專利名稱：：一種雞血藤的有效組分及其制備方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種治療腫瘤疾病的中藥提取物，具體地說涉及從雞血藤中提取的有效組分，制劑及其制備方法與用途。
背景技術(shù)：
：腫瘤是一種常見病、多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病。目前業(yè)內(nèi)對(duì)惡性腫瘤的治療主要還是以手術(shù)、放療、化療為主，但許多化學(xué)抗癌藥物在作用于靶細(xì)胞時(shí)往往累及正常細(xì)胞，造成嚴(yán)重的副反應(yīng)。植物藥的遺傳毒性不明顯，中草藥在抗癌抗突變方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景，而且中藥在對(duì)腫瘤的輔助治療中也起到不容忽視的作用。紫杉醇即是典型的從植物中獲得的具有良好抗癌活性的天然化合物，現(xiàn)已開發(fā)為抗腫瘤藥物。目前我國危害性最為嚴(yán)重的腫瘤為肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等。特別是肝癌的發(fā)生率近年來有所增加。值得重視，這些腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學(xué)及其防治，均為我國腫瘤研究的重點(diǎn)。尋找高效低毒的抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是當(dāng)前腫瘤研究的重要內(nèi)容。我國藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質(zhì)是研究和發(fā)現(xiàn)新藥先導(dǎo)化學(xué)物，開發(fā)新藥的天然寶庫。目前，我國從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，用于開發(fā)成治療腫瘤疾病、安全性好、毒性低的新藥還很少，從天然產(chǎn)物中提取活性物質(zhì)，開發(fā)成具有抗腫瘤療效的新藥，具有重要應(yīng)用價(jià)值和廣闊發(fā)展前景。雞血藤為一活血化瘀藥，別名血風(fēng)藤，性味歸經(jīng)溫；苦、甘；歸肝經(jīng)，其功能主治補(bǔ)血，活血，通絡(luò)。用于月經(jīng)不調(diào)，血虛萎黃，麻木癱瘓，風(fēng)濕痹痛。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種雞血藤的有效組分。本發(fā)明的另一目的在于提供上述雞血藤有效組分的制備方法。本發(fā)明還提供含有上述雞血藤有效組分的制劑及該組分的用途。本發(fā)明的雞血藤有效組分，其制備過程包括以下步驟步驟1:用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對(duì)雞血藤進(jìn)行提取，步驟2:提取液經(jīng)過色譜柱層析得洗脫液；步驟3:用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動(dòng)相為水和乙腈，收集32.6~40.8分鐘洗脫液得到有效組分(或稱為C05)。其中步驟l中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1-5:1-5，優(yōu)選為乙酸乙酯乙醇=1-2:1-2，最優(yōu)選為乙酸乙酯乙醇=1:1。所述步驟中，步驟l具體為取雞血藤藥材，以乙酸乙酯乙醇=1-5:1-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，分離后得到的提取液為提取物l，步驟2具體為將提取物l過正相硅膠柱，先用石油醚乙酸乙酯=47-53:1作為流動(dòng)相洗脫，然后改換氯仿甲醇8-13:1作為流動(dòng)相，得洗脫液，步驟3具體為用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的洗脫液，色譜柱為漢邦半制備柱(LichrospherC18;10.0mmx250mm,5iam)，流動(dòng)相為水(A)和乙腈(B)，洗脫梯度見下表，流速為3ml/min，柱溫為室溫。表l:洗脫梯度表Time—)_A(%)_B(%)085152065353530704559555595在時(shí)間段32.6-40.8分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明優(yōu)選的雞血藤有效組分制備方法，包括下列步驟將雞血藤藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(1:0.8-1.2)，加熱回流0.8-1.2小時(shí)，提取1-3次，合并濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進(jìn)行拌樣，用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(47-53:l)作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(8-13:l)作為流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件色譜柱為制備柱，流動(dòng)相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9-11ml/min，柱溫為室溫。本發(fā)明最優(yōu)選的雞血藤有效組分制備方法，包括下列步驟將雞血藤藥材粉碎后加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加熱回流l小時(shí)，提取2次，合并濾液得提取液；將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠進(jìn)行拌樣，用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；色譜柱為漢邦半制備柱(LichrospherC18;10.0mmx250mm,5pm)，流動(dòng)相為水(A)和乙腈(B)，洗脫梯度見下表，流速為3ml/min，柱溫為室溫。Time(min)_A(%)_B(%)085152065353530704559555595在時(shí)間段32.6~40.8分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。本發(fā)明32.6-40.8分鐘收集的有效組分成分如下表表2成分表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明還提供用本發(fā)明的中藥有效組分作為藥物活性成分制備成的藥物組合物，本發(fā)明的藥物組合物，包括有效組分，根據(jù)需要該組合物還可以加入藥物可接受的載體。