專利名稱：白介素-13抗體組合物的制作方法
白介素-13抗體組合物本申請是申請日為2006年09月四日、申請?zhí)枮?00680044973.9(國際申請?zhí)枮?PCT/GB2006/003650)、發(fā)明名稱為“白介素-13抗體組合物”的發(fā)明申請的分案申請。本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含白介素-13抗體，更具體的說是白介素-13單 克隆抗體，尤其是人白介素-13單克隆抗體。本發(fā)明還涉及純化所述抗體的方法和使用所 述組合物來治療白介素-13相關(guān)病癥諸如哮喘的用途。白介素(IL)-13是114個氨基酸的細(xì)胞因子，未修飾時的分子量是大約12kDa。 IL-13與IL-4最密切相關(guān)，二者在氨基酸水平具有30 %的序列同源性。人IL-13基因 位于染色體 5q31，與 IL-4 基因鄰近[McKenzie, A. N. et al.，JImmunol，1993. 150(12)， 5436-5444 ；Minty, A. et al.，Nature,1993. 362(6417)，248-50]。盡管最初將IL-13鑒定為Th2⑶4+淋巴細(xì)胞衍生細(xì)胞因子，Thl⑶4+T細(xì)胞、⑶8+T 淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、及非T細(xì)胞群諸如肥大細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì) 胞和氣道平滑肌細(xì)胞也生成IL-13。已經(jīng)將IL-13與許多疾病聯(lián)系起來，具體有由炎性應(yīng)答引起的疾病。例如，對 未曾接受治療的(nai've)、未被致敏的(non-sensitised)嚙齒類動物的氣道施用重組
IL-13顯示出引起哮喘表型的許多方面，包括氣道炎癥、粘液生成和氣道高應(yīng)答性(AHR) [ffills-Karp, Μ. et al. ， Science,1998.282 (5397)，2258-2261 ；Grunig, G. et al.， Science,1998. 282(5397),2261-2263 ；Venkayya, R. , et al., AmJ Respir Cell Mol Biol,2002. 26(2),202-208 ；Morse, B. et al.，Am J PhysiolL ung Cell Mol Physiol, 2002.282(1)，L44-49]。在肺中特異性過表達(dá)IL-13的轉(zhuǎn)基因小鼠中觀察到類似的表型。 在該模型中，更長時間的暴露于IL-13還導(dǎo)致纖維化[Zhu，Z. et al. , J Clin Invest, 1999.103(6),779-788]。已經(jīng)將IL-13基因的許多遺傳多態(tài)性與變應(yīng)性疾病聯(lián)系起來。具體而言，已經(jīng)將 IL-13基因第130位精氨酸殘基被谷氨酰胺替代的的變體(Q130R)與支氣管哮喘、特應(yīng)性 皮炎(atopic dermatitis)和血清 IgE/K平升高聯(lián)系起來[Heinzmann, A. et al.，Hum Mol Genet,2000. 9(4)，549-559 ；Howard, Τ.D.et al.，Am J Hum Genet,2002. 70(1)，230-236 ； Kauppi, P.et al. , Genomics,2001. 77(1~2), 35-42；Graves, P.Ε. et al. ,J Allergy Clin Immunol, 2000. 105 (3)，506-513]。有些小組還將這種IL-13變體稱為Ql 10R變體(第110 位精氨酸殘基用谷氨酰胺替代)，因為它們從氨基酸計數(shù)中排除了 20個氨基酸的信號序 列。還已經(jīng)將IL-13生成與變應(yīng)性哮喘聯(lián)系起來[van der Pouw Kraan, Τ. C. etal.， Genes Immun, 1999. 1 (1)，61-65]，而且在患有特應(yīng)性鼻炎(atopic rhinitis)(干草熱(hay fever))、變應(yīng)性皮炎(濕疹)和慢性(鼻)竇炎的人類受試者中測量到升高的IL-13水平。在哮喘外，已經(jīng)將IL-13與其它纖維變性疾患聯(lián)系起來。已經(jīng)在患有系統(tǒng)性硬化 的患者的血清中和患有其它形式肺纖維化的患者的支氣管-肺泡灌洗(BAL)樣品中測量到 升高的 IL-13 水平，達(dá)到比 IL-4 高 1000 倍[Hasegawa,M. etal.，J Rheumatol, 1997. 24(2)， 328-332 ；Hancock, A. et al. , Am J Respir Cell MolBiol,1998. 18(1)，60—65]。
已經(jīng)證明了 IL-13在小鼠肺中的過表達(dá)引起肺氣腫、粘液生成增加和炎癥，這 些癥狀反映了人慢性阻塞性肺病(COPD)的各個方面[Zheng, Τ. et al.，JClin Invest, 2000.106(9)，1081-1093]。有人提出IL-13可能在炎性腸病的發(fā)病機理中發(fā)揮作用[Heller，F(xiàn). et al.， Immunity，2002. 17 (5)，629-38]，而且在有些何杰金氏病(Hodgkin' s disease)患者的血 清中檢測到與正常對照相比升高的IL-13水平[Fiumara, P. et al.，Blood, 2001. 98(9)， 2877-2878]。還認(rèn)為IL-13抑制劑在治療上可用于預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[Terabe，M. etal. ,Nat Immunol，2000. 1(6)，515-520]。在動物模型中對IL-13的抑制還顯示出增強抗病毒疫苗， 而且對于HIV和其它感染性疾病的治療可能是有益的[Ahlcrs，J. D. et al. , Proc Natl Acad Sci U S A,2002. 99(20),13020-13025] 致力于IL-13抑制的抗體法已有記載。例如，WO 2005/007699 (CambridgeAntibody Technology Limited)記載了一系列顯示出中和IL-13活性的人抗IL-13抗體分子，而且宣 稱它們可在治療IL-13相關(guān)病癥方面可能有用。依照本發(fā)明的第一個方面，提供了一種藥用組合物，其包含IL-13抗體及一種或 多種制藥學(xué)可接受賦形劑，并用乙酸鹽緩沖劑緩沖至PH 4. 5-6. 0。普遍知道抗體純化規(guī)程通常需要多種分離技術(shù)，諸如層析分離(例如蛋白A層析、 離子交換層析、諸如此類)。這種分離方式的后果是需要使用多種不同緩沖液。例如，WO 2004/076485中所記載的抗體純化規(guī)程需要50mM甘氨酸/甘氨酸鹽pH8. 0用于蛋白A層 析、50mM Tris-HCl pH8. 0 和 20mM磷酸鈉 pH 6. 5 用于 Q-kpharose 層析、及 25mM Tris-HCl pH8. 6 用于 DEAE-sepharose 層析。相反，本發(fā)明只需要使用一種以固定濃度和預(yù)定pH存在于本發(fā)明組合物中的乙 酸鹽緩沖劑，其優(yōu)點在于這種緩沖劑存在于所有IL-13抗體純化步驟中。如此，這種緩沖劑 不僅用于純化過程開始時，而且用于整個純化過程，因此縮短了操作時間、降低了成本并提
