雞血藤對Hepcidin的調(diào)控及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及雞血藤(Caulis?Spatholobi)對Hepcidin的調(diào)控及其應(yīng)用。本發(fā)明揭示了雞血藤或其提取物對于防治Hepcidin分泌過多相關(guān)疾病具有極其優(yōu)異的效果；其通過抑制鐵調(diào)蛋白Hepcidin的表達，從而可避免因Hepcidin過表達導(dǎo)致的缺鐵及其它相關(guān)疾病。
【專利說明】雞血藤對Hepcidin的調(diào)控及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于藥物學(xué)領(lǐng)域；更具體地,本發(fā)明涉及雞血藤(Caulis Spatholobi)對Hepcidin的調(diào)控及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵是人體必需微量元素之一，鐵代謝平衡紊亂，會導(dǎo)致體內(nèi)鐵缺乏或鐵過載。肝臟分泌的鐵調(diào)素Hepcidin通過控制鐵的吸收和再循環(huán)利用維持體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的平衡。遺傳缺陷導(dǎo)致的低水平ifepcidin是原發(fā)性血色病發(fā)生發(fā)展的重要因素[Weiss G.Geneticmechanisms and modifying factors in hereditary hemochromatosis.Nature ReviewsGastroenterology&Hepatology 2009; 7:50-8];而在難治性缺鐵性貧血(IRIDA) [DuX, She E,Gelbart T, et al.The serine protease TMPRSS6is required to sense irondeficiency.Science 2008;320:1088 - 92 ；Finberg KE, Heeney MM, Campagna DR, etal.Mutations in TMPRS S6cause iron-refractory iron deficiency anemia (IRIDA).Nat Genet 2008; 40:569-71]和慢性炎癥性貧血(ACI) [Roy CN, Andrews NC.Anemia ofinflammation:the Hepcidin link.Curr Opin Hematol 2005;12:107-11]中 Hepcidin 的高表達為疾病的治療帶來一定難度。
[0003]因此,調(diào)節(jié)Hepcidin表達,對鐵代謝紊亂疾病的治療都具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供雞血藤(Caulis Spatholobi)在對Hepcidin的調(diào)控及其應(yīng)用。
[0005]在本發(fā)明的第一方面，提供一種雞血藤(Caulis Spatholobi)的用途,用于制備降低體內(nèi)Hepcidin水平及升高血清鐵含量的組合物。
[0006]在一個優(yōu)選例中，所述的組合物還用于預(yù)防、緩解或治療缺鐵性疾病或由Hepcidin分泌過多為病理特征的疾病。
[0007]在另一優(yōu)選例中，所述的缺鐵性疾病包括:缺鐵性貧血(包括:難治性缺鐵性貧血(IRIDA))、慢性炎癥性貧血(ACI)、腎性貧血。
[0008]在另一優(yōu)選例中，所述的缺鐵性疾病是H印cidin過表達導(dǎo)致的缺鐵性疾病。
[0009]在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于:
[0010]降低編碼H印cidin的基因——HAMP基因的表達；或
[0011]降低Smad蛋白(較佳地為Smadl/5/8蛋白)的磷酸化水平；
[0012]抑制BMP6對H印cidin表達的刺激作用；或
[0013]抑制IL-6對Hepcidin表達的誘導(dǎo)作用。 [0014]在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于:
[0015]升高血清鐵蛋白含量；或
[0016]提聞血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度。[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的雞血藤選自下組:
[0018](a)雞血藤藥材(較佳地為雞血藤的莖(或稱為藤))或其粉碎產(chǎn)物；或
