專利名稱：一種天冬免疫佐劑及含有該佐劑的流感疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種天冬免疫佐劑，還涉及含有天冬免疫佐劑的流感疫苗，屬于生物 技術領域，
背景技術：
天冬，又稱天門冬別名武竹、天冬草等，為百合科(Liliaceae)植物天冬 (Asparagus cochinchinensis (Lour. )Merr.)的塊根。全國分布廣泛，主產于貴州、廣西、 云南、甘肅、安徽、河南、湖南、湖北、四川等地。秋冬二季采挖、洗凈、除去莖基和須根，置沸 水中煮或蒸至透心，趁熱除去外皮、洗凈、干燥、切片或成段后生用。天冬始載于《神農本草 經》，歷代本草均有記載。其味甘、苦，性寒，歸肺、腎經?！睹t(yī)別錄》載“去寒熱，養(yǎng)肌膚，益 氣力”?！对氯A于本草》載“鎮(zhèn)心，潤五臟，益皮膚，悅顏色”。能使肌膚艷麗，保持青春活力。 為2005年版《中國藥典》收載品種，具有養(yǎng)陰潤燥，清肺生津。主要用于治療肺燥干咳，頓 咳痰粘，咽干口渴，腸燥便秘等癥。近十余年人們對其化學成分和藥理學作用方面進行了很多研究，實驗證明，天冬 提取物具有升高外周白細胞，增強網狀內皮系統(tǒng)吞噬能力和體液免疫功能，延長抗體存在 時間的作用的作用；煎劑或醇提取液可促進抗體生成，延長抗體生存時間；對實驗動物有 非常顯著的抗細胞突變作用，可升高腫瘤細胞cAMP水平，抑制腫瘤細胞增殖。這些藥理學 作用與天冬所含的多種有效成分，如天門冬素(天冬酰胺)、粘液質、谷留醇、5-甲氧基 甲基糖醛、留體皂苷、新酮糖和糠醛衍生物等成分密切相關。佐劑是一類能增強抗原的免疫原性、提高疫苗效果的物質，正是佐劑技術，使國產 疫苗在價格上具有明顯優(yōu)勢。在流感疫苗中使用佐劑不僅可以增強免疫原性，還可以降低 抗原用量。特別在應對大流行流感時，使用佐劑降低抗原用量進而擴大接種人群數量的特 性顯得尤為重要。在大流行流感疫苗研究中應用到的佐劑主要有鋁佐劑(氧化鋁、氫氧化 鋁、磷酸鋁)、MF59(是一種水包油的乳劑，包含鯊烯，0. 5% Tween80和0. 5%三油酸聚 山梨脂的水包油乳液)、LTK63和新型佐劑等。目前上市流感疫苗使用的佐劑主要是鋁佐劑和MF59。但事實上鋁佐劑對蛋白亞單 位疫苗誘導抗體產生的能力較弱，不能有效地誘導免疫應答，在一些情況下還可產生與超 敏反應有關的IgE ；MF59作為佐劑使用在增免疫原性的同時，也增強了反應原性，如接種部 位紅、腫、熱、痛等癥狀增加。此外，由于安全性、副作用等問題，LTK63和新型佐劑等其他物 質，包括殼聚糖、ISCOMs等作為流感疫苗佐劑也還只限于研究階段。因此，隨著各種新發(fā)流 感在世界的爆發(fā)和對人感染性的增強，加快新型流感疫苗的研究，尋求更高安全性和免疫 原性的佐劑仍然是流感疫苗發(fā)展的一個需要。佐劑發(fā)揮作用是由于能增強抗原的免疫原性、提高疫苗效果，因此佐劑一般可在 多種疫苗中進行使用，如目前的鋁佐劑。所以佐劑的研究不僅對流感，而且對其它感染性疾 病的防治也有很高的價值。天冬提取物作為免疫佐劑的應用，以流行性感冒(簡稱流感)病毒疫苗為例得到了應用性的實驗結果。流行性感冒(簡稱流感)是指由流感病毒引起，具有高度傳染性的急性呼吸道傳 染病。流感發(fā)病快，傳染性強，發(fā)病率高，主要通過空氣飛沫傳播。流感的流行沒有明顯的 季節(jié)性，只是冬末春初發(fā)病率稍高一點，而且?guī)缀趺磕甓紩l(fā)生，或者局部爆發(fā)，或者大規(guī) 模流行，甚至造成世界規(guī)模的大流行，嚴重危害了人類的健康和生命，給社會造成了沉重的 負擔。到目前為止，接種流感疫苗被認為是預防流感發(fā)生與傳播的最佳方法。由于流感病 毒變異很快，通常每年的流行類型都有所不同，生產企業(yè)一般都在世界衛(wèi)生組織(WHO)指 導下選擇流感病毒毒株進行疫苗生產，每年接種最新的流感疫苗才能達到預防的效果。一 旦流感病毒變異造成大規(guī)模流行或者是世界性流行，疫苗需求量會大量增加，但由于目前 流感疫苗生產工藝的限制，短時間內不可能提供足量疫苗，所以，應用免疫佐劑，減少疫苗 用量并提高其效果就顯得非常重要。經系統(tǒng)查閱文獻和專利，目前未發(fā)現(xiàn)關于天冬提取物具有免疫佐劑作用的報道。

