專利名稱：：苯甲酰取代水飛薊賓用于制備治療病毒性乙肝藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，本發(fā)明涉及式(1)所示的一個苯甲?；〈乃w薊賓酯型黃酮木脂素或其可藥用鹽用于制備抑制乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸HBVDNA復(fù)制、治療乙型病毒性肝炎藥物之用途，該黃酮木脂素具有確切抑制HBVDNA活性，其在高劑量(100微克/毫升)時對HBVDNA的復(fù)制抑制活性比α-干擾素在最高濃度10000單位/毫升濃度時的抑制活性高出將近兩倍，屬于強效的非核苷類抑制乙肝病毒天然產(chǎn)物，以上藥效學(xué)結(jié)果表明該黃酮木脂素或其可藥用鹽可預(yù)期用于制備抑制HBVDNA復(fù)制或治療乙型肝炎病毒感染疾病藥物的用途。
背景技術(shù)：
：乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒HBV引起的傳染病，HBV是嗜肝DNA病毒科hepadnaviridae的一員，其形狀為直徑42納米的球形顆粒。HBV是奇特的病毒，在其它動物中較少有傳染性，唯有在人體或者靈長類動物黑猩猩體內(nèi)才能得以復(fù)制。該病毒通過乙肝病毒攜帶者和乙肝病人的血液、唾液、精液、陰道分泌物進行傳播，具有慢性攜帶狀態(tài)。乙肝在我國廣泛流行，因其分為垂直傳播、水平傳播、家庭內(nèi)傳播、醫(yī)源性傳播和性傳播等多種方式，對人群感染率高，在某些地區(qū)感染率達到35%以上。據(jù)有關(guān)資料，肝炎檢測陽性的患者已經(jīng)達到1.89億，而應(yīng)就診未就診人數(shù)(攜帶者)將近4億，是當前危害人民健康最嚴重的傳染病之一。乙肝臨床表現(xiàn)多樣化，易發(fā)展為慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化，少數(shù)病人可轉(zhuǎn)變?yōu)樵l(fā)性肝癌。近幾年隨著肝病的研究，發(fā)展了標準化的HBVDNA的分析，大大推進了對乙肝患者病情的了解。HBVDNA的定量分析能預(yù)測乙肝的嚴重性及其預(yù)后，因為HBVDNA持續(xù)陽性(即持續(xù)病毒血癥)容易使乙肝病情進展和加重；高乙肝病毒(HBVDNA)含量容易促進肝硬化的形成；HBVDNA持續(xù)存在是肝細胞癌(HCC)發(fā)生的高危因素，特別是病毒含量較高、病程較長、年齡較大或合并其它肝病者；持續(xù)高濃度的HBVDNA存在，可導(dǎo)致失代償性肝硬化及原發(fā)性肝重癥的死亡率明顯增加。同時必須認識到，HBVDNA水平與肝臟組織學(xué)的關(guān)系極其密切文獻報道經(jīng)抗病毒治療，肝臟纖維化的改善和消除明顯；近期國際肝病會議報導(dǎo)，強效和低耐藥性的抗病毒治療，隨著HBVDNA的降低和轉(zhuǎn)陰，而觀察到肝硬化可出現(xiàn)不同程度的逆轉(zhuǎn)，因此現(xiàn)在主張肝硬化也應(yīng)進行抗病毒治療。因此，HBVDNA指標在抗病毒治療中的應(yīng)用也起著舉足輕重的作用HBVDNA的水平是決定慢性乙型肝炎是否需要抗病毒治療的重要指標；根據(jù)HBVDNA的不同情況分別制定出HBeAg陽性或HBeAg陰性的不同治療標準和要求；在抗病毒治療中，根據(jù)HBVDNA的治療反應(yīng)，判斷是否病毒學(xué)早期應(yīng)答進而決定長期用藥的策略以取得持續(xù)性的病毒學(xué)應(yīng)答，達到持續(xù)病毒抑制的目的；根據(jù)HBVDNA的病毒學(xué)的應(yīng)答情況，創(chuàng)造HBeAg血清學(xué)的轉(zhuǎn)換基礎(chǔ)和條件，以達到其良好的中間治療目標；根據(jù)HBVDNA持續(xù)抑制情況爭取病毒持續(xù)陰性，以爭取達到抗病毒最終治療目標；根據(jù)HBVDNA持續(xù)完全受到抑制，也顯示出了cccDNA的不同程度好轉(zhuǎn)和消失；在抗病毒治療中，以HBVDNA的變化來評估和預(yù)防抗病毒藥物所引起的病毒變異及耐藥發(fā)生的風險；一旦發(fā)生病毒變異或耐藥時，HBVDNA的變化是唯一的最先的信號和診斷依據(jù)，也是治療耐藥和改變治療策略的指導(dǎo)和依據(jù)。綜上所述，對HBVDNA的抑制程度在乙肝的進一步診斷和治療上有著新的重大意義，對療效的觀察，對評估乙肝預(yù)后及耐藥危險性均有較大的指導(dǎo)作用。由上述因素可知抑制乙肝病毒在體內(nèi)增殖的一個根本環(huán)節(jié)在于抑制HBVDNA的復(fù)制。HBVDNA水平的降低或者低于檢測水平是檢驗抗病毒藥物的一把金鑰匙。