[0019](b)雞血藤的水或有機溶劑提取物。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述的雞血藤藥材是Spatholobus suberectus Dunn的莖。
[0021]在另一優(yōu)選例中，所述的雞血藤的水提取物如下制備:
[0022]將雞血藤藥材用水浸泡1-10小時，煮沸后煎煮1-5小時，過濾收集藥液；收集藥洛重復(fù)煎煮步驟0-3次；合并藥液，減壓濃縮。
[0023]在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于降低體內(nèi)!fepcidin水平及升高血清鐵含量的中藥制劑，其通過以下方法制備獲得:將雞血藤藥材用水浸泡1-10小時，煮沸后煎煮1-5小時，過濾收集藥液；收集藥渣重復(fù)煎煮步驟0-3次；合并藥液，減壓濃縮。
[0024]在本發(fā)明的另一方面，提供一種降低體內(nèi)!fepcidin水平及升高血清鐵含量的方法，包括步驟:給需要的對 象施用有效量的雞血藤。
[0025]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1、雞血藤水煎液體外抑制HAMP表達。
[0027](A) 16種中草藥水煎液對人肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞H印cidin mRNA表達的影響。藥物濃度20μ g/mL，作用時間為12小時。其中雞血藤水煎液抑制HAMP基因的作用最明顯，表達量僅為對照組的40%。
[0028](B)雞血藤水煎液抑制IfepG2細(xì)胞H印cidin表達的濃度作用曲線，藥物作用時間為12小時。
[0029](C)雞血藤水煎液抑制IfepG2細(xì)胞H印cidin表達的時間作用曲線，藥物濃度為200 μ g/mL。
[0030](D)HepG2細(xì)胞中，不同濃度雞血藤水煎液抑制磷酸化Smadl/5/8蛋白Westernblot結(jié)果和定量分析。
[0031]圖2、雞血藤水煎液抑制BMP6誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞HAMP表達。
[0032]⑷雞血藤水煎液(20-400 μ g/mL)抑制BMP6 (10ng/mL, 12小時)誘導(dǎo)的H印cidinmRNA表達(O點)。
[0033](B)Western Blot分析磷酸化蛋白Smadl/5/8表達及定量。
[0034]圖3、雞血藤水煎液抑制IL-6誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞HAMP表達。
[0035](A) IL-6 (50ng/mL)或 BMP6 (10ng/mL)單獨處理 6 小時后，Hepcidin mRNA 表達量分別升高2倍和7倍；與雞血藤水煎劑(200 μ g/mL)作用12小時后，IL-6處理組H印cidinmRNA表達量下降至正常對照組的0.8倍，BMP6降低至0.25倍。雞血藤水煎劑對BMP6的抑制作用強于IL-6。
[0036](B)Western blot 分析憐酸化 Smadl/5/8 和憐酸化 Stat3。
[0037](C)定量分析磷酸化Smadl/5/8蛋白表達水平。
[0038](D)定量分析磷酸化Stat3蛋白表達水平。
[0039]圖4、雞血藤水煎液抑制小鼠體內(nèi)HAMPl基因表達和增加鐵動員。[0040](A) C57BL/6小鼠肝臟H印cidin mRNA表達量(雞血藤給藥劑量21.6g/Kg飼料)，服藥后第5天，Hepcidin表達量明顯降低(P〈0.05), 10-15天逐步恢復(fù)至正常。
[0041](B)血清鐵含量升高:第5天升高至正常組的2倍，隨后呈緩慢下降趨勢，與對照組比較仍具有顯著性差異(P〈0.05)。
[0042](C)肝組織鐵含量降低:給藥組每組下降超過10 μ g/g，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(Ρ〈0.05)。
[0043](D)脾組織鐵含量:未見明顯變化趨勢。
[0044]圖5、雞血藤水煎劑降低人血清H印cidin水平。
[0045](A)血清H印cidin含量:圓點代表健康志愿者，方框或三角形代表1DA患者。月艮食雞血藤后第5天，血清H印cidin顯著下降(Ρ〈0.01)，隨后有上升趨勢，但仍低于服藥前(Ρ〈0.05)。
[0046](B)血清鐵含量。
[0047](C)血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度。
[0048](D)血清鐵蛋白:3名健康志愿者升高明顯，而5名IDA患者未見明顯變化。【具體實施方式】
[0049]能導(dǎo)致貧血的因素很多，包括營養(yǎng)缺乏、感染、遺傳缺陷等等因素。其中，慢性炎癥、溶血、造血功能障礙、缺鐵、缺乏葉酸/維生素Β12等引發(fā)的貧血較為常見。缺鐵性貧血是貧血的一類。