發(fā)明內容
為解決目前免疫佐劑單一，副作用難以避免，疫苗生產供應量有限，難以應付感染 性疾病暴發(fā)時疫苗需求量大，疫苗起效時間慢等問題，本發(fā)明提供一種能提高疫苗免疫效 果，同時帶來巨大的經濟效益和社會效益的天冬免疫佐劑。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種含有天冬免疫佐劑的流感疫苗。本發(fā)明提供的天冬免疫佐劑是由下列質量比的組分組成的天冬提取物 0.001 100%載體0 99. 999%。所述載體由下列質量比的組分組成乳化劑 20 70%助乳化劑 20 70%油相1 50%水相1 30%。所述乳化劑為常規(guī)的TweenSO或聚氧乙烯蓖麻油中的一種，或者為質量混合比為 3 2 2 3的常規(guī)TweenSO與SpanSO的混合物，或者為質量混合比為1 1的常規(guī)聚 氧乙烯蓖麻油與SpanSO的混合物。所述助乳化劑為常規(guī)的1，2_丙二醇或聚乙二醇400中的一種。所述油相為常規(guī)的肉豆蔻酸異丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中的一種。所述水相為注射用水或者含有藥物或疫苗成分的注射用水溶液。本發(fā)明提供的天冬免疫佐劑，優(yōu)選下列質量比天冬提取物 0.1 100%載體0 99.9%。本發(fā)明提供的一種含有天冬免疫佐劑的流感疫苗的組成是天冬免疫佐劑與流感 疫苗血凝素的質量比為50 180000，其中，所述天冬免疫佐劑由下列質量比的組分組成天冬提取物 0.001 100%載體0 99. 999%。
所述天冬提取物是用乙醇或水作為溶劑，經現(xiàn)有技術的常規(guī)方法提取得到的，具 體是乙醇提取將干燥的天冬粉碎成粉，置于容器內，用乙醇冷浸或溫浸提取，或者加 熱回流提取，過濾，取濾液，回收濾液中的乙醇，濃縮濾液得浸膏；其中，每次提取時，乙醇的 質量濃度為60 95%，乙醇加入量是天冬藥材質量的2 10倍，冷浸是在室溫下浸泡1 10天，溫浸是在40 60°C溫度下浸泡1 2小時，提取次數為1 3次；加熱回流提取是 在20 60°C溫度下，回流提取1 3次，每次20分鐘 4小時；水提取將干燥的天冬粉碎成粉，置于容器內，用蒸餾水冷浸或溫浸提取，或者加 熱回流提取，過濾，取濾液，濃縮濾液得浸膏；其中，每次提取時，蒸餾水的加入量是天冬藥 材質量的2 10倍，冷浸是在室溫下浸泡1 10天，溫浸是在40 60°C溫度下浸泡1 2小時，提取次數為1 3次；加熱回流提取是在20 60°C溫度下，回流提取1 3次，每 次20分鐘 4小時。另外，所述天冬提取物還可采用現(xiàn)有技術的除水提取、乙醇提取以外的其它常規(guī) 溶劑提取而得到的提取物，如采用甲醇、丙酮、乙酸乙酯為溶劑進行的提取。本發(fā)明提供的天冬免疫佐劑與傳統(tǒng)氫氧化鋁佐劑相比，具有以下優(yōu)點1)天冬提取物制備方法簡單、經濟、環(huán)保。2)天冬是一種天然中草藥，常作為保健品使用。在流感疫苗中作為佐劑使用，安全 性高、副作用小。例如用含天冬提取物的流感疫苗肌肉注射小鼠，4小時內觀察小鼠活動性 無明顯減弱，未見全身不良反應。而用含氫氧化鋁佐劑流感疫苗注射，可觀察到小鼠活動性 明顯減弱，注射局部腫脹明顯。3)用天冬提取物為佐劑的流感疫苗，制備方法簡便，疫苗質量容易控制；而以氫 氧化鋁為佐劑制備流感疫苗，制備和存儲過程中，影響因素較多，對于疫苗的質量較難控 制。4)用天冬提取物作為流感疫苗佐劑，可更好的提高疫苗免疫原性，大大降低疫苗 抗原用量。例如通過以天冬提取物為佐劑的流感疫苗和以氫氧化鋁為佐劑的流感疫苗免疫 小鼠發(fā)現(xiàn)，以天冬提取物為佐劑使用的疫苗抗原用量即使是以氫氧化鋁為佐劑的疫苗抗原 用量的一半或者更少，同樣可以達到理想的免疫保護效果。


