專利名稱：：檢測遺傳突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測遺傳性變型的方法，包括與抗藥性、癌、遺傳功能障礙性疾病相關(guān)的遺傳性變型的方法。
背景技術(shù)：
：結(jié)合藥物治療或高活性抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)是治療人類免疫缺陷病毒(HIV)感染個體的主要方法。由于HAART可以將患者血液中的病毒復制抑制至檢測不到的水平，因此己顯著降低了HIV感染患者的發(fā)病率和死亡率(Eggeretal,BMJ315:1194-9(1997)，Palellaetal，NEnglJMed338:853-60(1998))。然而，對于HAART的反應經(jīng)常是易變的。有些患者反應良好，可以成功抑制病毒的復制，而其它患者在HAART之后不久就治療失敗了。來自HAART治療失敗患者的蛋白酶和反轉(zhuǎn)錄酶(RT)基因序列分析顯示對多種藥物的4元'〖生(Condraetal,JVirol70:8270-6(1996),LarderandKemp,Science246:1155-8(1989)，Johnsonetal，Top.HIVMed.13:125-131(2005))。這些突變林的生物功能已經(jīng)通過體外分析而證實，即將這些突變抹導入感染的分子克隆中并測定這些克隆對藥物的易感性(KellamandLarder,JVirol69:669-74(1995))。這些數(shù)據(jù)顯示遺傳改變是產(chǎn)生多種抗藥性(MDR)的基礎(chǔ)。HIV-1基因組是高度變化的，并且每個感染的個體包含大量在遺傳上相似但又不同的病毒變體(準種)。當治療患者體內(nèi)發(fā)生抗藥性時，己顯示至少某些病毒基因組不包含抗藥性突變。在含有抗性突變的病毒中，每個基因組中這些突變的數(shù)目是不同的。因此，抗藥性突變和治療效果之間的相互關(guān)系只能通過測定來自感染個體的大量的病毒群體中每個病毒基因組中的抗藥性突變的同一性、性質(zhì)和數(shù)目來充分了解。對于抗藥性機制的理解將推進更有效地開發(fā)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物、更好的治療方案以及更準確的療效預測。目前，兩種方法可用于一企測抗藥性突變的存在并預測對于新的HAART方案產(chǎn)生抗性的可能性(Petropoulosetal,AntimicrobAgentsChemother44:920-8(2000)，VanLaethemetal,JAcquirImmuneDeficSyndr22:107-18(1999))。然而，這兩種測試方法對檢測較小的抗藥性病毒群體的靈敏度很低，并且不能可靠的檢測野生型病毒中抗藥性病毒所占的百分比。此外，由于抗藥性突變是基于病毒群體進行檢測，因此這兩種測試方法都不適于連鎖分析，而該連鎖分析可以揭示對于理解抗藥性機制和預測治療效果所需的關(guān)鍵性信息。最近，開發(fā)了多種檢測較小的抗藥性群體的實時PCR方法(Charpentieretal，JVirol78:4234-47(2004),Hanceetal,JVirol75:6410-7(2001)，Metzneretal，JInfectDis188:1433-43(2003)，Metzneretal,Aids19:1819-25(2005)，Moheyetal,JClinVirol34:257-67(2005),Thelwelletal，NucleicAcidsRes28:3752-61(2000)，Whitcombeetal，NatBiotechnol17:804-7(1999))。但是這些測試方法每次僅能檢測一種抗藥性突變，這使得它們對于全部的抗藥性突變的分析的實用性較低。并且，對于HIV-1基因組中的高度遺傳變異性，很難設(shè)計能夠用來檢測大多數(shù)遺傳性變型的全部抗藥性突變?？寺y序方法己用于研究較小的抗藥性病毒群體、每個病毒基因組上抗藥性突變分布和大量病毒克隆的連鎖分析。雖然可以獲得全部擴增子的序列，但是該方法耗力、費時。該測試方法的靈敏度受分析過程中可用克隆的數(shù)量所限制，并且該方法受PCR擴增過程中不同病毒基因組或病毒基因組擴增子間的重組和相同分子的重復取樣影響。有限稀釋PCR或單基因組擴增法(SGA)能顯著地減少以上所涉及問題的可能性，但是其高成本阻礙了它在抗藥性突變的常規(guī)檢測中的應用(Palmeretal,JClinMicrobial43:406-13(2005))。己經(jīng)開發(fā)了高通量測序方法并有可能用于檢測抗藥性突變。皮升規(guī)模和多重聚合酶克隆測序方法(picoliter-scaleandmultiplexpolonysequencingmethod)能夠用于以成本效益好的方式測序病毒基因組(Marguliesetal,Natur6437:376-80(2005)，Shendureetal，Science309:1728-32(2005))。病毒基因組是由短的DNA片段(分別為200bp和20bp)裝配而成。因此，不能從單個病毒基因組獲得全部的抗性突變，并且連鎖分析不能使用通過兩種方法中任一方法所獲得的序列來進行。由于高水平的遺傳變異性，很難設(shè)計引物集來覆蓋可以包含全部抗藥性突變的Jw/基因。在這兩種方法中，從患者血漿中制備小量RNA分子的樣本很復雜(Rogersetal，Nature437:326-7(2005))。鑒于上述觀點，亟需開發(fā)能夠用于檢測較小的抗藥性群體(^0.01%)、同時分析幾萬個病毒基因組、使用有限的樣本在單分子水平鑒定所有主要突變、確定一個病毒基因組中存在的不同抗藥性突變的百分比和進行連鎖分析的方法。本發(fā)明涉及一種可以滿足以上所有要求的新型平行等位基因特異性序列測定方法(PASS)。它可用于研究多重抗藥性的機制，并且可以提供用來預測治療效果的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種檢測遺傳性變型的方法，包括與抗藥性、癌和遺傳功能障礙性疾病相關(guān)的遺傳性變型的方法。在一個特別的實施方案中，本發(fā)明涉及一種可用于檢測較小的抗藥性群體的測試方法，如病毒群體。本發(fā)明的目的和優(yōu)勢將從以下描述清晰體現(xiàn)。圖1A和1B。平行等位基因特異性序列測定方法(PASS)的圖示。(圖1A)將未修飾的5'端引物、Acrydite化的3'端引物、DNA模板和PCR試劑包埋于6%的丙烯酰胺凝膠中。由于在聚合反應過程中，Acrydite化的引物和聚丙烯酰胺凝膠共價偶聯(lián)而被固定，所以擴增的PCR產(chǎn)物積聚在DNA模板周圍并在擴增位點形成各自的點(聚合酶克隆(polony))。