[0050]本發(fā)明人經(jīng)過長期而廣泛的研究`，通過基于細(xì)胞系篩選并通過動物、人體實驗發(fā)現(xiàn)雞血藤(Spatholobus suberectus Dunn的莖)(或其提取物)對于防治鐵缺乏相關(guān)疾病具有極其優(yōu)異的效果，且沒有任何副作用。所述的雞血藤可抑制鐵調(diào)蛋白Ifepcidin的表達，從而可避免因Hepcidin過表達導(dǎo)致的缺鐵性疾病?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。
[0051]雞血藤(Caulis Spatholobi)或其提取物
[0052]雞血藤:是雙子葉植物綱、豆目、豆科、崖豆藤屬的植物。莖皮纖維可作人造棉、造紙和編織的原料；藤供藥用，有行氣、扶風(fēng)、活血的效用；根入藥，有舒筋活血的功能，也有殺蟲的作用。藤與根含酚性成分、氨基酸、糖類、樹脂。
[0053]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的雞血藤是:雞血藤的莖(或稱為藤)。
[0054]術(shù)語“本發(fā)明的組合物”指含有雞血藤或其提取物的組合物或基本上由雞血藤或其提取物組成的組合物。所述的提取物包括但不限于:水提取物或水性有機溶劑；優(yōu)選地為水提取物。
[0055]如本文所用，所述的“水性有機溶劑”是指常規(guī)用于從中藥中提取活性成分的水溶性溶劑，其是安全或沒有毒性的。例如，所述的“水性有機溶劑”選自醇類或酮類，如乙醇、甲醇、丙酮等。
[0056]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的雞血藤的水提取物如下制備:將雞血藤藥材用水浸泡1-10小時，煮沸后煎煮1-5小時，過濾收集藥液；收集藥渣重復(fù)煎煮步驟0-3次；合并藥液，減壓濃縮。
[0057]用途
[0058]為了論證雞血藤的用途，本發(fā)明人篩選了 16種中草藥，發(fā)現(xiàn)雞血藤水煎液在體外通過降低pSmadl/5/8信號通路的磷酸化而明顯抑制肝癌細(xì)胞系Hepcidin的表達。進一步動物試驗證實，雞血藤水煎液抑制肝臟Ifepcidin表達的同時，可以減少肝臟鐵含量，增加外周血清鐵濃度。在健康志愿者中，雞血藤水煎液可增加血清鐵、血清鐵蛋白含量及提高轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度，從而改善鐵代謝。這些結(jié)果，為雞血藤治療Ifepcidin升高性疾病提供了理論依據(jù)，同時也開創(chuàng)了以Hepcidin為靶點的中草藥治療方法。
[0059]鐵調(diào)蛋白H印cidin是一種調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵平衡的激素，它在維持鐵穩(wěn)定平衡方面起著重要作用。Hepcidin由肝臟特異性表達,并且通過與鐵轉(zhuǎn)運蛋白(Ferroportin)結(jié)合,誘導(dǎo)其發(fā)生降解從而降低鐵的轉(zhuǎn)運，并最終實現(xiàn)鐵在腸道吸收或者肝臟、脾臟以及骨髓中的巨噬細(xì)胞鐵釋放的調(diào)節(jié)。H印cidin與慢性炎癥性貧血(其中H印cidin表達異常升高)、難治性缺鐵性貧血(其中H印cidin表達異常升高)、腎性貧血(其中H印cidin表達異常升高)的發(fā)生密切相關(guān)。
[0060]慢性病貧血是一種由于機體處于長期炎癥狀態(tài)下所引發(fā)的鐵代謝紊亂疾病。該病的病因是體內(nèi)的炎癥因子上調(diào)H印cidin表達。H印cidin被認(rèn)為是調(diào)節(jié)鐵代謝的激素，它作用于鐵轉(zhuǎn)運蛋白(Ferroporlin),使后者內(nèi)吞降解,減少了小腸細(xì)胞內(nèi)鐵向血液循環(huán)的轉(zhuǎn)運，進而影響了鐵吸收。慢性疾病時的高炎癥因子狀態(tài)會通過JAK2/STAT3途徑促進肝細(xì)胞高表達Hepcidin，導(dǎo)致慢性病貧血時的鐵代謝紊亂。
[0061]本發(fā)明提供了雞血藤、或雞血藤的提取物的用途，用于制備降低H印cidin的組合物；或者，用于制備預(yù)防、緩解或治療缺鐵性疾病的組合物。所述的缺鐵性疾病包括:缺鐵性貧血(包括:難治性缺鐵性貧血(IRIDA))、慢性病性貧血、慢性炎癥性貧血(ACI)、腎性貧血。
[0062]組合物
[0063]如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明的組合物”包括藥物組合物和飲食補充劑(如保健品組合物)，只要它們含有雞血藤或其提取物作為提高血清鐵含量的活性成分。
`[0064]通常，所述的飲食補充劑含l_60wt%，較佳地為9_30wt%的雞血藤或其提取物；(b)食品上可接受的載體或賦形劑。
