專利名稱：：一種增強原花青素生物活性的分子修飾方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種對天然植物多酚進行分子修飾的方法以落葉松或其它松屬樹皮提取分離的原花青素為原料，通過對其分子中的羥基沒食子?；铣蓻]食子?；ㄇ嗨?，從而實現(xiàn)增強原花青素抗氧化及清除自由基生物活性。
背景技術：
：原花色素(proanthocyanidins)是植物體內生成的一大類天然多酚，原花青素(procyanidins)是其中分布最廣、數量最多的一種。1951年法國JacquesMasquelier首次發(fā)現(xiàn)原花青素具有抗氧化性能，并成功地從海岸松樹皮中提取得原花青素。1967年美國Joslyn等、1976年Bombardelli等又相繼發(fā)現(xiàn)了從葡萄籽、皮中提取分離原花青素的方法，擴展了原花青素的資源。從上世紀80年代以來，國外對于原花青素的資源開發(fā)、提取分離方法、結構鑒定及其生物活性、藥用功能等進行了大量研究，已有多種產品問世，例如從海岸松和其它松屬樹皮中提取的原花青素(商品名Pycnogenol，中文名為碧蘿芷)，從葡萄籽、皮提取的原花青素(商品名Gr即enol)等。眾多研究已闡明，原花色素植物多酚具有抗氧化活性是基于多酚具有還原性，酚羥基作為H供體有捕獲、鈍化自由基的功能，以及多酚羥基能絡合對自由基反應起催化作用的金屬離子(鐵，銅等)、從而抑制自由基鏈式反應的擴展。人們早已知悉食用油脂和富脂食品的氧化變質是由氧自由基引發(fā)。此外，現(xiàn)代醫(yī)學方法證明，人體新陳代謝產生的自由基副產物以及通過外界輻射等途徑引發(fā)自由基可對人體脂質、蛋白質、核酸、生物膜等生物大分子造成損傷，從而引發(fā)多種疾病，如心腦血管病、癌變、衰老、炎癥等。為此，國內外倍加重視原花青素作為一類具有抗氧化清除自由基作用的天然藥物和保健品的開發(fā)研究。我國從上世紀80年代起已加入世界研究原花色素的行列，但總體上仍處于植物化學研究階段。近十幾年來，國內在原花青素的提取和純化工藝及其功能研究有很大進展，已有廠家生產葡萄籽、皮和馬尾松樹皮的提取物，作為天然抗氧化劑進入市場。縱觀國內外迄今關于原花青素的研究報道，以往研究只著眼于其本身固有的功能效應，如作為一種抗氧化及自由基清除劑，在保健品、醫(yī)藥、食品、化妝品中得到多方面應用。但是，對通過分子結構修飾以增強生物活性的研究并未予以關注。
發(fā)明內容為了解決現(xiàn)有技術主要集中在提取分離及藥用研究上，本發(fā)明提供一種增強原花青素生物活性的分子修飾方法，通過?；磻谠ㄇ嗨胤肿又辛u基的位置上引入一種多酚羧酸——沒食子酸(3，4，5-三羥基苯甲酸)，合成沒食子酰化原花青素，從而使其抗氧化、清除自由基活性得到增強。本發(fā)明的方案為一種增強原花青素生物活性的分子修飾方法，步驟為第一步，合成三乙?；鶝]食子酰化原花青素按原花青素與3，4，5-三乙?；鶝]食子酰氯物質的量比為l:51:7(mol:mol)，將原花青素與3，4，5-三乙?；鶝]食子酰氯在溶劑中催化劑存在下于50IO(TC下進行?；磻磻Y束后減壓蒸餾去除溶劑和過量催化劑，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓去除乙酸乙酯，干燥，得到中間產物三乙?；鶝]食子?；ㄇ嗨?；所述的原花青素為從落葉松或其它松屬樹皮提取分離得到的原花青素。所述的催化劑為吡啶，用量為三乙?；鶝]食子酰氯的物質的量(mol)的1.01.5倍，吡啶屬弱堿性有利于防止沒食子?；ユI被破壞。所述的溶劑為1，4-二氧六環(huán)，1，4-二氧六環(huán)對原花青素和酰氯的溶解性好，可以實現(xiàn)均相反應；而且沸點也比較合適。