高了產(chǎn)量。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，“抗體”的術(shù)語包括免疫球蛋白，無論是天然的或者是部分或完全合成 的。該術(shù)語還覆蓋任何包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽或蛋白質(zhì)。包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體片段有諸如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd和雙抗體等分子。有可能采用單克隆抗體和其它抗體，并且采用重組DNA技術(shù)來生成保留最初抗體 特異性的其它抗體或嵌合分子。這樣的技術(shù)可涉及將編碼免疫球蛋白可變區(qū)或互補決定區(qū) (OTR)的DNA導(dǎo)入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加框架區(qū)。參見例如EP-A-184187 ； GB2188638A或EP-A-239400 ；及大量后續(xù)文獻?；蛘?，可以生成攜帶⑶R衍生序列的新VH或VL區(qū)，即通過一種或多種選定VH和 /或VL基因的隨機誘變而在整個可變域中生成突變。Gram et al.，PNAS USA, 1992. 89, 3576-3580記載了這樣一種技術(shù)，他們采用錯誤傾向PCR?？墒褂玫牧硪环N方法是針對VH和 VL 基因 CDR 區(qū)的誘變。Barbas et al. ,PNAS USA 1994. 91，3809-3813 和 khier et al.， J. Mol. Biol. 1996. 263，551-567 披露這樣的技術(shù)。因為可以以多種方法修飾抗體，術(shù)語“抗體”應(yīng)解釋為覆蓋任何包含具有所需特異 性的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特定結(jié)合成員或物質(zhì)。如此，該術(shù)語覆蓋抗體片段和衍生物，包括任何包含免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，無論是天然的或者是完全或部分合成的。因此還包 括包含免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或等同物且其與另一多肽相融合的嵌合分子。P-A-0120694 和EP-A-0125023及大量后續(xù)文獻中披露了嵌合抗體的克隆和表達(dá)?？贵w工程領(lǐng)域可利用的其它技術(shù)使之有可能分離人抗體和人源化抗體。例如，可 以如 Kontermann et al. , [2001 ；Antibody Engineering, SpringerLaboratory Manuals] 所述來生成人雜交瘤。許多出版物，諸如Kontermann et al. (supra)and W092/01047中 詳細(xì)記載了為生成特定結(jié)合成員而建立的另一種技術(shù)，噬菌體展示。小鼠抗體基因遭到滅 活并用人抗體基因功能性替換同時小鼠免疫系統(tǒng)的其它成分保持完整的轉(zhuǎn)基因小鼠可用 于分離針對人抗原的人抗體。核糖體展示，一種將突變導(dǎo)入已知基因序列的無細(xì)胞翻譯 技術(shù)也可用于生成和/或優(yōu)化特定結(jié)合成員[Hanes and Pluckthun PNAS USA，1994. 94， 4937-4942 ；He and Taussig Nucleic Acids Res.1997. 25,5132-5134 ；Schaffitzelet al.，J. Immunol. Methods,1999. 231，119—135 ；He et al.，J. Immunol. Methods,1999. 231， 105-117 ；He et al.，Methods Mol.Biol. 2004. 248,177-189] 通過合成寡核苷酸并在合適的表達(dá)載體中進行裝配，再用所得基因進行表達(dá)，可 以制備合成的抗體分子，參見例如 Knappik et al.，J. Mol. Biol. 2000. 296, 57-86 ；Krebs et al. , Journal of Immunological Methods 2001.254,67-84。已經(jīng)顯示了完整抗體的片段可發(fā)揮結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的例子有(i)由 VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；(ii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iii) 由單一抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(iv)由VH或VL結(jié)構(gòu)域組成的dAb片段 [Ward, Ε.S. et al.，Nature,1989. 341,544-546 ；McCafferty et al.，Nature,1990. 348， 552-554 ；Holt et al. , Trends Biotechnol. 2003. 21 (11)，484-490] ； (ν)分離的 CDR 區(qū); (vi)F(ab' )2片段，包含兩個相連Fab片段的二價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其 中VH結(jié)構(gòu)域與VL結(jié)構(gòu)域通過肽接頭相連接，該肽接頭容許這兩個結(jié)構(gòu)域相結(jié)合而形成 抗原結(jié)合位點[Bird etal. , Science, 1988. 242,423-426 ；Huston et al.，PNAS USA, 1988. 85,5879-5883] ； (viii)雙特異性單鏈 Fv 二聚體(PCT/US92/09965)；和(ix) “雙抗 體(diabody)”，通過基因融合構(gòu)建的多價或多特異性片段[W0 94/13804 ；P. Holliger et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993. 90,6444-6448]。Fv、scFv 或雙抗體分子可以通過摻 入連接VH與VL結(jié)構(gòu)域的二硫鍵而加以穩(wěn)定[Y. Reiter etal.，Nature Biotech.，1996. 14， 1239-1245]。還可以生成包含scFv相連的CH3結(jié)構(gòu)域的微型抗體(minibody) [S. Hu et al.，Cancer Res.，1996. 56，3055-3061]。若使用雙特異性抗體，則可以是常規(guī)雙特異性抗體，其可以以多種方式來制備 [Holliger and Winter Current Opinion Biotechnol. 1993. 4，446-449]，例如以化學(xué)方法 或從雜合雜交瘤制備，或者可以是任何上文所述雙特異性抗體片段。雙特異性抗體的例子 包括那些BiTE技術(shù)的雙特異性抗體，其中可以使用兩個具有不同特異性的抗體的結(jié)合結(jié) 構(gòu)域并經(jīng)柔性短接頭直接相連。這在一條短多肽鏈上聯(lián)合兩個/種抗體。雙抗體和scFv 可以構(gòu)建成不含F(xiàn)c區(qū)而只使用可變域，從而有可能降低抗獨特型反應(yīng)的效應(yīng)。與雙特異性完整抗體不同，雙特異性抗體也可能是特別有用的，因為它們易于構(gòu) 建并在大腸桿菌中表達(dá)。具有適宜結(jié)合特異性的雙抗體(和許多其它多肽諸如抗體片段) 易于通過噬菌體展示(W0 94/13804)從文庫中選擇。若雙抗體的一條臂保持不變，例如具