[0065]本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，含有:(a)有效量(如0.0001-50wt%)的雞血藤或其提取物；以及(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
[0066]本發(fā)明中，術(shù)語“含有”表示各種成分可一起應(yīng)用于本發(fā)明的混合物或組合物中。因此，術(shù)語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術(shù)語“含有”中。
[0067]本發(fā)明中，“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。
[0068]如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體:它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington’ sPharmaceutical Sciences (Mack Pub.C0., N.J.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分描述。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、矯味劑、pH緩沖物質(zhì)等。
[0069]從易于制備和給藥的立場看，優(yōu)選的藥物組合物是固態(tài)組合物，尤其是片劑和固體填充或液體填充的膠囊。藥物組合物的口服給藥是優(yōu)選的。
[0070]本發(fā)明所述的藥物組合物的劑型可以是多種多樣的，只要是能夠使活性成分有效地到達哺乳動物體內(nèi)的劑型都是可以的。比如可選自:片劑、膠囊、粉末、顆粒、糖漿、溶液、懸浮液、或氣霧劑。其中雞血藤或其提取物可以存在于適宜的固體或液體的載體或稀釋液中。
[0071]本發(fā)明的雞血藤或其提取物也可儲存在適宜于注射或滴注的消毒器具中。通常，在本發(fā)明的藥物組合物中，雞血藤有效成分占總重量的l_60wt%，較佳地為9-30wt%，其余為藥學(xué)上可接受的載體以及其它添加劑等物質(zhì)。
[0072]給藥方式和劑型
[0073]本發(fā)明的藥物組合物可以通過常規(guī)方法制成任何常規(guī)的制劑形式。
[0074]通常，當(dāng)所述雞血藤或其提取物用于上述用途時，它們可與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合，如溶劑、稀釋劑等，而且可以用如下形式口服給藥:片劑、膠囊、可分散的粉末、顆?；驊腋∫?含有如約0.05-5%懸浮劑)、糖漿(含有如約10-50%糖)、和酏劑(含有約20-50%乙醇)，或者以無菌可注射溶液或懸浮液形式(在等滲介質(zhì)中含有約
0.05-5%懸浮劑)進行非腸胃給藥。例如，這些藥物制劑可含有與載體混合的約l_60wt%，通常約為9-30wt%的活性成分。
[0075]所用的活性成分的有效劑量可隨所用的藥物、給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度而變化。然而，通常當(dāng)本發(fā)明的雞血藤或其提取物每天以約0.0001-100mg/kg動物體重的劑量給予時，能得到令人滿意的效果，較佳地每天以1-3次分開的劑量給予，或以緩釋形式給藥。對大部分大型哺乳動物而言，每天的總劑量約為0.01-1OOOmg,較佳地約為l-500mg。適用于內(nèi)服的劑量形式，包含與固態(tài)或液態(tài)藥學(xué)上可接受的載體密切混合的約l-200mg的雞血藤或其提取物?？烧{(diào)節(jié)此劑量方案以提供最佳治療應(yīng)答。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。
[0076]所述雞血藤或其提取物可通過口服以及靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下等途徑給藥；優(yōu)選的是口服給藥。固態(tài)載體包括:淀粉、乳糖、磷酸二鈣、微晶纖維素、蔗糖和白陶土，而液態(tài)載體包括:無菌水、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要適合活性成分的特性和所需的特定給藥方式。在制備藥物組合物中通常使用的佐劑也可有利地被包括，例如調(diào)味劑、色素、防腐劑和抗氧化劑如維生素E、維生素C、BHT和BHA。
[0077]所述雞血藤或其提取物也可腸胃外或腹腔內(nèi)給藥。還可在甘油、液體、聚乙二醇及其在油中的混合物中制備分散液。在常規(guī)儲存和使用條件下，這些制劑中含有防腐劑以防止微生物的生長。
