專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種改進(jìn)的含有淀粉酶的衣物洗滌劑組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及含有具有一未在自然界中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列的新型α-淀粉酶突變體的衣物洗滌劑，這種α-淀粉酶突變體具有一氨基酸序列，其中前體α-淀粉酶的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，特別是任何可氧化氨基酸，已被一種不同的氨基酸代替。本發(fā)明的衣物洗滌劑中的突變酶表現(xiàn)出改變的穩(wěn)定性/活性形象，包括但并未局限于改變的氧化穩(wěn)定性、改變的pH效能曲線(xiàn)，改變的比活性和/或改變的熱穩(wěn)定性。α-淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1)主要隨機(jī)水解淀粉中的內(nèi)部α-1，4-葡糖苷鍵，以產(chǎn)生小分子量麥芽糖糊精。α-淀粉酶具有很大的商業(yè)價(jià)值，其被用于淀粉加工的初始階段(液化)，用于酒精生產(chǎn)，作為洗滌劑基質(zhì)中的清潔劑，和在紡織工業(yè)中用于淀粉脫漿工藝。α-淀粉酶由很多種微生物包括芽孢桿菌屬和曲霉屬產(chǎn)生，最商品化的淀粉酶產(chǎn)生于諸如地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌之類(lèi)的細(xì)菌來(lái)源。近年在商業(yè)應(yīng)用中優(yōu)選的酶是那些源于地衣芽孢桿菌的酶，原因在于它們的熱穩(wěn)定性和效能，至少在中性和微堿性pH條件下。先前曾有研究利用重組DNA技術(shù)來(lái)探索哪些殘基對(duì)于淀粉酶的催化活性是重要的和/或探索對(duì)各種淀粉酶活性位點(diǎn)的某些氨基酸進(jìn)行修飾的效果(Vihinen，M.等(1990)《生物化學(xué)雜志》(J.Biochem.)107267-272；Holm，L.等(1990)《蛋白質(zhì)工程》(ProteinEngineering)3181-191；Takase，K.等(1992)《生物化學(xué)和生物物理學(xué)學(xué)報(bào)》(BiochemicaetBiophysicaActa)1120281-288；Matsui，I.等(1992)《歐洲生物化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)》(FebsLetters)310卷第3期216-218頁(yè))；哪些殘基對(duì)于熱穩(wěn)定性是重要的(Suzuki，Y.等(1989)《生物學(xué)化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)26418933-18938)；并且一個(gè)工作組已經(jīng)利用這種方法對(duì)一地衣芽孢桿菌的淀粉酶在各組氨酸殘基處引入突變，對(duì)組氨酸殘基進(jìn)行替換的理論基礎(chǔ)是與其它類(lèi)似的芽孢桿菌屬淀粉酶相比，地衣芽孢桿菌淀粉酶(已知為熱穩(wěn)定)具有多余的組氨酸，因而，表明取代一個(gè)組氨酸可以影響酶的熱穩(wěn)定性(Declerck，N.等(1990)《生物學(xué)化學(xué)雜志》26515481-15488；FR2665178-A1；Joyet，P.等(1992)《生物技術(shù)》(Bio/Technology)10157-1583)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如這里實(shí)施例所描述的α-淀粉酶在pH為4到10.5之間被過(guò)氧化氫和其它氧化劑滅活。商業(yè)上，根據(jù)商業(yè)性用途α-淀粉酶可在顯著不同的條件如高和底pH條件下使用。例如，α-淀粉酶可被用于優(yōu)選在低的pH(pH＜5.5)下淀粉的液化。另一方面，淀粉酶可被用于商業(yè)性洗碗或衣物洗滌劑，其中通常含有氧化劑如漂白劑或過(guò)酸，并且被用于更堿性的條件下。為了改變淀粉酶在變換的條件下的穩(wěn)定性和活性，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)選擇性置換、取代或刪除可氧化氨基酸如蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、組氨酸或半胱氨酸，導(dǎo)致變體酶與其前體相比具有一種改變了的形象。因?yàn)楫?dāng)前商品化的淀粉酶并不是在各種條件下都合意(穩(wěn)定)，所以需要一種具有改變了的穩(wěn)定性和/或活性形象的淀粉酶。與野生型或前體酶相比，在保持充分的酶活性的同時(shí)這種改變的穩(wěn)定性(氧化性的、熱的或pH效能曲線(xiàn))是可以達(dá)到的。通過(guò)引入這種突變而被影響了的特性可能是在保持熱穩(wěn)定性的同時(shí)在氧化穩(wěn)定性上的改變或者反之亦然。另外，在α-淀粉酶前體序列中以不同的氨基酸取代一可氧化氨基酸或刪除一個(gè)或多個(gè)可氧化氨基酸可能引起在一不同與被認(rèn)為對(duì)前體α-淀粉酶最佳的pH下的改變酶活性。換言之，本發(fā)明的突變體酶可能也具有改變的pH效能曲線(xiàn)，這或許是由于提高了酶的氧化穩(wěn)定性。本發(fā)明涉及含有突變體α-淀粉酶的新型衣物洗滌劑組合物，這種α-淀粉酶突變體是編碼α-淀粉酶的突變DNA序列的表達(dá)產(chǎn)物，這種突變的DNA序列衍生于被缺失或置換一個(gè)或多個(gè)可氧化氨基酸的前體α-淀粉酶。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，突變體是由前體α-淀粉酶的一個(gè)或多個(gè)蛋氨酸殘基被另一種氨基酸取代而來(lái)。而在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，突變體包括前體α-淀粉酶的一個(gè)或多個(gè)色氨酸殘基被取代或一個(gè)或多個(gè)色氨酸殘基和一個(gè)或多個(gè)蛋氨酸殘基聯(lián)合被取代?？偟膩?lái)看，這種突變體是通過(guò)體外修飾一編碼天然或重組的α-淀粉酶的前體DNA序列來(lái)編碼前體氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代或缺失而得到的。在氨基酸序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換或缺失優(yōu)選是由于這種序列中一個(gè)或多個(gè)蛋氨酸、色氨酸、半胱氨酸、組氨酸或酪氨酸殘基的置換或缺失，最優(yōu)選改變的殘基是蛋氨酸殘基?？裳趸被釟埢杀黄渌?0個(gè)天然氨基酸的任何一個(gè)替代。如果預(yù)期的效果是改變前體的氧化穩(wěn)定性，則氨基酸殘基可被一個(gè)非氧化氨基酸(如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天門(mén)冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴(lài)氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸)或另一可氧化氨基酸(如半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸或組氨酸，以最容易被氧化到不容易被氧化的順序列出)所取代。同樣，如果預(yù)期的效果是改變熱穩(wěn)定性，則可用其他20種天然氨基酸來(lái)置換(例如，半胱氨酸可被用來(lái)置換蛋氨酸)。優(yōu)選的衣物洗滌劑包括含有置換一個(gè)等價(jià)于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中發(fā)現(xiàn)的任何蛋氨酸殘基(+8，+15，+197，+256，+304，+366和+438)的蛋氨酸殘基的突變體。最優(yōu)選被取代的蛋氨酸是在一等價(jià)于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中+197或+15位點(diǎn)上的蛋氨酸。用于取代在+197位點(diǎn)上的蛋氨酸的優(yōu)選的置換氨基酸是丙氨酸(A)，異亮氨酸(I)，蘇氨酸(T)或半胱氨酸(C)。在+15位點(diǎn)上的優(yōu)選置換氨基酸是亮氨酸(L)，蘇氨酸(T)，天門(mén)冬氨酸(D)，絲氨酸(S)，纈氨酸(V)和異亮氨酸(I)，雖然上面沒(méi)有指明的其它置換氨基酸可能也可用。本發(fā)明的兩個(gè)特別優(yōu)選的突變體是M197T和M15L。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及包括含有取代等價(jià)于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(見(jiàn)圖2)中發(fā)現(xiàn)的任何色氨酸殘基的一個(gè)色氨酸殘基的突變體的衣物洗滌劑。優(yōu)選被置換的色氨酸在等價(jià)于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中的+138位點(diǎn)上?？梢灾苽鋯为?dú)在一個(gè)色氨酸殘基上的突變(置換)或聯(lián)合在其它可氧化氨基酸殘基上的突變。尤其是通過(guò)聯(lián)合置換至少一個(gè)色氨酸和至少一個(gè)蛋氨酸的修飾可能是有利的(例如，雙突變體+138/+197)。大體上，本發(fā)明的衣物洗滌劑中所包含的α-淀粉酶突變體在過(guò)氧化氫和其它氧化劑如漂白劑或過(guò)酸，或者，更尤其是較和緩的氧化劑如氯胺-T存在時(shí)表現(xiàn)出改變了的氧化穩(wěn)定性。具有提高了的氧化穩(wěn)定性的突變體酶將對(duì)延長(zhǎng)貨架壽命和擴(kuò)展用在洗滌產(chǎn)品中淀粉酶對(duì)漂白劑、過(guò)硼酸鹽、過(guò)碳酸鹽或過(guò)酸的相容性是有幫助的。相應(yīng)地，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括含有本發(fā)明的突變體α-淀粉酶還含有一種漂白劑或過(guò)酸化合物的一種衣物洗滌劑。本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案是一含有本發(fā)明突變體α-淀粉酶的具有高于大約10且更優(yōu)選介于大約10到12之間pH的衣物洗滌劑。也優(yōu)選一種具有介于大約10到12之間pH的并還含有一種漂白劑或過(guò)酸化合物的顆粒性衣物洗滌劑。當(dāng)與野生型或非本發(fā)明的酶相比時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的突變體酶也令人驚奇地以在中性pH范圍內(nèi)具有更高的活性為特點(diǎn)。相應(yīng)地，另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案包括含有本發(fā)明的突變體α-淀粉酶具有介于大約5.0到10.0之間的或更優(yōu)選介于大約6.0到10.0之間pH的衣物洗滌劑。最優(yōu)選的實(shí)施方案是pH在約6.0到10.0之間的液體洗滌劑。類(lèi)似地，降低的氧化穩(wěn)定性可能在需要快速和有效地將酶滅活的工業(yè)處理中有用。本發(fā)明的突變體酶也可以表現(xiàn)出一個(gè)拓寬了的pH效能曲線(xiàn)，據(jù)此，突變體如M15L對(duì)低pH的淀粉液化表現(xiàn)出穩(wěn)定性，突變體如M197T在高pH的洗滌劑條件下表現(xiàn)出穩(wěn)定性。本發(fā)明的突變體也可以具有改變的熱穩(wěn)定性，據(jù)此，突變體在高或低的溫度下可能具有提高了的穩(wěn)定性。不言而喻，根據(jù)預(yù)期的目的和含有突變體α-淀粉酶的衣物洗滌劑配方，與其前體相比，突變體的酶促特性的任何變化(增加或降低)可能是有益的。本發(fā)明優(yōu)選的衣物洗滌劑含有源自芽孢桿菌屬菌株如地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌，且最優(yōu)選源自地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶的突變體。本發(fā)明另一方面還提供一種含有通常由地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的一種新形式的α-淀粉酶的衣物洗滌劑。這個(gè)被稱(chēng)為A4形式的新形式是在被分泌的淀粉酶的N-末端具有額外的四個(gè)丙氨酸(圖4b)。本發(fā)明中包括A4形式α-淀粉酶的衍生物或突變體。A4形式的衍生物或突變體是指本發(fā)明包括含有一個(gè)或多個(gè)其它突變，如一個(gè)或多個(gè)可氧化氨基酸的突變(置換、取代或缺失)的A4形式α-淀粉酶。