第二步，脫除乙酰保護基向第一步反應得到的三乙?；鶝]食子酰化原花青素丙酮溶液中加堿溶液，控制溶液pH值在7.58.5，在05。C下脫除乙酰基，然后，調節(jié)溶液pH值在24;所述的堿溶液為0.050.lmol/L的NaOH或K0H。所述的酸可以使用0.lmol/L的HC1或硫酸、硝酸等酸來調節(jié)pH。第三步，純化處理將第二步脫除乙酰保護基后的溶液，蒸除丙酮得固體產物，將固體產物溶于乙酸乙酯、水洗，蒸除乙酸乙酯即得到目標產物沒食子?；ㄇ嗨亍１景l(fā)明方法的可行性依據是(1)已往的研究亦已闡明，植物多酚的抗氧化性、清除自由基活性的強弱取決于其分子中酚羥基的數量及酚羥基的位置。鄰酚羥基多則活性強，分子結構中含有沒食子?；茉鰪娖浠钚浴１景l(fā)明基于上述已得到驗證的結論，目標產物沒食子?；ㄇ嗨睾驮瓚B(tài)原花青素生物活性功能比較試驗亦證實了本發(fā)明方法獲得預期效果。(2)基于原花青素分子結構特點，有引入沒食子?；目赡?，本發(fā)明采用從落葉松樹皮提取并純制得原花青素作為試料，原花青素的化學結構式如下OH這是一種以黃烷-3-醇為結構單元的聚合物，其A環(huán)和B環(huán)中的酚羥基以及C環(huán)的醇羥基都具有反應活性，可以在一定反應條件下與沒食子酰氯反應，從而引入沒食子酰基。為了避免沒食子?；姆恿u基在反應過程中遭受破壞，采取了先將其進行乙?；Ｗo，在?；磻笤倜撊ヒ阴；?，恢復酚羥基原態(tài)的方法。其效果是①將原先對功能活性無貢獻的C環(huán)C3位的醇羥基通過沒食子?；蛊渚哂泄δ苄浴＂谕ㄟ^酚羥基的沒食子?；院挠靡粋€酚羥基的代價獲得增加三個鄰酚羥基的功能效益。本發(fā)明提供一種通過?；磻霙]食子?；?，對原花青素分子結構進行修飾以增強其生物活性的方法，合成具有更強抗氧化與清除自由基功能的沒食子?；ㄇ嗨?。本發(fā)明采用的技術方案如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>式中w——羥基的乙酰保護基，m—;i<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>上式表示的原花青素分子中所有羥基全部沒食子酰化只是一種理想狀態(tài)。由于這些羥基的反應活性有所區(qū)別，特別是由于空間位阻的影響，實際上這種理想狀態(tài)不可能實現(xiàn)。本發(fā)明采用適宜的催化劑和強化反應條件，通過分子修飾使目標產物中有盡可能多的沒食子?；瑫r通過分析試驗測定其沒食子?；潭?。將目標產物和原態(tài)原花青素進行生物活性功能比較試驗對不飽和油脂的抗氧化性能比較、金屬離子的絡合性能比較和對DPra自由基的清除能力比較測定，驗證本發(fā)明方法獲得預期效果。有益效果(1)本發(fā)明提出的對原花青素分子進行化學修飾，合成沒食子?；ㄇ嗨兀栽鰪娖淇寡趸?、清除自由基生物活性的方法，尚未見有國內外報道，擴展了我國原花青素研究領域，填補研究空白。(2)本發(fā)明采用的原花青素取自落葉松或其它松屬樹皮，在我國有豐富的資源。本發(fā)明將有助于這種天然資源的高效利用，也可為我國開發(fā)自主創(chuàng)新的植物源高效抗氧化及自由基清除劑新品種提供技術基礎。(3)本發(fā)明方法可為其它種類植物多酚增強生物活性，提供可以借鑒的分子修飾方法。圖1落葉松原花青素(原態(tài))紅外譜圖。圖2三乙?；鶝]食子?；ㄇ嗨?中間產物)紅外譜圖。圖3沒食子?；ㄇ嗨丶t外譜圖(目標產物)紅外譜圖。從3個圖譜比較可以看出，沒食子?；磻螅?650cm—11750cm—1范圍內出現(xiàn)屬于羰基的C=O伸縮振動吸收峰，表明部分羥基產生?