本發(fā)明的組合物，是單位劑量的藥物制劑形式，所述單位劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋等。本發(fā)明的組合物其中的有效組分，其在制劑中所占重量百分比可以是0.1-99.9%，其余為藥物可接受的載體。本發(fā)明的組合物，通過將上述有效組分和藥物可接受的載體混合制備得到。本發(fā)明的組合物，其藥物制劑形式可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜?jiǎng)婌F劑、滴劑、貼劑。本發(fā)明的制劑，優(yōu)選的是口服劑型，如膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、膏劑等。本發(fā)明的組合物，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤劑，必要時(shí)可對(duì)片劑進(jìn)行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鈉?？赏ㄟ^混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進(jìn)行反復(fù)混合可使活性物質(zhì)分布在整個(gè)使用大量填充劑的那些組合物中?？诜后w制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復(fù)配的干燥產(chǎn)品。這種液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對(duì)羥基苯甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常規(guī)的香味劑或著色劑。對(duì)于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質(zhì)和無菌載體。根據(jù)載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質(zhì)溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發(fā)明的組合物，在制備成藥劑時(shí)可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA二鈉、EDTA鈣鈉，一價(jià)堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯垸酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、e_環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的組合物在使用時(shí)根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次l-20劑，如l-20袋或?；蚱?。本發(fā)明還提供本發(fā)明的中藥有效組分和藥物組合物在抗腫瘤方面的應(yīng)用。以下為抗腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)活性篩選在細(xì)胞水平上檢測(cè)有效組分對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用。細(xì)胞株HL-60腫瘤細(xì)胞樣品配制根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心?？蓛?chǔ)存-20。C。細(xì)胞培養(yǎng)使用RPMI1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氫鈉]卯。/。，胎牛血清(四季青)10。/。混合培養(yǎng)HL60細(xì)胞，密度需低亍106個(gè)/mL。實(shí)驗(yàn)方法1種板(1)計(jì)算需要細(xì)胞總量NT-pcell'mL-lxVTOo-2xl04個(gè)/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。(2)吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中。取10/iL，加10/iL胎盤藍(lán)稀釋，計(jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL,則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積。(3)離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VImL，吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2二NT/NxVl。(4)在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入150/iL。(5)種板后選取4孔加入20(^L培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剩余孔加入200jLiLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。a)加藥在新的96孔板中加入220ML/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88ML藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50/iL，此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為50ng/mL。孵育48h。每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200/iL的培養(yǎng)液，將吸取0.88/iLDMSO加入混勻)，及陽性對(duì)照組(順鉑終濃度4/xg/mL)。b)SRB染色細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40%(質(zhì)量/體積)的三氯乙酸(TCA)100uL固定細(xì)胞，室溫放置5mm，4'C冰箱中放置1h。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加0.4。/。