本發(fā)明的一個(gè)組合物實(shí)施方案包括含有在此中所描述的α-淀粉酶突變體的液體、凝膠或顆粒的衣物洗滌劑組合物。優(yōu)選單獨(dú)含有一個(gè)在+197位的突變體或與其它酶如內(nèi)切糖苷酶、纖維素酶、蛋白酶、脂酶或其它淀粉酶聯(lián)合的洗滌劑組合物。特別優(yōu)選含有一種M15X/W138X/M197X突變體，最優(yōu)選含有一種M15T/W138Y/M197T(“TYT”)突變體的衣物洗滌劑組合物。另外，考慮本發(fā)明的組合物可以包括一種含有一個(gè)以上位點(diǎn)特異突變的α-淀粉酶。根據(jù)本發(fā)明的一種方法實(shí)施方案，本發(fā)明的衣物洗滌劑組合物用于一種洗滌臟衣物的方法。圖1a-1c顯示地衣芽孢桿菌(NCIB8061)中α-淀粉酶基因的DNA序列(序列號(hào)31)和如在GrayG.等(1986)《細(xì)菌雜志》(J.Bacter.)166635-643中所描述的推導(dǎo)出的翻譯產(chǎn)物。圖2顯示地衣芽孢桿菌(NCIB8061)中成熟的α-淀粉酶的氨基酸序列(序列號(hào)32)。圖3a-3b顯示芽孢桿菌屬α-淀粉酶一級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)比。地衣芽孢桿菌淀粉酶(Am-Lich)，序列號(hào)33，被GrayG.等(1986)《細(xì)菌雜志》166635-643描述；解淀粉芽孢桿菌淀粉酶(Am-Amylo)，序列號(hào)34，被Takkinen，K.等(1983)《生物學(xué)化學(xué)雜志》2581007-1013描述；嗜熱脂肪芽孢桿菌淀粉酶(Am-Stearo)，序列號(hào)35，被Ihara，H.等(1985)《生物化學(xué)雜志》9895-103描述。圖4a顯示突變體M197T的氨基酸序列，序列號(hào)36。圖4b顯示地衣芽孢桿菌NCIB8061中的A4形式α-淀粉酶的氨基酸序列，序列號(hào)37。由四個(gè)額外的丙氨酸開(kāi)始，從N-末端計(jì)數(shù)。圖5顯示質(zhì)粒pA4BL，其中BLAA代表地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因，從PstI到SstI；AmpR代表pBR322來(lái)源的氨芐青霉素抗性基因；CAT代表pC194來(lái)源的氯霉素抗性基因。圖6顯示地衣芽孢桿菌的(序列號(hào)38)、枯草芽孢桿菌的(序列號(hào)39)、pA4BL中的地衣芽孢桿菌的(序列號(hào)40)和pBLapr中地衣芽孢桿菌的(序列號(hào)41)信號(hào)序列-成熟蛋白連接。圖7a顯示在pH5.0，25℃時(shí)0.88MH2O2對(duì)某些α-淀粉酶(SpezymeAA20和M197L(A4形式))的滅活。圖7b顯示在pH10.0，25℃時(shí)0.88MH2O2對(duì)某些α-淀粉酶(SpezymeAA20，M197T)的滅活。圖7c顯示在pH5.0，25℃時(shí)0.88MH2O2對(duì)某些α-淀粉酶(SpezymeAA20，M15L)的滅活。圖8顯示一個(gè)制備M197X盒式突變體的模式圖。圖9顯示M197X突變體的表達(dá)。圖10顯示M197X突變體在pH5.0，5mMCaCl2條件下95℃5分鐘的熱穩(wěn)定性。圖11a和11b顯示某些淀粉酶在自動(dòng)洗碗洗滌劑中的滅活。圖11a顯示65℃時(shí)在存在或不存在淀粉的條件下某些淀粉酶在CascadeTM(一種商品化的洗碗產(chǎn)品)中的穩(wěn)定性。圖11b顯示65℃時(shí)在存在或不存在淀粉的條件下某些淀粉酶在SunlightTM(一種商品化的洗碗產(chǎn)品)中的穩(wěn)定性。圖12顯示一個(gè)制備M15X盒式突變體的模式圖。圖13顯示M15X突變體的表達(dá)。圖14顯示M15X突變體對(duì)可溶性淀粉的比活性。圖15顯示M15X突變體在pH5.0，5mMCaCl2條件下90℃5分鐘的熱穩(wěn)定性。圖16顯示M15變體對(duì)淀粉和可溶性底物的比活性及pH5.5時(shí)在噴射液化中的效能，作為地衣芽孢桿菌野生型活性百分比的函數(shù)。圖17顯示與突變體M197A(1.7mg/m1)和M197L(1.7mg/ml)相比，在pH8.0時(shí)氯胺-T對(duì)地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(0.65mg/ml的AA20)的滅活。圖18顯示與突變體M197A(4.3mg/ml)和M197L(0.53mg/ml)相比，在pH4.0時(shí)氯胺-T對(duì)地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(0.22mg/ml的AA20)的滅活。圖19顯示與雙突變體M197T/W138F(0.64mg/ml)和M197T/W138Y(0.60mg/ml)相比，在pH5.0時(shí)地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(0.75mg/ml的AA20)與氯胺-T的反應(yīng)。圖20顯示摻入自動(dòng)洗碗去污劑(ADD)配方中的各種α-淀粉酶多突變體在溫度從室溫升至65℃時(shí)的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果。圖21顯示通過(guò)剩余活性百分比測(cè)定的某些淀粉酶突變體(與野生型相比)在一自動(dòng)洗碗去污劑中室溫下0-30天的穩(wěn)定性。圖22顯示某些淀粉酶突變體(與野生型相比)在一自動(dòng)洗碗去污劑中38℃(100°F)和80％相對(duì)濕度下0-30天的穩(wěn)定性。圖23顯示某些淀粉酶在25℃中性或堿性pH下對(duì)Phadebas底物的pH活性曲線(xiàn)。圖24顯示某些淀粉酶在pH9.3和52℃下對(duì)過(guò)乙酸的穩(wěn)定性。圖25根據(jù)反射度(與對(duì)照之差)對(duì)所加入的淀粉酶ppm顯示本發(fā)明的淀粉酶(“TYT”)與TermamylTM淀粉酶相比在液體衣物洗滌劑中40℃時(shí)的相對(duì)清潔能力。圖26根據(jù)反射度(與對(duì)照之差)對(duì)所加入的淀粉酶ppm顯示本發(fā)明的淀粉酶(“TYT”)與TermamylTM淀粉酶相比在液體衣物洗滌劑中55℃時(shí)的相對(duì)清潔能力。圖27以反射度(與對(duì)照之差)對(duì)所加入的淀粉酶ppm顯示本發(fā)明的淀粉酶在商品化的洗滌劑中的洗滌效能。據(jù)認(rèn)為，用于淀粉液化中的淀粉酶可能因?yàn)樵诘矸蹌驖{中存在的一些活性而遭到某些形式的滅活(見(jiàn)US申請(qǐng)07/785，624和07/785，623及US專(zhuān)利5,180,669，1993年1月19日公布，這些文獻(xiàn)并入本文作為參考)。另外，在氧化劑存在如在含有漂白劑或過(guò)酸的洗滌劑中使用淀粉酶時(shí)，可能導(dǎo)致淀粉酶的部分或完全失活。因而，本發(fā)明重點(diǎn)在于改變被加入洗衣去污劑中的淀粉酶的氧化敏感性。本發(fā)明的在洗衣去污劑中的突變體酶也可能具有一改變了的pH曲線(xiàn)和/或可能因?yàn)樘岣吡嗣冈诘突蚋叩膒H下的氧化穩(wěn)定性而改變了的熱穩(wěn)定性。此中所用的α-淀粉酶包括天然產(chǎn)生的淀粉酶和重組的淀粉酶。本發(fā)明中優(yōu)選的淀粉酶是來(lái)源于地衣芽孢桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶，包括此中所描述的來(lái)源于地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶的A4形式，以及如那些來(lái)源于曲霉屬(即米曲霉和黑曲霉)的真菌α-淀粉酶。重組α-淀粉酶指一種α-淀粉酶，其中編碼天然產(chǎn)生的α-淀粉酶的DNA序列被修飾而產(chǎn)生一種在α-淀粉酶序列中編碼一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、插入或缺失的突變DNA序列。本文和US專(zhuān)利4,760,025和5,185,258中都公布了合適的修飾方法，這些文獻(xiàn)并入本文作為參考。在迄今已被測(cè)序的幾乎所有內(nèi)切淀粉酶之間，從植物、哺乳動(dòng)物到細(xì)菌，已發(fā)現(xiàn)具有同源性(Nakajima，R.t.等(1986)《應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)》(Appl.Microbiol.Biotechnol.)23355-360；Rogers，J.C.(1985)《生物化學(xué)生物物理學(xué)研究通訊》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)128470-476)。在某些芽孢桿菌屬淀粉酶中有四個(gè)區(qū)域具有特別高的同源性，如圖3所示，其中下面劃線(xiàn)的部分是高同源性的區(qū)域。另外，還用序列對(duì)比來(lái)描繪芽孢桿菌屬內(nèi)切淀粉酶之間的關(guān)系(Feng，D.F.和Doolittle，R.F.(1987)《分子進(jìn)化雜志》(J.Molec.Evol.)35351-360)。由Holm，L.等(1990)《蛋白質(zhì)工程》3(3)181-191頁(yè)確定的嗜熱脂肪芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌淀粉酶之間的相對(duì)序列同源性約為66％。按照前面Holm，L.等確定的，地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌淀粉酶之間的序列同源性約為81％。雖然序列同源性是重要的，但普遍認(rèn)為在比較淀粉酶或其它酶時(shí)結(jié)構(gòu)的同源性也很重要。例如，已經(jīng)表明在真菌淀粉酶和細(xì)菌(芽孢桿菌屬)淀粉酶之間的結(jié)構(gòu)同源性，因此真菌淀粉酶被包含在本發(fā)明中。一種α-淀粉酶突變體具有來(lái)源于一前體α-淀粉酶氨基酸序列的一種氨基酸序列。前體α-淀粉酶包括天然存在的α-淀粉酶和重組α-淀粉酶(如被定義的)。α-淀粉酶突變體的氨基酸序列通過(guò)置換、缺失或插入一個(gè)或多個(gè)前體氨基酸序列中的氨基酸而由前體α-淀粉酶氨基酸序列衍生來(lái)。這種修飾是對(duì)編碼前體α-淀粉酶氨基酸的前體DNA序列進(jìn)行的，而不是對(duì)前體α-淀粉酶本身進(jìn)行的操作。對(duì)前體DNA序列進(jìn)行這種操作的適宜的方法包括在這里及在US專(zhuān)利4,760,025和5,185,258中公開(kāi)的方法。此中，與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的M197、M15和W138位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的特定殘基被鑒定進(jìn)行置換或缺失，它們都是蛋氨酸、組氨酸、色氨酸、半胱氨酸和酪氨酸殘基。氨基酸位點(diǎn)數(shù)(即，+197)指在圖2中所列出的成熟地衣芽孢桿菌α-淀粉酶序列中給定的數(shù)字。然而，本發(fā)明并不僅僅局限于這種特殊的成熟α-淀粉酶(地衣芽孢桿菌)的突變，而且還擴(kuò)展至與在地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中鑒定出的特殊的殘基等價(jià)的位點(diǎn)上含有氨基酸殘基的前體α-淀粉酶。如果一種前體α-淀粉酶的一個(gè)殘基(氨基酸)同源(即在一級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)上的位點(diǎn)相同)或類(lèi)似于在地衣芽孢桿菌α-淀粉酶上的一個(gè)特定殘基或那個(gè)殘基所在的部分(即化學(xué)上或結(jié)構(gòu)上具有相同或相似的作用能力來(lái)結(jié)合、反應(yīng)或相互作用)，則這種前體α-淀粉酶的這個(gè)殘基等價(jià)于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中的那個(gè)殘基。為了確立一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性，將一種前體α-淀粉酶的氨基酸序列直接與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶一級(jí)序列相比，尤其是與已知對(duì)所有序列已知的α-淀粉酶都不變的一系列殘基進(jìn)行比較，如圖3所示。也可以通過(guò)三級(jí)結(jié)構(gòu)確定等價(jià)殘基豬胰腺α-淀粉酶的晶體結(jié)構(gòu)(Buisson，G.