雙鏈DNA變性后，洗脫游離的DNA鏈，而從Acrydite化引物延伸的DNA鏈保留在凝膠中。然后將測序引物退火到單鏈模板上并用熒光標記的野生型或抗性堿基進行延伸。然后將凝膠用微陣列掃描儀掃描獲得圖像。(圖1B)將引物的3'端與抗藥性突變位點并置。在用熒光標記的核苷酸延伸引物后，通過摻入的熒光團能夠確定突變位點處的堿基身份。模板序列在底部顯示，M184V引物序列用下劃線標示。引物序列在上部顯示。加入的野生型(WT)堿基用Cy3標記并用綠色表示。摻入的突變堿基用Cy5標記并用紅色表示。圖2A-2C。通過PASS檢測小比率抗藥性基因突變位點(minordrug-resistancemutation)。按照標準的PASS測序方法，將野生型(WT)和突變型克隆混合。將這些聚合酶克隆用M184V引物進行序列測定，對于野生型堿基用Cy3-dATP標記、對于突變型堿基用Cy5-dCTP標記。首先獲得Cy3野生型通道圖像(圖2A),然后為Cy5突變通道(圖2B)。最后，將兩個圖像相互疊加從而在同一圖像中顯示突變型和野生型病毒的群體(圖2C)。圖3A-3C。通過PASS檢測小比率抗藥性群體。(圖3A)將E44D突變克隆(WEAU-E44D)和野生型克隆(WEAU-wt)按1:10連續(xù)稀釋進行混合。PCR擴增后，將這些聚合酶克隆用E44D引物進行測序，對于野生型堿基用Cy3-dATP標記(綠色)，對于突變石成基用Cy5-dCTP標記(紅色)。如圖3B顯示，比例為1:1000的突變型/野生型混合物的分子數(shù)增加了10倍，以便在更大的野生型病毒群體中更好地檢測稀少的抗性突變。PCR擴增后，將這些聚合酶克隆用E44D引物進行測序，對于野生型堿基用Cy3-dATP標記(綠色)，對于突變用Cy5-dCTP標記(紅色)。檢測小比率抗藥性群體的PASS分析的靈敏度(圖3C)。將在圖3A中顯示的對于每種野生型突變型比例的相同實驗重復進行6次。進行線性回歸分析并繪圖。誤差條代表平均值士SD。圖4A-4C。不同分子上多個抗藥性突變的檢測。將三個抗藥性突變(L90M、E44D和M184V)引入野生型WEAU;o/基因中。在PASS測定中，將野生型克隆(WEAU-wt)和三種抗藥性克隆(WEAU-E44D、WEAU-L90M和WEAU-M184V)按1:1:1:1進行混合。將這些聚合酶克隆使用E44D(圖4A)、M18々V(圖4B)和L90M(圖4C)引物進行連續(xù)性測序。如下延伸突變位點'E4斗D位點使用Cy5_dCTP(突變型)和Cy3-dATP(野生型)來延伸，M1MV位點使用Cy5-dGTP(突變型)和Cy3-dATP(野生型)來延伸，并且L卯M位點使用Cy^dATP(突變型)和Cy^dUTP(野生型)來延伸。為更好觀察，顯示出每個圖像中的小區(qū)域。用編號箭頭指示每個克隆中的代表性聚合酶克隆。在三個圖像中E44D、M184M、L90M和野生型克隆的顏色模式分別為紅色-綠色-紅色(l)、綠色-紅色-紅色(2)和綠色-綠色-綠色(3)，以及綠色-綠色-紅色(4)。圖5A刁C。通過序列PASS分析(sequentialPASSassay)測定相同的病毒基因組中的主要抗藥性。在PASS測定中以WEAU-wt克隆為沖莫板并用Cy3或Cy5標記的dNTP對聚合酶克隆進行測序。對于同一種聚合酶克隆，使用對于22個主要抗藥性突變位點的不同測序引物進行連續(xù)探測。在同一聚合酶克隆中，當一個新的引物退火結(jié)合到該模板上之前，于45。C在曱酰胺中變性去除每個測序引物。根據(jù)藥物種類對結(jié)果進行分組。圖像上部的數(shù)目顯示PASS測序的序列。圖像的底部顯示每個突變位點。圖6A-6G。不同HIV-1亞型和重組體中單堿基突變的檢測。通過PASS分析27個HIV-1亞型或重組體分子克隆。它們?yōu)?個A亞型、8個B亞型、5個亞C型、3個D亞型、1個F亞型、2個G亞型、1個H亞型、2個CRF01—AE、1個CRF04一cpx和2個其他的重組體。將這些聚合酶克隆用Cy3-dCTP的E44D引物進行測序。圖7A和7B。通過連續(xù)稀釋目標分子確定PASS分析的敏感度。將WEAU-wt分子(lOO,OOO、10,000、l，OOO、100和IO)包埋于每片凝膠中(圖7A)。PASS檢測的實際基因組的數(shù)目在括號中顯示。PCR擴增后，將這些聚合酶克隆使用Cy5-dATP的E44D引物進行序列測定。當使用的分子數(shù)為10,000或更多時，許多點有彼此融合的趨勢并難以計數(shù)；而當使用的分子數(shù)小于10,000時，點易于準確計數(shù)。當測試中使用1個拷貝或沒有拷貝加入時，未檢測出聚合酶克隆(數(shù)據(jù)未顯示)。箭頭指示出在IO個分子的圖像中檢測到的2種聚合酶克隆。本試驗重復進行6次。進行線性回歸分析并繪圖(圖7B)。誤差吝代表平均值土SD。當分析100,000或更多分子時，難以準確計數(shù)點的數(shù)量。因此，未將他們包括在對分析法靈敏度的估計中。由于Acrydite修飾的引物固定于丙烯酰胺凝膠中，并且PCR在丙烯酰胺凝膠中于固相狀態(tài)下進行，因此在PASS分析中未將每個預期的分子檢出并不令人驚訝。圖8A和8B?；颊哐獫{樣本中多重抗藥性突變的檢測。(圖8A)PASS分析的患者血漿樣本包括之前從未治療過的患者(未治療組(naive))、曾經(jīng)治療過但目前未進行任何治療的患者(治療經(jīng)歷組)或者目前治療方案失敗的患者(失敗組)。從140(il血漿中提取RNA,取等同于14pi血漿的cDNA用于每個PASS測定。用Cy5-dGTP(野生型，紅色)和Cy3-dATP(突變型，綠色)測定該M184V突變位點。箭頭指示小比率抗藥性病毒或者野生型病毒。(圖8B)用PASS分析來自治療失散患者200372的血漿樣本的12個抗藥性突變位點。同一種聚合酶克隆使用12個不同的測序引物進行連續(xù)性檢測。當新的引物退火結(jié)合到相同的模板上之前，于45。C在曱酰胺中將每個測序引物通過變性去除。在4個PI(蛋白酶抑制劑)突變位點(M461、G48V、D30N和184V)、3個與核苷抗性有關(guān)的RT位點(V1181、E44D和K65R)和2個與NNRTI(非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑)有關(guān)的RT位點(V106A和K103N)未檢測出抗藥性突變。然而，在2個PI抗性突變位點(L90M和V82A)和RT中的M184V位點檢測到抗性。所有突變位點中未發(fā)現(xiàn)野生型病毒。該患者曾經(jīng)接受過其它治療方案，包括蛋白酶抑制劑方案，這有可能解釋了PI突變的存在。結(jié)果根據(jù)藥物種類進行分組。每個突變位點在圖像底部顯示。圖9A-9D。通過PASS檢測患者血漿樣本中抗藥性突變。從140血漿中提取RNA,取等同于14pl血漿的cDNA用于每個PASS測定。