所以，亞太肝臟研究學(xué)會和歐洲肝臟研究學(xué)會均將HBVDNA檢測不到作為乙型肝炎病毒患者治療終點之一。我國新藥開發(fā)指南中也將受測化合物對于HBVDNA的抑制強度視為必須完成的測試項目之一。拉米呋啶之所以能夠成為首選核苷類藥物便是因為其具有強效的抑制HBVDNA復(fù)制之活性。必須說明的是目前使用的抗病毒藥物其實只是病毒復(fù)制的抑制劑，并不能直接殺滅病毒和破壞病毒體，否則就會損傷宿主細胞。這些抗病毒藥物(多為核苷類藥物)還存在上述毒副作用大、易引起病毒基因突變、停藥后易反跳等缺點，因此開發(fā)新型抗病毒藥物是當今藥物研發(fā)領(lǐng)域的當務(wù)之急。其對于治療我國大量的乙肝患者和病毒攜帶者、控制傳染源等都有著極其重要的社會意義和經(jīng)濟意義。所以，從民族民間長期使用的天然藥物中發(fā)現(xiàn)新的非核苷類乙肝病毒抑制劑及此類能夠抑制HBVDNA復(fù)制的先導(dǎo)化合物有著很大的指導(dǎo)性意義，并有著遼闊的發(fā)展前景?；诖四康?，發(fā)明人以前曾完成多項抗乙肝病毒天然產(chǎn)物及其結(jié)構(gòu)改造衍生物的專利和文章，發(fā)現(xiàn)了多種抑制乙肝病毒表面抗原HBsAg或乙肝病毒e抗原HBeAg活性、抑制HBVDNA復(fù)制的化合物，從而說明從天然產(chǎn)物及其合成衍生物中篩選出能夠抑制HBVDNA復(fù)制、防治乙肝病毒感染的創(chuàng)新性藥物是可行的[參見“一類對映桉烷醇類倍半萜抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(趙昱、劉光明、于榮敏、李海波等；ZL200610053827.4)；“2β-羥基冬青酸抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(李校堃、趙昱、黃可新、李海波等；ZL200610053749.8)；“2α，3β-二羥基-5，11(13)-二烯桉烷_12_酸抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(趙昱、張禮和、孫漢董、李海波等；ZL200610053601.4)；“艾里莫芬烷內(nèi)酯抑制乙肝病毒的用途及其藥物組合物”(趙昱、李海波、楊雷香、周長新等；ZL03153691.3)；“一種艾里莫芬內(nèi)酯酸天然產(chǎn)物及其應(yīng)用”(趙昱、周長新、施樹云、王曉雨等；ZL200610053575.5)；“一種桉烷型倍半萜酸及其用途”(趙昱、劉光明、李海波、巫秀美等；ZL200610053579.3)；“六棱菊屬植物提取物抑制單純皰疹病毒及乙肝病毒的用途”(趙昱、周長新、于榮敏、白驊；CN1989989Α)；“1β_氧代_5，11(13)-二烯桉烷-12-酸抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(趙昱、李校堃、黃可新、李海波等；CN1927197Α)；“1β-羥基冬青酸抑制乙肝病毒的醫(yī)藥用途”(趙昱、李校堃、黃可新、巫秀美等；CN1935131Α)；“對映艾里莫芬烷酸及其抑制乙肝表面抗原的醫(yī)藥用途”(黃可新、李校堃、王曉雨、趙昱等；CN101239054)；“1_氧-取代苯甲酰奎尼酸化合物及其抑制乙肝病毒用途”(李校堃、胡利紅、巫秀美、趙昱等；CN101293836)；發(fā)明人已發(fā)表之抑制HBsAg/HBeAg和HBVDNA等活性文章參見“InVitroAntiviralActivityofThreeEnantiomericSesquiterpeneLactonesfromSenecioSpeciesAgainstHepatitisBVirus，，，HaiboLi(李海波)，ChangxinZhou(周長新)，XiumeiWu(巫秀美)，YuZhao^(MS)^,AntiviralChemistry&Chemotherapy，2005，16，277—282;“Ev￡ilu￡itionofAntiviralActivityofCompoundsIsolatedfromRanunculussieboldiiMiq.andRanunculussceleratusL",HaiboLi(李海波)，ChangxinZhou(周長新)，XiumeiWu(巫秀美)，YuZhao*(趙昱)等，PlantaMedica，2005，71(12)，1128-1133；"Applicationofhigh-speedcounter-currentchromatographyfortheisolationofantiviraleremophiIenolidesfromLigulariaatroviolacea，，，Shi,Shu-Yun(施樹云)，Hai-Bo(李海波)，Zhao，Yu(趙昱)等，BiomedicalChromatography,2008,22(9),985-991；"PurificationandidentificationofantiviralcomponentsfromLaggerapterodontabyhigh-speedcounter-currentchromatography，，,ShuyunShi(施樹云)，YuZhao(MS)等，JournalofChromatographyB，2007，859，119-124]。