等(1987)《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》(EMBOJ.)63909-3916)、曲霉的Taka-淀粉酶A的晶體結(jié)構(gòu)(Matsuura，Y.等(1984)《生物化學(xué)雜志》(東京)95697-702)和黑曲霉中的一種酸性α-淀粉酶的晶體結(jié)構(gòu)(Boel，E.等(1990)《生物化學(xué)》(Biochemistry)296244-6249)已被報(bào)道，前兩者的結(jié)構(gòu)類(lèi)似。雖然據(jù)推測(cè)在葡聚糖酶之間具有共同的超二級(jí)結(jié)構(gòu)(MacGregor，E.A和Svensson，B.(1989)《生物化學(xué)雜志》(Biochem.J.)259145-152)以及嗜熱脂肪芽孢桿菌的酶結(jié)構(gòu)已被模擬成Taka-淀粉酶A的結(jié)構(gòu)(Holm，L.等(1990)《蛋白質(zhì)工程》3181-191)，但對(duì)芽孢桿菌屬的α-淀粉酶還沒(méi)有已公布的結(jié)構(gòu)。在圖3中展示的四個(gè)高度保守區(qū)包含許多被認(rèn)為是活性位點(diǎn)的部分的殘基(Matsuura，Y.等(1984)《生物化學(xué)雜志》(東京)95697-702；Buisson，G.等(1987)《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》63909-3916；Vihinen，M.等(1990)《生物化學(xué)雜志》107267-272)，包括按地衣芽孢桿菌中計(jì)數(shù)的His105、Arg229、Asp231、His235、Glu261和Asp328。這里所用的表達(dá)載體指含有一個(gè)可操作地連接于一能夠在合適的宿主中影響該DNA表達(dá)的適宜的控制序列的DNA構(gòu)建物。這種控制序列可能含有一個(gè)用于有效轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、一個(gè)編碼合適的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。優(yōu)選的啟動(dòng)子是枯草芽孢桿菌aprE啟動(dòng)子。載體可以是一種質(zhì)粒、一種噬菌體顆?；蚝?jiǎn)單地是一種潛在的基因組插入片段。一旦轉(zhuǎn)化進(jìn)入一合適的宿主，載體可以不依賴(lài)于宿主基因組而復(fù)制和發(fā)揮功能，或者在某些情況下可以整合成為基因組本身。在本說(shuō)明中，質(zhì)粒和載體有時(shí)被相互交換地使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是當(dāng)前最常用的載體形式。然而本發(fā)明意在包括由能執(zhí)行同樣功能并且在本領(lǐng)域已被了解或開(kāi)始被了解的其它形式的表達(dá)載體所生產(chǎn)的淀粉酶。在本發(fā)明中有效的宿主菌(或細(xì)胞)一般是原核或真核宿主，包括任何能夠獲得α-淀粉酶表達(dá)的可轉(zhuǎn)化的微生物。特別是與α-淀粉酶所來(lái)源的種或?qū)傧嗤乃拗骶呛线m的，如芽孢桿菌屬菌株。優(yōu)選使用一種α-淀粉酶陰性的芽孢桿菌菌株和/或一種α-淀粉酶和蛋白酶缺失的芽孢桿菌菌株，如枯草芽孢桿菌菌株BG2473(ΔamyE、Δapr、Δnpr)。宿主細(xì)胞被通過(guò)利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。這種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞能夠復(fù)制編碼α-淀粉酶和其它變體(突變體)的載體或者表達(dá)預(yù)期的α-淀粉酶。本發(fā)明的突變體在發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)選被分泌到培養(yǎng)基中。任何適宜的信號(hào)序列，如aprE信號(hào)肽，都可被用來(lái)作到分泌表達(dá)。本發(fā)明的許多α-淀粉酶突變體在配制各種洗滌劑組合物，特別是某些衣物洗滌劑的清潔組合物，尤其是那些含有已知的氧化劑如漂白劑或過(guò)酸化合物的清潔組合物的過(guò)程中是有用的。本發(fā)明的α-淀粉酶突變體可被配制成pH在大約4.5到12.0，優(yōu)選大約5.0到10.0，最優(yōu)選約6.0到10.0之間的已知的粉末、液體或膠體洗滌劑。另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括pH在大約10.0到12.0之間的衣物洗滌劑，其中漂白劑也存在于組合物中。含有顆粒狀淀粉酶的適宜的組合物可按照在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)07/429,881、07/533,721和07/957,973中所描述的方法制造，所有這些文獻(xiàn)均并入本文作為參考。這些洗滌劑清潔組合物也可含有其它酶，如已知的蛋白酶、脂酶、纖維素酶、內(nèi)切糖苷酶或其它的淀粉酶和助洗劑、穩(wěn)定劑或其它由本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的賦形劑。這些酶可以以共顆?；蚧旌衔锘蛞员绢I(lǐng)域的技術(shù)人員所了解的其它任何形式存在。另外，本發(fā)明考慮多突變體可能在清潔或其它應(yīng)用中有用。例如，一個(gè)在+15和+197位有改變的突變體酶可以表現(xiàn)出提高了的在清洗劑中有用的效能或一個(gè)含有+197和+138位改變的多突變體可以具有改善了的效能。特別優(yōu)選的用于洗滌劑，尤其是衣物洗滌劑配方中的突變體酶包括但并不局限于M15T/M197T、M15S/M197T、W138Y/M197T、M15S/W138Y/M197T和M15T/W138Y/M197T(“TYT”)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括這里所描述的突變體α-淀粉酶與其它酶(即蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等)的聯(lián)合，優(yōu)選氧化穩(wěn)定的蛋白酶。適宜的氧化穩(wěn)定蛋白酶包括遺傳工程蛋白酶如那些在USRe34,606(引入本文作為參考)中所描述的、和商品化的酶如DURAZYM(NovoNordisk)、MAXAPEM(Gist-brocades)和PURAFECTOXP(GenencorInternational，Inc.)。在USRe34606中描述有制造這些蛋白酶突變體(氧化穩(wěn)定蛋白酶)，特別是這些帶有一種對(duì)在一等價(jià)于解淀粉芽孢桿菌中M222位點(diǎn)上的蛋氨酸進(jìn)行置換的突變體的適宜方法。在Re34606、EP257,446和USSN212,291中都提供有用于在其它枯草蛋白酶中確定“等價(jià)”位點(diǎn)的適宜的方法，所述文獻(xiàn)引入本文作為參考。此中所用的縮寫(xiě)，特別是氨基酸的三個(gè)字母或一個(gè)字母的標(biāo)志在Dale，J.W.，《細(xì)菌分子遺傳學(xué)》(MolecularGeneticsofBateria)，JohnWiley和Sons，(1986)附錄B中都有描述。實(shí)施例1地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中蛋氨酸殘基的置換α-淀粉酶基因(圖1)是由從國(guó)家工業(yè)細(xì)菌保藏中心((NationalCollectionofIndustrialBacteria)，阿伯丁(Aberdeen)，蘇格蘭)獲得的地衣芽孢桿菌NCIB8061中克隆的(Gray，G.等(1986)《細(xì)菌學(xué)雜志》166635-643)。編碼信號(hào)序列的最后三個(gè)殘基的1.72kbPstI到SstI片段；完整的成熟蛋白和終止區(qū)被亞克隆到M13MP18中。利用一個(gè)合成的如下形式的寡核苷酸盒子BclISstI5′GATCAAAACATAAAAAACCGGCCTTGGCCCCGCCGGTTTTTTATTATTTTTGAGCT3′3′TTTTGTATTTTTTGGCCGGAACCGGGGCGGCCAAAAAATAATAAAAAC5′序列號(hào)1將一個(gè)合成的終止子加在BclI和SstI位點(diǎn)之間。(Wells等(1983)《核酸研究》(NucleicAcidResearch)117911-7925)。寡核苷酸的定點(diǎn)誘變基本上是利用Zoller，M.等(1983)《酶學(xué)方法》(Meth.Enzymol.)100468-500上的方法簡(jiǎn)單地說(shuō)，通過(guò)利用表I列出的寡核苷酸來(lái)置換地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中發(fā)現(xiàn)的七個(gè)蛋氨酸中的每一個(gè)將5-磷酸化寡核苷酸引物用于在M13單鏈DNA模板上引入預(yù)期的突變。每個(gè)誘變的寡核苷酸也引入一個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)用作對(duì)連接突變的篩選。表I用于置換地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中蛋氨酸殘基的誘變寡核苷酸M8A5′-TGGGACGCTGGCGCAGTACTTTGAATGGT-3′序列號(hào)2ScaI+M15L5′-TGATGCAGTACTTTGAATGGTACCTGCCCAATGA-3′序列號(hào)3ScaI+KpnI+M197L5′-GATTATTTGTTGTATGCCGATATCGACTATGACCAT-3′序列號(hào)4EcoRV+M256A5′-CGGGGAAGGAGGCCTTTACGGTAGCT-3′序列號(hào)5StuI+M304L5′-GCGGCTATGACTTAAGGAAATTGC-3′序列號(hào)6AfIII+M366A5′-CTACGGGGATGCATACGGGACGA-3′序列號(hào)7NsiI+M366Y5′-CTACGGGGATTACTACGGGACCAAGGGAGACTCCC-3′序列號(hào)8StyI+M438A5′-CCGGTGGGGCCAAGCGGGCCTATGTTGGCCGGCAAA-3′序列號(hào)9SriT+粗體字母代表由寡核苷酸引入的堿基改變。在M8A形式中顯示的密碼子的改變是在+8位點(diǎn)上的蛋氨酸(M)被變換為丙氨酸(A)。下劃線(xiàn)表示由寡核苷酸引入的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。用異源雙鏈轉(zhuǎn)染大腸桿菌mutL細(xì)胞(Kramer等(1984)《細(xì)胞》(Cell)38879)，并在噬斑純化后，通過(guò)RF1的限制性酶切分析來(lái)鑒定克隆。陽(yáng)性克隆通過(guò)雙脫氧測(cè)序(Sanger等(1977)《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(ProC.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)745463-5467)并且每個(gè)克隆的PstI-SstI片段都被亞克隆到大腸桿菌載體質(zhì)粒pA4BL中。質(zhì)粒DA4BL按照在US申請(qǐng)860,468中(Power等)描述的方法，此文引入本文作為參考文獻(xiàn)，一個(gè)沉默PstI位點(diǎn)被引入在源自pS168-1的aprE基因(Stahl，M.L.和Ferrari，E.(1984)《細(xì)菌雜志》158411-418)的+1密碼子處(信號(hào)切割位點(diǎn)后的第一個(gè)氨基酸)。aprE啟動(dòng)子和信號(hào)肽區(qū)然后被以HindIII-PstI片段的形式從pJH101質(zhì)粒(Frrari，F(xiàn).A.等(1983)《細(xì)菌雜志》1541513-1515)中克隆出來(lái)并亞克隆至pUC18衍生的質(zhì)粒JM102(Ferrari，E.和Hoch，J.A.(1989)《芽孢桿菌屬》(Bacillus)C.R.Harwood編，Plenum出版，57-72頁(yè))中。地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中的PstI-SstI片段的插入使pA4BL(圖5)具有如圖6所示結(jié)果的aprE信號(hào)肽-淀粉酶接頭。向枯草芽孢桿菌中的轉(zhuǎn)化pA4BL是一種能在大腸桿菌中復(fù)制并能整合入枯草芽孢桿菌染色體的質(zhì)粒。含有不同突變體的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌(Anagnostopoulos，C.和Spizizen，J.(1961)《細(xì)菌雜志》81741-746)并通過(guò)一種坎貝爾型(Campbell-type)機(jī)制整合進(jìn)入染色體的aprE基因座(Young，M.