用PASS分析來自治療失敗患者200369的血漿樣本的12個抗藥性突變位點。對同一片凝膠使用12個不同的測序引物進行連續(xù)性檢測。顯示的圖像包括抗性突變(LIOOI、K103N和M184V)和一個具有代表性的K65R位點野生型圖像。圖像的上部顯示小比率抗性突變?nèi)后w所占的百分比。每個突變位點在圖像底部顯示。圖10。突變的分布。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于檢測個體基因組(如，病毒或癌細胞基因組)中的突變(如，'MDR突變或癌相關(guān)突變)的平行等位基因特異性測序方法(PASS)。該方法包4舌聚合酶克隆牙支術(shù)的應用(Mitraetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:5926-5931(2003);Zhuetal，Science301:836-838(2003))。該方法的靈敏度適于在突變基因組數(shù)很低(如僅存在像6個這么少的突變基因組拷貝時)或者在樣本中突變基因組僅占全部基因組拷貝總數(shù)的極少比例(例如，像大約0.01%這么低)時檢測突變。例如，依據(jù)本發(fā)明可以同時分析幾十萬的病毒基因組并可通過相同分子的多個突變位點的連續(xù)探詢(sequentialinterrogation)而確定個體分子中的主要突變位點。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種在大量核酸模板中(如，單鏈或雙鏈DNA)(如，來自抗藥性病原體或者突變的癌基因組)檢測出突變或者核苦酸修飾的方法，該方法包括i)在使修飾的擴增引物固定于(例如，共價附著于)半固體支持物中的條件下，將多個核酸模板和修飾的3'擴增引物或修飾的5'擴增引物包埋于(如，灌制(casting)于)該半固體支持物中；ii)將由步驟(i)得到的半固體支持物與PCR成份(如，聚合酶、dNTPs、未修飾的5'或者3'擴增引物和緩沖液)接觸(如，用其覆蓋)；iii)在使修飾和/或未修飾的擴增引物雜交至核酸模板以形成與引物結(jié)合的模板(primedtemplate)的條件下，處理來自步驟(ii)的組合物并在半固體支持物里進行預處理模板的PCR擴增，其中該擴增的雙鏈擴產(chǎn)物集聚于模板周圍；iv)將雙鏈擴增產(chǎn)物變性并去除(如，洗脫)未固定到半固體支持物中的單鏈；.v)將測序引物雜交到步驟(iv)所得的己固定的單鏈上，并在至少2種帶有不同可探測標記物的核苷酸存在下，進行雜交測序引物的延伸，其中之一的核苷酸在固定化單鏈含有突變或核苷酸修飾時結(jié)合到延伸產(chǎn)物中，且其它核苷酸在固定化單鏈不含突變或修飾核苷酸時結(jié)合到延伸產(chǎn)物中(如，其中之一的標記核苷酸與突變或修飾的核苦酸互補，而其它標記核苷酸與存在于野生型中的核苷酸互補)；以及vi)檢測步驟(v)所得的測序引物的延伸產(chǎn)物，從而能夠確定包含突變或者修飾核苷酸的測序引物的延伸產(chǎn)物的百分比(和模板的百分比)。根據(jù)本方法，可以使用例如標準操作程序從取自患者的含病毒生物樣本(組織或者體液(如血漿、唾液或者血細胞樣本))來提取病毒RNA或DNA?？蓪⑻崛〉腞NA反轉(zhuǎn)錄并分離所得的cDNA，例如，使用標準操作程序。然后可將該cDNA或者直接提取的DNA按以下描述進行PASS測定。將未修飾的5'引物、修飾的3'引物、DNA模板和擴增試劑(如PCR試劑)包埋于半固體支持物中(如，丙烯酰胺凝膠)-(或者，可以使用修飾的5'引物和未修飾的3'引物)。由于在聚合反應過程中，修飾的引物(如Acrydite化的引物)能夠結(jié)合到支持物中而固定，該擴增產(chǎn)物(如PCR產(chǎn)物)會積聚在cDNA模板的周圍，并在該擴增的位點形成單獨的點(聚合酶克隆)。擴增后，將雙鏈DNA變性(例如，按照標準的流程，如70%的曱酰胺)并且將游離的DNA鏈去除(如洗脫)。僅錨定的DNA鏈保持仍與支持物相連接。隨后可將測序引物退火結(jié)合到單鏈模板上，并使用標記的(如熒光標記的)野生型或抗性堿基進行延伸。然后可掃描支持物而獲得圖像。例如，當使用熒光標記的核苷酸延伸引物時，突變位點堿基的鑒別可以通過嵌入的核苷酸和最終形成的熒光團(或其他標記)來測定。盡管在以下實施例中由于所使用的儀器，僅使用了兩種焚光染料測定野生型和突變型堿基，但是藍色激光的添加允許檢測出用不同的熒光染料標記全部四種可能的堿基(Shendureetal,Science309:1728-1732(2005))。如以下實施例中所描述，在變性之后可以去除前一個測序引物，然后可連續(xù)使用不同的測序引物直到測定出所有的預期突變。本發(fā)明的測序方法比常規(guī)的基因型和表型分析的敏感度可以高例如200-2,000倍(根據(jù)對小比率抗性病毒群體的檢測)(如，0.1%0.01%比20%)。因此，它能更準確的預測治療效果。由于使用PASS測定法確定病毒基因組的實際數(shù)量，在每次測定中的聚合酶克隆總數(shù)也可以用于評估病毒的載量，因此使得醫(yī)生能夠評估藥物治療的效力和預后。在該方法中，可將病毒cDNA或病毒DNA分子直接導入支持物中(如，半固體如丙烯酰胺凝膠)，并在單鏈分子水平上進行擴增。因此可以完全消除PCR反應過程中通過重組或重復取樣而產(chǎn)生的人為序列(artifactsequence)。在測定了每個單獨的病毒基因組上所有的抗藥性突變之后，可知每個病毒基因組中存在的抗性突變、每個病毒基因組包含的突變的數(shù)量和含抗性突變的病毒基因組(在每次測序中的數(shù)以十萬的病毒基因組中)所占的百分比。由于在單鏈分子上獲得了所有的抗性突變，可使用獲得的數(shù)據(jù)進行連鎖分析(圖4和IO)來確定MDR機制，并通過分析患者的連續(xù)性樣本而確定在抗藥性中'單一或簡單MDR病毒間重組的作用。HIV感染的患者體內(nèi)的平均病毒載量大約為每毫升1()S個RNA拷貝。例如，如果使用140pl當量的血漿(280iil血漿用于RNA提取，其中一半用于PASS測定)，在每次測定中存在大約14,000個RNA拷貝。由于PASS測定的檢測率為16%(圖5)，每次分析可以;險測到2，520個聚合酶克隆。因此，PASS測定方法良好地適合于大多數(shù)患者的血漿樣本的分析。甚至當病毒載量高達每毫升106個RNA拷貝時，一次分析可以進行25，200個病毒拷貝中的抗藥性突變的檢測，因為該分析可以在50,000個分子中檢出l-10個分子(圖7)。當病毒載量太低時，可對病毒樣品進行濃縮，如從用于PASS測定的大量血漿來濃縮(如，通過超速離心)。測定法也可用于檢測生物樣本中傳染劑的存在(如，病毒或細菌傳染劑)和/或牙企測HBV、HCV或其他的傳染劑(如結(jié)核分枝4干菌0^cok"en'Mmft^e/rw/ow;)(TB))中的抗藥性突變。