫，每隔30分鐘取樣100ul，用咔唑法測(cè)定殘余活力，得到如表1的數(shù)據(jù)。根據(jù)表1的數(shù)據(jù)，以殘余活力的百分?jǐn)?shù)的對(duì)數(shù)對(duì)時(shí)間作圖，得到GI的熱失活曲線。
附圖2為GI于80℃下的熱失活曲線圖，圖中橫坐標(biāo)代表保溫時(shí)間(小時(shí))，縱坐標(biāo)代表殘余活力百分?jǐn)?shù)(％)的常用對(duì)數(shù)。帶＂●＂的線為野生型GI熱失活曲線，帶＂▲＂的線為GIG138P的熱失活曲線，T1/2為熱失活半衰期。
由圖可見(jiàn)，野生型GI在80℃下的熱失活半衰期為105min，而GIG138P為207min，接近野生型GI的兩倍。
②最適反應(yīng)溫度的測(cè)定以含有0.5mg/ml GI(分別為野生型GI和GIG138P)、0.045MD-木糖、10mMMgCl2及100mM K3PO4(pH8.0)的0.5ml液體為反應(yīng)液，在30-90℃溫度范圍內(nèi)的不同溫度下保溫10分鐘，采用咔唑法測(cè)定酶催化D-木糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖的活性，所得數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。根據(jù)表2的數(shù)據(jù)以相對(duì)于最大活力的百分?jǐn)?shù)(％)對(duì)反應(yīng)溫度作圖。
附圖3表示反應(yīng)溫度對(duì)GI活性的影響，橫坐標(biāo)代表溫度(℃)，縱坐標(biāo)代表相對(duì)于最大活力的百分?jǐn)?shù)(％)，帶＂●＂的線為野生型GI，帶＂▲＂的線為GI G138P，由圖可求得野生型GI和GIG138P的最適反應(yīng)溫度分別約為71℃和82℃。
表1野生型GI和GIG138P在80℃保溫下的相對(duì)活力時(shí)間(小時(shí))0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5相對(duì)活力野生型GI 100 82.1 72.5 55.5 40.1 30.3 27.3 24.5 20.0 18.3(％) GIG138P 100 94.2 91.3 85.4 67.9 60.5 47.6 44.7 40.9 37.7Lg相對(duì)活力 野生型GI 2.0 1.91 1.86 1.74 1.60 1.48 1.44 1.38 1.30 1.26(％) GIG138P 2.0 1.97 1.96 1.93 1.83 1.78 1.68 1.65 1.61 1.57表2野生型酶與GIG138P在不同溫度下的相對(duì)活力溫度(℃)304050606570 75808590相對(duì)活力 野生型GI 18.5 22.1 39.6 67.1 91.0 100 95.9 82.7 72.8 63.6(％)GIG138P 13.8 22.2 30.1 49.1 60.7 80.8 87.7 100 97.2 84.5③酶比活的測(cè)定采用咔唑法，以D-葡萄糖為底物測(cè)得野生型GI和GIG138P的比活分別為8.53U/mg和8.04U/mg，無(wú)明顯差別。
由上述結(jié)果可知，本實(shí)施例制備的(GIG138P是在不影響酶活力的情況下、熱穩(wěn)定性和最適反應(yīng)溫度同時(shí)得以提高的有意義突變體酶。
實(shí)施例2SM33GI突變體酶GIG138P的晶體結(jié)構(gòu)模擬采用常規(guī)的靜置汽相擴(kuò)散法制備出適合于X射線衍射的SM33GI單晶，用SIEMENS X200B面探測(cè)器收集晶體的衍射數(shù)據(jù)，參考美國(guó)Brookheaven國(guó)家實(shí)驗(yàn)室蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)銀行(PDB)提供的、由喀洛(Carrell)等構(gòu)建的銹赤鏈霉菌GI的1.9埃分辨率晶體結(jié)構(gòu)模型，通過(guò)分析晶體密堆積及經(jīng)典晶體學(xué)R因子搜索，按I222空間群構(gòu)建單體的初始模型，應(yīng)用立體化學(xué)約束倒易空間最小二乘法(PROLSQ)，輔以差值付里葉電子密度圖人工分析對(duì)初始模型進(jìn)行調(diào)整和精化，最終獲得SM33GI的1.9埃晶體結(jié)構(gòu)模型(該模型將申請(qǐng)輸入PDB)。模型的具體構(gòu)建過(guò)程可參見(jiàn)1996年的中國(guó)《中國(guó)科學(xué)》雜志。
使用美國(guó)BIOSYM公司的Insight II圖像系統(tǒng)，于計(jì)算機(jī)屏幕上顯示SM33GI的1.9埃分辨率晶體結(jié)構(gòu)模型，發(fā)現(xiàn)Gly138靠近酶分子表面，位于一段無(wú)規(guī)則卷曲中，且與136位的活性氨基酸靠近。那么，將它替換成Pro則能增加SM33GI空間結(jié)構(gòu)的剛性。同時(shí)，利用Insinght II圖像系統(tǒng)進(jìn)行殘基置換，把Gly138置換成Pro138，記錄置換后的坐標(biāo)，將生成的GIG138P的坐標(biāo)用荷蘭格羅林根(Groningen)大學(xué)物理化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的GROMOS分子動(dòng)力學(xué)模擬軟件包進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，首先做400步的能量極小化，然后在300K溫度下做20皮秒(ps)的動(dòng)力學(xué)模擬。附圖4(a)為SM33GI的Gly138附近氨基酸空間分布的立體對(duì)圖，附圖4(b)為模擬Pro138取代Gly138之后的情況，圖中的線條表示分子骨架。由圖可見(jiàn)，人為將Gly138替換成Pro138，模擬GIG138P的分子結(jié)構(gòu)，Pro的吡咯環(huán)側(cè)鏈剛好能夠充填Gly138由于無(wú)側(cè)鏈基團(tuán)而留下的空洞，使得整個(gè)分子結(jié)構(gòu)更加緊密、更加穩(wěn)定。