(1984)《微生物學(xué)遺傳雜志》(J.Gen.Microbiol.)1301613-1621)?？莶菅挎邨U菌BG2437是缺失了淀粉酶(ΔamyE)和兩個(gè)蛋白酶(Δapr，Δnpr)的I168菌株的衍生株(Stahl，M.L.和Ferrari，E.，《細(xì)菌雜志》158411-418及US專(zhuān)利5,264,366，此文引入這里作為參考)。轉(zhuǎn)化后，通過(guò)由PBS-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)(Hoch，J.A.(1983)1541513-1515)將sacU32(Hy)(Henner，D.J.等(1988)《細(xì)菌雜志》170296-300)突變引入。在枯草芽孢桿菌中由pA4BL表達(dá)的淀粉酶的N-末端分析表明，它將被加工成在分泌的淀粉酶的N-末端具有四個(gè)額外的丙氨酸(A4形式)。這些額外的殘基對(duì)A4形式的活性或熱穩(wěn)定性并沒(méi)有明顯的有害效應(yīng)，而且在一些應(yīng)用中可以提高效能。在隨后的試驗(yàn)中，地衣芽孢桿菌淀粉酶和突變體M197T的正確加工形式都由一個(gè)非常相似的構(gòu)建獲得(見(jiàn)圖6)。尤其是為了使下面的誘變寡核苷酸5′-CATCAGCGTCCCATTAAGATTTGCAGCCTGCGCAGACATGTTGCT-3′序列號(hào)10獲得一個(gè)編碼鏈模板，將A4結(jié)構(gòu)的5端在EcoRI-SstII片段上從pA4BL(圖5)亞克隆到M13BM20(BoehringerMannheim)上。這個(gè)引物清除了編碼額外四個(gè)N-末端丙氨酸的密碼子，通過(guò)缺少PstI位點(diǎn)來(lái)篩選正確的形式。將EcorI-SstI片段亞克隆回pA4BL載體(圖5)中形成pBLapr。M197T的置換可在SstII-SstI片段上被移出pA4BL(M197T)而移入互補(bǔ)的pBLapr載體形成pBLapr(M197T)。在枯草芽孢桿菌中由pBLapr表達(dá)的淀粉酶的N-末端分析表明它將被加工成與在地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中發(fā)現(xiàn)的相同的N-末端。實(shí)施例2蛋氨酸變異體的氧化敏感性地衣芽孢桿菌α-淀粉酶，如SpezymeAA20(購(gòu)自GenencorInternational，Inc.)在過(guò)氧化氫存在時(shí)迅速被滅活(圖7)。各種蛋氨酸變異體在枯草芽孢桿菌的搖瓶培養(yǎng)中被表達(dá)，其粗上清通過(guò)硫酸銨切換純化。從一個(gè)20％飽和的硫酸銨上清通過(guò)將硫酸銨提高至70％飽和度而將淀粉酶沉淀下來(lái)，然后重懸。隨后在25℃pH5.0條件下將變異體暴露于0.88M的過(guò)氧化氫。在地衣芽孢桿菌α-淀粉酶中的六個(gè)蛋氨酸位點(diǎn)上的變異體仍然遭到過(guò)氧化物的氧化，而在+197位點(diǎn)上的置換(M197L)則表現(xiàn)出對(duì)過(guò)氧化物氧化作用的抗性(見(jiàn)圖7)。然而，下面被更加細(xì)致地描述的隨后的分析則表明，一個(gè)變異體可能在pH5.0、25℃條件下對(duì)氧化作用敏感，但在不同條件下(即液化作用)，卻可表現(xiàn)出改變/提高了的效能。實(shí)施例3在197位點(diǎn)上的所有可能變異體的構(gòu)建所有的M197變異體(M197X)都是通過(guò)盒式誘變以A4形式產(chǎn)生的，如在圖8中所概括的1)利用下面所示的誘變寡核苷酸M197A5′-GATTATTTGGCGTATGCCGATATCGACTATGACCAT-3′EcoRV+ClaI-序列號(hào)11將定點(diǎn)誘變(通過(guò)在M13中引物的延伸〕用于產(chǎn)生M197A，這同時(shí)也插入一個(gè)EcoRV位點(diǎn)(密碼子200-201)來(lái)取代ClaI位點(diǎn)(密碼子201-202)。2)然后利用引物L(fēng)AAM12(表II)在密碼子186-188上引入另一沉默限制性酶切位點(diǎn)(BstBI)。3)所獲得的M197A(BstBI+，EcoRV+)變異體然后再被亞克隆(PstI-SstI片段)到質(zhì)粒pA4BL中，所獲得的質(zhì)粒用BstBI和EcoRV消化，大的含有載體的片段通過(guò)從瓊脂糖凝膠中電洗脫而被分離出來(lái)。4)每個(gè)合成的引物L(fēng)AAM14-30(表II)都與大的互補(bǔ)通用引物L(fēng)AMM13I(表II)退火。所形成的在+197位點(diǎn)編碼剩余所有天然氨基酸的盒子，分別被連接到上面制備的載體片段中。表II用于進(jìn)行盒式誘變來(lái)制備M197X變異體的合成寡核苷酸LAAM12GGGAAGTTTCGAATGAAAACG序列號(hào)12LAAM13X197bs序列號(hào)13(EcoRV)GTCGGCATATGCATATAATCATAGTTGCCGTTTTCATT(BstBI)LAAM14I197序列號(hào)14(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGATCTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM15F197序列號(hào)15(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGTTCTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM16V197序列號(hào)16(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGGTTTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM17S197序列號(hào)17(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAGCTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM18P197序列號(hào)18(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGCCTTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM19T197序列號(hào)19(Bst8I)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGACATATGCCGAC(EcoRV-)LAAM20Y197序列號(hào)20(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGTACTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM21H197序列號(hào)21(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGCACTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM22G197序列號(hào)22(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGGGCTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM23Q197序列號(hào)23(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGCAATATGCCGAC(EcoRV-)LAAM24N197序列號(hào)24(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAACTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM25K197序列號(hào)25(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAAATATGCCGAC(EcoRV-)LAAM26D197序列號(hào)26(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGGATTATGCCGAC(EcoRv-)LAAM27E197序列號(hào)27(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGGAATATGCCGAC(EcoRV-)LAAM28C197序列號(hào)28(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGTGTTATGCCGAC(EcoRy-)LAAM29W197序列號(hào)29(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGTGGTATGCCGAC(EcoRV-)LAAM30R197序列號(hào)30(BstBI)CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAGATATGCCGAC(EcoRV-)盒子被設(shè)計(jì)成在連接時(shí)破壞EcoRV位點(diǎn)，因此用這個(gè)單一位點(diǎn)的缺失來(lái)篩選從大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中所獲得的質(zhì)粒。另外，盒子的共同底鏈含有一個(gè)讀框移位，并編碼一個(gè)NsiI位點(diǎn)，因此，這條鏈來(lái)源的轉(zhuǎn)化體能通過(guò)篩選單一NsiI位點(diǎn)的存在而被清除，而且在任何情況下它都被認(rèn)為不會(huì)表達(dá)有活性的淀粉酶。經(jīng)限制性酶切分析陽(yáng)性的克隆通過(guò)測(cè)序和轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌獲得在搖瓶培養(yǎng)中的表達(dá)(圖9)而得到證實(shí)。然后通過(guò)一個(gè)可溶性底物檢測(cè)來(lái)測(cè)定某些M197X突變體的特異性活性。利用隨后的檢測(cè)方法所獲的資料在下面表III中列出?？扇苄缘孜餀z測(cè)以由Megazyme(澳大利亞)Pty.Ltd提供的終點(diǎn)檢測(cè)試劑盒為基礎(chǔ)，進(jìn)行了速率檢測(cè)每小瓶底物(對(duì)硝基苯基麥芽糖庚糖苷，BPNPG7)被溶于10ml無(wú)菌水中，隨后在測(cè)試緩沖液(50mk馬來(lái)酸緩沖液，pH6.7，5mM氯化鈣，0.002％吐溫20)中進(jìn)行1-4倍稀釋。在25℃通過(guò)向樣品池中的790μl底物中加入10μl淀粉酶來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)在410nm處每隔75秒的吸收值的變化率測(cè)定水解效率。檢測(cè)是線(xiàn)性的直到變化率高至0.4吸收單位/分鐘?；诶门Ｑ灏椎鞍讟?biāo)準(zhǔn)品的方法(Bradford，M.(1976)《分析生物化學(xué)》(Anal.Biochem.)72248)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的Bio-Rad檢測(cè)(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)來(lái)測(cè)定淀粉酶的濃度。淀粉水解檢測(cè)利用檢測(cè)SpezymeAA20α-淀粉酶活性的標(biāo)準(zhǔn)方法。這個(gè)方法在USSN07/785,624的實(shí)施例1中被詳細(xì)的描述，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。天然淀粉與碘作用產(chǎn)生藍(lán)色，但當(dāng)它水解成短的糊精分子后，就失去這個(gè)能力。底物是在pH6.2的磷酸鹽緩沖液(42.53克/升磷酸二氫鉀、3.16克/升氫氧化鈉)中的5克/升的可溶性L(fǎng)intner淀粉。將樣品加入25mM氯化鈣中并根據(jù)在30℃進(jìn)行陰性碘測(cè)試孵育所消耗的時(shí)間來(lái)測(cè)定其活性?；钚砸愿鶕?jù)公式其中LU＝力規(guī)分單位(liquefouunit)V＝樣品的體積(5ml)t＝糊精化時(shí)間(分鐘)D＝稀釋因子＝稀釋體積/加入的酶量毫升或克數(shù)所計(jì)算的每克或每毫升力規(guī)分(LU)記錄表III比活性(以AA20值的％表示)α-淀粉酶可溶性底物淀粉SpezymeAA20100100A4形式105115M15L(A4形式)9394M15L85103M197T(A4形式)7583M197T6281M197A(A4形式)8889M197C8585M197L(A4形式)5117實(shí)施例4變異體M15L的鑒定根據(jù)前面的實(shí)施例產(chǎn)生的變異體M15L沒(méi)有表現(xiàn)出增加的淀粉酶活性(表III)而且仍被過(guò)氧化氫滅活(圖7)。