而且，PASS測定法可以用于檢測CTL(細胞毒性T淋巴纟田胞)和中和抗體逃逸突變(neutralizingantibodyescapemutation)。除以上所述，本發(fā)明也可應用于檢測來自癌癥患者的樣本中的突變或曱基化的核苷?；虮磉_序型分析(gene-expressionprofiling)可用于腫瘤分級和測定癌癥患者的預后(Hoheisel，Nat.Rev.Genet.7:200-210(2006);Schenaetal,Science270:467-470(1995);Endohetal,J.Clin.Oncol.22:811-819(2004);Lossosetal,N.Engl,J.Med.350:1828-1837(2004);Chenetal,N.Engl.J.MeA356:11-20(2007))。宿主基因中某些突變可以導致癌癥的產(chǎn)生。迄今為止，已經(jīng)將許多突變與能夠?qū)е履[瘤形成的不受控細胞生長相關(guān)聯(lián)(如己報道了與乳腺癌相關(guān)聯(lián)的突變)。也已經(jīng)報道了對某些基因或啟動子的曱基化能顯著的影響癌癥的發(fā)展。攜帶癌癥相關(guān)的突變或曱基化的核苷的腫瘤細胞僅占活檢組織中總細胞數(shù)的一部分；癌細胞的高百分比說明了更高的侵襲性或不良的預后。因此，關(guān)鍵是能夠檢測異源癌樣本中低百分比的突變或曱基化的核苷。'最近，使用大規(guī)模的并行皮升反應器序列測定技術(shù)，在非小細胞肺癌里的表皮生長因子受體基因(EGFR)中檢出了0.2。/。的突變(Thomasetal,Nat.Med.12:852-855(2006))。該方法有利于為復發(fā)患者選^^首期的治療方法和靶向性抑制劑。此處所述PASS測定法，對稀少突變抹的檢測敏感度為0.01%，它能更有效地檢測異源癌樣本中較低頻率的突變或甲基化核苷。來自個體的活檢組織、血液或排出物(如尿液、糞便或粘液或漿液分泌物(唾液)等)可用于基因組DNA的提取。然后可將這些DNA消化成較小片段用于檢測癌癥相關(guān)的突變或通過亞硫酸氫鈉處理來修飾用于檢測曱基化核苷(Fisheretal，LungCancerEpubaheadofprintDecember28，2006;Tomiietal,Int.J.Cancer120:566-573(2007))。如本文所述，對于標準PASS測定，可將處理過的DNA包埋于聚丙烯酰胺凝膠中，并進行PASS分析來檢測稀少的癌癥相關(guān)性突^或曱基化核苷。該方法可用于癌癥的診斷和預后，以及為更好的看護患者而選擇首期治療方法?？蓞⒁奤SPs6,432,360、6,485,944和6,511,803，和美國專利申請Nos.20030207265、20030124594、20020127552、20060014167、20020120127、20030215856和20020120126中對聚合酶克隆擴增的詳細描述)。(也可參見Butzetal，BMCBiotechnology3:11(2003);MitraandChurch,NucleicAcidsResearch27(24):e34(1999);USP5,958,698、USP5,616,478;Samatovetal，NucleicAcidsResearch33(17):el45(2005);Samatovetal，AnalyticalBiochemistry356:300-302(2006);Chetverinaetal,BioTechniques33:150-156(2002);Chetverinaetal,AnalyticalBiochemistry334:376-381(2004)。)實施例實-險細節(jié)我秀擔^f^/^的賴務。將包含最多抗藥性突變位點的部分戶/基因從幾乎全長HIV-1克隆WEAU.A1擴增。通過重疊PCR方法，將E44D、M90L和M184V突變引入。然后將該野生型(WEAU.wt)和突變型PCR產(chǎn)物(WEAU.E44D、WEAU.M90L和WEAU.M184M)直接克隆入pSTBBlue載體(Novagen，Madison,WI)中。通過序列測定確iUl些抗藥性突變。對于示蹤實驗，突變型和野生型克隆以不同的比例(高于104)進行混合。通過NanoDrop分光光度計測定質(zhì)粒DNA的濃度，基于DNA濃度和質(zhì)粒長度(bp)計算每個DNA樣本中分子的數(shù)目。戎,處理。將聚四氟乙烯涂覆的玻璃載片(Eriescientific,Portsmouth,NH)暴露于PCR通風櫥(PCRhood)中的紫外光15分鐘，接著使用結(jié)合溶液(0.02%冰醋酸和0.40/o結(jié)合鹽水(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ))處理1小時。然后將載片用水沖洗3次，乙醇沖洗2次，并在PCR通風櫥里干燥40分鐘。將處理過的載片儲存于真空干燥器中。'凝魔滲斜。將載片和蓋片暴露于PCR通風櫥中的紫外光15分鐘。在載片上的橢圓形空間里填充20!il凝膠混合物，該混合物于6%聚丙烯酰胺凝膠中含有1fiM的Acrydite修飾的反向引物、模板(1-18)i1)、0.3%二烯丙基酒石酰胺、5%Rhinohide、0.1%APS、0.1%TEMED、0.2%BSA(牛血清白蛋白))。使該凝膠混合物聚合30分鐘。其后用刀片去除蓋片。使用0.05。/。的吐溫-2d溶液沖洗載片15分鐘，然后完全干燥。凝屋力PC7{增。PCR試劑的擴散混合物中含有1正向引物、0.1%吐溫20、0.2%牛血清白蛋白、lxPCR緩沖液、250)LiMdNTP混合物、3.3個單位的JumpstartTaqDNA聚合酶(Sigma,St.Louis,MO)和水(補足20pl)。一旦將混合物加到凝膠的中央，立即用蓋片覆蓋凝膠，并在室溫放置10分鐘。將凝膠與蓋片用SecurSeal槽(GraceBio-Labs，Bend,OR)密封。每個槽用640^的礦物油填充。將含有蛋白酶和部分RT基因的大約1.1kb的po/基因片段用引物PAF15'-CTTTGGCAACGACCCCTCGTCACA-3'(2265-2288，HXB2)和PAR25'-CCTGCATAAATCTGACTTGCCCAATTCAA-3'(3367陽3339)來擴增。該PCR產(chǎn)物包含對于核香類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)、非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)和蛋白酶抑制劑(PI)的所有主要抗性突變。