5有針對IL-13的特異性，則可以將文庫構(gòu)建成另一條臂進行變化并選擇具有適宜特異性的 抗體。雙特異性完整抗體可以通過隆起入空腔(knobs-into-holes)工程來構(gòu)建[Ridgeway et al.，Protein Eng.，1996. 9，616-621]。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，“ IL-13抗體”術(shù)語包括根據(jù)WO 2005/007699實施例2_10和25所列測 定法，能夠在低于500nM的濃度中和天然存在IL-13的完整抗體或抗體片段。優(yōu)選的是，IL-13抗體以等于或優(yōu)于由BAK502G9VH結(jié)構(gòu)域(W02005/007699中的 SEQ ID NO 15)和 BAK502G9VL 結(jié)構(gòu)域(W0 2005/007699 中的 SEQ ID NO 16)形成的 IL-13 抗原結(jié)合位點的效力中和天然存在的IL-13。優(yōu)選的是，IL-13抗體是單克隆IL-13抗體，更優(yōu)選人IL-13單克隆抗體。特別優(yōu)選的IL-13 抗體是選自 WO 2003/035847,WO 2003/08645UW02005/007699 或WO 2005/081873中所述的IL-13抗體。例如，在一個特別優(yōu)選的實施方案中，IL-13抗體包含BAK278D6H⑶R1-3和 LCDR1-3 (分別是 WO 2005/007699 中的 SEQ ID NOS :1_6)。將具有 BAK278D6 的 CDR 組的 CDR，BAK278D6HCDR或BAK278D6LCDR，或其一處或多處經(jīng)過替代的CDR都稱為BAK278D6譜系的。 在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，IL-13抗體包含BAK502G9HCDR1-3和 LCDRl-3(分別是 WO 2005/007699 中的 SEQ ID NOS :7_12)。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，IL-13抗體包含BAK1111D10HCDR1-3和 LCDRl-3(分別是 WO 2005/007699 中的 SEQ ID NOS :91-96)。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，IL-13抗體包含BAKl 167F2HCDR1-3和 LCDRl-3(分別是 WO 2005/007699 中的 SEQ ID NOS :61-66)。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，IL-13抗體包含BAKl 183H4HCDR1-3和 LCDRl-3(分別是 WO 2005/007699 中的 SEQ ID NOS :97-102)?？梢栽诳贵w框架區(qū)或其它蛋白支架例如纖連蛋白或細(xì)胞色素B中提供相關(guān)CDR 組[Koide et al.，J. Mol. Biol. 1998. 284，1141—1151；Nygren et al.，Current Opinion in Structural Biology, 1997. 7，463-469]。優(yōu)選采用抗體框架區(qū)，而且在采用它們時， 它們優(yōu)選是種系的，更優(yōu)選的是，重鏈的抗體框架區(qū)可以是來自VHl家族的DP14。輕鏈 的優(yōu)選框架區(qū)可以是λ3-3Η。對于BAK502G9⑶R組，優(yōu)選的是，VH FR1-3的抗體框架 區(qū)分別是W02005/007699中的SEQ ID NOS :27-29，而VL FR1-3的抗體框架區(qū)分別是 W02005/007699中的SEQ ID NOS :30-32。在一個優(yōu)選的實施方案中，所提供的VH結(jié)構(gòu)域 具有WO 2005/007699中SEQ ID NO :15的氨基酸序列，這稱為“BAK502G9VH結(jié)構(gòu)域”。在另 一個高度優(yōu)選的實施方案中，所提供的VL結(jié)構(gòu)域具有WO 2005/007699中SEQ ID NO :16的 氨基酸序列，這稱為“BAK502G9VL結(jié)構(gòu)域”。在一個優(yōu)選的實施方案中，IL-13抗體與獼猴(cynomologous) IL-13和/或IL-13 變體Q130R發(fā)生交叉反應(yīng)。優(yōu)選的是，IL-13抗體以l_200mg/ml、更優(yōu)選50_100mg/ml、尤其是50mg/ml的量 存在于藥物組合物中。優(yōu)選的是，將藥物組合物緩沖至pH 5. 2-5. 7，最優(yōu)選5. 5士0. 1。選擇這樣一種pH 賦予藥物組合物以顯著穩(wěn)定性。在此范圍內(nèi)控制PH的備選緩沖劑的例子包括琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組氨酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽、戊二酸鹽、卡可基酸鹽、馬來酸氫鈉、三(羥甲基)氨 基甲烷(Tris)、2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、咪唑和其它有機酸緩沖劑。優(yōu)選的是，緩沖劑是乙酸鹽緩沖劑，更優(yōu)選乙酸鈉。優(yōu)選的是，乙酸鹽緩沖劑以Ι-lOOmM、更優(yōu)選30_70mM、尤其是50mM的量存在于藥
物組合物中。應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，提及的“制藥學(xué)可接受賦形劑”包括藥物組合物中常規(guī)使用的任何賦形 劑。這樣的賦形劑通?？梢园ㄒ环N或多種表面活性劑、無機或有機鹽、穩(wěn)定劑、稀釋劑、增 溶劑、還原劑、抗氧化劑、螯合劑、防腐劑、諸如此類。典型的表面活性劑的例子包括非離子表面活性劑(HLB 6-18)，諸如山梨聚糖脂 肪酸酯(sorbitan fatty acid ester)(例如山梨聚糖單辛酸酯、山梨聚糖單月桂酸酯、山 梨聚糖單棕櫚酸酯)、甘油脂肪酸酯(例如甘油單辛酸酯、甘油單肉豆蔻酸酯、甘油單硬脂 酸酯)、聚甘油脂肪酸酯(例如聚甘油(十)單硬脂酸酯、聚甘油(十)雙硬脂酸酯、聚甘 油(十)單亞油酸酯)、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯(例如聚氧乙烯山梨聚糖單月桂酸酯、 聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖單硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖單棕櫚酸 酯、聚氧乙烯山梨聚糖三油酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖三硬脂酸酯)、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸 酯(例如聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯)、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯 (例如聚氧乙烯甘油基單硬脂酸酯)、聚乙二醇脂肪酸酯(例如聚乙二醇雙硬脂酸酯)、聚氧 