；磻D3為中間產物脫除乙酰保護基后得到的目標產物，可見C二O伸縮振動吸收峰依然存在，表明在脫除乙酰保護基時沒食子?；ユI未遭受破壞。又由于在產物水解液中實測得沒食子酸，從而證明目標產物確為預期的沒食子?；ㄇ嗨亍＞唧w實施方式實施例1:—種增強原花青素生物活性的分子修飾方法，步驟為(1)所采用的原料是從落葉松或其它松屬樹皮提取分離得到的聚原花青素，可以采用自制也可以購買市售的產品。(2)原花青素分子化學修飾的方法是首先將其與3，4，5-三乙酰基沒食子酰氯在一定的溶劑中和一定催化劑和溫度作用下反應，生成中間產物三乙酰基沒食子?；ㄇ嗨?；將該中間產物在一定條件用稀堿液脫去乙酰基以恢復酚羥基原態(tài)，再經過后處理，獲得目標產物沒食子?；ㄇ嗨亍ｕ；磻捎玫娜軇?，4_二氧六環(huán)，催化劑為吡啶，反應溫度可以是5010(TC，原花青素、三乙?；鶝]食子酰氯投料量按物質的量比可以為1:51:7，反應時間可以為48h，吡啶的用量可以為三乙?；鶝]食子酰氯的1.01.5倍(按摩爾計)。將三乙?；鶝]食子酰化原花青素溶于丙酮，加適量水稀釋，用0.050.lmol/L的NaOH，在05t:下脫除乙酰基，使用堿液量以控制溶液pH值在7.58.5不變?yōu)橄薅龋笥?.lmol/L的HC1調節(jié)pH，使產物溶液pH值為24。脫除乙?；?，蒸出丙酮得固體產物；將固體產物溶于乙酸乙酯，充分水洗，分層，蒸出乙酸乙酯即得目標產物沒食子?；ㄇ嗨?。實施例2:(1)將經凈化、風干和粉碎的落葉松樹皮用水浸提，得到提取物水溶液。冷至室溫后分出清液；除去其中的樹脂，樹膠等雜質，再用乙酸乙酯進行萃取后，蒸出乙酸乙酯，冷凍干燥，得到落葉松原花青素。(2)稱取10.85g實驗室制備的三乙?；鶝]食子酰氯，溶于50mL的1，4_二氧六環(huán)，全部溶解后，加入2.0g落葉松原花青素，加入3.5mL吡啶催化劑，在10(TC下反應6h。減壓蒸去1，4-二氧六環(huán)溶劑和過量的吡啶。實驗室制備三乙酰基沒食子酰氯是以沒食子酸為原料，先用醋酐/吡啶法制成三乙?；鶝]食子酸，然后在四氯化碳中與PC15反應制成三乙?；鶝]食子酰氯。具體制法可以參考2005年02期林產化學與工業(yè)上發(fā)表的《多酚羧酸合成功能高分子材料研究(I)——沒食子酸與纖維素的酯化合成及產物功能特性試驗》(3)上述產物用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，減壓蒸出乙酸乙酯，干燥，獲得落葉松原花青素沒食子酰化中間產物10.25g。(4)取1.0g落葉松原花青素沒食子?；虚g產物，用10%的NaOH溶液20mL在氮氣保護下完全水解。以標準沒食子酸為對照樣，用HPLC法測定水解液中沒食子酸含量，計算得到沒食子?；潭葹?1%。(5)取lg中間產物，溶于20mL丙酮，在水浴中冷至0t:，在攪拌下于15min內滴入90mL0.lmol/L的NaOH，加入10mL水稀釋。在(TC下靜置3h，測pH值為8，不再變化。用0.lmol/LHC1酸化至pH為3，減壓蒸出丙酮。(6)產物呈固體析出，過濾，使溶于乙酸乙酯，酯層用水洗滌，減壓蒸出乙酸乙酯后獲得目標產物沒食子?；ㄇ嗨?.43g。實施例3:(1)實施例2中制備得到落葉松原花青素為原料。稱取15.7g實驗室制備的三乙?；鶝]食子酰氯，溶于60mL1，4-二氧六環(huán)，加入2.0g落葉松原花青素溶解，加入4.7mL吡啶催化劑，在8(TC下反應8h。(2)減壓蒸去1，4-二氧六環(huán)溶劑和過量的吡啶。溶液加入乙酸乙酯萃取，合并萃取液，減壓蒸出乙酸乙酯，干燥，獲得落葉松原花青素沒食子酰化中間產物11.9g。(3)取1.0g落葉松原花青素沒食子?；虚g產物，用10%的NaOH溶液20mL在氮氣保護下完全水解，以標準沒食子酸為對照樣，用HPLC法測定水解液中沒食子酸含量，計算得到沒食子?