的SRB100nL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用10mmol/LTrisl50uL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標(biāo)儀(ELx800)測(cè)定，所用波長為490nm。4抑制率的計(jì)算抑制率按如下公式計(jì)算袖加卞"八藥物組」值—空白組」值"no,抑制率(％)=-x100%陰性對(duì)照組/(值一空白組」值藥效結(jié)果見表3。根據(jù)HL-60腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果，雞血藤C05有效組分對(duì)抑制HL-60腫瘤細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表3，HL-60腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>細(xì)胞株K562腫瘤細(xì)胞樣品配制根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心?？蓛?chǔ)存-20。C。細(xì)胞培養(yǎng)使用RPMI1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氫鈉]90。/。，小牛血清(賽樂)10%,非必需氨基酸(Gibco)1。/?；旌吓囵B(yǎng)K562細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)方法1種板(1)計(jì)算需要細(xì)胞總量NT-pcell'mL-lxVT(p=8xl03個(gè)/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。(2)吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中。取10/iL，加10/iL胎盤藍(lán)稀釋，計(jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為:NL/4xl04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積。(3)離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VImL,吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2二NT/NxVl。(4)在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100/iL,孵育24h。(5)種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剩余孔加入100/xLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。2加藥(1)96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150ML。(2)在新的96孔板中加入220/iL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88/xL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50pL，此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為50/tg/mL。孵育48h。每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200/xL的培養(yǎng)液，將吸取0.88mLDMSO加入混勻)，陽性對(duì)照組(阿霉素終濃度4Mg/mL)。3SRB染色細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，每孔加入40。/。(質(zhì)量/體積)的三氯乙酸(TCA)70nL固定細(xì)胞，4'C冰箱中放置1h。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中干燥后，每孔加0.4%的SRB100"L(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸洗漆5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用10mmol/LTrisl50uL/孔溶解，振蕩5min,使用酶標(biāo)儀(ELx800)測(cè)定，所用波長為490nm。4抑制率的計(jì)算抑制率按如下公式計(jì)算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>藥效結(jié)果見表4。根據(jù)K562腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果，雞血藤C05有效組分對(duì)抑制K562腫瘤細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表4，K562腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>細(xì)胞株KB腫瘤細(xì)胞樣品配制根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心?？蓛?chǔ)存-20。C。細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90。/。，小牛血清(賽樂)10%,非必需氨基酸(Gibco)1。/?；旌吓囵B(yǎng)KB細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)方法1種板(O計(jì)算需要細(xì)胞總量NT:pcellnnL-lxVT(p-2xl03個(gè)/mL),其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。(2)吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中。取10/xL，加10pL胎盤藍(lán)稀釋，計(jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL,則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為:NL/4xl04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積。(3)離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VImL,吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2:NT/NxVl。