乙烯烷基醚(例如聚氧乙烯月桂醚)、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(例如聚氧乙烯聚氧丙二 醇醚、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯鯨蠟基醚)、聚氧乙烯烷基苯基醚(例 如聚氧乙烯壬基苯基醚)、聚氧乙烯氫化蓖麻油(例如聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻 油)、聚氧乙烯蜂蠟(bees wax)衍生物(例如聚氧乙烯山梨醇蜂蠟)、聚氧乙烯羊毛脂衍 生物(例如聚氧乙烯羊毛脂)、和聚氧乙烯脂肪酸酰胺(例如聚氧乙烯硬脂酸酰胺)；陰離 子表面活性劑，諸如C10-C18烷基硫酸酯鹽(例如十六烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉、油酰 硫酸鈉(oleyl sulfate))、具有平均2-4摩爾環(huán)氧乙烷的聚氧乙烯C10-C18烷基醚硫酸酯 鹽(例如聚氧乙烯十二烷基硫酸鈉)、和C8-C18烷基磺基琥珀酸酯鹽(例如十二烷基磺基 琥珀酸酯鈉)；和天然表面活性劑，諸如卵磷脂、甘油磷脂、鞘磷脂(sphingophospholipid) (例如鞘磷脂(sphingomyelin))、和C12-C18脂肪酸的蔗糖酯。優(yōu)選的是，表面活性劑選自聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。特別優(yōu)選的是，表面活性 劑是聚山梨醇酯20、21、40、60、65、80、81和85，最優(yōu)選聚山梨醇酯20和80，尤其聚山梨醇 酯80。優(yōu)選的是，表面活性劑以0. 001-0. 1% (w/w)、更優(yōu)選0. 005-0. 05% (w/w)、尤其是 0.01% (w/w)的量存在于藥物組合物中。典型的無機鹽的例子包括氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、磷酸鈉、硫酸鈉、硫酸銨、磷酸 鉀和碳酸氫鈉，或者任何其它鈉鹽、鉀鹽或鈣鹽。優(yōu)選的是，無機鹽是氯化鈉。優(yōu)選的是，無機鹽以10-200mM、更優(yōu)選60_130mM、尤其是85mM的量存在于藥物組 合物中。還原劑的例子包括N-乙?；腚装彼?、N-乙酰基高半胱氨酸、硫辛酸、硫代二 甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、硫代乙醇酸及其鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽、和 C1-C7硫代鏈烷酸。
抗氧化劑的例子包括異抗壞血酸(erythorbic acid)、二丁基羥基甲苯、丁基羥基 苯甲醚、α -生育酚、乙酸生育酚、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸 硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊酯、和沒食子酸丙酯。螯合劑的例子包括乙二胺四乙酸(EDTA) 二鈉、焦磷酸鈉、和偏磷酸鈉。穩(wěn)定劑的例子包括肌酸酐、選自組氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苯丙 氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和蘇氨酸的氨基酸、選自蔗 糖、海藻糖、山梨醇、木糖醇和甘露糖的碳水化合物、選自聚乙二醇(PEG ；例如PEG3350或 PEG4000)或聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)的表面活 性劑、或其任意組合。在一個優(yōu)選實施方案中，穩(wěn)定劑包含上文定義的單一的碳水化合物(例如海藻 糖)。在另一個優(yōu)選實施方案中，穩(wěn)定劑包含氨基酸及碳水化合物(例如海藻糖及丙氨 酸，或者海藻糖、丙氨酸及甘氨酸)。在又一個優(yōu)選實施方案中，穩(wěn)定劑包含氨基酸及碳水化合物和表面活性劑(例如 海藻糖、丙氨酸及PEG3350，或者海藻糖、脯氨酸及PEG3350，或者海藻糖、丙氨酸及聚山梨 醇酯80，或者海藻糖、脯氨酸及聚山梨醇酯80，或者海藻糖、丙氨酸、甘氨酸及PEG3350，或 者海藻糖、丙氨酸、甘氨酸及聚山梨醇酯80)。在又一個優(yōu)選實施方案中，穩(wěn)定劑包含氨基酸及表面活性劑(例如丙氨酸及 PEG3350,或者丙氨酸、甘氨酸及PEG3!350)。在又一個優(yōu)選實施方案中，穩(wěn)定劑包含碳水化合物及表面活性劑(例如海藻糖及 PEG3350，或者海藻糖及聚山梨醇酯80)。防腐劑的例子包括氯化十八烷基二甲基芐基銨(octadecyldimethylbenzyla mmonium chloride)、氯己雙胺(hexamethonium chloride)、苯扎氯銨(benzalkonium chlorideM氯化烷基芐基二甲基銨混合物，其中烷基是長鏈化合物)、芐索氯銨 (benzethonium chloride)，芳香醇諸如酚、丁醇和苯甲醇，烷基對羥基苯甲酸酯(alkyl paraben)諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯，鄰苯二酚、間苯二酚、環(huán)己醇、3_戊醇、和間甲酚。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，藥物組合物包含IL-13抗體、表面活性劑和無 機鹽，并用乙酸鹽緩沖劑緩沖至PH 5. 5 士0. 1。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，藥物組合物包含IL-13抗體、氯化鈉和聚山 梨醇酯80，并用乙酸鈉緩沖劑緩沖至pH 5.5 士 0. 1。在本發(fā)明的又一個優(yōu)選實施方案中，藥物組合物包含50mg/ml IL-13抗體、85mM 氯化鈉和0.01% (w/w)聚山梨醇酯80，并用50mM乙酸鈉緩沖劑緩沖至pH 5. 5 士0. 1。依照本發(fā)明的第二個方面，提供了用于純化IL-13抗體的方法，其包括一個或多 個層析分離步驟，其中每個分離步驟包括用包含一種或多種制藥學(xué)可接受賦形劑并用乙酸 鹽緩沖劑緩沖至PH 3. 5-7. 0的洗脫緩沖液進行洗脫。優(yōu)選的是，一個或多個層析分離步驟選自親和層析(例如蛋白A或蛋白G親和層 析)、離子交換層析(例如陽離子和陰離子交換層析)、疏水相互作用層析(例如苯基層 析)、羥磷灰石層析、大小排阻層析、固定化金屬親和層析、親水相互作用層析、親硫吸附層 析、優(yōu)球蛋白吸附層析、染料配體層析、或固定化硼酸鹽層析。最優(yōu)選的是，層析分離通過蛋7/29