用PTC-200熱循環(huán)儀(PTC-200ThermalCycler;MJResearch,Hercules,CA)，按照下列反應條件進行聚合酶克隆PCR:94。C反應3分鐘；94。C反應30秒、56。C反應45秒和72°C反應3分鐘的循環(huán)共65個；72。C反應6分鐘。卓^M差延/^^巧。PCR擴增以后，將載片于科普林缸(Coplinjar)中用。烷浸泡15分鐘，并用洗液IE(10mMTris-HCIpH7.5、50mMKCl、2mMEDTApH8.0和0.01%TritonX-100)沖洗4次。接著將載片在曱酰胺變性溶液中(70%的曱酰胺和lxSSC)變性15分鐘。用水沖洗1次，洗液1E沖洗2次后，向每張載片施用FrameSeal槽(Bio-Rad，Hercules,CA),并且向每張載片添加125pi的退火混合物(6xSSPE,0.01%TritonX-100和75pi的100|iM的測序引物)。-在PTC-200熱循環(huán)儀里，按照下列反應條件進行測序引物的雜交94。C反應6分鐘和53。C反應20分鐘。當引物退火結(jié)合到模板上后，將載片用洗液1E沖洗2次，再用Klenow緩沖液(50mMTris-HCIpH7.4,5mMMgCl2和0.01%TritonX-100)于室溫平衡3分鐘。將45微升延伸混合物(在Klenow緩沖液中的0.5|iMCy5標記的脫氧核苷酸{野生型或突變型}、0.5|iMCy3標記的不同的脫氧核苷酸{突變型或野生型}、1%單鏈DNA結(jié)合蛋白(USBcorporation,Cleveland,OH)和10個單位的Klenow酶)力口到每片凝膠上。將載片在室溫醉育3分鐘，用洗液IE洗滌2次，并用ScanArrayExpress(PerkinElmer,Wellesley;MA)進行掃描。^/淨jf^的戎i^^ir。為測定各個蛋白酶/RT擴增子中的主要抗藥性突變，將聚合酶克隆載片用曱酰胺變性溶液于45。C處理15分鐘，接著用水沖'洗，用洗液1E沖洗2次。掃描載片以確保完全去除來自先前SBE(單堿基的延伸)的測序引物，然后將它們用不同的測序引物進行退火。重復SBE步驟直至測定出所有期望的突變(參見表1和圖5)。表1:PASS測序中使用的引物引物_引物序列_PCR擴增引物_PAF1CTTTGGCAACGACCCCTCGTCACAPAF2CCAAAAATTGCAGGGCCCCTAGGAAPAR1-AcrCCCACTAACTTCTGTATGTCATTGACAGTCCAPAR2陽AcrCCTGCATAAATCTGACTTGCCCAATTCAA蛋白酶基因中的測序引物D30NgaGAAGCTCTATTAGATACAGGAGCAGATM46IgaAATTTGCCAGGAAGATGGAAACCAAAAATG48VgtCCAGGAAGATGGAAACCAAAAATGATAG150VagTGGAAACCAAAAATGATAGGGGGAV82AtcGGTACAGTATTAGTAGGACCTACACCTG184VagCAGTATTAGTAGGACCTACACCTGTCAACL90MtaACCTGTCAACATAATTGGAAGAAATCTG逆轉(zhuǎn)錄酶基因中的測序引物M41La-t/cAAAGCATTAGTAGAAATTTGTACAGAAE44DacGTAGAAATTTGTACAGAAATGGAAAAGGAK65RagCAATACTCCAGTATTTGCCATAAAGAD67NgaACTCCAGTATTTGCCATAAAGAAAAAAT69Dac.gaGTATTTGCCATAAAGAAAAAAGACAGTK70RagTTGCCATAAAGTAAAAAGACAGTACTAL74VtgAAAAAGACAGTACTAAATGGAGAAAAL100ItaGTTCAATTAGGAATACCACATCCCGCAGGGK103NacACATCCCGCAGGGTTAAAAAAGAAV106AtcGCAGGGTTAAAAAAGAAAAAATCAGV108IgaAGGGTTAAAAAAGAAAAAATCAGTAACAV118IgaGGATGTGGGTGATGCATATTTTTCAQ151Mca.atATTAGATATCAGTACAATGTGCTTCCAY181CagAGAAAACAAAATCCAGACATAGTTATCTM184VagCAAAATCCAGACATAGTTATCTATCAATACY188CLHta.t/c.g/aATAGTTATCTATCAATACATGGATGATTTGG190AgcTCTATCAATACATGGATGATTTGTATGTAGL210WtgAAAAATAGAGGAGCTGAGACAACCATCTGTT215Y/Fac.tt/aCAACATCTGTTGAGGTGGGGATTTK219EagTTGAGGTGGGGACTTACCACACCAGACP225HcaCCAGACAAAAAACATCAGAAAGAAC4毒iM4提承和逆掙z秀。使用QIAamp病毒RNA小量提取試劑盒(QIAampViralRNAMiniKit,QiagenInc.,Valencia,CA)從來自HIV-l感染個體的280^1血漿樣本中提取病毒RNA(vRNA)。將vRNA洗提入60plAVE緩沖液中，并且將17pi的vRNA用于cDNA合成，所述合成在40(il的反應體積中使用SuperscriptIII(InvitrogenCorp,Carlsbad,CA)和引物RTunil5'-CCAATCCCCCCTTTTCTTTTAAAATTGTG-3'。將約一半cDNA(18pl)用于一次PASS測定。結(jié)果卓個戎秀擔^f的乎/f^h^。近來，己經(jīng)開發(fā)了聚合酶克隆(polymerasecolony;polony)技術(shù)以在固相中檢測單分子水平的單堿基突變(Mitraetal,ProcNatlAcadSciUSA100:5926-31(2003),Mitraetal,AnalBiochem320:55-65(2003))。該方法己用于描述組合選4奪性前體-mRNA的剪接(combinatorialalternativepre-mRNAsplicing)和平4亍序歹'J觀'J定(Shendureetal,Science309:1728-32(2005)，Zhuetal,Science301:836-8(2003》。為檢測小比率抗性病毒群體，通過應用聚合酶克隆技術(shù)在一次測定中同時分析數(shù)十萬種病毒基因組，已經(jīng)開發(fā)出了平行等位基因特異性序列測定(PASS)方法。擴增了含有蛋白酶和部分逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)基因的1.1kb的po/基因片段。該擴增子包含針對逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶的所有主要的抗性突變。