專利名稱：一種雞血藤提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞血藤提取物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤通常合并不同程度貧血，而目前對惡性腫瘤的治療主要還是以手術(shù)摘除、放 療、化療為主，而幾乎所有抗癌藥物在作用于癌細(xì)胞的同時，也累及正常細(xì)胞，因此腫瘤患 者放療后常常引起骨髓抑制，表現(xiàn)為白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板不同程度下降，其中下降最為 明顯的是白細(xì)胞，這是目前制約腫瘤治療效果及愈后康復(fù)的一大難題。目前臨床使用的升 白藥有強力升白片、瑞白等，但因毒副反應(yīng)大、價格昂貴等因素，其應(yīng)用范圍受到限制，未能 真正滿足臨床需要。尋找治療效果好、毒副反應(yīng)低、價格相對便宜的新的骨髓抑制治療藥 物，已成為目前腫瘤醫(yī)生關(guān)注的焦點問題。雞血藤為豆科植物密花豆Spatholob suberectus Durra的干燥藤莖(《中華人民共和 國藥典》2005版)，主要分布在廣西、廣東，其性溫，味苦、甘，歸肝、腎經(jīng)，具有補血、活血通絡(luò)的 作用，是一種較常用的活血化瘀中藥，用于治療血虛萎黃、麻木癱瘓、風(fēng)濕痹痛等歷史悠久《本 草綱目拾遺》記載雞血藤“活血”，《飲片新參》記載“雞血藤去瘀血，生新血，流利經(jīng)脈”。目前，開發(fā)我國傳統(tǒng)中藥的藥理作用越來越受到醫(yī)學(xué)界的重視，從許多天然藥物 中發(fā)現(xiàn)了具有治療價值的新藥。研究發(fā)現(xiàn)，雞血藤不但可以降低因受到輻照而產(chǎn)生骨髓功 能性抑制所造成的造血干、祖細(xì)胞數(shù)量下降的速度，甚至可阻止這種抑制作用，從而彌補造 血干、祖細(xì)胞因輻照而導(dǎo)致的在量和質(zhì)上的缺陷，以期達(dá)到使三系血細(xì)胞(白細(xì)胞、紅細(xì) 胞、血小板)水平恢復(fù)的最終目的，其中提升白細(xì)胞的作用最為明顯。近年來臨床上常用雞 血藤治療各種原因引起的白細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞等全血性減少和再生障礙性貧血等疾病， 具有較好的療效，尤其是在提升白細(xì)胞方面，效果顯著。雞血藤的主要成分為黃酮類、酚類、三萜類及留體類化合物，有關(guān)其活性部位的提 取精制及活性已有部分報道專利CN101347496A采用的是乙酸乙酯和乙醇的混合溶劑提 取，提取物過正相硅膠柱，用石油醚、乙酸乙酯、氯仿等進行洗脫，最后用制備液相色譜，乙 腈_水洗脫，所得組分用于惡性腫瘤，該方法使用了氯仿、乙腈等有毒溶劑，并且應(yīng)用了制 備液相等精密儀器，不適合工業(yè)化大生產(chǎn)；專利CN1939396A則將雞血藤藥材悶潤后，用水 或80%乙醇回流提取，提取物用聚酰胺層析柱吸附后，不同濃度乙醇洗脫，所得組分用于 惡性腫瘤，該方法的缺點是提取時間過長、步驟繁瑣；也有文獻報道采用水和/或乙醇回流 提取雞血藤，提取液用大孔樹脂吸附后，用水和/或乙醇進行洗脫，得到雞血藤提取物，再 使用大孔樹脂進行精制，其工藝過程中，提取溶劑為通用試劑水或高濃度乙醇，提取目標(biāo)物 質(zhì)太過廣泛，為后續(xù)精制造成不便，提取液經(jīng)大孔樹脂吸附后，又采用了全梯度水-乙醇洗 脫，工藝較為復(fù)雜，且得到的雞血藤提取物對升高白細(xì)胞的作用不明顯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種雞血藤提取物的制備方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案(1)提取將雞血藤藥材粉碎，加入45-55%的乙醇，回流提取2-3次，每次1_2小時，合并提 取液，將提取液濃縮至無醇味；(2)上柱將步驟⑴得到的提取液用大孔吸附樹脂柱進行吸附；(3)洗脫第一次用水洗脫至無糖反應(yīng)；第二次用20-30%乙醇洗脫至顏色明顯變淺；第三 次用65-75%的乙醇洗脫至顏色明顯變淺；收集65-75%的乙醇洗脫液，回收乙醇，蒸干，得 到雞血藤提取物。