專利名稱：一種用納米金檢測dna突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測DNA突變的方法，尤其是涉及一種用納米金探針檢測DNA突變的 方法。
背景技術(shù)：
基因突變是指基因組DNA分子在結(jié)構(gòu)功能上發(fā)生堿基對組成或排列順序的改變，主要 包括堿基的替換、缺失或插入。由于基因突變與多種遺傳性疾病、腫瘤的發(fā)生具有密切的關(guān) 系，因此檢測基因突變對于遺傳性疾病或者腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和診斷具有重要的意義。
檢測基因突變的方法主要有凝膠電泳法、DNA測序法和DNA芯片技術(shù)。凝膠電泳法 的基本原理是不同構(gòu)象的DNA在凝膠中的遷移率不同，根據(jù)遷移率的改變與否，可以判 斷是否存在基因突變。這種方法雖然簡單，但是其靈敏度易受到電泳條件和DNA片段大小 等因素的影響，重現(xiàn)性較差，也不易實現(xiàn)自動化。DNA測序法是檢測基因突變最直接最準確 的方法，它既可以確定突變的類型，又可以確定突變的位置。但是該種方法需要特殊的儀器 設(shè)備，且耗時費力，測序時需要同位素或者熒光標記，花費昂貴。DNA芯片技術(shù)是20世紀 90年代發(fā)展起來的一項新技術(shù)，其基本原理是許多已知序列DNA被排列在集成電路板上， 彼此之間重疊一個堿基，并覆蓋整個所需檢測的基因，熒光標記的正常DNA和突變DNA分 別與兩塊DNA芯片雜交，由于至少存在一個堿基的差異，正常DNA和突變DNA將會得到 不同的雜交圖譜，通過共聚焦顯微鏡分別檢測兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號，即可確定是 否存在突變。這種方法自動化程度高，可以檢測大量的樣品，但是需要特殊的儀器，成本也 較高。因此尚需找到更加簡單快捷、高效靈敏、成本低廉的檢測基因突變的方法。
納米物質(zhì)所表現(xiàn)出獨特的光學性質(zhì)、電學性質(zhì)、磁學性質(zhì)和熱學性質(zhì)受到了廣泛的關(guān)注 和研究。美國西北大學Mirkin CA領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，利用納米金優(yōu)良的光學性質(zhì)，在檢測DNA 方面做了大量卓有成效的研究。他們將巰基化的DNA序列固定在納米金的表面，然后與目 標DNA進行雜交，雜交后納米金的顏色和紫外可見吸收光譜會發(fā)生明顯改變，據(jù)此可以判 斷是否存在目標DNA序列(1. Elghanian R,Storhoff JJ, Mucic RC， et al. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science, 1997， 277(5329):1078-1081; 2. Taton TA, Mirkin CA， Letsinger RL.Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes. Science, 2000, 289(5485):1757-1760)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用納米金探針檢測DNA突變的方法。 本發(fā)明的具體步驟如下
1) 將野生型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金混勻，靜置后 加入氯化鈉溶液，混勻后靜置，得到的體系稱為體系l;
2) 將突變型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金混勻，靜置后 加入氯化鈉溶液，混勻后靜置，得到的體系稱為體系2;
3) 往步驟1所得的體系1中加入氯化鈉溶液，混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的 520 nm處的吸光值稱為吸光值1;
4) 往步驟2所得的體系2中加入氯化鈉溶液，使氯化鈉的終濃度與步驟3中氯化鈉的終 濃度相同，混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值2;
5) 當吸光值2與吸光值1有明顯差異時，可以判斷有突變存在。 所述的納米金的粒徑范圍為5 50nm。
野生型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金的加入量最好為野 生型單鏈DNA :納米金=(10 50) pmol : (40 50) pL，與野生型單鏈DNA序列完全互 補的探針與野生型單鏈DNA等量，氯化鈉的終濃度最好為0.05 0.1 mol/L。
突變型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金的加入量最好為突 變型單鏈DNA :納米金=(10 50) pmol : (40 50) ^L，與野生型單鏈DNA序列完全互 補的探針與突變型單鏈DNA等量，氯化鈉的終濃度最好為0.05~0.1 mol/L。
在步驟3)中，氯化鈉的終濃度最好為0.2 0.3mol/L。
本發(fā)明的技術(shù)方案所涉及的原理是納米金在水溶液中可穩(wěn)定分散，呈酒紅色，但高鹽 溶液對納米金的穩(wěn)定性影響很大，加入高鹽溶液后，納米金的穩(wěn)定性被破壞，納米金顆粒互 相聚結(jié)沉淀，納米金的顏色和紫外可見吸收光譜最大吸收峰發(fā)生改變。納米金對單鏈DNA 和雙鏈DNA的吸附能力不同，在高鹽溶液中單鏈DNA和雙鏈DNA對納米金的穩(wěn)定性具有 顯著不同的保護作用。單鏈DNA能結(jié)合到納米金表面形成保護層，'使納米金在高鹽溶液中 聚集程度較小，520 nm處的吸光值變化不大；而雙鏈DNA幾乎不能附著在納米金表面，無 法阻止納米金在高鹽溶液中發(fā)生聚集，520nm處的吸光值發(fā)生明顯的改變。將探針分別與野 生型DNA和突變型DNA雜交，由于突變型DNA不能與探針完全互補，因此其雜交效率將 低于野生型DNA，其雜交體系中殘留的游離單鏈DNA將高于野生型DNA雜交體系，從而
對納米金的穩(wěn)定產(chǎn)生更強的保護作用。因此，通過比較520nm處吸光值的改變程度可以判斷 是否存在突變。本發(fā)明中DNA和納米金均無需作任何修飾，大大簡化樣品的處理過程和操 作步驟，只需檢測As2o的不同，即可判定DNA是否存在突變，最低檢出限為10pmol，在40min 左右獲得檢測結(jié)果，具有簡便快速、成本低廉、高度靈敏等特點，具有較大的臨床應(yīng)用潛力。


圖1為本發(fā)明實施例所使用納米金的透射電鏡圖。在圖1中，標尺為50nm。