白A親和層析，之后是陽離子交換層析(例如使用SP-sepharose基質(zhì))，再之后是陰離子交 換層析(例如使用Q-s印harose基質(zhì))來進行。優(yōu)選的是，所述一種或多種制藥學(xué)可接受賦形劑包含無機鹽，諸如氯化鈉。優(yōu)選的是，無機鹽以10-200mM、更優(yōu)選60_130mM、尤其是85mM的量存在于洗脫緩 沖液中。控制pH在3. 5-7. 0范圍內(nèi)的備選緩沖劑的例子包括琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組氨 酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽和其它有機酸緩沖劑。優(yōu)選的是，緩沖劑是乙酸鹽緩沖劑，更優(yōu)選乙酸鈉緩沖劑。優(yōu)選的是，乙酸鹽緩沖液以Ι-lOOmM、更優(yōu)選30_70mM、尤其是50mM的量存在于洗 脫緩沖液中。最優(yōu)選的是，洗脫緩沖液包含50mM乙酸鈉和85mM氯化鈉，并緩沖至pH 5. 5 士0. 1?？梢酝ㄟ^在適宜條件下培養(yǎng)包含下述核酸的重組宿主細(xì)胞來表達(dá)編碼任何本發(fā) 明IL-13抗體(例如CDR或CDR組或VH結(jié)構(gòu)域或VL結(jié)構(gòu)域或抗原結(jié)合位點或抗體分子， 例如scFv或IgG4，像所提供的那樣)的核酸。在通過表達(dá)而生成后，可以使用任何合適技 術(shù)來分離和/或純化VH或VL結(jié)構(gòu)域或者特定結(jié)合成員，然后根據(jù)需要使用。所提供的特定結(jié)合成員、VH和/或VL結(jié)構(gòu)域、及編碼核酸分子和載體可以分離和 /或純化自例如它們的天然環(huán)境，它們處于基本純的或同質(zhì)的形式，或者在核酸的情況中不 含或基本上不含具有所需功能的多肽的編碼序列以外的核酸或基因源。核酸可以包含DNA 或RNA，而且可以整個或部分是合成的。本文中在提及核苷酸序列時涵蓋具有具體序列的DNA分子，且涵蓋具有具體序 列、其中用U替代T的RNA分子，除非另有說明。用于在多種不同宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是眾所周知的。合適的宿主細(xì) 胞包括細(xì)菌、哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母、桿狀病毒系統(tǒng)、及轉(zhuǎn)基因植物和動物。本領(lǐng)域可用于表達(dá)異源多肽的哺乳動物細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、 HeLa細(xì)胞、幼倉鼠腎細(xì)胞、NSO小鼠黑素瘤細(xì)胞、YB2/0大鼠骨髓瘤細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞、人胚 視網(wǎng)膜細(xì)胞等。優(yōu)選的是，所述哺乳動物細(xì)胞系是骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)物，諸如例如NSO細(xì)胞IGalfre and Milstein，Methods Enzymology，1981. 73 :3]。骨髓瘤細(xì)胞有漿細(xì)胞瘤細(xì)胞，即淋巴 樣細(xì)胞譜系的細(xì)胞。一種例示性的NSO細(xì)胞系有例如細(xì)胞系ECACC No. 85110503，可以從 供應(yīng)用微生物學(xué)和研究之用的歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心(European Collection of Cell Cultures (ECACC), Centre for AppliedMicrobiology &Research, Salisbury, Wiltshire, SP40JG,United Kingdom)免費獲得。已發(fā)現(xiàn)NSO能夠產(chǎn)生極高產(chǎn)量的產(chǎn)物，特別是在用于 生成重組抗體時。另一種優(yōu)選的哺乳動物細(xì)胞系是中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。它可以是二氫葉酸還 原酶(dhfr)缺陷的，因而其生長依賴于胸苷和次黃嘌呤[PNAS，1990，77 :4216-4220]。用 抗體基因和dhfr基因轉(zhuǎn)染親本dhfr-CHO細(xì)胞系，從而能夠選擇具有dhfr陽性表型的CHO 細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。通過在缺少胸苷和次黃嘌呤的培養(yǎng)基上培養(yǎng)集落來進行選擇，胸苷和次黃嘌 呤的缺乏阻止了未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞恢復(fù)了葉酸途徑，從而規(guī)避了選擇系統(tǒng)。由 于兩種轉(zhuǎn)染基因的共整合，這些轉(zhuǎn)化體通常表達(dá)低水平的基因產(chǎn)物?？梢酝ㄟ^使用甲氨蝶
9呤(MTX)的擴增來提高抗體基因的表達(dá)水平。這種藥物是dhfr酶的直接抑制劑，從而能夠 分離擴增其dhfr基因拷貝數(shù)并足以在這些條件下存活的抗性集落。由于dhff與抗體基因 在最初的轉(zhuǎn)化體中最密切相連，所以通常存在相伴擴增，從而提高所需抗體基因的表達(dá)。與CHO或骨髓瘤細(xì)胞一起使用的另一種選擇系統(tǒng)是WO 87/04462中記載的谷氨酸 合成酶(GQ擴增系統(tǒng)。該系統(tǒng)牽涉用編碼GS酶的基因和所需抗體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。然后選 擇在不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞。然后對所選擇的這些克隆用甲硫氨酸砜亞胺 (methionine sulphoximine, MSX)抑制GS酶。細(xì)胞為了存活將擴增GS基因，相伴擴增編 碼抗體的基因。本領(lǐng)域已完全建立了抗體和抗體片段在原核細(xì)胞諸如大腸桿菌中的表達(dá)。綜述參 見例如Pluckthun A. , Bio/Technology 1991.9:545-551。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可利用真核 細(xì)胞培養(yǎng)物中的表達(dá)作為生成例如特定結(jié)合成員的選項IChadd，H. Ε. and Chamow, S. Μ.， Current Opinion in Biotechnology 2001. 12 :188-194 ；Andersen, D.C. and Krummen, L, Current Opinion in Biotechnology2002. 13 117 ；Larrick, J. W. and Thomas, D. W.， Current opinion inBiotechnology 2001.12:411-418]。可以選擇或構(gòu)建合適的載體，其包含適宜的調(diào)控序列，包括啟動子序列、終止 子序列、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標(biāo)志基因、和需要的其它序列。根據(jù)需要，載體 可以是質(zhì)粒、病毒例如噬菌體、或噬菌粒。更多細(xì)節(jié)參見例如Molecular Cloning :a Laboratory Manual :3rd edition, Sambrook and Russell,2001. Cold Spring Harbor Laboratory Press.用于操作核酸的許多已知技術(shù)和方案，例如制備核酸構(gòu)建物、誘變、 測序、將DNA導(dǎo)入細(xì)胞、表達(dá)基因、和分析蛋白質(zhì)，詳細(xì)描述于Current Protocols in Molecular Biology,2nd Edition, Ausubel et al. eds. , John ffiley&Sons, 1988 ；Short Protocols in MolecularBiology :A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology, Ausubel et al. eds. , John Wiley&Sons,4th edition 1999。