優(yōu)選地，所述步驟(1)中加入50%的乙醇提取；所述步驟(3)為第一次用水洗脫 至無糖反應(yīng)；第二次用20-30%乙醇洗脫至顏色明顯變淺；第三次采用70%的乙醇進行洗 脫。本發(fā)明還提供了 一種雞血藤提取物，其是采用上述制備方法制備而得。本發(fā)明還提供了上述方法制備而得的雞血藤提取物在制備升高白細(xì)胞的藥物中 的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果1.本發(fā)明雞血藤提取物的制備方法是在現(xiàn)有方法的基礎(chǔ)上，通過長期研究和系列 實驗篩選，篩選得到的最合理的生產(chǎn)工藝組合，即45-55%的乙醇為提取溶劑、HPD400大 孔吸附樹脂吸附、65-75%的乙醇洗脫。采用該制備方法最大限度的提取了有效成分，雞血 藤提取物總黃酮的得率較高，同時減少了雜質(zhì)溶出；且所得到的雞血藤提取物比已有相關(guān) 文獻報道的方法制備得到的雞血藤提取物具有更顯著地升高白細(xì)胞的作用。2.本發(fā)明雞血藤提取物的制備方法操作簡便，溶劑使用少，在可操作性和成本上 非常符合工業(yè)化大生產(chǎn)的需要。


圖1為不同制備工藝得到的雞血藤提取物對CTX致SD大鼠白細(xì)胞低下模型的影 響，其中#表示與模型組相比，p < 0. 05。
具體實施例方式實施例1一種雞血藤提取物的制備方法，包括以下步驟(1)提取將雞血藤藥材1公斤粉碎，加入45%的乙醇6升回流提取3次，每次2小時，合并 提取液，將提取液濃縮至約為藥材的1/4重量；(2)上柱將步驟⑴得到的提取液用大孔吸附樹脂柱進行吸附；(3)洗脫第一次用水洗脫至無糖反應(yīng)；第二次用20%乙醇洗脫至顏色明顯變淺；第三次用
465%乙醇洗脫至顏色明顯變淺。收集65%乙醇洗脫液，回收乙醇，蒸干，得到雞血藤提取物 65克，用比色法測得其中總黃酮的總苷含量為55%。實施例2一種雞血藤提取物的制備方法，包括以下步驟(1)提取將雞血藤藥材2公斤粉碎，加入50%乙醇12升回流提取3次，每次2小時，合并提 取液，將提取液濃縮至約為藥材的1/4重量；(2)上柱將步驟⑴得到的提取液用大孔吸附樹脂柱進行吸附；(3)洗脫第一次用水洗脫至無糖反應(yīng)；第二次用25%乙醇洗脫至顏色明顯變淺；第三次用 70%乙醇洗脫至顏色明顯變淺。收集70%乙醇洗脫液，回收乙醇，蒸干，得到雞血藤提取物 141克，用比色法測得其中總黃酮的總苷含量為62%。實施例3一種雞血藤提取物的制備方法，包括以下步驟(1)提取將雞血藤藥材1公斤粉碎，加入55%乙醇6升回流提取2次，每次1. 5小時，合并 提取液，將提取液濃縮至無醇味(約為藥材的1/4重量)；(2)上柱將步驟⑴得到的提取液用大孔吸附樹脂柱進行吸附；(3)洗脫第一次用水洗脫至無糖反應(yīng)；第二次用20%乙醇洗脫至顏色明顯變淺；第三次用 75%乙醇洗脫至顏色明顯變淺。收集75%乙醇洗脫液，回收乙醇，蒸干，得到雞血藤提取物 73克，用比色法測得其中總黃酮的總苷含量為53%。試驗例1雞血藤提取物的制備工藝研究1)藥材來源采購于廣州清平藥材市場2)提取溶劑對雞血藤提取物制備方法的影響分別用水、50 %乙醇、75 %乙醇、95 %乙醇對雞血藤藥材進行提取，得到浸膏，結(jié)果 如表1。表1不同溶劑對雞血藤浸膏得率的影響
提取溶劑藥材重量(g)浸膏重量(g)浸膏得率水10015. 6015. 60%50%乙醇10015. 5215. 52%75%乙醇10015. 5015. 50% 表1結(jié)果表明除95%乙醇外，水、50%乙醇、75%乙醇提取的浸膏得率都相當(dāng)，采 用50%乙醇提取得到的提取物總黃酮含量較高，因此對其進行大孔吸附樹脂分離。3)不同提取方法結(jié)合洗脫方法對雞血藤提取物得率的影響采用弱極性的HPD400大孔吸附樹脂分離經(jīng)過2)處理后的雞血藤提取物，第三次 分別采用水、25%乙醇、70%乙醇、90%乙醇進行洗脫(洗脫的第一次和第二次均相同)，結(jié) 果見表2。表2不同洗脫方法對雞血藤提取物得率的影響 3004.7 1.57% 25%乙醇洗脫
50%乙醇提取-