然而，它在淀粉噴射液化中確實(shí)表現(xiàn)出顯著增加的效能，尤其是在低pH時(shí)，如下面表IV所示。典型地是利用一個(gè)在混和室后裝有一個(gè)2.5升延遲旋管和一個(gè)末端返壓閥的HydroheaterM103-M蒸氣噴射器來(lái)進(jìn)行淀粉的液化。通過(guò)一個(gè)Moyno泵將淀粉加入噴射器，蒸氣通過(guò)一個(gè)150psi的蒸氣線(xiàn)供應(yīng)，并降低至90-100psi。溫度探針被安裝在Hydroheater噴射器之后和返壓閥之前。淀粉勻漿由玉米濕法研磨機(jī)制備，并在兩天內(nèi)使用。用去離子水將淀粉稀釋至預(yù)期的固形物水平，并用2％的NaOH或飽和Na2CO3調(diào)節(jié)淀粉的pH。典型的液化條件是淀粉32％-35％固形物鈣離子40-50ppm(加入30即m)pH5.0-6.0α-淀粉酶12-14LU/g干淀粉以大約350ml/min的速率將淀粉引入噴射器。噴射器的溫度被保持在105-107℃。將淀粉樣品從噴射器加熱器轉(zhuǎn)至95℃第二階段液化，并持續(xù)90分鐘。在第二階段液化作用后立即通過(guò)測(cè)定樣品中的葡萄糖當(dāng)量(DE)和檢測(cè)原始淀粉的存在來(lái)評(píng)價(jià)淀粉液化的程度，這兩種方法都是按照在《玉米精煉者協(xié)會(huì)成員公司標(biāo)準(zhǔn)分析方法》(StandardAnalyticalMethodsoftheMemberCompaniesoftheCornRefinersAssociation，Inc.)第六版中所描述的方法進(jìn)行。在大體上是上面所給的條件和pH6.0條件下處理淀粉時(shí)，將產(chǎn)生一種DE大約為10的且沒(méi)有原始淀粉的液化了的淀粉。利用本發(fā)明的突變體進(jìn)行的淀粉液化測(cè)試結(jié)果在表IV中列出。表IV變異體M15L(A4形式)和M15L在淀粉液化中的效能pH90分鐘后的DESpezymeAA205.99.9M15L(A4形式)5.910.4SpezymeAA205.21.2M15L(A4形式)5.22.2SpezymeAA205.99.3*M15L5.911.3*SpezymeAA205.53.25**M15L5.56.7*SpezymeAA205.20.7*M15L5.23.65***三次試驗(yàn)的平均值**兩次試驗(yàn)的平均值實(shí)施例5M15X變異體的構(gòu)建大體上按照上面實(shí)施例3中所描述的過(guò)程，在M15處的所有變異體(M15X)都是如在圖12中所概括的通過(guò)盒式誘變?cè)谔烊坏匾卵挎邨U菌中制備1)定點(diǎn)誘變(通過(guò)在M13中引物的延伸)被用于在M15密碼子側(cè)翼引入單一限制性位點(diǎn)，以便于插入一個(gè)誘變盒。特別是通過(guò)利用下面列出的兩個(gè)寡核苷酸M15XBstB15′-GATGCAGTATTTCGAACTGGTATA-3′BstB1序列號(hào)48M15XMsc15′-TGCCCAATGATGGCCAACATTGGAAG-3′Msc1序列號(hào)4949引入在密碼子11-13處的BstB1和在密碼子18-20處的Msc1位點(diǎn)。2)然后通過(guò)從誘變了的淀粉酶(BstB1+，Msc1+)中將Sfi1-SstII片段通過(guò)亞克隆至質(zhì)粒pBLapr中構(gòu)建用于M15X盒式誘變的載體。然后用BstB1和Msc1消化所獲得的質(zhì)粒，并通過(guò)從聚丙烯酰胺凝膠中電洗脫分離大的載體片段。3)按照與產(chǎn)生M197X變異體一樣的方法制備誘變盒。將合成的每個(gè)分別編碼一種在15位密碼子處的置換的寡聚物與一個(gè)共同的底鏈引物退火。通過(guò)盒子與載體適宜地連接使Msc1位點(diǎn)被破壞，這就允許通過(guò)這個(gè)位點(diǎn)的喪失來(lái)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體。底鏈引物含有一個(gè)單一的SnaBI位點(diǎn)，這允許通過(guò)篩選SnabI位點(diǎn)而將由底鏈衍生來(lái)的轉(zhuǎn)化體被清除。這個(gè)引物也含有一個(gè)讀框移位，這也能清除由通用底鏈衍生的突變體淀粉酶的表達(dá)。合成的盒子在表V中列出，總的盒式誘變策略在圖12中闡明。表V用于盒式誘變來(lái)產(chǎn)生M15X變異體的合成寡核苷酸M15A(BstB1)CGAATGGTATGCTCCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)50M15R(BstB1)CGAATGGTATCGCCCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)51M15N(BstB1)CGAATGGTATAATCCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)52M15D(BstB1)CGAATGGTATGATCCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)53M15H(BstB1)CGAATGGTATCACCCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)54M15K(BstB1)CGAATGGTATAAACCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)55M15P(BstB1)CGAATGGTATCCGCCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)56M15S(BstB1)CGAATGGTATTCTCCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)57M15T(BstB1)CGAATGGTACACTCCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)58M15V(BstB1)CGAATGGTATGTTCCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)59M15C(BstB1)CGAATGGTATTGTCCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)60M15Q(BstB1)CGAATGGTATCAACCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)61M15E(BstB1)CGAATGGTATGAACCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)62M15G(BstB1)CGAATGGTATGGTCCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)63M15I(BstB1)CGAATGGTATATTCCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)64M15F(BstB1)CGAATGGTATTTTCCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)65M15W(BstB1)CGAATGGTACTGGCCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)66M15Y(BstB1)CGAATGGTATTATCCCAATGACGG(Msc1)序列號(hào)67M15x(Msc1)CCGTCATTGGGACTACGTACCATT(BstB1)序列號(hào)68(底鏈)下劃線(xiàn)表示在位點(diǎn)15處氨基酸的密碼子改變。在某些情況下產(chǎn)生保守性置換來(lái)阻止新的限制性位點(diǎn)的引入。實(shí)施例6利用M15X變異體的桌面液化通過(guò)利用桌面液化系統(tǒng)與SpezymeAA20(購(gòu)自GenencorIntermational，lnc.)在pH5.5時(shí)的液化作用相比，對(duì)按照實(shí)施例5制備的11種帶有M15置換的α-淀粉酶變異體檢測(cè)活性。桌面規(guī)模的液化系統(tǒng)由一個(gè)在距前端大約12英寸處裝有一個(gè)7英寸長(zhǎng)的靜態(tài)混和元件和在后端裝有一個(gè)30psi返壓閥的不銹鋼旋管(直徑0.25英寸，容積大約350ml)組成。除兩端外，旋管都浸于一裝有溫度控制加熱元件的甘油-水浴中，保持浴器溫度在105-106℃。通過(guò)攪拌保持懸浮狀態(tài)的含有酶的淀粉勻漿經(jīng)一個(gè)活塞驅(qū)動(dòng)計(jì)量泵以大約70ml/min的速度注入反應(yīng)旋管。淀粉從旋管的末端被回收，并被移入第二級(jí)反應(yīng)(95℃90分鐘)。第二級(jí)反應(yīng)后，立即按照實(shí)施例4中描述的方法測(cè)定液化淀粉的DE。結(jié)果見(jiàn)圖16。實(shí)施例7M197X變異體的鑒別正如在圖9中可看到的，M197X(A4形式)變異體表達(dá)很大范圍的淀粉酶活性(在可溶性底物檢測(cè)中測(cè)定的)。通過(guò)用兩倍容積的乙醇沉淀和重懸從上清中部分純化淀粉酶。然后在pH5.0的醋酸鹽緩沖液中在5mM氯化鈣存在下通過(guò)加熱至95℃5分鐘來(lái)篩選它們的熱穩(wěn)定性；A4野生型在孵育后保持28％的活性。對(duì)于M197W和M197P，我們無(wú)法從上清中回收活性蛋白。經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)M197H變異體含有第二個(gè)突變，N190K。M197L在一獨(dú)立的試驗(yàn)中被鑒定，它是熱穩(wěn)定性最低的變異體之一。在淀粉酶活性的表達(dá)和熱穩(wěn)定性之間似乎有一種廣泛的相關(guān)性。在保持或提高熱穩(wěn)定性上，地衣芽孢桿菌淀粉酶被限定于在197位點(diǎn)上可容納的殘基在這些條件下優(yōu)選半胱氨酸和蘇氨酸來(lái)獲得最高的熱穩(wěn)定性，而丙氨酸和異亮氨酸具有中等的穩(wěn)定性。然而，在+197位點(diǎn)上其它的置換則導(dǎo)致可能在其它用途中有用的降低了的穩(wěn)定性。另外，在+197位點(diǎn)上的不同的置換可能具有其它的有益的性質(zhì)，如改變了的pH效能曲線(xiàn)或改變了的氧化穩(wěn)定性。例如，M197C變異體被發(fā)現(xiàn)很容易被空氣所氧化滅活，但卻有提高了的熱穩(wěn)定性。相反地，與M197L變異體相比，M197T和M197A在pH5.0到pH10之間保持對(duì)過(guò)氧化物滅活作用的抗性(圖7)同時(shí)，不僅保持有高的熱穩(wěn)定性(圖10)，而且還保持有高的活性(表III)。實(shí)施例8在洗滌劑配方中的穩(wěn)定性和效能在自動(dòng)洗碗劑(ADD)基質(zhì)中測(cè)定了M197T(A4形式)、M197T和M197A(A4形式)的穩(wěn)定性。2ppmSarinaseTM(在ADD中被廣泛使用的類(lèi)型的蛋白酶，購(gòu)自NovoIndustries)被加入兩種商品化的含有漂白劑的ADD中CascadeTM(ProcterandGamble，Ltd.)和SunlightTM(Unilever)，追蹤在65℃淀粉酶變異體和TermamylTM(一種購(gòu)自NovoNordisk的熱穩(wěn)定α-淀粉酶，A/S)滅活的時(shí)間過(guò)程。在這兩種情況下所用的ADD產(chǎn)品的濃度都等于“預(yù)浸泡”條件每升水(每加侖7克的硬度)中14克產(chǎn)品。正如可被看到的(圖11a和11b)，M197A變異體的兩種形式都比TermamylTm和M197T(A4形式)穩(wěn)定的多，TermamylTM和M197A(A4形式)在第一個(gè)測(cè)試將要進(jìn)行前便被滅活。如通過(guò)下面的方法確定的，這種穩(wěn)定性的益處在淀粉存在或不存在時(shí)都可看到。淀粉酶被加到5mlADD和SavinaseTM中，在一試管中預(yù)熱，旋振后，利用可溶性底物檢測(cè)方法作為時(shí)間函數(shù)測(cè)定其活性。“+淀粉”試管有被烘烤到內(nèi)表面的套管狀淀粉(140℃，60分鐘)。結(jié)果展示于圖11a和11b中。實(shí)施例9M15X變異體的鑒定所有的M15X變異體在枯草芽孢桿菌中都被繁殖。所檢測(cè)的其表達(dá)水平如圖13所示。通過(guò)20-70％硫酸銨的切換將淀粉酶分離和部分純化。按照實(shí)施例3測(cè)定這些變異體對(duì)可溶性底物的比活性(圖14)。許多M15X淀粉酶具有比SpezymeAA20更高的比活性。