實(shí)施例3銹赤鏈霉菌GI突變體酶G138P的晶體結(jié)構(gòu)模擬威特羅(Whitlow)等測(cè)定了銹赤鏈霉菌GI的晶體結(jié)構(gòu)(見(jiàn)美國(guó)《ProteinsStructure，F(xiàn)uction，and Genetics》1991年第9卷第153-173頁(yè))。利用Insight II圖像系統(tǒng)，顯示PDB提供的、由威特羅等構(gòu)建的銹赤鏈霉菌GI的1.6埃晶體結(jié)構(gòu)模型，發(fā)現(xiàn)銹赤鏈霉菌GI與SM33GI在空間結(jié)構(gòu)上很接近，它的138位也為Gly，位于與SM33GI相同位置的一段無(wú)規(guī)則卷曲中，Pro138同樣能增加它空間結(jié)構(gòu)的剛性。采用與實(shí)施例2相同的方法進(jìn)行銹赤鏈霉菌的突變體酶G138P的分子模擬，附圖5為模擬Pro138取代Gly138之后，銹赤鏈霉菌GI的Gly138附近氨基酸空間分布的立體對(duì)圖。從圖中可以看出，Pro138能夠產(chǎn)生類似于在SM33GI結(jié)構(gòu)中的效果。
實(shí)施例4節(jié)桿菌NRRL B3728菌株GI突變體酶G138P的晶體結(jié)構(gòu)模擬從節(jié)桿菌NRRL B3728菌株GI的氨基酸序列可知，它的138位也是Gly。1989年亨利克(Henrick)等人測(cè)定了該GI的晶體結(jié)構(gòu)(見(jiàn)美國(guó)《J.Mol.Biol》1989年第208卷129-157頁(yè))。同樣用Insight II圖像系統(tǒng)顯示PDB提供的節(jié)桿菌NRRLB3728菌株GI的2.5埃晶體結(jié)構(gòu)模型，并進(jìn)行該酶突變體酶G138P的晶體結(jié)構(gòu)模擬。發(fā)現(xiàn)該酶的Gly138也位于一段無(wú)規(guī)則卷曲中，那么Pro138同樣能夠增加其結(jié)構(gòu)剛性，同時(shí)結(jié)構(gòu)模擬證明，Pro138在節(jié)桿菌NRRL B3728菌株GI中能夠產(chǎn)生類似于在SM33GI結(jié)構(gòu)中的效果。
權(quán)利要求
1.一種7號(hào)淀粉酶鏈霉菌M1033葡萄糖異構(gòu)酶的突變體酶GIG138P，其特征在于所述GI之138位的甘氨酸(Gly)突變成了脯氨酸(Pro)。
2.一種7號(hào)淀粉酶鏈霉菌M1033葡萄糖異構(gòu)酶的突變體酶GIG138P的制備方法，其特征在于根據(jù)SM33GI的基因序列，設(shè)計(jì)并合成引入Pro138密碼子的定點(diǎn)突變引物，對(duì)SM33GI基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，測(cè)定DNA序列，鑒定出Gly138密碼子變?yōu)镻ro138密碼子的突變體，將突變體基因進(jìn)行表達(dá)，獲得突變體酶GIG138P。
3.一種獲得熱穩(wěn)定性提高的葡萄糖異構(gòu)酶有意義突變體的突變方案，其特征在于將其138位Gly或某些GI中在同源性比較上相當(dāng)于SM33GI Gly138的Gly替換成Pro；所述“某些GI中在同源性比較上相當(dāng)于SM33GI Gly138的Gly”是指枯草桿菌(Bacillus subtilis)GI的Gly196、嗜熱硫化氫梭狀芽孢桿菌(Clostridium thermohydrosulfuricum)GI的Gly188、嗜熱產(chǎn)硫梭狀芽孢桿菌(Clostridium thermosulfurogenes)GI的Gly189和大腸桿菌(Escherichia coli)GI的Gly189。
全文摘要
本發(fā)明利用蛋白質(zhì)工程的定點(diǎn)突變方法改良葡萄糖異構(gòu)酶，提供了一種獲得熱穩(wěn)定性提高的GI有意義突變體的突變方案，其特征在于將GI的138位Gly或某些GI中在同源性比較上相當(dāng)于SM33 GI Gly138的Gly替換成Pro，采用本方法獲得的SM33 GI的突變體酶GIG138P，其熱失活半衰期比野生型GI提高了0.9-1.1倍，最適反應(yīng)溫度提高了10-12℃，比活與野生型酶相當(dāng)，它是熱穩(wěn)定性和最適反應(yīng)溫度同時(shí)獲得改善的有意義突變體。
文檔編號(hào)C12N15/61GK1156182SQ9511278
公開(kāi)日1997年8月6日 申請(qǐng)日期1995年11月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月27日
發(fā)明者伍傳金, 滕脈坤, 崔濤, 牛立文, 王玉珍, 徐洵, 王淳, 朱國(guó)萍, 杭俊, 肖亞中, 劉兢, 朱學(xué)良 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)