抗腫瘤疫苗佐劑、其制備方法和編碼核酸以及抗腫瘤疫苗組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗佐劑，尤其涉及由鞭毛蛋白與熱休克蛋白gp96制備的融合 蛋白Flagp96疫苗佐劑。另外，本申請還涉及編碼融合蛋白Flagp96的核酸以及含有該融 合蛋白Flagp96的疫苗組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是嚴重威脅人類的健康的多發(fā)病和常見病。手術(shù)、化療和放療是治療惡 性腫瘤的三大傳統(tǒng)療法。腫瘤的免疫治療近年來發(fā)展迅速，提高腫瘤的免疫原性，制備高效 的腫瘤疫苗已成為免疫治療的熱點。最有效的疫苗必須既能激活CD4 +T細胞又能激活CD8+T 細胞，因此基于樹突狀細胞的免疫治療和腫瘤疫苗具有極大的開發(fā)及臨床應用價值。
[0003] 樹突狀細胞（dendritic cells，DCs)是體內(nèi)功能最強的專職抗原提呈細胞 (antigen presenting cell，APC)，可以通過HLA限制的方式向處女T細胞呈遞抗原，能夠 高水平表達MHC-I、MHC-II類分子，可以分泌免疫刺激因子，表達黏附和共刺激分子，從而 誘發(fā)CD4 +Th細胞的有效初始化和產(chǎn)生強效的抗腫瘤CTLs，制備DC疫苗的策略旨在誘導抗 原特異性免疫應答和形成免疫記憶。目前，將自體/異體腫瘤細胞或腫瘤抗原與樹突狀細 胞融合，雖可增強其免疫原性，提高CDS +T細胞的殺瘤活性，但殺傷效應有限，操作復雜，成 本高昂，且腫瘤特異性抗原篩選困難，難于大規(guī)模臨床應用。
[0004]而佐劑是一種非特異性的免疫增強劑，將體液免疫轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎庖撸淖兠庖咔?蛋白的種類和亞類，消除免疫耐受性從而增強免疫反應。理想的佐劑應該有以下特征：能促 進體液和細胞介導的免疫，也能作用于弱免疫性抗原，而且不引起有害的副作用，能以不同 途徑免疫，也能用于不同抗原，能在免疫抑制個體中發(fā)揮作用，應用于食用動物不應留有毒 素殘留，能有效影響免疫反應質(zhì)量，并且性能穩(wěn)定、便宜而且容易產(chǎn)生。
[0005] 樹突狀細胞作為體內(nèi)功能最強的專職抗原提呈細胞，是連接抗原與免疫應答細胞 以激發(fā)有效抗腫瘤免疫應答反應的橋梁?；诨罨瘶渫粻罴毎哪[瘤疫苗，通常以自身腫 瘤細胞和同種異體DC融合，產(chǎn)生的融合細胞表達腫瘤抗原并具DC的共刺激能力；或以腫瘤 相關(guān)抗原、腫瘤細胞溶解物負載DC疫苗，可在不同癌癥的治療中產(chǎn)生腫瘤特異性CD8 +T細 胞免疫應答。但其臨床應用中發(fā)現(xiàn)許多腫瘤缺乏明確的特異性抗原肽，且單一抗原肽負載 DC增加了誘導多樣化腫瘤免疫耐受的危險性，這使得腫瘤成分負載DC的免疫治療缺乏有 效靶點。
[0006] 鞭毛蛋白，是構(gòu)成細菌的鞭毛纖維的粒狀蛋白質(zhì)，具有較強的抗原性，可以通過自 身激發(fā)先天性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應答，發(fā)揮較強的免疫佐劑作用。我們已經(jīng)確定Toll-Iike受 體（TLR)功能特性，先天性免疫系統(tǒng)精確熟練的檢測入侵的病原微生物。通過TLR識別微 生物組分啟動信號轉(zhuǎn)導途徑，從而觸發(fā)基因的表達。這些基因產(chǎn)物控制先天免疫反應和進 一步指導抗原特異性獲得性免疫的發(fā)展。
[0007] TLR5是鞭毛蛋白受體的一部分，主要表達于肺和腸上皮細胞、單核/巨噬細胞，小 腸的固有層未成熟樹突狀細胞，是鞭毛蛋白的受體。在體內(nèi)，鞭毛蛋白能夠增強抗原特異性 CD4+T細胞擴增和記憶的發(fā)展，與TLR-5相互作用，誘導產(chǎn)生了促炎癥反應和激活宿主的樹 突狀細胞。此外，鞭毛蛋白能誘導大量促炎性介質(zhì)，如TNF-a、IL-l、IL-6、MIP_3a和iNOS， 可參與細菌相關(guān)病理的發(fā)展。類似于內(nèi)毒素，鞭毛蛋白是全身性炎癥反應的有效介質(zhì)。
[0008] 熱休克蛋白（HSP) gp96是一種高度保守和呈單態(tài)性的蛋白質(zhì)。gp96可與DC表面 的受體（如CD91、CD40、Toll-Iike受體和清道夫受體等）相互作用，通過CD14PTLR2和 CD14PTLR4介導的信號轉(zhuǎn)導途徑誘導DC成熟并增強其功能，促進CD8 +和CD4 +T細胞細胞增 殖和分泌細胞因子。能與細胞內(nèi)大量多肽非共價結(jié)合而不受細胞單倍型和MHC分子的影 響，包括細胞中的腫瘤抗原、病毒抗原或胞內(nèi)細菌抗原。gp96-肽復合物也可在體外形成，并 具有與體內(nèi)相似的免疫活性。gp96-肽復合物通過gp96的特異性受體CD91介導的內(nèi)吞被 抗原提呈細胞攝取，然后通過內(nèi)源性途徑將其結(jié)合的抗原肽提呈給MHC I類和II類分子， 從而啟動特異性T細胞CD8+和CD4 +T細胞免疫應答。