毋庸置疑，繼續(xù)從天然產(chǎn)物及其結(jié)構(gòu)改造衍生物中尋找能夠抑制HBVDNA復(fù)制的先導(dǎo)化合物是非常有必要性和緊迫性的，也因此被國家科技部列為新藥研制重大專項之一。在上述治療CHB藥物中，還有一類是保肝類藥物，其臨床大量使用之典型為存在于菊科植物水飛薊的種子中的水飛薊素。水飛薊已在臨床上廣泛應(yīng)用，在市場上其商品名為Legalon利肝隆或Flavobion，其代表性化合物當屬黃酮木脂素水飛薊賓。黃酮木質(zhì)素化合物屬于雜木質(zhì)素類，是由一分子苯丙素和一分子黃酮結(jié)合而成的一類天然產(chǎn)物。水飛薊中水飛薊賓含量最多，活性也最高。該藥作用主要有以下幾點(一)抗自由基活性水飛薊素對于由四氯化碳、半乳糖胺、醇類和其他肝毒素造成的肝損害具有保護作用。1990年Lotteron等人報道了在小鼠肝微粒體內(nèi)，水飛薊素能減少由四氯化碳代謝引起的體外脂質(zhì)過氧化及由還原型輔酶單獨引起的過氧化作用，這些都表明水飛薊素為鏈中斷抗氧化劑或為自由基清除劑。(二)保護肝細胞膜通過抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)維持細胞膜的流動性，保護肝細胞膜。還能阻斷真菌毒素鬼筆毒環(huán)肽和α-鵝膏蕈堿等與肝細胞上特異受體的結(jié)合，抑制其對肝細胞的攻擊及跨膜轉(zhuǎn)運，中斷其肝腸循環(huán)，從而增強肝細胞膜對于多種損害因素的抵抗力。(三)促進肝細胞的修復(fù)和再生水飛薊賓進入細胞后可以與雌二醇受體結(jié)合，并使之激活，活化的受體可以增強肝細胞核內(nèi)RNA聚合酶1的活性，使RNA轉(zhuǎn)錄增強，促進酶及蛋白質(zhì)的合成，并間接促進DNA的合成，有利于肝細胞的修復(fù)和再生。(四)抗腫瘤作用各種活性氧能氧化鳥嘌呤形成8-羥基鳥嘌呤，造成DNA損傷，進而引起腫瘤，水飛薊賓作為一個有效的抗自由基物質(zhì)也顯示了預(yù)防和治療腫瘤的作用。三十多年的臨床實驗證明該藥具有確切的療效和低毒性(參閱Flora，K.等，Am.J.Gastroenterol,1998,93,139-143；Sailer,R.等，Drugs,2001,61(14)，2035-2063；Gazak,R-等，Curr.Med.Chem.2007，14，315-338；Svagera,Z.等，Phytother.Res.2003，17，524-530；Gazak,R.等，Bioorg.Med.Chem.2004，12，5677-5687；Varga,Z.等；Phytothe.Res.2001，15，608-612.Singh，R.P.等，Curr.CancerDrugTar.2004,4,1-11)。因此，以水飛薊賓為代表的黃酮木質(zhì)素類化合物引起了越來越多的關(guān)注，如發(fā)明人于2006-2009年間制備并報道的多個系列水飛薊賓類衍生物也具有顯著的抗氧化活性(楊雷香、趙星等，"Design，synthesisandexaminationofneuronprotectivepropertiesofalkenylatedandamidateddehydro-silybinderivatives",JournalofMedicinalChemistry，2009，52(23)，7732-7752；汪峰，趙昱等，“PreparationofC-23esterifiedsilybinderivativesandevaluationoftheirlipidperoxidationinhibitoryandDNAprotectiveproperties”，Bioorganic&MedicinalChemistry,2009，17(17)，6380-6389；楊雷香，趙昱等，"SynthesisandAntioxidantPropertiesEvaluationofNovelSilybinAnalogues”，JournalofEnzymeInhibitionandMedicinalChemistry,2006，21(4),399-404；等等)。