圖2為野生型單鏈DNA與完全互補的探針雜交后，再加入氯化鈉溶液，納米金聚沉的 透射電鏡圖。在圖2中，標尺為50nm。
圖3為人p53基因密碼子245處野生型和突變型DNA分別與納米金探針雜交，再加入 氯化鈉溶液所得體系的紫外可見吸收光譜檢測結(jié)果。
圖4為人p53基因密碼子245處野生型和突變型DNA分別與納米金探針雜交，再加入 氯化鈉溶液所得體系的紫外可見吸收光譜檢測結(jié)果。
圖5為人p53基因密碼子245處野生型和突變型DNA分別與納米金探針雜交，再加入 氯化鈉溶液所得體系的紫外可見吸收光譜檢測結(jié)果。
圖6為人p53基因密碼子282處野生型和突變型DNA分別與納米金探針雜交，再加入 氯化鈉溶液所得體系的紫外可見吸收光譜檢測結(jié)果。
圖7為人p53基因密碼子282處野生型和突變型DNA分別與納米金探針雜交，再加入 氯化鈉溶液所得體系的紫外可見吸收光譜檢測結(jié)果。
圖8為人p53基因密碼子282處野生型和突變型DNA分別與納米金探針雜交，再加入 氯化鈉溶液所得體系的紫外可見吸收光譜檢測結(jié)果。
在圖3 8中，橫坐標為波長(nm)，縱坐標為吸光值。曲線a為納米金的紫外可見吸收光 譜，b為突變型單鏈DNA與納米金探針體系的紫外可見吸收光譜，c為野生型單鏈DNA與 納米金探針體系的紫外可見吸收光譜。
具體實施例方式
下面通過實施例結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明。 實施例1
將該檢測方法應(yīng)用于檢測人p53基因密碼子245處的點突變，堿基G突變?yōu)閴A基A^(參 見文獻Rangel-Lopez A, Maldonado-Rodriguez R， Salcedo-Vargas M, et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol, 2005， 15(8):1-13)，具體操作步驟如下 1) 將野生型單鏈DNA 50 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和50 7.54 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置lOmin后 加入3pL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.057，混勻后室溫靜置30min，得到的體 系稱為體系1。
2) 將突變型單鏈DNA 50 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和50 7.54 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置lOmin后 加入3^L lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.057，混勻后室溫靜置30min，得到的體 系稱為體系2。
3) 往步驟1所得的體系1中加入10 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.206， 混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值1。
4) 往步驟2所得的體系2中加入10 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.206， 混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520 nm處的吸光值稱為吸光值2。
結(jié)果表明，往體系1中加入氯化鈉溶液后，吸光值1為1.16 (圖3c)，往體系2中加入 氯化鈉溶液后，吸光值2為1.64 (圖3b)。吸光值2與吸光值1有明顯的差異，據(jù)此可以判 斷存在突變。
實施例2
將該檢測方法應(yīng)用于檢測人p53基因密碼子245處的點突變，堿基G突變?yōu)閴A基AP](參 見文獻Rangel-Lopez A， Maldonado-Rodriguez R, Salcedo-Vargas M, et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol, 2005, 15(8):1-13)，具體操作步驟如下
1) 將野生型單鏈DNA42 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和45 4.81 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置12min后 加入4pL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.082，混勻后室溫靜置33min，得到的體 系稱為體系1。
2) 將突變型單鏈DNA42 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和45 7.54 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置12min后 加入4pL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.082，混勻后室溫靜置33min，得到的體 系稱為體系2。
3) 往步驟1所得的體系1中加入11 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.25， 混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值1。
4)往步驟2所得的體系2中加入11 nL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.25， 混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值2。
結(jié)果表明，往體系1中加入氯化鈉溶液后，吸光值1為0.78 (圖4c)，往體系2中加入 氯化鈉溶液后，吸光值2為0.97 (圖4b)。吸光值2與吸光值1有明顯的差異，據(jù)此可以判 斷存在突變。
實施例3
將該檢測方法應(yīng)用于檢測人p53基因密碼子245處的點突變，堿基G突變?yōu)閴A基A^(參 見文獻Rangel-Lopez A, Maldonado-Rodriguez R， Salcedo-Vargas M, et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol， 2005, 15(8):1-13)，具體操作步驟如下
