專利名稱：柯里拉京在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化合物柯里拉京(Corilagin)，尤其是涉及一種柯里拉京在制備 抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤(tumor)是一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤(Malignant Tumor, cancer) 是目前危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病。根據(jù)我國衛(wèi)生部公布的資料，2006年我國惡性腫 瘤在農(nóng)村和城市人口中死亡率均居第一位。并且惡性腫瘤的危害性還在日益增加。目前， 我國常見的10大惡性腫瘤為肺癌、胃癌、食管癌、腸癌、肝癌、宮頸癌、乳腺癌、白血病、惡性 淋巴瘤、鼻咽癌。在諸多惡性腫瘤中，肝癌、卵巢癌是最難治療的一類，患者的死亡率常年居 高不下，5年存活率很低，因此它們都成為了抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點。肝癌(hetatocellular carcinoma, HCC)禾口卵巢癌(Ovarian cancer)均是臨床 上治療難度大的惡性腫瘤，迄今仍缺乏理想的治療藥物。其早期一般無臨床癥狀，很難發(fā) 現(xiàn)，而一旦出現(xiàn)典型的臨床表現(xiàn)，通常已經(jīng)屬于中晚期，發(fā)生了侵襲轉(zhuǎn)移，患者死亡率非常 高。其中，肝癌，俗稱“癌中之王”，屬于中醫(yī)肝積、肥氣、癥積、膨脹、癖黃等范疇，惡性程度 高，發(fā)展迅速，自然生存期短，5年生存率僅為14% 30%。全世界每年新發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤 病人42. 5%發(fā)生在中國，且年齡多為40 50歲。而卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之 一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和乳腺癌而列居第三位。但因卵巢癌致死者，卻占各類婦科腫瘤 的首位，對婦女生命造成嚴(yán)重威脅。到目前為止，就國內(nèi)外臨床資料統(tǒng)計，其5年生存率僅 25% 30%?？吕锢┯址Q訶子次鞣素、鞣料云實素等，化學(xué)名為1-0-沒食子酰-3，6-0-六羥 基聯(lián)苯二甲酰-D-葡萄糖，是從大戟科葉下株屬植物中分離一種鞣質(zhì)，由于鞣質(zhì)在早 些年代常被看作是植物中的無效成份，因而在天然藥物研發(fā)過程中，都希望去除得越徹底 越好，導(dǎo)致迄今國內(nèi)外對柯里拉京的而研究較少，主要集中在抗病毒、抗血脂、抗血壓、抗 凝血等方面。目前，國內(nèi)僅有的7個公開專利(CN101461816A、CN1709901A、CN1695647A、 CN1695627A、CN1197641A、CN101461831A、CN101613382A)涉及到柯里拉京的制備、抗乙型肝 炎、胃酸過多等方面的研究；且在抗腫瘤藥物的研究方面，未見關(guān)于藥理學(xué)和分子機制的國 內(nèi)專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供柯里拉京在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述柯里拉京又稱訶子次鞣素、鞣料云實素等，是從大戟科葉下株屬植物中分離 出的一種鞣質(zhì)，所述柯里拉京(Corilagin)的化學(xué)名為1_0_沒食子酰-3，6_0_六羥基聯(lián)苯 二甲酰-3 -D-葡萄糖，其分子式為C27H22018，結(jié)構(gòu)式如下 所述抗腫瘤藥物包括抗腫瘤生長藥物或抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面的藥物等。所述抗腫瘤藥物可為口服藥劑或注射藥劑等。所述注射可為靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射等。本發(fā)明所述柯里拉京可以采用中國專利CN1197641A或CN1709901A中公開的方法 制備。實驗表明，柯里拉京具有很好的抗腫瘤效果，不管是在體外腫瘤細(xì)胞實驗，還是對 體內(nèi)腫瘤動物模型都有很好的療效。所述柯里拉京是一種具有抗腫瘤藥效的新化合物，可 用于制備抗腫瘤藥物。