在發(fā)明人報道的上述文章中，經(jīng)發(fā)明人設(shè)計并合成出的多個系列之A環(huán)、B環(huán)、E環(huán)和23位取代的黃酮木脂素類化合物都顯示出強效捕獲DPPH自由基和超氧陰離子自由基的活性、抗氧化活性、以及保護PC12細胞的活性。但是顯而易見上述研究僅集中于研究水飛薊賓類黃酮木脂素的抗氧化作用和細胞保護作用。近期(2006年)，謝軍報道了聯(lián)合應(yīng)用具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)雙重作用的干擾素和保肝護肝的水飛薊賓磷脂復(fù)合物治療慢性乙肝的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥對患者體內(nèi)ALT、AST值降低比單獨用干擾素效果明顯，說明水飛薊賓磷脂復(fù)合物能加強干擾素的治療慢性乙肝之作用。但是，類似的治療方案仍是將水飛薊賓等黃酮木脂素作為輔助用藥，且主要是用于保護肝細胞膜而非直接用其實施抗病毒作用。左國營等(左國營，劉樹玲，徐貴麗，世界華人消化雜志，2006年14卷13期，1241-1246頁)綜述了近20年來藥用植物成分體外抗HBV活性的研究進展，文中論及多種天然產(chǎn)物，其中并沒有報道任何黃酮木脂素類化合物具有抗HBV活性的相關(guān)記錄，尤其是水飛薊賓類天然產(chǎn)物及其衍生物，國內(nèi)幾乎無人涉及，僅由發(fā)明人團隊對其進行了前人未加注意的結(jié)構(gòu)改造和抗氧化活性研究。以水飛薊賓為代表的黃酮木脂素化合物雖然具有以上所述之抗氧化療效，然而其見報于抗病毒治療方面之文獻相對較少，黃酮木脂素類化合物治療DNA類病毒感染尤其是其用于抗乙肝病毒方面(尤其是抑制HBVDNA復(fù)制)的新用途尚未得到有效開發(fā)，故此從黃酮木脂素中尋找抗乙肝病毒領(lǐng)域的活性化合物，亦即將黃酮木脂素結(jié)構(gòu)改造使其具有抗DNA類病毒活性是一個嶄新的領(lǐng)域。從其中發(fā)現(xiàn)抑制HBVDNA復(fù)制的先導(dǎo)化合物更是前人所未嘗試過的挑戰(zhàn)。為了探索這個領(lǐng)域，我們設(shè)計并制備了與水飛薊賓結(jié)構(gòu)有所差異的一種新的黃酮木脂素衍生物，也即在原水飛薊賓之23位連接上一個苯甲?；?，延長了整個分子共軛范圍和共軛強度，如此設(shè)計可以生成新型空間結(jié)構(gòu)不同于水飛薊賓的一類新型木質(zhì)素二氫黃酮醇類化合物(也是一類新型黃酮木脂素化合物)，以期發(fā)現(xiàn)，能抑制HBVDNA復(fù)制的黃酮木脂素先導(dǎo)化合物，從而將其進一步開發(fā)成具有能抑制HBVDNA復(fù)制治療CHB的創(chuàng)新性藥物，據(jù)此完成本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供式(1)所示結(jié)構(gòu)的苯甲?；〈乃w薊賓酯或其可藥用鹽用于制備治療乙型病毒性肝炎的藥物的用途；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>式⑴化合物的名稱為(士)_苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2,3-二氫-1,4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯。本發(fā)明還提供了一種制備式(1)所示的黃酮木脂素類化合物的方法，其特征是用市售或者自制的水飛薊賓與苯甲酸在三苯基磷和偶氮二甲酸二乙酯存在下，進行縮合反應(yīng)而得。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于抑制HBVDNA復(fù)制、治療乙型病毒性肝炎的藥物組合物，其特征為含有治療有效量的作為活性成分的式(1)化合物或者它的可藥用鹽和可藥用輔料組成的混合物。其藥物劑型可以是片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、貼片劑、皮下植埋劑、外用搽劑、口服液或軟膏劑，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型或納米制劑。本發(fā)明的苯甲?；〈乃w薊賓酯型黃酮木脂素(1)與天然黃酮木脂素類化合物水飛薊賓相比較，具有諸多結(jié)構(gòu)和物化性質(zhì)上差異化的特征，包括其疏水性、芳香性、吉布斯自由能、氫鍵受體、電性、分子間范德華力、以及3D構(gòu)象、伸展方向、分子重心、電性分布中心等特質(zhì)均與水飛薊賓有著明顯不同；且化合物(1)分子量比水飛薊賓增大了168個質(zhì)量單位。