1)將野生型單鏈DNA 35 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 、對生型單鏈ONA完全互補的序列)和40 2.8 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置9min后加 入4pL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.091，混勻后室溫靜置35min，得到的體系 稱為體系1。
.、2)將突,，.^^i)NA.35q)mok:等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 "野生型單鏈DNA完全互樸的序列)'和40 2.8 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置9min后加 入4nLlmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.091，混勻后室溫靜置35min，得到的體系 稱為體系2。
3) 往步驟1所得的體系1中加入6 nL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.2，混 勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值1。
4) 往步驟2所得的體系2中加入6 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度先0.2，混 勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值2。
結(jié)果表明，往體系1中加入氯化鈉溶液后，吸光值1為0.39 (圖5c)，往體系2中加入 氯化鈉溶液后，吸光值2為0.58 (圖5b)。吸光值2與吸光值1有明顯的差異，據(jù)此可以判 斷存在突變。
實施例4
將該檢測方法應(yīng)用于檢測人p53基因密碼子282處的點突變，堿基C突變?yōu)閴A基T[3](參 見文獻Rangel-Lopez A, Maldonado-Rodriguez R, Salcedo-Vargas M, et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol, 2005, 15(8):1-13)，具體操作步驟如下
1) 將野生型單鏈DNA 28 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和42 7.4 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置16min后加 入3^iLlmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.067，混勻后室溫靜置29min，得到的體系 稱為體系l。
2) 將突變型單鏈DNA28 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和42 7.4nmol/L的納米金混勻，室溫靜置16min后加 入3^L lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.067，混勻后室溫靜置29min，得到的體系 稱為體系2。
3) 往步驟1所得的體系1中加入10 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.236， 混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值1。
4) 往步驟2所得的體系2中加入10 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.236， 混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值2。
結(jié)果表明，往體系1中加入氯化鈉溶液后，吸光值1為1.02 (圖6c)，往體系2中加入 氯化鈉溶液后，吸光值2為1.57 (圖6b)。吸光值2與吸光值1有明顯的差異，據(jù)此可以判 浙存在突變。
實施例5
將該檢測方法應(yīng)用于檢測人p53基因密碼子282處的點突變，堿基C突變?yōu)閴A基T (參 見文獻Rangel-Lopez A, Maldonado-Rodriguez R, Salcedo-Vargas M, et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol, 2005， 15(8):1-13)，具體操作步驟如下
1) 將野生型單鏈DNA 19 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和48 5.49 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置8min后加 入4nL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.077，混勻后室溫靜置36min，得到的體系 稱為體系l。
2) 將突變型單鏈DNA 19 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和48 5.49 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置8min后加 入4pL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.077，混勻后室溫靜置36min，得到的體系 稱為體系2。
3) 往步驟1所得的體系1中加入13 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.261， 混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520 nm處的吸光值稱為吸光值1 。
4)往步驟2所得的體系2中加入13 pL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.261， 混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值2。
結(jié)果表明，往體系1中加入氯化鈉溶液后，吸光值1為0.82 (圖7c)，往體系2中加入 氯化鈉溶液后，吸光值2為1.21 (圖7b)。吸光值2與吸光值1有明顯的差異，據(jù)此可以判 斷存在突變。
實施例6