在丙烯酰胺凝膠中進行聚合酶克隆的擴增反應。由于在聚合反應過程中，Acrydite修飾的引物通過共價結(jié)合進聚丙烯酰胺凝膠里而固定，PCR產(chǎn)物積聚在DNA模板的周圍并在擴增的部位形成各自的點(聚合酶克隆)(圖1A)。擴增之后，負性的DNA鏈和互補的測序引物雜交，引物3'端與抗性突變并置。當引物通過單堿基延伸(SBE)進行延伸后，突變位點堿基的身份通過嵌入的用不同熒光團標記的核苷酸^！測定(圖1B)。通過微陣列掃描儀獲得圖像，該圖像用于野生型和突變型群體的分析。為了測定PASS分析的靈敏度，將野生型分子(WEAU-wt)和突變型分子(WEAU-E44D)依據(jù)不同的比例進行混合(l:1、1:10、1:100和1:1,000)。然后用E44D引物檢測該混合物。以0.1%或更高值存在的突變易于檢測(圖3A)。在以相同的1:1,000的突變型和野生型比率下，將病毒基因組的輸入量增至10,000時，盡管部分野生型分子彼此融合在一起而不能準確地進行計數(shù)，仍可以很容易的檢測出抗性突變(圖3B)。因此，用于檢測小比率的抗性突變的方法的靈敏度可以高達大約0.01%。線性回歸分析揭示了在檢測出的和預期的突變型/野生型比例之間存在很好的線性關(guān)系(R^0.9945)(圖3C)。通過多重單堿基延伸(SBE),在單獨的分子上檢測出了22個主要突變，這說明當進行更多的測序循環(huán)時，PASS測定法可用于檢測對于連鎖式分析的大多數(shù)主要突變和潛在的其它次要突變(圖5)。還測定了來自許多亞型和重組體形式(2個A亞型、8個B亞型、5個C亞型、3個D亞型、1個F亞型、2個G亞型、1個H亞型、2個CRF01—AE重組型、1個CRF04一cpx重組型和2個其他的重組體)的27個病毒基因組。所有己測試的亞型和重組體都得到了同等擴增，這說明PASS測定法能夠用于大多數(shù)的遺傳亞型和重組體(圖6)。該測定法對于野生型和突變型群體檢測的靈敏度約為6個病毒基因組拷貝。線性回歸分析顯示在10到10,000個病毒基因組拷貝之間存在很好的線性檢測相關(guān)性(112=0.9958)(圖7)。當分析大于200,000的野生型分子時，未檢測出i突變的堿基，這表明在目前的實驗條件下，通過Taq聚合酶引入的突變率低于5xl06。因此，通過PASS檢測出的低頻率突變將不太可能是PCR錯誤。為檢測存在于病毒種群中的每個分子內(nèi)的不同抗性突變，制備了3個單獨的抗藥性克隆(WEAU-E44D、WEAU-L90M和WEAU-M184V)，并將它們與野生型克隆(WEAU-wt)按1:1:1:1的比例混合。然后將這些聚合酶克隆用E44D、M184V和L90M引物進行順序性測序。正如預期，在每個反應中，大約25%的聚合酶克隆含有抗性突變，并且其它75%的聚合物克隆為野生型(圖4A-4C)。當從所有3個圖像分析聚合酶克隆時，野生型克隆顯示為綠色-綠色-紅色的模式，而E44D克隆顯示為紅色-綠色-紅色的模式，M184V克隆顯示為綠色-紅色-紅色的模式，而L90M顯示為綠色-綠色-綠色的模式。這些結(jié)果證明了當大量的病毒基因組進行平行分析時，PASS測定法可以準確地測定用于連鎖分析的每種病毒基因組中不同的抗性突變的存在。為了利用PASS測定法測定來自HIV感染患者的樣本中的抗性群體，分析了來自3個不同患者組的13個血漿樣本未治療過的患者(未治療組)、曾經(jīng)治療過但目前未進行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的患者(治療經(jīng)歷組)以及目前治療方案失敗的患者(失敗組)。首先測定M184V突變，并且在未治療過的患者中未測到該突變；在6個先前治療過的患者中，2個患者體內(nèi)^^測到小比率抗性群體(<2%);而在治療失敗的患者中，檢測到高比率(major)抗性群體(36%-100%)(圖8和表2)。表2.M184V密碼子中A^G的抗藥性突變的4企測<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>為檢測所研究的病毒種群中是否存在其它的抗性突變，對來自三個組的7個患者樣本進行了12個可能的抗性突變位點分析(表3)。在l個治療經(jīng)歷組患者和所有3個治療失敗組的患者中^r測出其它的抗性突變。在200372號患者中檢測出L90M和V82A突變，200371號患者中檢測出K70R和T215Y突變(表3和圖7)。在這兩個患者中均沒有檢測到野生型病毒。在其他的兩個患者中，在多個抗性突變位點均檢測到抗性和野生型病毒(圖9)。這使進行詳細的連鎖分析成為可能。在治療失敗組中的200369號患者體內(nèi)，90.32%的病毒中存在L100I突變，并且89.64%的病毒中存在K103N突變。利用標準的基因型測定法未能一企測出的36.26%的M184V突變病毒可以很容易地用PASS測定法檢測出來(圖9)。連鎖分析顯示多于一半的病毒(52.14%)同時攜帶L100I和K103N突變，并且35.10%的病毒含有3種抗性突變(LIOOI、K103M和M184V)。其它的含有單個或兩個抗性突變的病毒作為小比率群體存在(LIOOI0.66%、K103N0.07%、M184V0.07%、M層I/M1184V0.07%)(表3)。以前進行過治療的200362號患者也顯示出相似的抗性突變連鎖序型(profile)。盡管大多數(shù)病毒含有一種或更多抗性突變，但是兩個患者仍帶有少量的野生型病毒種群(1.67%和9.22%)。表3.個體病毒基因組中抗藥性突變的連鎖分析<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>尚未確認在逆轉(zhuǎn)錄病毒治療失敗的患者中作為基因型或表型測試結(jié)果的HIV治療結(jié)果上的連續(xù)改進(Johnsonetal,Top.HIVMed.13:125-131(2005))。這種結(jié)果的部分原因可能由于在這些患者中用于檢測小比率抗性群體的測定法靈敏度太低(存在〉20。/。突變病毒)(Petropoulosetal,Antimicrob.AgentsChemother.44:920-928(2000),VanLaethemetal，J.Acquir.ImmuneDefic.Syndr.22:107-118(1999))。與基因型或表型測定法相比，點突變測定法均具有顯著較高的靈敏度(VanLaethemetal,Acquir.ImmuneDefic.Syndr.22:107-118(1999))。由于通過這些方法檢測的抗藥性突變是基于群體的，它們都不能進行連鎖分析。然而，克隆序列測定法己用于研究每種病毒基因組中的小比率抗性群體和抗性突變的連鎖分析(Condraetal,Nature374:569-571(1995))。