本發(fā)明以肝癌和卵巢癌為模型，研究柯里拉京在體外的細(xì)胞水平、分子水平上 對肝癌細(xì)胞Be 17402、SMMC7721及卵巢癌細(xì)胞Hey、SK0V3ip的增殖，凋亡、細(xì)胞周期阻滯 和相關(guān)信號傳導(dǎo)通路中蛋白的分泌情況等作用效果，以及在裸鼠體內(nèi)對高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞 MHCC97-H的生長、轉(zhuǎn)移的作用效果，揭示柯里拉京干預(yù)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成的信號傳 導(dǎo)機制，確定抗腫瘤的作用靶點，建立柯里拉京作為藥物治療惡性腫瘤生長和侵襲轉(zhuǎn)移的 有效策略。本發(fā)明所涉及的抗腫瘤藥物，可以是柯里拉京按照常規(guī)的藥物制劑工藝，制備成 一種適合臨床上使用的藥物制劑，并具備良好的抗腫瘤生長和侵襲轉(zhuǎn)移療效。


圖 1 為本發(fā)明 MTT 測定 72h柯里拉京 Chang-liver、Bel7402、SMMC7721、Hey 細(xì)胞增 殖的抑制效果。在圖1中，橫坐標(biāo)為柯里拉京濃度(P g/mL)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞抑制率(％ ) ;A 柯里拉京對Chang-liver、Bel7402、SMMC772172h的細(xì)胞增殖的抑制效果； Chang-liver， ■ Bel7402，▲ SMMC7721 ；B 柯里拉京72h對N0E001細(xì)胞增殖的抑制效果；C 柯里拉京72h 對Hey細(xì)胞增殖的抑制效果。圖2為本發(fā)明所述柯里拉京對卵巢癌細(xì)胞Hey的細(xì)胞周期阻滯作用。在圖2中縱 坐標(biāo)Number為檢測器所檢測到的細(xì)胞數(shù)量，橫坐標(biāo)Channel (FL2-A)為檢測器中細(xì)胞DNA 含量；圖(a)、(b)、(c)分別為對照組中24h、48h、72h流式結(jié)果；圖(A)、(B)、(C)分別為柯 里拉京處理細(xì)胞24h、48h、72h后的流式結(jié)果。圖3為本發(fā)明所述柯里拉京對SK0V3ip細(xì)胞中TGF-0 /PI3K/Akt/Snail信號通 路的影響。在圖3中，A 柯里拉京對SK0V3ip細(xì)胞內(nèi)AKT和pAKT的作用；No treat 沒有 藥物處理；A-treated 短葉蘇木酚酸乙酯處理《-treated 柯里拉京處理；B 柯里拉京對SK0V3ip細(xì)胞內(nèi)TGF-3的作用；C 柯里拉京對SK0V3ip細(xì)胞內(nèi)Snail的作用。圖4為本發(fā)明柯里拉京對裸鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制作用。在圖4中，(a)為陰性對 照組，(b)為陽性對照組，(A)為10mg/kg柯里拉京組，⑶為20mg/kg柯里拉京組，(C)為 30mg/kg柯里拉京組。
具體實施例方式以下實施例通過柯里拉京在體內(nèi)外對肝癌和卵巢癌的抑制效果，以及在分子水平 上闡述的抗腫瘤機理來說明本發(fā)明，但并不代表本發(fā)明只限于該實施例。對福建閩南地區(qū)的民間偏方和中醫(yī)驗方中涉及的45科114種南藥，通過活性跟 蹤進行大規(guī)模的篩選，最終篩選出8科12種具有明顯抗癌效果的中草藥，通過綜合評價發(fā) 現(xiàn)葉下珠(Phyllanthus urinaria L.)和珠子草(Phyllanthus niruri L.)兩種大戟科 植物最具潛力。繼續(xù)對該兩種植物中抗癌活性成分進一步研究發(fā)現(xiàn)，其中主要的抗腫瘤 活性成分為單一化合物，呈白色針晶狀粉末，從質(zhì)譜和元素分析推出該化合物為柯里拉京 (Corilagin,分子式為 C27H22018)。實施例1柯里拉京在體外對肝癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞以及正常細(xì)胞的抑制效果實驗材料細(xì)胞株、培養(yǎng)液、藥品人肝癌細(xì)胞Be 17402、SMMC7721、人卵巢癌細(xì)胞 Hey、人正常肝細(xì)胞Chang-liver以及人正常卵巢上皮細(xì)胞N0E001購自中國科學(xué)院上海細(xì) 胞生物學(xué)研究所；培養(yǎng)基RPMI 1640購自GIBC0公司，胎牛血清購自Hyclone公司，青霉 素、鏈霉素購自上海生工公司；3-(4，5_ 二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(簡稱為 MTT)、二甲基亞砜(簡稱為DMS0)等購自Sigma公司或國內(nèi)其他公司。