(4)在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液,每孔加入100/iL，孵育24h。(5)種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剩余孔加入100/xLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。2加藥(1)96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150mL。(2)在新的96孔板中加入220ML/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88/xL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入5(^L，此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為50/ig/mL。孵育48h。每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培養(yǎng)液，將吸取0.88^LDMSO加入混勻)，陽性對(duì)照組(阿霉素終濃度4/ig/mL)。3MTT比色法測(cè)定(1)取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液二10:1)100/iL，孵育4h。(2)吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150juL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標(biāo)儀(Elx800)測(cè)定。4抑制率的計(jì)算抑制率按如下公式計(jì)算-袖wt"/、藥物組/f值一空白組^(值"no,抑制率(％)=-xi。0%陰性對(duì)照組力值一空白組^值藥效結(jié)果見表5。根據(jù)KB腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果，雞血藤C05有效組分對(duì)抑制KB腫瘤細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表5，KB腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>藥理模型MCF-7腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%,小牛血清(賽樂)10%，非必需氨基酸(Gibco)1%混合培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞。計(jì)算需要細(xì)胞總量NT-pcellnnL-lxVT。=2x103個(gè)/mL)，其中VT=0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中。取10/iL，加10/iL胎盤藍(lán)稀釋，計(jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL,則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養(yǎng)液VlmL，吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入10(^L，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剩余孔加入100/xLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案雞血藤c05有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心?？蓛?chǔ)存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150mL。在新的96孔板中加入220ml/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88pL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔每孔加入50/xL，此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為50]Ug/mL。孵育48h。每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200/tL的培養(yǎng)液，將吸取0.88mLDMSO加入混勻)，陽性對(duì)照組(阿霉素終濃度4pg/mL)。MTT比色法測(cè)定取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液-10:1)100mL，孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150/iL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標(biāo)儀(Elx800)測(cè)定。抑制率的計(jì)算抑制率按如下公式計(jì)算鵬摔(％)=藥物歸-空白歸督/0陰性對(duì)照組^值一空白組>(值藥效結(jié)果見表6。根據(jù)MCF-7腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果,雞血藤c05有效組分對(duì)抑制MCF-7腫瘤細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表6，MCF-7腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>RSD(%)5.2972.6325.3511,872藥理模型HepG2腫瘤細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)與種板細(xì)胞培養(yǎng)使fflDMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，胎牛血清(四季青)10%，非必需氨基酸(Gibco)1。/。混合培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。計(jì)算需要細(xì)胞總量NT-pcellnnL-lxVT(p-2x103個(gè)/mL)，其中VT-0.1mLx孔數(shù)+細(xì)胞槽剩余量。吹打培養(yǎng)瓶壁上的懸浮細(xì)胞，加入離心管中。