雖然PASS測定法需要花費數(shù)天來分析所有主要的突變，但是與克隆序列測定法相比，它能在本質(zhì)上更有效、更快速、更靈敏的檢測小比率抗性群體。盡管與標準的基因型測定法相比PASS測定法需要花費較長的時間去完成，但是對于檢測小比率抗性突變和對于連鎖分析他都提供了優(yōu)秀得多的靈敏度。雖然小比率抗性病毒種群的臨床意義還沒有完全確定，但是這些群體很可能會顯著影響之后的治療效果(Charpentieretal，J.Virol.78:4234-4247(2004)，'Metzneretal,J.Infect.Dis.188:1433-1443(2003),Wintersetal,J.Virol.72:5303-5306(1998))。因為對于檢測小比率抗性病毒群體，PASS測定法比基因型或表型測定法(0.01%對20%)的靈敏度要高約1,000倍，它可以更準確的預測治療效果。PASS測定法允許對多個突變的詳細連鎖分析，使得研究不同突變組合對于小比率和大比率病毒群體的影響成為可能(表3)。除了這些臨床上的改進，PASS測定法的技術(shù)優(yōu)勢值得注意。例如，在PASS操作中將病毒cDNA分子直接包埋至聚丙烯酰胺凝膠中，并在單一分子水平上進行PCR擴增。因此，將常規(guī)PCR反應過程中通過重組或重復取樣而產(chǎn)生的人為序列消除(Fangetal,J.Virol.Methods76:139-148(1998)，Liuetal,Science273:415-416(1996》。綜上，以上描述的是一種具有高靈敏度、高特異性和高通量的能夠在感染HIV的個體中檢測小比率抗性種群的PASS測定法。該方法應用了聚合酶克隆技術(shù)，該技術(shù)己用于檢測組合選擇性前體mRNA的剪接，平行檢測單磁<基突變和平行序列測定(Zhuetal，Science301:836-838(2003)，Merritetal,Biotechnol.Bioeng.92:519-531(2005)，Butzetal,BMCGenet.5:3(2004)，Shendureetal,Science309:1728-1732(2005))。該新技術(shù)也可以充滿潛力地用于^r測在T和B細胞靶向的抗原決定簇中的HIV逃逸突變，其它的人病原體(如乙型和丙型肝炎病毒、TB等)以及與癌相關(guān)的突變或核苷修飾。以上引用的所有文件和其他信息資源于此全部并入?yún)⒖?。?quán)利要求1.一種在大量的核酸模板中檢測或測定突變或核苷酸修飾的頻率的方法，該方法包括i)將大量核酸模板和修飾的3′擴增引物或者修飾的5′擴增引物在使所述修飾的擴增引物固定于半固體支持物中的條件下包埋于所述半固體支持物中；ii)將步驟(i)獲得的所述半固體支持物與聚合酶、三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和未修飾的5′或者3′擴增引物接觸；iii)在使所述修飾和/或未修飾的擴增引物雜交至所述核酸模板以形成與引物結(jié)合的模板的條件下處理從步驟(ii)獲得的組合物；iv)在所述半固體支持物內(nèi)進行所述與引物結(jié)合的模板的擴增，其中所述擴增的雙鏈產(chǎn)物集中在所述與引物結(jié)合的模板的周圍；v)將所述雙鏈擴增產(chǎn)物變性并去除獲得的未固定到所述半固體支持物中的單鏈；vi)將測序引物與所述步驟(v)獲得的固定化的單鏈雜交，并在帶有不同可檢測標記的至少2種核苷酸存在下，對所述雜交的測序引物進行延伸以形成延伸產(chǎn)物，其中所述核苷酸中的一種在所述固定化單鏈含有所述突變或核苷酸修飾時結(jié)合到所述延伸產(chǎn)物中；另外的所述核苷酸在所述固定化單鏈不含所述突變或修飾核苷酸時結(jié)合到所述延伸產(chǎn)物中；以及vii)檢測從步驟(vi)獲得的測序引物的延伸產(chǎn)物，并確定包含所述突變核苷酸或修飾核苷酸的所述核酸模板的存在或頻率。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述方法是一種測定突變頻率的方法。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述大量的核酸模板包含雙鏈DNA。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述大量的核酸模板來源于病原體。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述病原體為病毒病原體或細菌病原體。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述病原體是人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)或結(jié)核分枝桿菌(TB)。7.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述抗原為抗藥性病原體。8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述大量的核酸模板來源于癌細胞的基因組。9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述癌細胞為人類癌細胞。10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述癌細胞來源于活檢組織、血液或排出物。11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述排出物包括尿液、糞便、粘液或漿液分泌物。12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述修飾的擴增引物共價附接于所述半固體支持物。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述半固體支持物為丙烯酰胺凝膠。14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中未修飾的5'引物和修飾的3'引物包埋于所述半固體支持物中。15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中未修飾的3'引物和修飾的5'引物包埋于所述半固體支持物中。16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述修飾引物為Acrydite標記的引物。17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述可^f企測標記為熒光標記。18.