圖1為不同接種組在56天內的血凝抑制抗體效價變化；圖2為不同接種組在接種后7天內的體重增長情況；圖3為不同接種組在42天內的血凝抑制抗體效價；圖4為不同接種組在2周、4周、6周的血凝抑制抗體效價。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但并不以此來限定本發(fā)明。本發(fā)明實施例中未特別指明的組分均為市購產品，所用設備或儀器均是常規(guī)的。實施例1天冬乙醇提取物的制備取干燥天冬30g，粉碎成粉，置于容器內，用7倍即210g質量濃度為90%的乙醇，按常規(guī)進行加熱回流提取，其中，每次回流時間為40分鐘，溫度 為60°C，提取次數為3次，過濾后，對濾液進行減壓回收乙醇后，余下濾液經濃縮干燥，得浸膏。實施例2天冬水提取物的制備取干燥天冬30g，粉碎成粉，置于容器內，用5倍即150g蒸 餾水按常規(guī)進行加熱回流提取，其中，每次回流時間為3小時，溫度為25°C，提取次數為3 次，過濾，合并濾液后，對濾液進行濃縮干燥，得浸膏。實施例3納米乳劑載體的制備1)按下列質量比備料1. Ig聚氧乙烯蓖麻油，1.6g Span80,6g 1，2_丙二醇，3g肉
豆蔻酸異丙酯，3. 4g注射用水；2)向混合攪拌瓶內加入1. Ig聚氧乙烯蓖麻油，1.6g Span80，6g 1，2_丙二醇，3g 肉豆蔻酸異丙酯在轉速為200轉/分鐘，室溫條件下，持續(xù)攪拌10分鐘，混勻后加入3g肉 豆蔻酸異丙酯，混合均勻得混合物；3)在上述2)的混合物中滴入3. 4g注射用水，同時在轉速為200轉/分鐘，室溫 下，攪拌混合液至黃色半透明，得到納米乳劑載體；4)對3)制得的納米乳劑載體進行如下檢測1.經馬爾文粒徑檢測儀檢測，粒徑范圍為27. 672 32. 458nm，合格；2.經3000rpm，15min離心分離，納米 乳劑體系不分層，合格；3.經4°C放置50天，納米乳劑體系無變化，合格。實施例41)稱取實施例2的天冬提取物15. 2mg,溶于3. 4ml市購的H3N2流感病毒裂解疫 苗(血凝素含量43. 67 μ g/ml)，得含天冬提取物的流感疫苗；2)取1. Ig聚氧乙烯蓖麻油，1.6g Span80,6g 1，2_丙二醇，3g肉豆蔻酸異丙酯放 于攪拌瓶中，轉速維持在200轉/分鐘，室溫攪拌10分鐘，至充分混勻，得混合溶液；3)在上述2)的混合溶液中緩慢滴入1)制備的含天冬提取物的流感疫苗3. 4ml, 同時維持轉速在200轉/分鐘，攪拌至溶液為黃棕色半透明，得到以天冬提取物、納米 乳劑載體為佐劑的流感病毒疫苗，其中天冬提取物的質量比為0. 130%，載體質量比為 99. 870% ；天冬免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為78902。4)對3)制得的含有天冬免疫佐劑的流感病毒疫苗進行如下檢測1.經馬爾文粒 徑檢測儀檢測，粒徑范圍為31. 793 38. 165nm，合格；2.經3000rpm，15min離心分離，納米 乳劑體系不分層，合格；3.經4°C放置50天，納米乳劑體系無變化，合格。用實施例4制備的含有天冬免疫佐劑的流感病毒疫苗，注射標準體重昆明種雄性 小鼠，每只小鼠200ul。此200ul注射疫苗中流感疫苗血凝素含量為1.97呢，天冬0.2!1^。 第1天接種一針，第21天補種一針。于首次免疫后第一周開始，每隔7天采尾血，分離血清 測定血凝抑制效價，同時設立注射等量的生理鹽水空白對照組、等血凝素含量的Al (OH)3佐 劑流感疫苗的佐劑對照組、等血凝素含量的單獨流感疫苗對照組。得到的血凝抑制抗體效 價檢測結果見附圖1。實施例51)稱取實施例1的天冬提取物1. 75mg,溶于382ul市購的H3N2流感病毒裂解疫