在pH5的醋酸鹽緩沖液中，在5mM氯化鈣存在的條件下，通過(guò)將淀粉酶加熱至90℃持續(xù)5分鐘來(lái)對(duì)變異體進(jìn)行桌面熱穩(wěn)定性檢測(cè)(圖15)。大部分的變異體和SpezymeAA20都進(jìn)行了這個(gè)檢測(cè)。那些在檢測(cè)中表現(xiàn)出適當(dāng)穩(wěn)定性的變異體(適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性被定義為保持至少大約SpezymeAA20熱穩(wěn)定性60％的熱穩(wěn)定性)被用來(lái)測(cè)試其對(duì)淀粉的比活性和在pH5.5時(shí)的液化效能。那些變異體中最有趣的表現(xiàn)在圖16中。M15D、N和T，與L一起在pH5.5條件下的液化作用中比SpezymeAA20表現(xiàn)出更高的效能，而且在可溶性底物和淀粉水解檢測(cè)中都具有增加的比活性?？偟膩?lái)說(shuō)，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)置換15位上的蛋氨酸可以使變異體具有增加了的低pH下的液化效能和/或增加了的比活性。實(shí)施例10對(duì)氧化作用的色氨酸敏感性氯胺-T(N-氯-對(duì)甲苯磺酰胺鈉鹽)是一種選擇性氧化劑，在中性或堿性pH下它可將蛋氨酸氧化為蛋氨酸亞砜。在酸性pH下，氯胺-T修飾蛋氨酸和色氨酸(Schechter，Y.，Burstein，Y.和Patchornik，A.(1975)《生物化學(xué)》(Biochemistry)14(20)4497-4503)。圖17顯示的是在pH8.0下氯胺-T對(duì)地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的滅活(AA20＝0.65mg/ml，M197A＝1.7mg/ml，M197L＝1.7mg/ml)。數(shù)據(jù)表明，通過(guò)將197位上的蛋氨酸改變?yōu)榱涟彼峄虍惲涟彼?，?淀粉酶的滅活可被阻止。相反，如圖18所示，在pH4.0時(shí)，M197A和M197L的滅活仍繼續(xù)，但需要更多當(dāng)量的氯胺-T(圖18，AA20＝0.22mg/ml，M197A＝4.3mg/ml，M197L＝0.53mg/ml；pH4.0的200mM醋酸鈉)。這表明，一個(gè)色氨酸殘基也參與氯胺-T介導(dǎo)的滅活作用。另外，胰酶圖譜和隨后的氨基酸序列分析表明在138位點(diǎn)上的色氨酸被氯胺-T氧化(資料未附)。為了證明這一點(diǎn)，按照下面提供的方法制備在138位上色氨酸的定點(diǎn)突變體。α-淀粉酶雙突變體W138和M197的制備某些W138(F，Y和A)的變異體被制備成帶有M197T的雙突變體(按照實(shí)施例3公開(kāi)的方法制備)。按照在實(shí)施例1和3中描述的方法制備雙突變體。通常，DNA的單一負(fù)鏈?zhǔn)怯蓮牡匾卵挎邨U菌α-淀粉酶M197T突變體的1.72kb編碼序列(PstI-SstI)的一個(gè)M13MP18克隆制備。利用下面列出的引物進(jìn)行定點(diǎn)誘變，除了T4基因32蛋白和T4聚合酶被用來(lái)置換klenow外基本上是通過(guò)Zoller，M.等《1983)的方法。為了鑒別這些帶有適宜突變的克隆，引物都含有單一的位點(diǎn)和預(yù)期的突變。色氨酸138到苯丙氨酸133134135136137138139140141142143CACCTAATTAAAGCTTTCACACATTTTCATTTT序列號(hào)42HindIII色氨酸138到酪氨酸133134135136137138139140141142143CACCTAATTAAAGCTTACACACATTTTCATTTT序列號(hào)43HindIII色氨酸138到丙氨酸-這個(gè)引物也在138位的上游和下游構(gòu)建單一位點(diǎn)。127128129130131132133134135136137138139140141142CCGCGTAATTTCCGGAGAACACCTAATTAAAGCCGCAACACATTTTCATBspEI143144145146147TTTCCCGGGCGCGGCAG序列號(hào)44XmaI通過(guò)限制性酶切分析鑒定突變體，并對(duì)W138F和W138Y利用DNA測(cè)序證實(shí)。W138A序列顯示了一個(gè)在單一BspI和XmaI之間的核苷酸缺失，然而，其余的基因被測(cè)序是正確的。含有W138X和M197T突變的1.37kb的SstII/SstI片段被從M13MP18中移出并轉(zhuǎn)入表達(dá)載體pBLapr，形成pBLapr(W138F，M197T)和pBLapr(W138Y，M197T)。含有單一BspEI和XmaI位點(diǎn)的片段被克隆到pBLapr(BspEI，XmaI，M197T)中，因?yàn)檫@對(duì)在138位置上含有其它氨基酸置換的克隆盒子是有幫助的。在138位氨基酸的單突變按照在前面實(shí)施例中描述的總的方法，制備某些W138(F，Y，L，H和C)的單突變體。在實(shí)施例7中的質(zhì)粒pBLapr(W138X，M197T)上含有M197T突變的1.24kb的Asp718-SstI片段被在197位點(diǎn)上為蛋氨酸的野生型片段取代，結(jié)果產(chǎn)生pBLapr(W138F)、pBLapr(W138Y)和pBLapr(BspEI，XmaI)。利用下面的引物色氨酸138到亮氨酸CCGGAGAACACCTAATTAAAGCCCTAACACATTTTCATTTTC序列號(hào)45色氨酸138到組氨酸CCGGAGAACACCTAATTAAAGCCCACACACATTTTCATTTTC序列號(hào)46色氨酸138到半胱氨酸CCGGAGAACACCTAATTAAAGCCTGCACACATTTTCATTTTC序列號(hào)47通過(guò)將合成的盒子連接到pBLapr(BspEI，XmaI)載體中，制備出突變體W138L、W138H、和W138C。雙突變體M197T/W138F和M197T/W138Y與氯胺-T的反應(yīng)同野生型相比(AA20＝0.75mg/ml，M197T/138F＝0.64mg/ml，M197T/W138Y＝0.60mg/ml；pH5.0的50mM醋酸鈉)。圖19中所示的結(jié)果表明，色氨酸138的誘變導(dǎo)致變異體對(duì)氯胺-T的抗性更強(qiáng)。實(shí)施例11多突變體的制備按照實(shí)施例1、3、5和10的方法，制備如下的多突變體M15T/M197T；M15S/M197T；W138Y/M197T；M15S/W138Y/M197T和M15T/W138Y/M197T。這些多突變體中的一些曾被舉例說(shuō)明，例如在實(shí)施例10中W138Y/M197T的制備和測(cè)試。通過(guò)限制性酶切分析鑒定多突變體。在本發(fā)明范圍內(nèi)的各種多突變體被進(jìn)一步測(cè)試其作為清潔劑(自動(dòng)洗碗劑)的添加劑的效能。下面詳細(xì)描述了這些測(cè)試。穩(wěn)定性測(cè)試在硬度為7gpg的水中制備一含有過(guò)硼酸鹽和TAED的4000ppm的自動(dòng)洗碗劑(ADD)。將上面描述的某些淀粉酶突變體加入到這種ADD溶液中產(chǎn)生一個(gè)當(dāng)利用Ceralpha方法(Megazyme(Austri.)Pty.Ltd.，Parramatta，NSW，澳大利亞)檢測(cè)時(shí)為0.4的速率。將一系列樣品在室溫(21-23℃)下保持大約30分鐘(未被加熱)。將另一系列樣品從室溫加熱至大約65℃(被加熱)。在加入酶30分鐘后測(cè)定淀粉酶突變體的活性，并計(jì)算與在加入時(shí)酶活性的相對(duì)活性(相對(duì)活性％)。圖20所示的結(jié)果表明，為了在含有ADD+過(guò)硼酸鹽+TAED的配方中的穩(wěn)定性，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶在+197位點(diǎn)上的蛋氨酸應(yīng)該被修飾。淀粉水解檢測(cè)在硬度為7gpg的水中制備一含有過(guò)硼酸鹽和TAED的4000ppm的自動(dòng)洗碗劑(ADD)溶液并加入三塊烹制過(guò)的彎形空心面。上面描述的淀粉酶突變體被加入到這種ADD溶液中以制備一終濃度為5ppm的活性酶。利用二硝基水楊酸法一葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為對(duì)照測(cè)定試管在50℃孵育大約30分鐘所釋放出的還原糖的濃度。結(jié)果見(jiàn)表VI。表VI</tables></tables>表VI所示的結(jié)果表明，M15T/M197T、M15S/M197T、W138Y/M197T、M15S/W138Y/M197T和M15T/W138Y/M197T與不加酶和野生型α-淀粉酶對(duì)照相比效果更好。燕麥片污跡用一烹制過(guò)的混合的燕麥片糊將碟子均勻弄臟，并在37℃過(guò)夜烘干。將碟子放入一個(gè)ASKOModel770洗碗機(jī)中利用10g的含有5％過(guò)硼酸鹽、3％TAED的自動(dòng)洗碗劑和11mg某種淀粉酶在45℃以快洗周期進(jìn)行洗滌。在弄臟前、弄臟后和清洗后都將碟子稱(chēng)重，計(jì)算從所有碟子上清除的臟污的平均％。數(shù)據(jù)見(jiàn)下面表VII。表VII</tables>這些數(shù)據(jù)表明，突變體酶提供了一個(gè)比由野生型提供的更大的效益。野生型淀粉酶在清除燕麥片中提供了比不加淀粉酶的ADD高20％的清潔效益。實(shí)施例12洗碗清潔劑組合物按照Korex自動(dòng)化洗碗劑(KorexAutomaticDishwasherDetergent)配方制造1％(w/w)野生型和突變體淀粉酶顆粒，其中加有5％(w/w)單水過(guò)硼酸鈉和3％(w/w)的TAED。將這些配方的樣品置于室溫(21-23℃)或在38℃和相對(duì)濕度80％的環(huán)境中4周。結(jié)果見(jiàn)圖21和22所示。資料表明，在洗滌劑中通過(guò)Ceralpha方法測(cè)定的野生型淀粉酶活性隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加而降低。在室溫下，突變體酶則非常穩(wěn)定。在38℃和相對(duì)濕度80％的條件下，所有突變體都比野生型更穩(wěn)定。用這些突變體淀粉酶配制自動(dòng)化洗碗劑的優(yōu)點(diǎn)是這些淀粉酶在過(guò)硼酸鹽和TAED存在下顯著地比野生型更穩(wěn)定，并且它們?cè)谙礈熘袨榍宄矸坌允澄镂圹E提供了一個(gè)重要的效能益處。實(shí)施例13氧化穩(wěn)定蛋白酶/氧化穩(wěn)定淀粉酶穩(wěn)定性的研究將含有1)野生型蛋白酶和野生型淀粉酶，或者2)按照在USRe34606中描述的方法制備的漂白劑穩(wěn)定蛋白酶(GG36-M222S)和漂白劑穩(wěn)定淀粉酶(AA20-M15T/W138Y/M197T)的酶顆粒以每種酶12.5mg的量溶于含有pH10.2的0.1M硼酸鈉和0.005％吐溫80緩沖液中。向9ml這種溶液中加入1ml蒸餾水或1ml30％過(guò)氧化氫。將溶液置25℃孵育30分鐘后，測(cè)定每種溶液中的蛋白酶和淀粉酶的活性，并以最初活性的％來(lái)記錄。資料見(jiàn)下面表VIII。表VIII</tables>資料表明，在對(duì)氧化作用敏感的氨基酸殘基上都有突變的一種漂白劑穩(wěn)定淀粉酶突變體和一種漂白劑穩(wěn)定蛋白酶突變體的聯(lián)合使用，在對(duì)漂白劑的滅活作用有抗性的配方中提供蛋白酶和淀粉酶聯(lián)合的益處。一種漂白劑穩(wěn)定淀粉酶和一種漂白劑穩(wěn)定蛋白酶的聯(lián)合使用在漂白劑中30分鐘后保持了它們大部分的初始活性，而野生型酶的聯(lián)合使用則在同樣的時(shí)間內(nèi)失去80％以上的初始活性。實(shí)施例14淀粉酶變異體的比較活性曲線(xiàn)獲得了淀粉酶變異體的活性曲線(xiàn)。將兩個(gè)Phadebas片(Phadebas淀粉酶測(cè)試試劑盒，PharmaciaDiagnostics)溶于分別裝有12毫升pH為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的緩沖液(0.05硼酸鹽/0.05M磷酸鉀/0.005M氯化鈣)的小瓶中來(lái)測(cè)定每種被測(cè)試酶的相對(duì)淀粉水解活性。在加入兩片后，所得pH值分別為6.21、7.0、7.68、8.75、9.72和10.63。將每個(gè)小瓶通過(guò)磁力攪拌混勻，混勻時(shí)用移液器吸200ul放入一Costar聚苯乙烯96孔板中。酶樣品從含有9.9mg/mlTermamyl(購(gòu)自丹麥NovoNordisk的野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶)、5.2mg/mlSpezymeAA20(購(gòu)自加州南舊金山GenencorInternational，Inc.