—種測定患者體內(nèi)病毒載量的方法，該方法包括i)從來自所述患者的生物樣本中提取病毒DNA;'擴增引物固定于半固體支持物中的條件^包埋于所述半固體支持物中；'iii)將步驟(i)獲得的所述半固體支持物與聚合酶、三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和未修飾的5'或者3'擴增引物接觸；iv)在使所述修飾和/或未修飾的擴增引物與所述DNA雜交以形成與引物結(jié)合的模板的條件下，處理從步驟(iii)獲得的組合物；v)在所述半固體支持物中進行所述與引物結(jié)合的模板的擴增，其中所述擴增的雙鏈產(chǎn)物集中在所述與引物結(jié)合的模板的周圍；vi)將所述雙鏈擴增產(chǎn)物變性并去除所得的未固定到所述半固體支持物中的單鏈；vii)將測序引物與所述從步驟(vi)獲得的固定化的單鏈雜交，并在帶有可伸產(chǎn)物；以及viii)檢測從步驟(vii)獲得的標記的延伸產(chǎn)物，并由此確定所述病毒載量。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中在步驟(ii)之前，剪切所述DNA。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述剪切后的DNA的長度為大約100個堿基至大約1000kb。21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述剪切后的DNA的長度為大約lkb至大約100kb。22.—種測定患者體內(nèi)病毒載量的方法，該方法包括i)從來自所述患者的生物樣本中提取病毒RNA;ii)反轉(zhuǎn)錄所述RNA以生成cDNA，并將所述cDNA和修飾的3'擴增引物或修飾的5'擴增引物在使所述修飾的擴增引物固定于半固體支持物中的條件下包埋于所述半固體支持物中；iii)將步驟(i)得到的所述半固體支持物與聚合酶、三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和未修飾的5'或者3'擴增引物接觸；iv)在使所述修飾和/或未修飾的擴增引物與所述cDNA雜交以形成與引物結(jié)合的模板的條件下處理從步驟(iii)獲得的組合物；v)在所述半固體支持物中進行所述與引物結(jié)合的模板的擴增，其中所述擴增的雙鏈產(chǎn)物集中在所述與引物結(jié)合的模板的周圍；vi)將所述雙鏈擴增產(chǎn)物變性并去除所得的未固定到所述半固體支持物中的單鏈；vii)將測序引物與所述步驟(vi)獲得的固定化的單鏈雜交，并在帶有可斗全的延伸產(chǎn)物；以及viii)檢測從步驟(vii)獲得的標記的延伸產(chǎn)物，并由此確定所述病毒載量。23.—種測定患者體內(nèi)病毒載量的方法，該方法包括i)從來自所述患者的生物樣本中提取病毒DNA;的擴增引物固定于半固體支持物中的條件下包埋于所述半固體支持物中；iii)將步驟(i)得到的半固體支持物與聚合酶、三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和未修飾的5'或者3'擴增引物接觸；iv)在使所述修飾和/或未修飾的擴增引物與所述DNA雜交以形成與引物結(jié)合的模板的條件下處理從步驟(iii)獲得的組合物；v)在所述半固體支持物中進行所述與引物結(jié)合的模板的擴增，其中所述擴增的雙鏈產(chǎn)物集中在所述與引物結(jié)合的模板的周圍；Vi)將所述雙鏈擴增產(chǎn)物變性并去除所得的未固定到所述半固體支持物中的單鏈；vii)將對于所述病毒具有特異性的標記的探針與所述步驟(vi)得到的固定化的單鏈雜交以形成標記的雙鏈體；以及viii)檢測所述標記的雙鏈體的存在，并由此確定所述病毒載量。24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中在步驟(ii)之前，剪切所述DNA。25.—種測定患者體內(nèi)病毒載量的方法，該方法包括i)從來自所述患者的生物樣本中提取病毒RNA;ii)反轉(zhuǎn)錄所述RNA以生成cDNA,并將所述cDNA和修飾的3'擴增引物或者修飾的5'擴增引物在使所述修飾的擴增引物固定于半固體支持物中的條件下包埋于所述半固體支持物中；iii)將步驟(i)得到的所述半固體支持物與聚合酶、三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和未修飾的5'或者3'擴增引物接觸；iv)在使所述修飾和/或未修飾的擴增引物與所述cDNA雜交以形成與引物結(jié)合的模板的條件下處理從步驟(iii)獲得的組合物；v)在所述半固體支持物中進行所述與引物結(jié)合的模板的擴增，其中所述擴增的雙鏈產(chǎn)物集中在所述與引物結(jié)合的模板的周圍；vi)將所述雙鏈擴增產(chǎn)物變性并去除所得的未固定到所述半固體支持物中的單鏈；vii)將對于所述病毒具有特異性的標記的探針與所述步驟(vi)得到的固定化的單鏈雜交以形成標記的雙鏈體；以及viii)檢測所述標記的雙鏈體的存在，并由此確定所述病毒載量。26.—種在源自從生物樣本中分離的DNA的大量核酸模板中檢測突變或核苷酸修飾的方法，該方法包括i)將所述大量核酸模板和修飾的3'擴增引物或者修飾的5'擴增引物在使所述修飾的擴增引物固定于半固體支持物中的條件下包埋于所述半固體支持物中；ii)將步驟(i)獲得的所述半固體支持物與聚合酶、三磷酸脫氧核苷酸(dNTPs)和未修飾的5'或者3'擴增引物接觸；iii)在使所述修飾和/或未修飾的擴增引物雜交至所述核酸模板以形成與引物結(jié)合的模板的條件下處理從步驟(ii)獲得的組合物；iv)在所述半固體支持物內(nèi)進行所述與引物結(jié)合的模板的擴增，其中所述擴增的雙鏈產(chǎn)物集中在所述與引物結(jié)合的模板的周圍；v)將所述雙鏈擴增產(chǎn)物變性并去除獲得的未固定到所述半固體支持物中的單鏈；vi)將測序引物與所述從步驟(v)獲得的固定化的單鏈雜交，并在帶有可檢測標記的核芬酸存在下，對所述雜交的測序引物進行延伸，其中帶有所述可檢測標記的所述核香酸在所述固定化單鏈含有所述突變或核苦酸修飾時結(jié)合到所述延伸產(chǎn)物中，從而形成標記的延伸產(chǎn)物；以及viii)檢測從步驟(vii)獲得的標記的延伸產(chǎn)物，并由此確定所述突變或核苷酸修飾的存在。27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述生物樣本包含來自癌細胞的DNA。全文摘要本發(fā)明涉及到一種檢測遺傳變體的方法，所述遺傳變體包括與抗藥性、癌癥和遺傳功能障礙性疾病相關(guān)的遺傳變體。文檔編號C12Q1/68GK101421418SQ200780013086公開日2009年4月29日申請日期2007年4月10日優(yōu)先權(quán)日2006年4月10日發(fā)明者軍朱,峰高申請人:杜克大學