專利名稱：一株生防放線菌-淀粉酶產色鏈霉菌d的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物技術領域，特別是涉及生防放線菌——淀粉酶產色鏈霉菌D的培養(yǎng)及其代謝產物的分離與應用。

背景技術：
放線菌(Actinomycetes)與人類的關系極為密切。據(jù)統(tǒng)計，在已發(fā)現(xiàn)的抗生素中，有61.7％為放線菌所產生。常用的抗生素除青霉素和頭孢霉素類外，絕大多數(shù)都是放線菌的產物。土壤是放線菌棲居的重要場所，從土壤中獲得具有高效抗菌活性的放線菌產生抗生素是目前世界范圍內研制開發(fā)新醫(yī)藥和新農藥必不可少的基礎工作。
目前對植物病害的防治，主要采用化學農藥殺滅病原菌，但化學農藥對人畜的毒副作用和殘留問題至今仍難以有效的解決。利用放線菌產生的抗病原真菌的活性物質進行植物病原真菌病害的生物防治，則具有周期短、易于研究、便于生產、無毒無害等優(yōu)點。
本發(fā)明從杭州的土壤中分離到一株生防放線菌，并對此生防放線菌發(fā)酵代謝產物中的抗菌成分進行分離，得到了主要活性成分，經四大光譜分析，明確了其結構式。該發(fā)明為微生物源農藥的進一步研制和開發(fā)提供優(yōu)良的出發(fā)菌株和生物活性化合物。


發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對化學農藥不安全與微生物源農藥種類較少的不足，提供一種從杭州土壤中分離篩選出的放線菌-淀粉酶產色鏈霉菌D；本發(fā)明的另一目的是提供利用該菌株通過發(fā)酵提取其代謝產物制備成防治部分植物真菌病害的微生物農藥及其制備方法。
本發(fā)明淀粉酶產色鏈霉菌的分離、篩選與鑒定 是于2006年8月在浙江杭州臨安天目山采集的土樣中，經分離、培養(yǎng)、發(fā)酵、活性測定以及對抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的篩選等步驟獲得并保存；經微生物分類學鑒定為淀粉酶產色鏈霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)，定名為淀粉酶產色鏈霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)D。該菌株己在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期2007年5月25日，保藏登記號CGMCC No.2060。
淀粉酶產色鏈霉菌D顯微形態(tài)特征孢子絲直、鉤狀、松散螺旋形，孢子長圓、橢圓或卵圓形。
本發(fā)明所述的淀粉酶產色鏈霉菌D，經發(fā)酵提取可獲得對部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的活性化合物[2，4-Dioxo-1-(3，4，5-trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yl)-1，2，3，4-tetrahydro-pyrimidin-5-yl]-methylamino-acetic acid。
本發(fā)明目的通過以下技術方案來實現(xiàn) 一種防治番茄灰霉病和黃瓜枯萎病等植物真菌病害微生物農藥的制備方法，按以下步驟進行 (1)菌種的活化培養(yǎng)將分離保存的淀粉酶產色鏈霉菌D菌種移至試管內高氏一號斜面上，在28℃±1℃條件下，培養(yǎng)至試管斜面長滿孢子； (2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)液為每1000mL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，麩皮10g，NH4NO33g，(NH4)2SO45g，CaCO35g，MgSO41g，滅菌，待冷卻至40℃，在無菌條件下接種淀粉酶產色鏈霉菌D至發(fā)酵培養(yǎng)液中，在28℃±1℃條件下，培養(yǎng)5天； (3)發(fā)酵物提取發(fā)酵完畢，收集發(fā)酵液，按常規(guī)化學方法提取、層析，分離純化獲得活性化合物 [2，4-Dioxo-1-(3，4，5-trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yl)-1，2，3，4-tetrahydro-pyrimidin-5-yl]-methylamino-acetic acid，該化合物分子式為C13H19O9N3，結構式見下圖；
(4)將此活性化合物配以農用藥物輔料，制備成多種劑型的農用藥物。
本發(fā)明的有益效果 一是本發(fā)明從杭州土壤分離篩選出代謝物產量高、并對部分植物真菌病害病原菌具有較強抑制作用的淀粉酶產色鏈霉菌D，這為農業(yè)上防治植物真菌病害病原菌提供了一種微生物菌株； 二是本發(fā)明提供了從淀粉酶產色鏈霉菌D的發(fā)酵物中提取其活性代謝產物[2，4-Dioxo-1-(3，4，5-trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yl)-1，2，3，4-tetrahydro-pyrimidin-5-yl]-methylamino-acetic acid，并進而制備成可防治植物真菌病害的微生物源農藥的制備方法；該農藥應用于植物真菌病害的防治，其效果較常規(guī)化學藥劑略優(yōu)(見試驗例表1)，為農用殺菌劑的開發(fā)增添了新的途徑。