[0078]適應(yīng)于注射的藥物形式包括:無菌水溶液或分散液和無菌粉(用于臨時制備無菌注射溶液或分散液)。在所有情況中，這些形式必須是無菌的且必須是流體以易于注射器排出流體。在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，且必須能防止微生物(如細(xì)菌和真菌)的污染影響。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇)、它們的適當(dāng)混合物和植物油。
[0079]雞血藤或其提取物還可與其它活性成分或藥物聯(lián)合給藥。
[0080]當(dāng)兩種或兩種以上的藥物聯(lián)合給藥時，一般具有優(yōu)于兩種藥物分別單獨給藥的效
果O[0081]本發(fā)明的主要優(yōu)點在于:
[0082](I)首次發(fā)現(xiàn)了雞血藤的作用靶點為鐵調(diào)蛋白Hepcidin，其對于防治鐵缺乏相關(guān)疾病具有極其優(yōu)異的效果，且沒有任何副作用。雞血藤藥理作用強，具有極好的藥用前景。
[0083](2)可以從植物中獲取雞血藤提取物，在毒性低、服用方便的同時，還具有來源豐富，價格低廉，制備工藝簡單的優(yōu)點。
[0084]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0085]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0086]1.材料和方法
[0087]1、中藥材水煎劑的制備
[0088]所有中藥材均購自上海萬仕誠國藥制品有限公司(2010)，產(chǎn)地及入藥部位詳見表1。準(zhǔn)確稱取各種中藥材20g，蒸餾水IL室溫浸泡藥材2h，大火煮沸后小火煎煮2h，過濾收集藥液，在藥渣中注入IL蒸餾水，繼續(xù)煎煮2h，過濾收集藥液。將兩次收集的藥液合并，減壓濃縮至40g/L(相當(dāng)于每毫升含生藥0.04克)濃度。使用前經(jīng)0.22 μ m針孔濾器(Millpore)過濾。
[0089]表1、中藥材的名稱、產(chǎn)地及`用藥部位
【權(quán)利要求】
1.一種雞血藤(Caulis Spatholobi)的用途，其特征在于，用于制備降低體內(nèi)Hepcidin水平及升高血清鐵含量的組合物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于預(yù)防、緩解或治療缺鐵性疾病或由H印cidin分泌過多為病理特征的疾病。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的缺鐵性疾病包括:缺鐵性貧血、慢性炎癥性貧血、腎性貧血。
4.如權(quán)利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述的缺鐵性疾病是Hepcidin過表達導(dǎo)致的缺鐵性疾病。
5.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于: 降低編碼H印cidin的基因——HAMP基因的表達；或 降低Smad蛋白的磷酸化水平； 抑制BMP6對H印cidin表達的刺激作用；或 抑制IL-6對Hepcidin表達的誘導(dǎo)作用。
6.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于: 升高血清鐵蛋白含量；或 提高血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度。
7.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的雞血藤選自下組: (a)雞血藤藥材或其粉碎產(chǎn)物；或 (b)雞血藤的水或有機溶劑提取物。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的雞血藤的水提取物如下制備: 將雞血藤藥材用水浸泡1-10小時，煮沸后煎煮1-5小時，過濾收集藥液；收集藥渣重復(fù)煎煮步驟0-3次；合并藥液，減壓濃縮。
9.一種用于降低體內(nèi)Ifepcidin水平及升高血清鐵含量的中藥制劑，其通過以下方法制備獲得:將雞血藤藥材用水浸泡1-10小時，煮沸后煎煮1-5小時，過濾收集藥液；收集藥渣重復(fù)煎煮步驟0-3次；合并藥液，減壓濃縮。
10.一種降低體內(nèi)Ifepcidin水平及升高血清鐵含量的方法，其特征在于，包括步驟--給需要的對象施用有效量的雞血藤。
【文檔編號】A61P5/00GK103720748SQ201210384580
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月11日
【發(fā)明者】王福俤, 管宇, 安鵬 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院