6苗(血凝素含量為43. 67 μ g/ml)，得含天冬提取物的流感疫苗；2)稱取聚氧乙烯蓖麻油lg，1，2-丙二醇lg，肉豆蔻酸異丙酯Ig于攪拌瓶中，轉速 維持在100轉/分鐘，室溫攪拌1 10分鐘，至充分混勻，得混合溶液；3)在上述2)的混合溶液中緩慢滴入1)制備的含天冬提取物的流感疫苗382ul， 同時維持轉速在200轉/分鐘，攪拌混合液至透明，得到以天冬提取物、納米乳劑載體為佐 劑的流感病毒疫苗。其中天冬提取物的質量比為0. 058%，載體質量比為99. 942% ；天冬 免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為179941。實施例61)制備下列不同的佐劑或溶液a)取實施例2的天冬提取物0. 2mg溶于160 μ 1生理鹽水，備用；b)取濃度為15. 98mg/ml的氫氧化鋁12. 5 μ 1，其中含AL(OH)3O. 2mg，加入生理鹽 水至體積為160 μ 1，備用；c) 160 μ 1生理鹽水，備用；d) 200 μ 1生理鹽水，備用；2)制備下列不同的疫苗取血凝素含量為43. 67 μ g/ml的市購H3N2流感病毒裂解疫苗40 μ 1，分別和上述 a、b、c不同溶液混合，分別得到含有天冬免疫佐劑的流感疫苗樣品A、含有AL (OH)3佐劑的 流感疫苗樣品B、單獨的流感疫苗樣品C。d組不加疫苗，為生理鹽水空白對照樣品D。所配 置的上述A、B、C、D四個樣品均制備三份，體積均為200μ 1，備用；其中含有天冬免疫佐劑的 流感疫苗樣品A中天冬提取物的質量比為100%，載體質量比為0%;天冬免疫佐劑與流感 疫苗血凝素的質量比為144。3)免疫接種及檢測用上述2)所配的Α、B、C、D四個不同的樣品分別免疫標準體重雌性昆明小鼠，每 組3只，每只肌肉注射200ul，第1天接種一針，第21天補種一針。于第一天接種前和接種 后第8天對各組小鼠進行體重測量，對7天內各組平均增長的體重進行計算，結果見附圖2 ； 并于首次免疫后14天、21天、28天、35天、42天取尾血，分離血清測定血凝抑制效價，結果 見附圖3。實施例7A、取實施例1的天冬提取物0. 3mg溶于178. 5μ 1生理鹽水，然后加入市購的Η3Ν2 流感裂解疫苗20μ 1至終體積為200μ 1，Η3Ν2流感裂解疫苗的血凝素含量為0. 87ug，得含 有天冬免疫佐劑的流感病毒疫苗，備用；其中天冬提取物的質量比為100%，載體質量比 為0% ；天冬免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為345。B、取實施例2的天冬提取物0. Img溶于160 μ 1生理鹽水中，然后加入市購的Η3Ν2 流感裂解疫苗40μ 1至終體積200μ 1，Η3Ν2流感裂解疫苗的血凝素含量為1. 75μ g，得含 有天冬免疫佐劑的流感病毒疫苗，備用；其中天冬提取物的質量比為100%，載體質量比 為0% ；天冬免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為57。C、取H3N2流感裂解疫苗40 μ 1，其中含血凝素1. 75 μ g，與160 μ 1生理鹽水混合 至終體積為200 μ 1，作為單獨疫苗對照組，備用；D、取濃度為15. 98mg/ml的氫氧化鋁佐劑37. 5 μ 1，其中含0. 6mgAL (OH)3,與含血凝素1. 75 μ g的流感疫苗40 μ 1混合，然后加入生理鹽水至終體積200 μ 1，作為AL (OH) 3佐 劑疫苗對照組，備用Ε、生理鹽水200 μ 1，為空白對照組，備用；F、免疫接種及抗體檢測將上述配好的Α、B、C、D、E五個樣品分別免疫標準體重昆明雌性小鼠，肌肉注射， 每只200 μ 1，每組5只，第1天接種一針，第21天補種一針，分別于首次免疫后2周、4周、6 周進行尾部采血，分離血清，檢測血凝抑制抗體效價，結果見附圖4。結論本發(fā)明提供的天冬免疫佐劑具有顯著的免疫佐劑效果，毒副作用小，可用于 人、獸多種疫苗，以防治各種感染性疾病。