上述特征都決定了式(1)所示化合物之三維構(gòu)象與HBVDNA之3D空間結(jié)構(gòu)相結(jié)合之配體_受體結(jié)合復(fù)合物形態(tài)和結(jié)合方式都可能產(chǎn)生較大的差別，其結(jié)合位點和結(jié)合模式、其結(jié)合自由能等均會產(chǎn)生較大的改變，因而可能在抑制HBVDNA復(fù)制方面有著意想不到的效果。我們測試了該化合物對H印G2.2.15細胞的生長抑制作用，同時測試了其對H印G2.2.15細胞分泌的乙型肝炎HBVDNA復(fù)制的抑制活性。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)式(1)所示之黃酮木脂素化合物對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)的復(fù)制具有比較強的抑制作用，其在高劑量(100微克/毫升)時對乙肝病毒HBVDNA的復(fù)制抑制活性比α-干擾素在最高濃度10000單位/毫升濃度時的抑制活性高出將近兩倍，屬于強效的非核苷類抑制乙肝病毒天然產(chǎn)物。以上說明式(1)化合物有著意想不到的抗HBV效果，從而可以預(yù)期其可以作為抑制HBVDNA復(fù)制、治療乙型病毒性肝炎之活性先導(dǎo)化合物繼續(xù)開發(fā)。經(jīng)本發(fā)明人詳細的文獻查閱，到目前為止，尚無有關(guān)該化合物治療乙肝病毒感染性疾病和制備抗乙肝病毒藥物的報道。黃酮木脂素式(1)化合物對于HBVDNA強效抑制均屬于意想不到的發(fā)現(xiàn)，有著確切的原創(chuàng)性。綜上所述，我們制備的該黃酮木脂素既有結(jié)構(gòu)上的獨特性，又有抗病毒作用方面研究的新穎性，并在抗乙肝病毒活性測試中發(fā)現(xiàn)了不尋常的抑制HBVDNA的活性，有望成為抑制HBVDNA復(fù)制及治療CHB之先導(dǎo)化合物。本發(fā)明有益之處在于首次發(fā)現(xiàn)式(1)所示之苯甲?；〈乃w薊賓酯型黃酮木脂素具有抑制HBVDNA復(fù)制功效以及在防治乙肝病毒方面的成藥潛力，為開發(fā)成為治療乙肝病毒創(chuàng)新藥物、開發(fā)抑制HBVDNA復(fù)制之創(chuàng)新藥物提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)。具有潛在巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。本發(fā)明再一特點為本發(fā)明之合成起始物來源方便，合成方便。其制備方法簡單易行，原料來源方便易得，成本低，污染小，利于節(jié)能減排條件下的大規(guī)模生產(chǎn)。產(chǎn)業(yè)化前景十分明確。具體實施例方式本發(fā)明人通過多步簡單合成，并通過層析手段得到該能有效抑制HBVDNA復(fù)制活性的一個黃酮木脂素類活性化合物，又經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振波譜等綜合解析推導(dǎo)出其化學(xué)結(jié)構(gòu)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，式(1)化合物對H印G2.2.15細胞的生長無明顯抑制作用，而對H印G2.2.15細胞分泌的HBVDNA之復(fù)制具有顯著的抑制作用，提示該化合物具有用藥安全、抑制HBVDNA復(fù)制高效的特點。因此，根據(jù)本發(fā)明人的研究，發(fā)明人所設(shè)計并合成的式(1)所示之23位上苯甲?；〈乃w薊賓類黃酮木脂素化合物可以用于制備治療乙肝病毒感染性疾病的藥物和用于治療乙肝病毒感染性疾病。為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面分別用式(1)化合物的制備及其對H印G2.2.15細胞生長抑制作用以及對H印G2.2.15細胞分泌的HBVDNA復(fù)制之抑制作用試驗的結(jié)果，說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。實施例給出了式(1)化合物的部分合成、結(jié)構(gòu)鑒定、和活性數(shù)據(jù)。必須說明，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制，根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。