將 Sambrook等人和Ausubel等人的公開內(nèi)容收入本文作為參考。將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞可采用任何可利用的技術(shù)。對于真核細(xì)胞，合適的技術(shù)可包 括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-右旋糖苷、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、及使用逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它病毒 例如痘苗病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)，對于昆蟲細(xì)胞，使用桿狀病毒。將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞，特別是真核細(xì) 胞可使用基于病毒或質(zhì)粒的系統(tǒng)。質(zhì)粒系統(tǒng)可作為附加體(印isomally)來操作，或者可摻 入宿主細(xì)胞或摻入人工染色體[Csonka，Ε. et al.，Journal of Cell Science, 200. 113 3207-3216 ；Vanderbyl, S. et al. , Molecular Therapy, 2002. 5 (5) :10]。摻入可以是單個 或多個基因座處一個或多個拷貝的隨機或靶向整合。對于細(xì)菌細(xì)胞，合適的技術(shù)可包括氯 化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔、及使用噬菌體的感染。導(dǎo)入之后可通過例如在適于表達(dá)基因的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞來引起或容許核酸 表達(dá)。在一個實施方案中，本發(fā)明的核酸整合入宿主細(xì)胞的基因組(例如染色體)。依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可通過包含促進與基因組重組的序列來促進整合。依照本發(fā)明的第三方面，提供了本文定義的藥物抗體組合物在制備用于治療 IL-13相關(guān)病癥的藥物中的用途。優(yōu)選的是，所述IL-13相關(guān)病癥選自哮喘、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性鼻炎、纖維化(fibrosis)、慢性阻塞性肺病、硬皮病、炎性腸病(inflammatory bowel disease)和何杰金 氏淋巴瘤。本發(fā)明的組合物還可用于治療腫瘤和病毒感染，因為IL-13抗體能抑制IL-13 介導(dǎo)的免疫抑制。最優(yōu)選的是，IL-13相關(guān)病癥是哮喘。本發(fā)明進一步提供了治療或預(yù)防IL-13相關(guān)病癥的方法，其包括對患者施用治療 有效量的本文定義的藥物抗體組合物。本發(fā)明進一步提供了本文定義的藥物抗體組合物，其用于治療IL-13相關(guān)病癥。本發(fā)明的藥物組合物可以是液體劑型或在使用前重建的凍干劑型。可以使用凍干 劑型的賦形劑，例如糖醇或糖(例如甘露醇或葡萄糖)。在液體劑型的情況中，本發(fā)明的藥 物組合物通常以具有確定體積的容器的形式提供，包括密封和已滅菌的塑料或玻璃管、安 瓿和注射器，以及大體積容器的形式，像瓶子。優(yōu)選的是，本發(fā)明的組合物是液體劑型。本發(fā)明的藥物組合物可以通過口服、通過注射(例如皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌肉 內(nèi))、通過吸入、或局部的(例如眼內(nèi)、鼻內(nèi)、直腸、傷口、皮膚)來施用。施用路徑可以根據(jù) 治療的物理化學(xué)特征、關(guān)于疾病的特殊考慮、或者優(yōu)化功效或降低副作用的要求來決定。優(yōu)選的是，本發(fā)明的組合物通過皮下注射來施用。設(shè)想了治療不限于臨床使用。因 此，使用無針頭裝置的皮下注射也可以是優(yōu)選的。依照本發(fā)明，可將所提供的組合物施用于個人。施用優(yōu)選是“治療有效量”的， 這足以顯示出對患者的益處。所述益處可以至少是至少一種癥狀的緩解。所施用的實際 量、及施用的速率和時程取決于所治療病癥的本質(zhì)和嚴(yán)重程度。治療的處方，例如關(guān)于劑 量的決定等，在普通開業(yè)醫(yī)師和其它醫(yī)生的職責(zé)之內(nèi)?？贵w的適宜劑量在本領(lǐng)域是眾所周 知的[Ledermann, J. A. et al. , Int. J. Cancer, 1999. 47 :659-664 ；Bagshawe, K. D. et al., Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 1991. 4 :915-922]。精確劑量取決于許多因素，包括待治療區(qū)域的大小和位置、抗體的確切本質(zhì)(例 如完整抗體、片段或雙抗體)、及附著于抗體的任何可檢測標(biāo)記物或其它分子的本質(zhì)。典型 的抗體劑量對于系統(tǒng)應(yīng)用為IOOpg-IOg和用于局部應(yīng)用為Iyg-IOOmg的范圍內(nèi)。通常，抗體是完整抗體，優(yōu)選IgG4同種型。成人患者的單次治療劑量在按比例調(diào) 整后可用于兒童和嬰幼兒，并且對其它抗體形式根據(jù)分子量按比例進行調(diào)整?？梢砸悦咳?一次、每周兩次、每周一次、或每月一次的間隔重復(fù)進行治療，這由醫(yī)師決定。在本發(fā)明的優(yōu) 選實施方案中，治療是定期的，而且兩次施用之間的間隔為大約2周或更長，優(yōu)選大約3周 或更長，更優(yōu)選大約4周或更長，或者大約每月一次施用。本發(fā)明還涉及1. 一種藥物組合物，其包含IL-13抗體及一種或多種制藥學(xué)可接受賦形劑，并用 乙酸鹽緩沖劑緩沖至PH 4. 5-6. 0。2.依照項1的藥物組合物，其中所述IL-13抗體是人IL-13單克隆抗體。3.依照項1或2的藥物組合物，其中所述IL-13抗體以l-200mg/ml的量存在于所 述藥物組合物中。4.依照前述項任一項的藥物組合物，其緩沖至pH 5. 2-5. 7。5.依照前述項任一項的藥物組合物，其包含乙酸鈉，所述乙酸鈉以I-IOOmM的量 存在于所述藥物組合物中。6.依照前述項任一項的藥物組合物，其中所述制藥學(xué)可接受賦形劑包括一種或多種表面活性劑、無機或有機鹽、穩(wěn)定劑、稀釋劑、增溶劑、還原劑、抗氧化劑、螯合劑和/或防 腐劑。 7.依照項6的藥物組合物，其中所述表面活性劑選自聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸8.依照項7的藥物組合物，其中所述表面活性劑是聚山梨醇酯80，所述聚山梨醇 酯80以0. 001-0. 1% (w/w)的量存在于所述藥物組合物中。9.依照項6-8任一項的藥物組合物，其中所述無機鹽包括氯化鈉、氯化鉀、氯化 鈣、磷酸鈉、磷酸鉀和碳酸氫鈉。10.依照項9的藥物組合物，其中所述無機鹽是氯化鈉，所述氯化鈉以10_200mM的