實驗方法將一組濃度為0、6. 25、12. 5,25,50,100,200 u g/mL的柯里拉京分別作 用細(xì)胞 Bel7402、SMMC7721、Hey、Chang-liver 和 N0E00172h，再用 MTT 法測定。具體方法 如下(1)取對數(shù)生長期細(xì)胞，0. 25%胰酶消化，用細(xì)胞培養(yǎng)液制成5 X 104個/mL單細(xì)胞懸 液接種于96孔板，每孔100 y L ；⑵培養(yǎng)24h后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，分別加入100 u L對照 組培養(yǎng)液及含柯里拉京的實驗組培養(yǎng)液，每組4個重復(fù)孔；(3)繼續(xù)培養(yǎng)72h后，吸去培養(yǎng) 液，每孔加人200 u L MTT (0. 5mg/ml)，再繼續(xù)培養(yǎng)4h ； (4)吸去上清，加200 u L DMS0,振蕩 lOmin，使結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀上讀取490nm處吸光度(0D)值。根據(jù)光吸收值計算人參 皂苷IH901處理后的細(xì)胞相對存活率。結(jié)果表明，柯里拉京對腫瘤細(xì)胞Bel-7402、SMMC7721和Hey的抑制作用都極為顯 著(圖 1)。其 72h 的 IC5Q 分別達到 19. 67 u g/mL、17. 0 u g/mL、13. 56 u g/mL,且呈現(xiàn)濃度-效 應(yīng)依賴關(guān)系。而對正常細(xì)胞Chang-liver、N0E001的毒副作用很低，IC5(1達到100. g/mL， 92. 22y g/mL。實施例2柯里拉京對卵巢癌細(xì)胞Hey的細(xì)胞周期的阻滯作用將Hey細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿中，加入17 i g/ml柯里拉京共同培養(yǎng)24h、48h、 72h(方法同實施例1)，并做好對照。經(jīng)過含0. 1 % RNaseA的5mg/ml PI避光處理lOmin 后，用流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果表明，在24h至72h，對照組的G0/G1期從48. 88%下降到39. 29%，而柯里拉 京組從54. 85%上升到71. 75% (圖2)。由此可見，柯里拉京能夠使得卵巢癌細(xì)胞Hey的細(xì) 胞周期阻滯在G0/G1期，并且呈時間-效應(yīng)依賴性?？吕锢β殉舶┘?xì)胞Hey的細(xì)胞周
5期阻滯作用參見表1。表 1 實施例3柯里拉京對SK0V3ip細(xì)胞中TGF_ ^ /PI3K/Akt/Snail信號通路的影響細(xì)胞接種將人卵巢癌細(xì)胞SK0V3ip混勻于10% FBS RPMI 1640接種于60mm培 養(yǎng)皿中，每個皿的細(xì)胞數(shù)為3.5 X105個。加藥將細(xì)胞依次加入32iig/mlA藥，17iig/ml C藥。12h后饑餓將培液換成RPMI 1640無FBS，藥濃度同前。36h后將每組的兩皿細(xì)胞中的一皿分別加入表皮生長因子EGF(濃度為20 y g/ ml)，作用lOmin后提蛋白。Western blot檢測pAkt及Akt 用Bradford法蛋白定量法使每孔蛋白總量為 20 u g，分別用pAkt (p473)和Akt抗體檢測(CST公司，兔抗，抗體濃度1 1000)。結(jié)果表明，柯里拉京能夠通過對TGF-0 /PI3K/Akt/Snail這一個與腫瘤生長和侵 襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的信號通路的研究發(fā)現(xiàn)，柯里拉京能夠明顯抑制SK0V3ip細(xì)胞內(nèi)TGF-3 / PI3K/Akt/Snail信號通路，其主要是抑制TGF-0 1的分泌，并呈劑量效應(yīng)(圖3A)，還能 明顯降低Akt的磷酸化(圖3B)，進而降低卵巢癌細(xì)胞中Snail的表達(圖3C)，這樣就 能夠通過TGF-0/PI3K/Akt/Snail的信號通路，下調(diào)E鈣粘蛋白(E-cadherin)的分泌。 