[0009] 綜上所述，開發(fā)簡便、高效、多功能的免疫佐劑迫在眉睫，然而，現(xiàn)有技術(shù)中沒有將 鞭毛蛋白與熱休克蛋白融合gp96從而作為免疫佐劑的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的申請人通過深入研究發(fā)現(xiàn)，通過使鞭毛蛋白與熱休克蛋白gp96融合得 到的融合蛋白Flagp96能夠使鞭毛蛋白和熱休克蛋白gp96能夠使兩者的功能產(chǎn)生協(xié)同效 應，達到增強特異抗原性，同時能有效活化抗原遞呈細胞并增強其抗原遞呈能力，刺激特化 樹突狀細胞、CD8+T淋巴細胞和自然殺傷（NK)細胞等，功能性激活所必需的其他免疫信號。 從而極大地增強機體天然免疫反應的能力，形成免疫消除腫瘤，達到癌癥免疫治療的目標。 [0011] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種可作為免疫佐劑的融合蛋白，其為鞭毛蛋白 f lagelin的氨基酸序列A和熱休克蛋白gp96的氨基酸序列B的融合蛋白。
[0012] 在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白中鞭毛蛋白flagelin來源于鼠傷寒沙 門氏菌菌株LT2。在另外優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白中熱休克蛋白gp96來源于 人類。
[0013] 優(yōu)選地，本發(fā)明的融合蛋白的序列為SEQ ID NO :2所示的序列。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種核酸，其編碼本發(fā)明所述的融合蛋白。優(yōu)選地， 所述序列具有SEQ ID NO :1所示的序列。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供制備融合蛋白的方法，其中包括使本發(fā)明所述的核 酸在細胞表達系統(tǒng)或非細胞表達系統(tǒng)中進行翻譯的過程?？蛇x地，所述制備融合蛋白的方 法包括通過化學合成方式來合成肽的過程。
[0016] 此外，本發(fā)明還提供本發(fā)明中所述的融合蛋白作為佐劑在制備用于治療腫瘤的疫 苗中的用途。此外，本發(fā)明還提供本發(fā)明所述的核酸在制備用于治療腫瘤的基團疫苗中的 用途。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供一種疫苗組合物，其包括本發(fā)明所述的融合蛋白和 腫瘤抗原。優(yōu)選地，所述腫瘤抗原選自細胞抗原、病毒抗原和細菌抗原。
[0018] 優(yōu)選地，抗腫瘤疫苗組合物通過包括以下步驟的方法制備：
[0019] (1)將腫瘤細胞經(jīng)過2-10次反復凍融，釋放出抗原，增加暴露抗原的數(shù)量，表位得 到增加，從而增強抗原的免疫原性；
[0020] (2)引入白喉毒素，作為載體，有效地遞送抗原到MHC類分子上；
[0021] (3)加入T輔助表位mHSP70407-426,其來自結(jié)核桿菌，能誘導Thl的極化反應，同 時刺激Thl極化因子的表位；
[0022] (4)將所述多種抗原、白喉毒素和T輔助表位mHSP70407-426用戊二醛偶聯(lián)；
[0023] (5)引入所述抗腫瘤疫苗佐劑。
[0024] 其中，腫瘤細胞優(yōu)選地選自由 HCC1599 ATCC CRL-2331、HCC1937 ATCC CRL-2336、 HCC1143 ATCC CRL-2321 和 MDA-MB-468 ATCC HTB-132 組成的組的至少之一。
[0025] 本發(fā)明的融合蛋白不僅能夠增強抗原遞呈，還能夠刺激特化免疫細胞，如樹突狀 細胞、CD8 +T淋巴細胞和自然殺傷（NK)細胞等功能性激活所必需的其他免疫信號。從而制 服癌癥抑制機體天然免疫反應的能力，恢復或形成免疫消除腫瘤，達到癌癥免疫治療的目 標。這一免疫治療有潛力單獨使用或與傳統(tǒng)的癌癥治療聯(lián)合使用，形成和建立免疫保護，對 抗癌癥和轉(zhuǎn)移灶。
[0026] 通過解釋本發(fā)明的以下優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點將變得清楚。
【附圖說明】
[0027] 圖1細胞免疫過程的說明圖。
[0028] 圖2真核表