量存在于所述藥物組合物中。11.依照項1的藥物組合物，其包含IL-13抗體、表面活性劑和無機鹽，并用乙酸鹽 緩沖劑緩沖至PH 5. 5 士0. 1。12.依照項1的藥物組合物，其包含IL-13抗體、氯化鈉和聚山梨醇酯80，并用乙 酸鹽緩沖劑緩沖至PH 5. 5 士0. 1。13.依照項1的藥物組合物，其包含50mg/ml IL-13抗體、85mM氯化鈉和0. 01 % (w/w)聚山梨醇酯80，并用50mM乙酸鈉緩沖劑緩沖至pH 5. 5 士0. 1。14.用于純化IL-13抗體的方法，其包括一個或多個層析分離步驟，其中每一個 所述分離步驟包括用含有一種或多種制藥學(xué)可接受賦形劑并用乙酸鹽緩沖劑緩沖至PH 3. 5-7. 0的洗脫緩沖液進行洗脫。15.依照項14的方法，其中所述層析分離步驟選自親和層析和離子交換層析。16.依照項15的方法，其中所述層析分離是通過蛋白A親和層析接著陽離子交換 層析再接著陰離子交換層析而進行的。17.依照項14-16任一項的方法，其中所述一種或多種制藥學(xué)可接受賦形劑包括 無機鹽。18.依照項17的方法，其中所述無機鹽是氯化鈉，所述氯化鈉以10_200mM的量存 在于所述洗脫緩沖液中。19.依照項14-18任一項的方法，其中所述乙酸鹽緩沖劑是乙酸鈉，所述乙酸鈉以 I-IOOmM的量存在于所述洗脫緩沖液中。20.依照項14-19任一項的方法，其中所述洗脫緩沖液含有50mM乙酸鈉和85mM氯 化鈉，并緩沖至PH 5. 5 士0. 1。21.依照項1-13任一項的藥物組合物在制備用于治療IL-13相關(guān)病癥的藥物中的 用途。22.依照項21的用途，其中所述IL-13相關(guān)病癥選自哮喘、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性鼻 炎、纖維化、慢性阻塞性肺病、硬皮病、炎性腸病和何杰金氏淋巴瘤。23.依照項22的用途，其中所述IL-13相關(guān)病癥是哮喘。24.治療或預(yù)防IL-13相關(guān)病癥的方法，其包括對患者施用治療有效量的依照項 1-13任一項的藥用抗體組合物。25.依照項1-13任一項的藥用抗體組合物，其是用于治療IL-13相關(guān)病癥的藥用 抗體組合物。
附圖簡述

圖1顯示了各樣品在本發(fā)明組合物28天穩(wěn)定性評估的第1天的SDS-PAGE分析結(jié)^ ο圖2顯示了各樣品在本發(fā)明組合物28天穩(wěn)定性評估的第21天的SDS-PAGE分析結(jié)果。圖3顯示了各樣品在本發(fā)明組合物觀天穩(wěn)定性評估的第1天的GP-HPLC分析結(jié)^ ο圖4顯示了各樣品在本發(fā)明組合物2-8 °C 28天穩(wěn)定性評估期間的GP-HPLC分析結(jié) 果的層析圖。圖5顯示了各樣品在本發(fā)明組合物25°C 28天穩(wěn)定性評估期間的GP-HPLC分析結(jié) 果的層析圖。圖6顯示了各樣品在本發(fā)明組合物用不同緩沖液中和的觀天穩(wěn)定性評估期間的 GP-HPLC分析結(jié)果的層析圖。圖7顯示了各樣品在本發(fā)明組合物洲天穩(wěn)定性評估的第觀天的IEF分析結(jié)果。圖8顯示了不同制劑于-70°C存儲的12個月穩(wěn)定性評估的凝膠過濾HPLC分析結(jié)果。圖9顯示了不同制劑于+5°C存儲的12個月穩(wěn)定性評估的凝膠過濾HPLC分析結(jié)果。圖10顯示了不同制劑于+25°C存儲的12個月穩(wěn)定性評估的凝膠過濾HPLC分析結(jié)果。圖11顯示了不同制劑于+37°C存儲的8周穩(wěn)定性評估的凝膠過濾HPLC分析結(jié)果。圖12顯示了不同制劑于+45°C存儲的5天穩(wěn)定性評估的凝膠過濾HPLC分析結(jié)果。圖13顯示了不同制劑于-70°C存儲的12個月穩(wěn)定性評估期間第0、6和12個月的 還原性SDS-PAGE分析結(jié)果。圖14顯示了于_70°C存儲的圖13中還原性SDS-PAGE分析之后BAK502G9重鏈和 輕鏈的百分比豐度。圖15顯示了不同制劑于+5°C存儲的12個月穩(wěn)定性評估期間第0、6和12個月的 還原性SDS-PAGE分析結(jié)果。圖16顯示了于+5°C存儲的圖15中還原性SDS-PAGE分析之后BAK502G9重鏈和輕 鏈的百分比豐度。圖17顯示了不同制劑于+25°C存儲的12個月穩(wěn)定性評估期間第0、6和12個月的 還原性SDS-PAGE分析結(jié)果。圖18顯示了于+25°C存儲的圖17中還原性SDS-PAGE分析之后BAK502G9重鏈和 輕鏈的百分比豐度。圖19顯示了不同制劑于+37°C存儲的8周穩(wěn)定性評估期間第0和8周的還原性 SDS-PAGE分析結(jié)果。圖20顯示了于+37°C存儲的圖19中還原性SDS-PAGE分析之后BAK502G9重鏈和 輕鏈的百分比豐度。圖21顯示了不同制劑于+45°C存儲的5天穩(wěn)定性評估期間第0和5天的還原性SDS-PAGE分析結(jié)果。圖22顯示了于+45°C存儲的圖21中還原性SDS-PAGE分析之后BAK502G9重鏈和 輕鏈的百分比豐度。圖23顯示了不同制劑于-70°C存儲的12個月穩(wěn)定性評估期間第0、6和12個月的 非還原性SDS-PAGE分析結(jié)果。圖M顯示了于_70°C存儲的圖23中非還原性SDS-PAGE分析之后完整BAK502G9 單體的百分比豐度。圖25顯示了不同制劑于+5°C存儲的12個月穩(wěn)定性評估期間第0、6和12個月的 非還原性SDS-PAGE分析結(jié)果。圖沈顯示了于+5°C存儲的圖25中非還原性SDS-PAGE分析之后完整BAK502G9單 體的百分比豐度。圖27顯示了不同制劑于+25°C存儲的12個月穩(wěn)定性評估期間第0、6和12個月的 非還原性SDS-PAGE分析結(jié)果。圖28顯示了于+25°C存儲的圖27中非還原性SDS-PAGE分析之后完整BAK502G9 單體的百分比豐度。圖四顯示了不同制劑于+37°C存儲的8周穩(wěn)定性評估期間第0和8周的非還原性 SDS-PAGE分析結(jié)果。圖30顯示了于+37°C存儲的圖四中非還原性SDS-PAGE分析之后完整BAK502G9 單體的百分比豐度。圖31顯示了不同制劑于+45°C存儲的5天穩(wěn)定性評估期間第0和5天的非還原性 SDS-PAGE分析結(jié)果。圖32顯示了于+45°C存儲的圖31中非還原性SDS-PAGE分析之后完整BAK502G9 單體的百分比豐度。
實施例下面參照以下方法和實施例來闡述本發(fā)明，僅作為例示。實施例1 :BAK502G9的表達(dá)以與WO 87/04462和WO 2004/076485中所述規(guī)程類似的方式在GS NSO細(xì)胞系中 表達(dá)BAK502G9，所得培養(yǎng)物上清液含598mg/l BAK502G9抗體。實施例2 :BAK502G9的純化(a)rmp 蛋白 A Sepharose 純化rmp蛋白A Sepharose fast flow層析步驟所使用的柱為2. 6cm直徑，在0. 9% w/v 氯化鈉中裝柱，床高14. 5cm，柱體積77ml。樹月旨來自GE Healthcare/Amersham Biosciences 17-5138。層析使用 Amersham Biosciences P-50 泵、UVl 檢測儀和流動室(flow cell)進 行。將柱在使用前用6M鹽酸胍清潔。用水清洗和清潔后，隨后將rmp蛋白A Sepharose fast flow柱用350ml磷酸鹽 緩沖鹽水PH7. 2平衡。將2. 6升培養(yǎng)物上清液直接于室溫以200cm/小時加載到柱上。然后用567ml磷酸鹽緩沖鹽水pH7. 2，接著用568ml 50mM乙酸鈉pH5. 55清洗柱。 通過用380ml 50mM乙酸鈉pH3. 75進行清洗，從柱上洗脫BAK502G9抗體。洗脫后，用50mM乙酸PH3.0清洗柱。在峰的上下坡最大UV偏差2%之間收集洗脫峰。在217ml中回收了 1. 5gBAK502G9 抗體。