實施例1式(1)化合物的制備1.1儀器與試劑紫外光譜用ShimadzuUV-240紫外分光光度計測定；核磁共振氫譜1H-NMR由INOVA型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(VARIANIN0VA-400MHz)測定(四甲基硅醚TMS為內(nèi)標)；電噴霧質(zhì)譜ESI-MS由BrukerEsquire3000+質(zhì)譜儀測定，柱層析用硅膠(100-200，200-300和300-400目)以及薄層層析用硅膠GF254(10-40目)均由青島海洋化工廠生產(chǎn)；所用試劑均為分析純，其中石油醚沸程為60-90°C；薄層制備層析(PTLC)用Merck公司的鋁箔硅膠板；柱色譜用葡聚糖凝膠S印hadexLH-20采用瑞典AmershamPharmaciaBiotechAB公司產(chǎn)品；反相硅膠RP-18采用日本FujiSilysiaChemical公司的Chromatorex產(chǎn)品；MCI為日本三菱化工公司產(chǎn)品，薄板(TLC)檢測用254nm和365nm的紫外燈；顯色劑用碘蒸氣、10%硫酸-乙醇以及磷鉬酸溶液。1.2化合物(1)的制備OOHOOCH3(1)在干燥的反應(yīng)瓶中加入1克水飛薊賓，0.49克苯甲酸和1.6克三苯基磷，用20毫升無水四氫呋喃溶解，加入1克偶氮二甲酸二乙酯，加完后于室溫攪拌10小時，減壓蒸餾除去溶劑，加入5毫升氯仿，過濾除去白色固體，母液經(jīng)200-300目硅膠反復(fù)柱層析，氯仿/甲醇101洗脫，經(jīng)凝膠柱層析純化，最終得淺黃色粉末0.76克，收率54%。(士)_苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)_2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯Rf(氯仿醋酸乙酯甲酸=5010.25):0.20；核磁共振氫譜1HNMR(400MHz，氘代氯仿，Sppm):3.85(s，3H，OCH3)，4.21(m,1H,H_23a)，4.28(m,1H,H-10)，4.52(m,2H,H_3，23b)，4.96(d,J=12.OHz,1H,H-2),5.02(d,J=8.OHz,1H,H-11),6.02(s,1H,H-6)，6·06(s,1H,H-8)，6·92-8.06(m,11H,Ar-H),11.20(s,1H,5-0H)；電噴霧質(zhì)譜ESI-MS:m/z585[M_H]+。實施例2式(1)化合物對H印G2.2.15細胞分泌的乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)復(fù)制的抑制作用2.1細胞培養(yǎng)將H印G2.2.15細胞培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清，100U/毫升青霉素和100U/毫升鏈霉素，100微克/毫升G418的DMEM培養(yǎng)基中，置37°C，5%C02，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.2采用MTT法測定式(1)化合物對H印G2.2.15細胞生長的抑制作用取對數(shù)生長期的H印G2.2.15細胞，用培養(yǎng)基將細胞稀釋成1XIO5個/毫升，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100微升，在37°C，5%CO2,100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后加入用培養(yǎng)基稀釋的化合物(1)，濃度分別為1000微克/毫升，200微克/毫升，40微克/毫升和8微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設(shè)三個復(fù)孔，置于37°C，5%CO2,100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)72小時后，每孔加入MTT試劑10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄去培養(yǎng)基，每孔加入DMS0200微升，用振蕩器振蕩20分鐘，在570nm波長下用酶標儀測定OD值。以只加培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔為對照孔。抑制率(％)=(對照孔OD值-實驗組OD值)/對照孔OD值X100%。實驗重復(fù)三次。