30020.74 6.91 %
70%乙醇洗脫
50%乙醇提取-
3000.460.153%
90%乙醇洗脫從表2可以看出，50 %乙醇提取-水洗脫和50 %乙醇提取_70 %乙醇洗脫，浸膏得 率最高，由于黃酮的水溶性相對較差，而大部分黃酮在稀醇中溶解度較大，因此，選用50% 乙提取-70%乙醇洗脫得到的雞血藤提取物得率最高。試驗例2不同制備工藝制備的雞血藤提取物對CTX致SD大鼠白細(xì)胞低下模型的 影響1.試驗動物選用檢疫合格的SD大鼠98只，檢疫觀察結(jié)束后眼眶靜脈叢采血測定血常規(guī)，然后 根據(jù)白細(xì)胞總數(shù)將大鼠隨機均衡分成12組。2.試驗分組及給藥劑量空白對照組(10只，灌胃給予與藥物組等容積的0. 5% CMC-Na)；模型對照組(8只，灌胃給予與藥物組等容積的0. 5% CMC-Na)；A組(8只，630mg/kg) 50%乙醇提取總浸膏；B組(8只，220mg/kg) 50%乙醇提取-水洗脫浸膏；C組(8只，64mg/kg) 50%乙醇提取-25%乙醇洗脫浸膏；
D高劑量組(8只，840mg/kg) 50%乙醇提取_70%乙醇洗脫浸膏；D中劑量組(8只，280mg/kg) :50%乙醇提取-70%乙醇洗脫浸膏；D低劑量組(8只，90mg/kg) 50%乙醇提取_70%乙醇洗脫浸膏；E組(8只，6. 2mg/kg) 50%乙醇提取-90%乙醇洗脫浸膏；F組(8只，270mg/kg) :95%乙醇提取總浸膏G組(8只，300mg/kg)文獻報道方法(大孔吸附樹脂分離純化雞血藤總黃酮的研 究，時珍國醫(yī)國藥2008年第10期)提取的總黃酮浸膏；阿膠(中藥)組(8只，2. 43g/kg)；利可君(西藥)組(8只，16. 2mg/kg)；以上分組中，A、F組為僅進行提取步驟(沒有進行上柱和洗脫步驟)得到的總浸 膏；B組為提取上柱后僅進行第一次洗脫得到的浸膏(僅用水洗脫，沒有進行第二次和第 三次洗脫)；C、D和E組是提取上柱后洗脫得到的浸膏，第三次洗脫分別采用25%的乙醇、 70%的乙醇和90%的乙醇進行(第一次和第二次進行相同洗脫)；G組(8只，300mg/kg)為 文獻(大孔吸附樹脂分離純化雞血藤總黃酮的研究，時珍國醫(yī)國藥2008年第10期)報道 提取的總黃酮浸膏(提取方法為取雞血藤500g，2500ml 80%乙醇浸泡過夜，加熱回流提 取3次，2小時/次，合并提取液，減壓回收乙醇至無醇味，加入5000ml蒸餾水，稀釋至每毫 升含生藥0. lg的溶液，靜至過夜，過濾，濾液用FL-2的大孔吸附樹脂為純化雞血藤總黃酮 的吸附劑，用70%乙醇洗脫劑洗脫，濃縮得雞血藤總黃酮)。3.給藥方式空白對照組皮下注射等容積的生理鹽水；其余各組大鼠根據(jù)體重皮下注射大劑量 (100mg/kg)環(huán)磷酰胺一次(dayl)進行造模，造模后各組均根據(jù)設(shè)定劑量開始給藥，每天一 次，連續(xù)11天(dayl 11)，空白對照組和模型對照組給予等容積的0. 5% CMC_Na，實驗過 程中Dayl、Day4、Day7、Day9稱量大鼠體重并根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量。4.觀察指標(biāo)Day-1分組前，Day 4、Day 7、Day9、Dayll給藥后約2小時，檢測血常規(guī)(采血約 0. 5ml/次)情況重點統(tǒng)計分析白細(xì)胞總數(shù)WBC、中性粒細(xì)胞數(shù)NEUT、淋巴細(xì)胞數(shù)LYMpH、單 核細(xì)胞數(shù)MONO、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)E0、嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)BAS0、NEUT%、LYMpH%、M0N0%、E0%、 BAS0%、紅細(xì)胞總數(shù)RBC、血紅蛋白HGB等。末次采血后動脈放血處死大鼠，取胸腺、脾臟稱濕重計算臟器指數(shù)。5.結(jié)果分析本試驗對采用本發(fā)明制備工藝所得的雞血藤提取物(D高劑量組、D中劑量組和D 低劑量組)與一系列采用現(xiàn)有制備工藝得到的雞血藤提取物(A、B、C、E、F、G)及具有升白 作用的中藥阿膠和西藥利可君進行了藥效比較。