權利要求
一種天冬免疫佐劑，其特征在于由下列質量比的組分組成天冬提取物 0.001～100％載體0～99.999％。
2.根據權利要求1所述的天冬免疫佐劑，其特征在于所述載體由下列質量比的組分組成乳化劑 20 70% 助乳化劑 20 70% 油相1 50%水相1 30%。
3.根據權利要求2所述的天冬免疫佐劑，其特征在于所述乳化劑為TweenSO或聚氧乙 烯蓖麻油中的一種，或者為質量混合比為3 2 2 3的TweenSO與SpanSO的混合物，或 者為質量混合比為1 1的聚氧乙烯蓖麻油與SpanSO的混合物；所述助乳化劑為1，2_丙 二醇或聚乙二醇400中的一種；所述油相為肉豆蔻酸異丙酯或油酸乙酯或注射用大豆油中 的一種；所述水相為注射用水或者含有藥物或者疫苗成分的注射用水溶液。
4.一種天冬免疫佐劑，其特征在于由下列優(yōu)選的質量比的組分組成 天冬提取物0. 1 100%載體0 99. 9%。
5.一種含有天冬免疫佐劑的流感疫苗，其特征在于天冬免疫佐劑與流感疫苗血凝素的 質量比為50 180000，其中，所述天冬免疫佐劑由下列質量比的組分組成天冬提取物 0. 001 100% 載體0 99. 999%。
6.根據權利要求1所述的天冬免疫佐劑，其特征在于所述天冬提取物是用乙醇或水作 為溶劑，經現(xiàn)有技術的常規(guī)方法提取得到的，具體是乙醇提取將干燥的天冬粉碎成粉，置于容器內，用乙醇冷浸或溫浸提取，或者加熱回 流提取，過濾，取濾液，回收濾液中的乙醇，濃縮濾液得浸膏；其中，每次提取時，乙醇的質量 濃度為60 95%，乙醇加入量是天冬藥材質量的2 10倍，冷浸是在室溫下浸泡1 10 天，溫浸是在40 60°C溫度下浸泡1 2小時，提取次數為1 3次；加熱回流提取是在 20 60°C溫度下，回流提取1 3次，每次20分鐘 4小時；水提取將干燥的天冬粉碎成粉，置于容器內，用蒸餾水冷浸或溫浸提取，或者加熱回 流提取，過濾，取濾液，濃縮濾液得浸膏；其中，每次提取時，蒸餾水的加入量是天冬藥材質 量的2 10倍，冷浸是在室溫下浸泡1 10天，溫浸是在40 60°C溫度下浸泡1 2小 時，提取次數為1 3次；加熱回流提取是在20 60°C溫度下，回流提取1 3次，每次20 分鐘 4小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種天冬免疫佐劑及含有該佐劑的流感疫苗，其中天冬免疫佐劑由下列質量比的組分組成天冬提取物0.001～100％，載體0～99.999％。所述含有天冬免疫佐劑的流感疫苗的組成是天冬免疫佐劑與流感疫苗血凝素的質量比為50～180000。本發(fā)明提供的天冬佐劑具有顯著的免疫佐劑效果，用于各種人、獸疫苗中，能起到有效的疾病防治作用。天冬提取物作為流感疫苗的免疫佐劑，與傳統(tǒng)氫氧化鋁佐劑比較，其使用安全性高、副作用小，能更好地提高流感疫苗免疫原性，在制備流感疫苗過程中，其方法簡便，經濟環(huán)保，質量容易控制，大大降低了流感疫苗抗原用量，能夠滿足流行性流感暴發(fā)時的免疫需求。
文檔編號A61K39/39GK101926995SQ20101025695
公開日2010年12月29日 申請日期2010年8月19日 優(yōu)先權日2010年8月19日
發(fā)明者呂青, 李慧, 李映波, 程永現(xiàn), 陳芹芹 申請人:中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所;中國科學院昆明植物研究所