而 E-cadherin 能夠加快上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的過程，使得細(xì)胞失去細(xì)胞極性和細(xì)胞間連接，細(xì)胞外基質(zhì)成分發(fā)生降解，細(xì)胞變得具 有遷移性，能夠從上皮游離下來并遷移到不同的部位，最終促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。因此降低 TGF-^/PI3K/Akt/Snail蛋白的表達，就能夠抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。實施例4柯里拉京對BALB/c裸鼠體內(nèi)成瘤實驗的抑制效果BALB/c裸鼠25只，4_ 6周，體重20 25g，雌雄約各一半，分為5組，每組5只。 每只裸鼠右側(cè)背部皮下注射0. 2mL的1 X 107個/mL MHCC97-H單細(xì)胞懸液。腹腔注射給藥， 0. 2mL/次，隔天注射一次，共計12次。以生理鹽水為陰性對照，環(huán)磷酰胺CTX為陽性對照，肝癌MHCC97-H裸鼠模型結(jié)果 顯示，在抑制腫瘤生長方面，柯里拉京與陽性對照的CTX的效果相當(dāng)，30mg/kg柯里拉京抑 制效果為35. 19%，而25mg/kg CTX的抑制效果為32. 01% (圖4)；而在抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移 方面，柯里拉京用藥組中，只有20mg/kg柯里拉京用藥組中有2只裸鼠發(fā)生輕微轉(zhuǎn)移，其他 13只沒有發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，侵襲轉(zhuǎn)移的抑制效果高達86. 7%，相對于陰性對照組和陽性對照組都100%發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。柯里拉京對裸鼠體內(nèi)腫瘤生長和侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用參見表2。表 2 與陰性對照組比較，*P < 0. 05/*P < 0. 01 ；+表示有肝轉(zhuǎn)移現(xiàn)象發(fā)生，/表示無肝 轉(zhuǎn)移現(xiàn)象發(fā)生。
權(quán)利要求
柯里拉京在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述柯里拉京的化學(xué)名為1-O-沒食子酰-3，6-O-六羥基聯(lián)苯二甲酰-β-D-葡萄糖，其分子式為C27H22O18，其結(jié)構(gòu)式如下FSA00000187995300011.tif
2.如權(quán)利要求1所述的柯里拉京在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述抗腫瘤 藥物包括抗腫瘤生長藥物或抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面的藥物。
3.如權(quán)利要求1所述的柯里拉京在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述抗腫瘤 藥物為口服藥劑或注射藥劑。
4.如權(quán)利要求3所述的柯里拉京在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述注射為 靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射。
全文摘要
柯里拉京在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，涉及一種化合物柯里拉京。所述柯里拉京的化學(xué)名為1-O-沒食子酰-3，6-O-六羥基聯(lián)苯二甲酰-β-D-葡萄糖，其分子式為C27H22O18。所述抗腫瘤藥物包括抗腫瘤生長藥物或抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面的藥物等。所述抗腫瘤藥物可為口服藥劑或注射藥劑等。所述注射可為靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射等。實驗表明，柯里拉京具有很好的抗腫瘤效果，不管是在體外腫瘤細(xì)胞實驗，還是對體內(nèi)腫瘤動物模型都有很好的療效。所述柯里拉京是一種具有抗腫瘤藥效的新化合物，可用于制備抗腫瘤藥物。
文檔編號A61P35/00GK101879173SQ20101022572
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者吳美愛, 明艷林, 童慶宣, 郁茵華, 鄭國華, 鄭志忠, 金鴻雁, 陳良華 申請人:廈門華僑亞熱帶植物引種園