取10/iL，加10pL胎盤藍(lán)稀釋，計(jì)算計(jì)數(shù)板上活細(xì)胞數(shù)總數(shù)NL，則離心管中的細(xì)胞數(shù)N為NL/4xl04x2xV個(gè)，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min),吸去上清液，加入培養(yǎng)液VImL，吹打，使細(xì)胞混勻，吸取V2mL加入到細(xì)胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細(xì)胞槽中再加入VT-V2mL的培養(yǎng)液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL，孵育24h。種板后選取4孔加入培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，剩余孔加入100mLPBS，以減少培養(yǎng)液的蒸發(fā)。給藥方案雞血藤C05有效組分根據(jù)所稱量的藥品的重量，根據(jù)所稱量的藥品的重量，加入相應(yīng)體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當(dāng)離心。可儲(chǔ)存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液150/iL。在新的96孔板中加入220/iL/孔的培養(yǎng)液，將吸取0.88ML藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細(xì)胞的孔毎孔加入50mL，此時(shí)藥物稀釋1000倍，即終濃度為50]Ug/mL。孵育48h。每個(gè)濃度設(shè)4(2)個(gè)平行復(fù)孔，每板設(shè)陰性對(duì)照組(細(xì)胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200/iL的培養(yǎng)液，將吸取0.88mLDMSO加入混勻)，陽性對(duì)照組(阿霉素終濃度4/ig/mL)。MTT比色法測(cè)定取出培養(yǎng)板，去處每孔上清，加入培養(yǎng)液一MTT混合溶液(培養(yǎng)液MTT溶液=10:1)100jLiL，孵育4h。吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150/iL的DMSO，振蕩10min,550nm酶標(biāo)儀(Elx800)測(cè)定。抑制率的計(jì)算抑制率按如下公式計(jì)算鵬摔(％)=藥物組應(yīng)-空白組應(yīng)x100%陰性對(duì)照組j值一空白組/(值藥效結(jié)果見表7。根據(jù)HepG2腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果，雞血藤C05有效組分對(duì)抑制HepG2腫瘤細(xì)胞增殖有非常顯著效果。表7，HepG2腫瘤細(xì)胞抑制率結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>流速為10ml/min，柱溫為室溫。樣品用100%乙醇溶解，經(jīng)制備液相色譜分離，在時(shí)間段32.640.8分鐘收集溶液，濃縮干燥后得到有效組分組分0.20g。實(shí)施例2雞血藤有效組分的分析對(duì)實(shí)施例1的雞血藤有效組分的HPLC-ELSD聯(lián)用分析色譜條件色譜柱AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6鵬X150mm,5ym);采用梯度洗脫，流動(dòng)相A相為0.2%冰醋酸水溶液，流動(dòng)相B相為含0.2%冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下O分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為90%的0.2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B為10%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；10分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為50%的0.2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相8為50%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；30分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B為95%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；35分鐘時(shí)，流動(dòng)相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動(dòng)相B為95%的0.2%冰醋酸的乙腈。溶液流速0.5mL'min—、檢測(cè)波長全波長；柱溫30°C;ELSD條件漂移管溫度105°C;氮?dú)饬魉?.OL/min供試品溶液的制備稱取本發(fā)明有效組分，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。測(cè)定方法精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定。實(shí)施例3雞血藤有效組分制劑取實(shí)施例1的雞血藤有效組分0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6-8'C液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。實(shí)施例4雞血藤有效組分制劑取實(shí)施例1的雞血藤有效組分0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸鈉0.9g和蒸餾水lml，上述組分混合均勻后，冷凍千燥，分裝500支，即得。實(shí)施例5雞血藤有效組分制劑取降香油1.5g,加入到13ml飽和的羥丙基e-環(huán)糊精中，攪拌溶解，濾過，濾葉低溫干燥，的降香油和羥丙基e-環(huán)糊精的包合物粉末。除上述降香油合羥丙基e-環(huán)糊精的包合物粉末外，再取實(shí)施例1的雞血藤有效組分0.5g、甘露醇5.5g、依地酸鈣鈉0.9g和蒸餾水2ml，上述組分混勻后，冷凍干燥，分裝300支，即得。實(shí)施例6雞血藤有效組分的制備操作步驟同實(shí)施例l，條件改為乙酸乙酯和乙醇(1:5)，正相硅膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯47:l作為流動(dòng)相，得洗脫液I，然后改換氯仿和甲醇(8:1)作為流動(dòng)相。