具體實施例方式 實施例1(淀粉酶產色鏈霉菌D的分離與篩選) 本發(fā)明于2006年8月在浙江臨安天目山采集的土樣中，經分離、培養(yǎng)、發(fā)酵、活性測定以及對抑制植物真菌病害病原菌有效菌株的篩選等步驟，從中獲得淀粉酶產色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)D，保存。
淀粉酶產色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)D抑菌活性測定取其發(fā)酵上清液1mL于無菌培養(yǎng)皿內，與9mL冷卻至50℃的PDA培養(yǎng)基迅速混勻，冷卻后在每個培養(yǎng)基平面分別放1個直徑為4mm的黃瓜枯萎病或番茄灰霉病等供試菌菌餅，菌餅接于培養(yǎng)皿中央(培養(yǎng)皿直徑為9cm)，置培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)36h，以無菌水處理作為對照，重復3次；采用十字交叉法測定菌落直徑，以下列公式計算抑制率
測定結果表明淀粉酶產色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)D代謝產物對黃瓜枯萎病菌和番茄灰霉病菌的抑制率分別為83.8％和78％。
實施例2(淀粉酶產色鏈霉菌D發(fā)酵代謝產物的制備方法) 按以下步驟進行 (1)菌種試管斜面活化培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基為高氏一號培養(yǎng)基，其組分與含量為K2HPO40.5g、KNO31g、MgSO40.5g、可溶性淀粉20g、NaCl 0.5g、FeSO40.01g、瓊脂20g，溶化后補足水至1L；在無菌條件下用接種環(huán)挑取少許淀粉酶產色鏈霉菌D的孢子，至已滅菌的高氏一號培養(yǎng)基試管(15×150mm)中，置培養(yǎng)箱內28℃±1℃，活化培養(yǎng)96h，至試管斜面長滿孢子； (2)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)液為每1000mL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，麩皮10g，NH4NO33g，(NH4)28O45g，CaCO35g，MgSO41g，余量為水；每300mL三角瓶裝40mL發(fā)酵培養(yǎng)液，配制后121℃滅菌20min，待冷卻至40℃在無菌條件下，挑取一鉑金環(huán)淀粉酶產色鏈霉菌D孢子接種，28℃±1℃，發(fā)酵培養(yǎng)5天； (3)發(fā)酵物提取發(fā)酵完畢后收集發(fā)酵液，在真空條件下濃縮至浸膏，再以異丙醇溶解，離心取上清液，濃縮至浸膏，而后上硅膠柱層析，以異丙醇和水(體積比10％～90％)洗脫，分離純化得活性化合物[2，4-Dioxo-1-(3，4，5-trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yl)-1，2，3，4-tetrahydro-pyrimidin-5-yl]-methylamino-acetic acid。
以下實施例3、4中所述的淀粉酶產色鏈霉菌D代謝產物均為實施例2所制產品；所述產品的百分含量均為質量百分比。
實施例3(利用淀粉酶產色鏈霉菌D發(fā)酵代謝產物制備成可濕性粉劑) 其中 白炭黑(上海富奇化工有限公司生產) 農乳0203-B(邢臺藍星助劑廠生產) 木質素磺酸鈉(上海威呈化工有限公司生產) 輕質碳酸鈣(上海大宇生化有限公司生產) 產品含1.5％活性化合物[2，4-Dioxo-1-(3，4，5-trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yl)-1，2，3，4-tetrahydro-pyrimidin-5-yl]-methylamino-acetic acid，加入2％的白炭黑作為吸附劑，并加入1％的農乳0203-B和3％的木質素磺酸鈉輔料，最后用輕質碳酸鈣補足到100％，混勻后，經氣流粉碎制成可濕性粉劑(以下內容中稱“產品A”)。
實施例4(利用淀粉酶產色鏈霉菌D發(fā)酵代謝產物制備成乳油) 其中 乙醇(上海申興制藥廠生產) 農乳0204(邢臺藍星助劑廠生產) 二甲苯(上海申興制藥廠生產) 產品2％的活性化合物[2，4-Dioxo-1-(3，4，5-trihydroxy-6-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yl)-1，2，3，4-tetrahydro-pyrimidin-5-yl]-methylamino-acetic acid，用4％的乙醇溶解，加入質量5％農乳0204-C作為乳化劑，最后用二甲苯補足到100％，攪拌混勻制成乳油(以下內容中稱“產品B”)。
試驗例(本發(fā)明產品與常規(guī)農藥防治效果對比試驗) 將“產品A、B”對黃瓜枯萎病或番茄灰霉病等植物病害進行防治試驗，以常規(guī)化學農藥、清水為對照，如表1、表2所示，試制的農用殺菌劑“產品A、B”比常規(guī)化學農藥防治效果略優(yōu)。
表1產品A對番茄灰霉病防效統(tǒng)計表 (藥效試驗均于2007年7月-9月在杭州市郊試驗農田進行) 表2產品B對黃瓜枯萎病防效統(tǒng)計表 (藥效試驗均于2007年7月-9月在杭州市郊試驗農田進行)
權利要求
1.一種淀粉酶產色鏈霉菌菌株，其保藏登記號為CGMCC No.2060。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種防治蔬菜真菌病害微生物農藥的制備方法，屬于微生物技術領域。該方法利用一種從浙江杭州臨安天目山采集的土樣中分離篩選出的淀粉酶產色鏈霉菌D，經過菌種的活化培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵物提??；將所提純的活性化合物配以農用藥物輔料等步驟，制備成多種劑型的農用藥物。該微生物農藥可用于防治黃瓜枯萎病和番茄灰霉病等蔬菜真菌病害，其防治效果較常規(guī)化學藥劑略優(yōu)，且安全。
文檔編號C12N1/20GK101225368SQ20071015683
公開日2008年7月23日 申請日期2007年11月19日 優(yōu)先權日2007年11月19日
發(fā)明者申屠旭萍, 俞曉平, 董勝張, 王為民 申請人:中國計量學院