2.3測定式(1)所示之黃酮木脂素化合物對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)復(fù)制的抑制作用取對數(shù)生長期的H印G2.2.15細胞，用培養(yǎng)基將細胞稀釋成1XIO5個/毫升，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100微升，在37°C，5%CO2,100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后加入用培養(yǎng)基稀釋的式(1)所示之黃酮木脂素化合物，濃度分別為100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升，每孔200微升，每個濃度設(shè)三個復(fù)孔，置于37°C，5%C02，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4天換含相同濃度樣品的培養(yǎng)基，將同一樣品同一濃度的換出的培養(yǎng)基等體積混勻，作為待測樣品。第8天時用HBVDNA定量PCR試劑盒測定培養(yǎng)基中HBVDNA濃度。以拉米呋啶(3-TC)為陽性對照1(注拉米呋啶測試濃度為100微克/毫升，20微克/毫升和4微克/毫升)，以α-干擾素為陽性對照2(注α-干擾素測試濃度為10000單位/毫升，5000單位/毫升和1000單位/毫升)。2.4實驗結(jié)果實驗結(jié)果舉例說明如表1所示，制備出的黃酮木脂素式(1)化合物具有強效的抑制乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸復(fù)制的作用。表1樣品第8天時對H印G2.2.15細胞的HBVDNA復(fù)制的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>該實施例結(jié)果說明式(1)所示之黃酮木脂素化合物對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)的復(fù)制具有比較強的抑制作用，其在高劑量(100微克/毫升)時對HBVDNA的復(fù)制抑制活性比α-干擾素在最高濃度10000單位/毫升濃度時的抑制活性高出將近兩倍，在中等劑量(20微克/毫升)時對HBVDNA的復(fù)制抑制便超過50%；因此該化合物屬于有效的非核苷類抑制乙肝病毒天然產(chǎn)物，值得進一步關(guān)注和深入研究，并可預(yù)期進一步優(yōu)化發(fā)展為抑制HBVDNA復(fù)制的藥物。在上述說明書闡述本發(fā)明時，同時提供了實施例的目的是舉例說明本發(fā)明的實際操作過程和本發(fā)明的意義。在進入本發(fā)明權(quán)利要求和其等同物范圍內(nèi)時，本發(fā)明的實際應(yīng)用包括所有一般變化、配合，或改進。權(quán)利要求具有式(1)所示結(jié)構(gòu)的苯甲?；〈乃w薊賓酯或其可藥用鹽用于制備治療乙型病毒性肝炎藥物之用途；式(1)化合物的名稱為(±)-苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯。FSA00000134372200011.tif2.具有式(1)所示結(jié)構(gòu)的苯甲?；〈乃w薊賓酯或其可藥用鹽用于制備抑制乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸HBVDNA復(fù)制藥物之用途；<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式(1)化合物的名稱為(士)_苯甲酸[3_(4_羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3_二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯。全文摘要本發(fā)明涉及苯甲酰取代水飛薊賓用于制備治療病毒性乙肝藥物的用途，具體而言，本發(fā)明涉及一個苯甲酰基取代的水飛薊賓酯型黃酮木脂素或其可藥用鹽用于制備抑制HBVDNA復(fù)制、治療乙型肝炎病毒感染疾病的藥物的用途，該黃酮木脂素具有確切抑制乙肝病毒HBVDNA活性，其在高劑量(100微克/毫升)時對乙肝病毒HBVDNA復(fù)制抑制活性比α-干擾素在最高濃度10000單位/毫升濃度時的抑制活性高出近兩倍，屬于強效的非核苷類抑制乙肝病毒天然產(chǎn)物，以上藥效學(xué)結(jié)果表明該黃酮木脂素或其可藥用鹽可預(yù)期用于制備抑制HBVDNA復(fù)制、治療乙型肝炎病毒感染疾病藥物的用途。文檔編號A61P31/20GK101829105SQ20101018190公開日2010年9月15日申請日期2010年5月25日優(yōu)先權(quán)日2010年5月25日發(fā)明者巫秀美,張成桂,徐秀全,王曉雨,羅爾夫·希爾根菲爾德,譚仁祥,賴泳,趙昱申請人:大理學(xué)院