將該檢測方法應(yīng)用于檢測人p53基因密碼子282處的點突變，堿基C突變?yōu)閴A基T[3](參 見文獻Rangel-Lopez A， Maldonado-Rodriguez R, Salcedo陽Vargas M， et al. Low density DNA microarray for detection of most frequent TP53 missense point mutations. BMC Biotechnol, 2005, 15(8):1-13)，具體操作步驟如下
1) 將野生型單鏈DNA 10 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和46 3.87 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置7min后加 入5pL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.098，混勻后室溫靜置31min，得到的體系 稱為體系1。
2) 將突變型單鏈DNA 10 pmol、等量的與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針探針(與 野生型單鏈DNA完全互補的序列)和46 3.87 nmol/L的納米金混勻，室溫靜置7min后加 入5nL lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.098，混勻后室溫靜置31min，得到的體系 稱為體系2。
3) 往步驟1所得的體系1中加入14 lmol/L的氯化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.292， 混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520 nm處的吸光值稱為吸光值1 。
4) 往步驟2所得的體系2中加入14 lmol/L的氧化鈉溶液，氯化鈉的終濃度為0.292， 混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520 nm處的吸光值稱為吸光值2。
結(jié)果表明，往體系1中加入氯化鈉溶液后，吸光值1為0.66 (圖8c)，往體系2中加入 氯化鈉溶液后，吸光值2為0.83 (圖8b)。吸光值2與吸光值1有明顯的差異，據(jù)此可以判 斷存在突變。
權(quán)利要求
1.一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特征在于其具體步驟如下1)將野生型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金混勻，靜置后加入氯化鈉溶液，混勻后靜置，得到的體系稱為體系1；2)將突變型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金混勻，靜置后加入氯化鈉溶液，混勻后靜置，得到的體系稱為體系2；3)往步驟1所得的體系1中加入氯化鈉溶液，混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值1；4)往步驟2所得的體系2中加入氯化鈉溶液，使氯化鈉的終濃度與步驟3中氯化鈉的終濃度相同，混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值2；5)當吸光值2與吸光值1有明顯差異時，可以判斷有突變存在。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特征在于所述的納米金 的粒徑范圍為5 50nm。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特征在于野生型單鏈 DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金的加入量為野生型單鏈DNA :納米 金=(10 50) pmol: (40 50) pL。
4. 如權(quán)利要求1或3所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特征在于與野生型 單鏈DNA序列完全互補的探針與野生型單鏈DNA等量。
5. 如權(quán)利要求1所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特征在于在步驟l)中， 氯化鈉的終濃度為0.05~0.1 mol/L。
6. 如權(quán)利要求1所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特征在于突變型單鏈 DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金的加入量為突變型單鏈DNA :納米 金=(10 50) pmol : (40 50) nL。
7. 如權(quán)利要求1或6所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特征在于與野生型 單鏈DNA序列完全互補的探針與突變型單鏈DNA等量。
8. 如權(quán)利要求1所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特征在于在步驟2)中， 氯化鈉的終濃度為0.05~0.1 mol/L。
9. 如權(quán)利要求1所述的一種用納米金檢測DNA突變的方法，其特征在于在步驟3)中， 氯化鈉的終濃度為0.2-0.3 mol/L。
全文摘要
一種用納米金檢測DNA突變的方法，涉及一種檢測DNA突變的方法。提供一種用納米金探針檢測DNA突變的方法。將野生型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金混勻，靜置后加入氯化鈉溶液后靜置得體系1；將突變型單鏈DNA、與野生型單鏈DNA序列完全互補的探針和納米金混勻，靜置后加入氯化鈉溶液后靜置得體系2；往體系1加入氯化鈉溶液，混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值1；往體系2加入氯化鈉溶液，混勻后作紫外可見吸收光譜檢測，所得的520nm處的吸光值稱為吸光值2；當吸光值2與1有明顯差異時，可判斷有突變存在。DNA和納米金無需作任何修飾，簡化樣品的處理。
文檔編號C12Q1/68GK101344481SQ20081007160
公開日2009年1月14日 申請日期2008年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月18日
發(fā)明者孫莉萍, 張其清, 張召武, 張建鋒, 輝 李, 霜 王 申請人:廈門大學