試驗結(jié)果如圖1和表3所示。圖1和表3結(jié)果表明雞血藤提取物D組具有顯著地促進白細(xì)胞低下模型大鼠白 細(xì)胞恢復(fù)的作用，并有一定的量效關(guān)系；雞血藤D高、中、低組升高白細(xì)胞的作用主要是通 過促進中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)的恢復(fù)實現(xiàn)的，對中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸、 嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)的比例未見明顯影響。雞血藤提取物D高劑量的升白效果最佳，與其他的 現(xiàn)有制備工藝得到的雞血藤提取物以及阿膠和利可君相比，升白效果顯著；雞血藤提取物 A、B、C、E、F、G對白細(xì)胞低下模型大鼠未見明顯影響，但提取物C具有一定的作用趨勢；各組樣品促進白細(xì)胞低下模型大鼠白細(xì)胞恢復(fù)作用的強弱順序為D高劑量組> D中劑量組 > D低劑量組>阿膠組>利可君組> C組竺A、B、E、F、G組。以上是針對本發(fā)明的可行實施例的具體說明，但該實施例并非用以限制本發(fā)明的 專利范圍，凡未脫離本發(fā)明的等效實施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專利范圍中。表3 給藥第11天雞血藤提取物對CTX致SD大鼠白細(xì)胞低下模型的影響(又士S, n=8~10)
注與空_白對照組相比,*表示p<0.05, **表示p<0.01;與模型對照組相比，#表示p<0.05, ##表示p<0.01.
權(quán)利要求
一種雞血藤提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)提取將雞血藤藥材粉碎，加入45-55％的乙醇，回流提取2-3次，每次1-2小時，合并提取液，將提取液濃縮至無醇味；(2)上柱將步驟(1)得到的提取液用大孔吸附樹脂柱進行吸附；(3)洗脫第一次用水洗脫至無糖反應(yīng)；第二次用10-30％的乙醇洗脫至顏色明顯變淺；第三次用65-75％的乙醇洗脫至顏色明顯變淺；收集65-75％的乙醇洗脫液，回收乙醇，蒸干，得到雞血藤提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞血藤提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中加入 50%的乙醇提取。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雞血藤提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中 第三次采用70%的乙醇進行洗脫。
4.一種雞血藤提取物，其特征在于，采用權(quán)利要求1-3任一項所述的制備方法制備而得。
5.權(quán)利要求4所述的雞血藤提取物在制備升高白細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雞血藤提取物及其制備方法和應(yīng)用。雞血藤藥材中加入45-55％的乙醇進行提取后上大孔吸附樹脂柱，然后依次用水、10-30％的乙醇和65-75％的乙醇進行洗脫。取65-75％乙醇洗脫部分，回收乙醇，蒸干，得到雞血藤提取物。本發(fā)明雞血藤提取物的制備方法在現(xiàn)有制備方法的基礎(chǔ)上進行了合理化設(shè)計，得到了優(yōu)化的生產(chǎn)工藝組合，采用該制備方法制備得到的雞血藤提取物得率較高；本雞血藤提取物相較于現(xiàn)有制備方法得到的雞血藤提取物具有更顯著地升高白細(xì)胞的作用。
文檔編號A61P7/00GK101849988SQ201010192208
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
發(fā)明者應(yīng)軍, 曾祥騰, 楊威, 肖百全 申請人:廣州醫(yī)藥工業(yè)研究院