的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶)或4.1mg/ml根據(jù)本發(fā)明的突變體淀粉酶(M15T/W138Y/M197T)的溶液中獲得。每個(gè)樣品在一淀粉酶檢測(cè)緩沖液(pH6.7的50mM醋酸鹽緩沖液、5mMCaCl2、0.002％吐溫20)中被稀釋到1/5000。用多通道移液器將10微升稀釋后的酶加入底物溶液。用Ika-SchuttlerMTS2板振蕩器以1100rpm30分鐘將反應(yīng)混合物混勻。用0.45微米親水96孔過(guò)濾板(由Millipore的多篩選過(guò)濾系統(tǒng)提供，Bedford，Mass.)通過(guò)從含有酶和溶解了藍(lán)色染料的上清中過(guò)濾不可溶的底物顆粒來(lái)中止反應(yīng)。用一多通道移液器移走樣品。每個(gè)只含有底物而沒(méi)有酶的pH設(shè)立一個(gè)200微升的對(duì)照。從過(guò)濾后的上清中，再用多通道移液器從每個(gè)樣品吸取100微升放入另一個(gè)Costar聚苯乙烯96孔板中，在620nm處讀取光吸收值。通過(guò)活性百分比對(duì)孵育時(shí)間作圖，結(jié)果見(jiàn)圖23。如圖23所示，與Termamyl或SpezymeAA20相比，根據(jù)本發(fā)明的突變體酶在從至少6到8.5之間的pH范圍內(nèi)具有更大的活性。實(shí)施例15淀粉酶對(duì)過(guò)乙酸的氧化穩(wěn)定性在25℃將12.3微升淀粉酶稀釋于裝有977.7微升pH10.0的含0.1MCHES(2-n-環(huán)己基氨基乙烷-磺酸)和0.005M氯化鈣的溶液的Eppendorf管中。通過(guò)旋振將樣品混勻，移走10微升用來(lái)在麥芽糖庚糖上測(cè)定初活性。其余的980微升與10微升32％的過(guò)乙酸混和。測(cè)試過(guò)程中，將樣品置于以甘油作為導(dǎo)熱液體的加熱器中孵育。測(cè)量反應(yīng)管內(nèi)部溫度為52℃。反應(yīng)過(guò)程中試管的蓋子被密封。緩沖液的pH在52℃時(shí)約為9.3，這個(gè)值與在《酶學(xué)方法》(MethodsofEnzymology)87卷(1982)中報(bào)道的CHES緩沖液在較高溫度時(shí)預(yù)期的pH位移一致。樣品被旋勻，在0、15、30、45和60分鐘時(shí)分別取出10微升進(jìn)行活性檢測(cè)。通過(guò)相對(duì)活性(基于向溶液中釋放的水解的淀粉量)對(duì)pH值作圖，結(jié)果顯示于圖24中。如圖24所示，與Termamyl相比，在pH9.3下與氧化劑孵育時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的突變體酶與其初活性相比保持一種特別高的活性百分比。實(shí)施例16在液體衣物洗滌劑中的比較淀粉酶清洗效能與商品化的野生型淀粉酶相比較，對(duì)根據(jù)發(fā)明的突變體淀粉酶在典型的液體衣物洗滌劑條件下的清洗效能進(jìn)行了測(cè)試。將被玉米淀粉/墨汁弄臟的棉花樣品PEPD7435WRL(從ScientificServicesS/D，Inc.，SparrowBush，N.Y.獲得)用于測(cè)試淀粉酶添加劑的清洗效能。將油脂釋放性TIDE濃縮洗滌劑(商品化的并購(gòu)自Proctor&amp;Gamble，CincinnatiOhio)加熱至90℃一個(gè)小時(shí)來(lái)滅活存在的任何酶(如蛋白酶或脂肪酶)。所用的淀粉酶是Termamyl60T淀粉酶(購(gòu)自丹麥NovoNordisk的野生型地衣芽孢桿菌淀粉酶)和本發(fā)明的淀粉酶，M15T/W138Y/M197T。對(duì)1.0克的液體洗滌劑和足以在最終清洗溶液中產(chǎn)生0.05、0.1、0.5或1.0ppm淀粉酶濃度的淀粉酶(Termamyl或M15T/W138Y/M197T)進(jìn)行定量并放置備用。設(shè)立一不加淀粉酶的對(duì)照。洗滌測(cè)試是在一個(gè)Model7243STerg-o-tometer(美國(guó)測(cè)試公司(UnitedStatesTestingCo.)，Hoboken，N.J.)中進(jìn)行。清洗液為加有10ml硬水濃縮物至100ppmCa2+離子和50ppmMg2+終濃度的蒸餾水。將1升清洗液加入每個(gè)Terg-o-tometer罐中。在清洗液達(dá)到適宜的溫度時(shí)，打開(kāi)攪拌器，并將洗滌劑和淀粉酶同時(shí)加入清洗液中。經(jīng)3分鐘溶解后，將棉花樣品加入清洗液中。以100rpm攪拌15分鐘后，關(guān)閉攪拌器并從Terg-o-tometer罐中取出棉花樣品，放入洗衣機(jī)中用冷水漂洗10分鐘。漂洗后，取出沾淀粉的棉花樣品并壓干。然后用一反射測(cè)試儀讀取樣品來(lái)測(cè)定清潔的量。在40℃和55℃都進(jìn)行試驗(yàn)。通過(guò)以反射度的變化(僅用清潔劑標(biāo)準(zhǔn)化了的)對(duì)加入的淀粉酶的ppm作圖，結(jié)果分別表現(xiàn)于圖25和26。如在圖25和26中所示，突變體淀粉酶在清洗能力上明顯比商品化的淀粉酶表現(xiàn)得更出色。實(shí)施例17本發(fā)明的淀粉酶在液體洗滌劑中的洗滌效能聯(lián)合應(yīng)用兩種商品化的液體洗滌劑組合物，SA8(購(gòu)自AmwayCorp.，Ada，Michigan)和Purex(購(gòu)自DialCorp.，Phoenix，Arizona)對(duì)根據(jù)本發(fā)明的突變體淀粉酶的洗滌效能進(jìn)行測(cè)試。在清洗液中將突變體淀粉酶(M15T/W138Y/M197T)加至0.0，0.05，0.1，0.5，1.0和5.0ppm的終濃度。將SA8以0.75克/升的量加入清洗液使洗滌溶液的pH為6.5，溫度為55℃。Purex以1.0克/升的量加入清洗液，使洗滌溶液的pH為9.0，溫度為40℃。其它方面的洗滌程序按照實(shí)施例16進(jìn)行。對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)以確定反射度的變化(僅同洗滌劑標(biāo)準(zhǔn)化了的)。在圖27中給出結(jié)果。如在圖27中可看到的，淀粉酶的加入顯著改善了洗滌劑的清洗能力。序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人GENENCORINTERNATIONAL，INC.(ii)發(fā)明目題一種改進(jìn)的含有淀粉酶的衣物洗滌劑組合物(iii)序列數(shù)68(iv)聯(lián)系地址(A)收信人GenencorInternational(B)街180Kimball路(C)城市南舊金山(D)州加州(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵編94080(V)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，版本#1.25(vi)本申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類(lèi)(viii)律師/代理人信息(A)姓名Stone，ChristoDherL.(B)注冊(cè)號(hào)35,696(C)參考/案卷號(hào)GC220-4(ix)通訊信息(A)電話(huà)(415)742-7555(B)傳真(415)742-7217(2)序列號(hào)1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度56個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)1GATCAAAACATAAAAAACCGGCCTTGGCCCCGCCGGTTTTTTATTATTTTTGAGCT56(2)序列號(hào)2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度29個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)2TGGGACGCTGGCGCAGTACTTTGAATGGT29(2)序列號(hào)3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度34個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)3TGATGCAGTACTTTGAATGGTACCTGCCCAATGA34(2)序列號(hào)4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)4GATTATTTGTTGTATGCCGATATCGACTATGACCAT36(2)序列號(hào)5的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)5CGGGGAAGGAGGCCTTTACGGTAGCT26(2)序列號(hào)6的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)6GCGGCTATGACTTAAGGAAATTGC24(2)序列號(hào)7的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度23個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)7CTACGGGGATGCATACGGGACGA23(2)序列號(hào)8的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)8CTACGGGGATTACTACGGGACCAAGGGAGACTCCC35(2)序列號(hào)9的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)9CCGGTGGGGCCAAGCGGGCCTATGTTGGCCGGCAAA36(2)序列號(hào)10的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度45個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)10CATCAGCGTCCCATTAAGATTTGCAGCCTGCGCAGACATGTTGCT45(2)序列號(hào)11的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)11GATTATTTGGCGTATGCCGATATCGACTATGACCAT36(2)序列號(hào)12的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)12GGGAAGTTTCGAATGAAAACG21(2)序列號(hào)13的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)13GTCGGCATATGCATATAATCATAGTTGCCGTTTTCATT38(2)序列號(hào)14的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)14CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGATCTATGCCGAC41(2)序列號(hào)15的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)15CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGTTCTATGCCGAC41(2)序列號(hào)16的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)16CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGGTTTATGCCGAC41(2)序列號(hào)17的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)17CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAGCTATGCCGAC41(2)序列號(hào)18的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)18CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGCCTTATGCCGAC41(2)序列號(hào)19的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)19CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGACATATGCCGAC41(2)序列號(hào)20的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)20CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGTACTATGCCGAC41(2)序列號(hào)21的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)21CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGCACTATGCCGAC41(2)序列號(hào)22的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)22CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGGGCTATGCCGAC41(2)序列號(hào)23的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)23CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGCAATATGCCGAC41(2)序列號(hào)24的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)24CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAACTATGCCGAC41(2)序列號(hào)25的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)25GCAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAAATATGCCGAC41(2)序列號(hào)26的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)26CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGGATTATGCCGAC41(2)序列號(hào)27的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)27CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGGAATATGCCGAC41(2)序列號(hào)28的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)28CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGTGTATTGCCGAC41(2)序列號(hào)29的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)29CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGTGGTATGCCGAC41(2)序列號(hào)30的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)30CGAATGAAAACGGCAACTATGATTATTTGAGATATGCCGAC41(2)序列號(hào)31的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1968個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)31AGCTTGAAGAAGTGAAGAAGCAGAGAGGCTATTGAATAAATGAGTAGAAAGCGCCATATC60GGCGCTTTTCTTTTGGAAGAAAATATAGGGAAAATGGTACTTGTTAAAAATTCGGAATAT120TTATACAACATCATATGTTTCACATTGAAAGGGGAGGAGAATCATGAA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浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)44CCGCGTAATTTCCGGAGAACACCTAATTAAAGCCGCAACACATTTTCATTTTCCCGGGCG60CGGCAG66(2)序列號(hào)45的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)45CCGGAGAACACCTAATTAAAGCCCTAACACATTTTCATTTTC42(2)序列號(hào)46的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)46CCGGAGAACACCTAATTAAAGCCCACACACATTTTCATTTTC42(2)序列號(hào)47的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)47CCGGAGAACACCTAATTAAAGCCTGCACACATTTTCATTTTC42(2)序列號(hào)48的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)48GATGCAGTATTTCGAACTGGTATA24(2)序列號(hào)49的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)49TGCCCAATGATGGCCAACATTGGAAG26(2)序列號(hào)50的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)50CGAATGGTATGCTCCCAATGACGG24(2)序列號(hào)51的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)51CGAATGGTATCGCCCCAATGACGG24(2)序列號(hào)52的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)52CGAATGGTATAATCCCAATGACGG24(2)序列號(hào)53的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)53CGAATGGTATGATCCCAATGACGG24(2)序列號(hào)54的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)54CGAATGGTATCACCCCAATGACGG24(2)序列號(hào)55的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)55CGAATGGTATAAACCCAATGACGG24(2)序列號(hào)56的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)56CGAATGGTATCCGCCCAATGACGG24(2)序列號(hào)57的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)57CGAATGGTATTCTCCCAATGACGG24(2)序列號(hào)58的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)58CGAATGGTACACTCCCAATGACGG24(2)序列號(hào)59的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)59CGAATGGTATGTTCCCAATGACGG24(2)序列號(hào)60的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)60CGAArGGTATTGTCCCAATGACGG24(2)序列號(hào)61的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)61CGAATGGTATCAACCCAATGACGG24(2)序列號(hào)62的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)62CGAATGGTATGAACCCAATGACGG24(2)序列號(hào)63的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)63CGAATGGTATGGTCCCAATGACGG24(2)序列號(hào)64的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)64CGAATGGTATATTCCCAATGACGG24(2)序列號(hào)65的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)65CGAATGGTATTTTCCCAATGACGG24(2)序列號(hào)66的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)66CGAATGGTACTGGCCCAATGACGG24(2)序列號(hào)67的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)67CGAATGGTATTATCCCAATGACGG14(2)序列號(hào)68的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)成鏈類(lèi)型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型DNA(基因組的)(xi)序列描述序列號(hào)68CCGTCATTGGGACTACGTACCATT2權(quán)利要求1.一種改進(jìn)的衣物洗滌劑組合物，其特征在于在衣物洗滌劑組合物中包含作為編碼一種α-淀粉酶的突變DNA序列表達(dá)產(chǎn)物的一種突變體α-淀粉酶，通過(guò)置換一個(gè)與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶M+197位點(diǎn)等價(jià)的位點(diǎn)上的蛋氨酸和置換與地衣芽孢桿菌α-淀粉酶M+15或W+138位點(diǎn)等價(jià)的位點(diǎn)上的一個(gè)或多個(gè)蛋氨酸或色氨酸而從一個(gè)前體α-淀粉酶得到該突變DNA序列。2.權(quán)利要求1的一種改進(jìn)的衣物洗滌劑組合物，其中洗滌組合物是一液體組合物。3.權(quán)利要求1的一種改進(jìn)的衣物洗滌劑組合物，其中突變體α-淀粉酶選自M15T/M197T、M15S/M197T、W138Y/M197T、M15S/W138Y/M197T和M15T/W138Y/M197T。4.權(quán)利要求1的一種改進(jìn)的衣物洗滌劑組合物，其中還包括作為編碼一種蛋白酶的突變DNA序列表達(dá)產(chǎn)物的突變體蛋白酶，通過(guò)置換一個(gè)與解淀粉芽孢桿菌蛋白酶的M+222位點(diǎn)等價(jià)的位點(diǎn)上的蛋氨酸而從一種前體蛋白酶得到該突變DNA序列。5.權(quán)利要求4的一種改進(jìn)的衣物洗滌劑組合物，其中突變蛋白酶含有選自丙氨酸、半胱氨酸和絲氨酸的置換。6.權(quán)利要求4的一種改進(jìn)的衣物洗滌劑組合物，其中含有選自M15T/M197T、M15S/M197T、W138Y/M197T、M15S/W138Y/M197T和M15T/W138Y/M197T的一種α-淀粉酶突變體和選自M222C、M222S和M222A的一種蛋白酶突變體。7.權(quán)利要求2的一種改進(jìn)的衣物洗滌劑組合物，其中液體洗滌劑的pH在大約6.0到10.0之間。8.根據(jù)權(quán)利要求1的一種改進(jìn)的衣物洗滌劑組合物，其中所說(shuō)的衣物洗滌劑含有漂白劑。9.根據(jù)權(quán)利要求8的一種改進(jìn)的衣物洗滌劑組合物，其中所說(shuō)的衣物洗滌劑具有大約10以上的pH。10.根據(jù)權(quán)利要求9的一種改進(jìn)的衣物洗滌劑組合物，其中所說(shuō)的衣物洗滌劑是顆粒狀的。全文摘要這里公開(kāi)了含有天然存在或重組α－淀粉酶的DNA序列來(lái)源的新型α－淀粉酶突變體的衣物洗滌劑。總體上,通過(guò)體外修飾一個(gè)編碼天然存在或重組α－淀粉酶的前體DNA序列以產(chǎn)生在一前體α－淀粉酶的氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)可氧化氨基酸殘基的置換(取代)或缺失來(lái)獲得突變體α－淀粉酶。與前體相比,這種含有突變體α－淀粉酶的衣物洗滌劑具有增加了的洗滌能力穩(wěn)定性和/或改變了的pH效能曲線(xiàn)和/或改變的熱穩(wěn)定性。文檔編號(hào)C11D3/38GK1179176SQ96192801公開(kāi)日1998年4月15日申請(qǐng)日期1996年3月22日優(yōu)先權(quán)日1996年3月22日發(fā)明者C·C·巴尼特,S·G·伯耶爾,C·米奇恩森,S·D·保爾申請(qǐng)人:金克克國(guó)際有限公司