實(shí)施例7雞血藤有效組分的制備操作步驟同實(shí)施例l，條件改為乙酸乙酯和乙醇(5:1)，正相硅膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯53:l作為流動(dòng)相，得洗脫液I，然后改換氯仿和甲醇(13:1)作為流動(dòng)相。實(shí)施例8雞血藤有效組分的制備操作步驟同實(shí)施例l，條件改為乙酸乙酯和乙醇(1:2)，正相硅膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯47:l作為流動(dòng)相，得洗脫液I，然后改換氯仿和甲醇(8:1)作為流動(dòng)相。實(shí)施例9雞血藤有效組分的制備操作步驟同實(shí)施例l，條件改為乙酸乙酯和乙醇(2:1)，正相硅膠柱分離，首先用石油醚和乙酸乙酯53:l作為流動(dòng)相，得洗脫液I，然后改換氯仿和甲醇(13:1)作為流動(dòng)相。權(quán)利要求1、一種雞血藤有效組分，其特征在于，其制備過程包括以下步驟步驟1用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對(duì)雞血藤進(jìn)行提?。徊襟E2提取液經(jīng)過色譜柱層析得洗脫液；步驟3用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動(dòng)相為水和乙腈，收集32.6～40.8分鐘洗脫液得到有效組分。2、權(quán)利要求1的有效組分，其特征在于，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1-5:1陽5。3、權(quán)利要求l的有效組分，其特征在于，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1-2:1-2。4、權(quán)利要求1的有效組分，其特征在于，步驟1中所述乙酸乙酯和乙醇的混合物，兩者的比例為乙酸乙酯乙醇=1:1。5、權(quán)利要求l的有效組分，其特征在于，所述步驟中，步驟l為取雞血藤藥材，以乙酸乙酯:乙醇=1-5:1-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，分離后得到的提取液為提取物l，步驟2為將提取物l過正相硅膠柱，先用石油醚乙酸乙酯=47~53:1作為流動(dòng)相洗脫，然后改換氯仿甲醇8~13:1作為流動(dòng)相，得洗脫液，步驟3為用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的洗脫液，流動(dòng)相為水-A和乙腈-B，進(jìn)行梯度洗脫。6、權(quán)利要求5的有效組分，其特征在于，所述梯度洗脫程序如下色譜柱為漢邦半制備柱(LichrospherC18;10.0mmx250mm,5nm)，流動(dòng)相為水(A)和乙腈(B)，洗脫梯度見下表，流速為3ml/min，柱溫為室溫，Time(min)_A(%)_B(%)085152065353530704559555595在時(shí)間段32.6-40.8分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。7、含有權(quán)利要求l-6任何一項(xiàng)有效組分的藥物組合物。8、權(quán)利要求1的有效組分的制備方法，其特征在于，其制備過程包括以下步驟:步驟1:用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對(duì)雞血藤進(jìn)行提?。徊襟E2:提取液經(jīng)過色譜柱層析得洗脫液；步驟3:用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動(dòng)相為水和乙腈，收集32.6~40.8分鐘洗脫液得到有效組分。9、權(quán)利要求8的有效組分的制備方法，其特征在于，所述步驟中，步驟l為取雞血藤藥材，以乙酸乙酯:乙醇=1-5:1-5為溶劑，回流提取，將提取液與藥渣分離，分離后得到的提取液為提取物l，步驟2為將提取物l過正相硅膠柱，先用石油醚乙酸乙酯=47~53:1作為流動(dòng)相洗脫，然后改換氯仿甲醇813:1作為流動(dòng)相，得洗脫液，步驟3為用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的洗脫液，色譜柱為漢邦半制備柱(LichrospherC18;10.0mmx250mm,5)Lim)，流動(dòng)相為水(A)和乙腈(B)，洗脫梯度見下表，流速為3ml/min，柱溫為室溫，Time(min)_A(%)_B(%)<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>在時(shí)間段32.6~40.8分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。10、權(quán)利要求9的有效組分的制備方法，其特征在于，步驟如下將雞血藤藥材粉碎后加入乙酸乙酯乙醇=1:1，加熱回流l小時(shí)，提取2次，合并濾液得提取液；將提取液濃縮成浸膏，并將其與硅膠拌樣(1:1.0-1.2)，用正相硅膠柱對(duì)其進(jìn)行分離，首先用石油醚乙酸乙酯=50:1作為流動(dòng)相，得洗脫液I，棄之，然后改換氯仿甲醇=10:1作為流動(dòng)相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮干燥后得樣品；用制備液相色譜繼續(xù)分離得到的樣品；制備色譜的分離條件:色譜柱為漢邦半制備柱(LichrospherC18;10.0mmx250mm，5pm)，流動(dòng)相為水(A)和乙腈(B)，洗脫梯度見下表，流速為3ml/min，柱溫為室溫，<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>在時(shí)間段32.6-40.8分鐘收集溶液，溶液經(jīng)濃縮干燥后得到有效組分。全文摘要本發(fā)明涉及一種雞血藤的有效組分及其制備方法與用途，本發(fā)明的雞血藤有效組分，其制備過程包括以下步驟步驟1用乙酸乙酯和乙醇混合物作為溶劑對(duì)雞血藤進(jìn)行提取；步驟2提取液經(jīng)過色譜柱層析得洗脫液；步驟3用制備液相色譜梯度洗脫得到的洗脫液，流動(dòng)相為水和乙腈，收集32.6～40.8分鐘洗脫液得到有效組分。文檔編號(hào)A61K36/185GK101347496SQ200710123270公開日2009年1月21日申請(qǐng)日期2007年7月20日優(yōu)先權(quán)日2007年7月20日發(fā)明者靂劉,強(qiáng)史,水文波,程翼宇,靜竇,葛志偉,慶賀,陽霍申請(qǐng)人:天津天士力制藥股份有限公司