(b)低DH病毒滅活將rmp 蛋白 A Sepharose fast flow 洗出液用 173mlIOOmM 乙酸調(diào)整至 pH 3. 70。 然后將調(diào)整后的洗出液靜置60分鐘以滅活病毒。然后將調(diào)整后的洗出液用437ml 50mM氫 氧化鈉中和至ρΗ5· 50，并使用Millipore stericup (產(chǎn)品號SCGPUl 1RE)進行0. 22 μ m過 濾。在823ml中回收了 1. 4g BAK502G9抗體。(c) SP Sepharose 純化SP Sepharose fast flow層析步驟所使用的柱為1. 6cm直徑，在磷酸鹽緩沖鹽水 ρΗ7· 2 中裝柱,床高 15. 5cm，柱體積 31ml。樹脂來自 GE Healthcare/Amersham Biosciences 17-0729。層析使用 Amersham Biosciences P-50 泵、UVl 檢測儀和流動室(flow cell)進 行。將柱在使用前用0. 5M氫氧化鈉清潔。用水清洗和清潔后，隨后將SP Sepharose fast flow柱用145ml 50mM乙酸鈉 ρΗ5· 50 平衡。將400ml BAK502G9抗體(作為中和后的rmp蛋白A洗出液)直接于室溫以200cm/ 小時加載到柱上。然后用30&ι1 50mM乙酸鈉+30mM氯化鈉pH5. 50清洗柱。通過用150ml 50mM乙酸鈉+85mM氯化鈉pH5. 50進行清洗，從柱上洗脫BAK502G9 抗體。洗脫后，用50mM乙酸鈉+2M氯化鈉pH5. 50清洗柱。在峰的上坡最大UV偏差2%與下坡最大UV偏差30%之間收集洗脫峰。將洗出液 用 Millipore sterif lip (產(chǎn)品號 SCGP00525)進行 0. 22 μ m 過濾。在 54ml 中回收了 0. 67g BAK502G9 抗體。對剩余的39&ι1 BAK502G9抗體(作為中和后的rmp蛋白A洗出液)重復(fù)此加工步 驟。又在5細(xì)1中回收了 0. 67g BAK502G9抗體。在下一步前合并兩份過濾后的SP Sepharose 洗出液。(d)Q Sepharose Fast Flow 層析Q Sepharose fast flow層析步驟所使用的柱為1. 6cm直徑，在磷酸鹽緩沖鹽水 ρΗ7· 2 中裝柱，床高 13. 3cm，柱體積 27ml。樹脂來自 GE Heal thcare/Amer sham Biosciences 17-0510。層析使用 Amersham Biosciences P-50 泵、UVl 檢測儀和流動室(flow cell)進 行。將柱在使用前用0. 5M氫氧化鈉清潔。用水清洗和清潔后，隨后將Q Sepharose fast flow柱用138ml 50mM乙酸鈉 +85mM氯化鈉pH5. 50平衡。將Mml BAK502G9抗體(作為SP Sepharose洗出液)直接于室溫以200cm/小時 加載到柱上。通過用12細(xì)1 50mM乙酸鈉+85mM氯化鈉pH5. 50清洗柱，進行BAK502G9抗體的等 度洗脫(isocratic elution)。洗脫后，用50mM乙酸鈉+2M氯化鈉pH5. 50清洗柱。在峰的上下坡最大UV偏差2 %之間收集洗脫峰。將洗出液用 Milliporesteriflip (產(chǎn)品號 SCGPU01RE)進行 0. 22 μ m 過濾。在 88ml 中回收了
150. 52gBAK502G9抗體。對剩余的44ml BAK502G9抗體(作為SP Sepharose洗出液)重復(fù)此 加工步驟。又在51ml中回收了 0. Mg BAK502G9抗體。然后合并兩份過濾后的Q Sepharose 洗出液。(e)濃縮產(chǎn)品是在50mM乙酸鈉+85mM氯化鈉pH5. 50中獲得的，不需要滲濾。將17. 5升中的95. 31g BAK502G9抗體(作為Q Sepharose濾出液)濃縮至1. 5 升。使用 Millipore Pellicon 2TFF 系統(tǒng)和 0. lM230KDa 膜(MilliporeP2B030A01)來進行 濃縮。然后從該器材中回收BAK502G9抗體，然后用50mM乙酸鈉+85mM氯化鈉pH5. 50緩沖 沖洗該器材。然后將濃縮后的抗體與緩沖沖洗液(buffer flush)合并。將1. 67ml 10% w/v聚山梨醇酯80添加至合并液，聚山梨醇酯80的終濃度為0.01% w/v。然后將合并液進 行0.22 μ m過濾。在1.67升中回收了 91. 6克BAK502G9抗體。(f)所用材料用于配制上述緩沖液的化學(xué)制品如下鹽酸胍·Sigma Aldrich. G4505正磷酸氫二鈉.VffR.1038349正磷酸二氫鈉.VWR.102454R乙酸鈉三水合物.VWR. 102354X.氯化鈉.VWR.10241AP.乙酸.VWR. 10001CU.聚山梨醇酯80. J. T. Baker. 7394.實施例3 28天穩(wěn)定性分析rmp蛋白A層析如下文表1所列進行。表1:蛋白A層析參數(shù)
基質(zhì)rmp 蛋白 A Sepharose床高14. 2cm柱直徑5. Ocm柱體積278ml線性流速150cm/hr平衡緩沖液及CV 磷酸鹽緩沖鹽水PH7. 2，5個CV加載物質(zhì)澄清后的培養(yǎng)物收獲物加載容量(mg IgG/ml基質(zhì))16. 6mg/ml 基質(zhì)
權(quán)利要求
1.用于純化IL-13抗體的方法，其包括一個或多個層析分離步驟，其中每一個所述分 離步驟包括用含有一種或多種制藥學(xué)可接受賦形劑并用乙酸鹽緩沖劑緩沖至PH 3. 5-7. 0 的洗脫緩沖液進行洗脫。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述層析分離步驟選自親和層析和離子交換層析。
3.依照權(quán)利要求2的方法，其中所述層析分離是通過蛋白A親和層析接著陽離子交換 層析再接著陰離子交換層析而進行的。
4.依照權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述一種或多種制藥學(xué)可接受賦形劑包括無 機鹽。
5.依照權(quán)利要求4的方法，其中所述無機鹽是氯化鈉，所述氯化鈉以10-200mM的量存 在于所述洗脫緩沖液中。
6.依照權(quán)利要求1-5任一項的方法，其中所述乙酸鹽緩沖劑是乙酸鈉，所述乙酸鈉以 I-IOOmM的量存在于所述洗脫緩沖液中。
7.依照權(quán)利要求1-5任一項的方法，其中所述洗脫緩沖液含有50mM乙酸鈉和85mM氯 化鈉，并緩沖至PH 5. 5 士0. 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及白介素-13抗體組合物，更具體地，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含白介素-13抗體，更具體的說是白介素-13單克隆抗體，尤其是人白介素-13單克隆抗體。本發(fā)明還涉及純化所述抗體的方法和使用所述組合物來治療白介素-13相關(guān)病癥諸如哮喘、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性鼻炎、纖維化、慢性阻塞性肺病、硬皮病、炎性腸病和何杰金氏淋巴瘤，特別是哮喘的用途。
文檔編號A61K39/395GK102060925SQ20101055120
公開日2011年5月18日 申請日期2006年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月30日
發(fā)明者克萊爾·L·霍普, 卡倫·班尼斯特, 布倫丹·C·菲什, 珍妮特·E·蘭斯通 申請人:醫(yī)學(xué)免疫有限公司