；潭葹?5%。(4)取lg反應得到的中間產物，先溶于20mL丙酮，在冰水浴中冷至(TC，一邊攪拌一邊滴加0.lmol/L的NaOH100mL，在15min內滴加完畢，然后加入10mL水稀釋。(5)在(TC下靜置3h，測pH值為8，不再變化。用0.lmol/LHCl酸化至pH為3，減壓蒸出丙酮。(6)產物呈固體析出，過濾，使溶于乙酸乙酯，酯層用水洗滌，減壓蒸出乙酸乙酯后獲得目標產物沒食子?；ㄇ嗨?.49g。實施例4:(1)稱取13.0g實驗室制備的三乙酰基沒食子酰氯，溶于17mL的1，4_二氧六環(huán)，微加熱使全部溶解后，加入2.0g從馬尾松樹皮提取的原花青素和4mL妣啶催化劑，在IO(TC下加熱回流反應4h。冷卻后，減壓蒸去1，4-二氧六環(huán)溶劑和過量的吡啶。(2)殘余物中加水攪拌，于冰箱冷藏室中冷卻lh后用布氏漏斗抽濾，并用大量水反復洗滌后得到松散固體，冷凍干燥，即得馬尾松原花青素沒食子?；虚g產物11.4g。(3)取2.0g中間產物，用8%的NaOH溶液25mL在氮氣保護下完全水解。以標準沒食子酸為對照樣，用HPLC法測定水解液中沒食子酸含量，計算得到沒食子?；潭葹?4%。(4)取lg中間產物，溶于20mL丙酮，加入30mL0.lmol/L的NaOH，10mL水，放置10h，測定pH為6，繼續(xù)加入0.lmol/L的NaOH50mL，使pH值為8，過濾，濾液用0.lmol/LHCl酸化至pH為3。減壓蒸出丙酮。(5)產物呈固體析出，過濾，使溶于乙酸乙酯，酯層用水洗滌，減壓蒸出乙酸乙酯后獲得目標產物沒食子?；ㄇ嗨?.43g。本發(fā)明中沒食子?；ㄇ嗨氐目寡趸钚酝ㄟ^試驗獲得驗證對不飽和油脂的抗氧化作用，絡合金屬離子的能力，對DPPH自由基的清除能力都得到增強。實施例5:本發(fā)明中沒食子酰化原花青素和原花青素對不飽和油脂的抗氧化性能比較測定為了考察落葉松原花青素沒食子?；院蟮玫降漠a物抗氧化能力是否有所增加，采用Schaal烘箱法分別測定原花青素和沒食子?；ㄇ嗨貙χ参镉椭瑹嵫趸囊种颇芰?。按lkg底物油加入0.4g抗氧化劑的比例計算所需加入試樣量。以市售植物調和油經過實驗室處理后作為底物試驗用油樣。7(1)稱取試驗用油樣30.0g(準確至±0.lg)，于潔凈的250mL三角瓶中；(2)分別準確稱取0.0120g的自制的落葉松原花青素、沒食子?；ㄇ嗨兀谷苡?.5mL95%乙醇和3.5mL蒸餾水。(3)將稱取好的試驗用油樣加熱至6(TC，在攪拌的情況下分別加入上述準備的樣品，充分混合，然后超聲乳化使成乳液；(4)將配置好的試料移入烘箱中，控制烘箱內溫度63±rC;(5)每隔24h取樣分析測定其過氧化值P0V(meq/kg)。過氧化值測定過程按GB5009.37-2003中4.2.2節(jié)比色法進行，過氧化值的含量按以下公式計算結果wx^x55.84x2式中X——試樣中過氧化值的含量，meq/kg;c——由標準曲線上查得試樣中的鐵的質量，g;c。——由標準曲線上查得零管鐵的質量，Pg;Vi——試樣稀釋總體積，mL;V2——測定時取樣體積，mL;m——試樣質量，g;55.84-Fe的原子量；2——換算因子。結果如下表1.不同時間下的過氧化值表過氧化值，meq/kg時間，h024487296120原花青素+試驗油樣一2.7266.02213.42820.55024.441沒食子?；ㄇ嗨?試驗油樣一1.2472.204'7.3279.99215.901經測定計算實驗室處理過的底物試驗油樣的基礎過氧化值為0.337，從結果數據可見，與落葉松原花青素相比，經過沒食子酰化改性以后得到的沒食子?；ㄇ嗨貙Σ伙柡陀椭目寡趸饔玫玫皆鰪姟嵤├?:本發(fā)明中沒食子?；ㄇ嗨睾驮ㄇ嗨貙饘匐x子的絡合性能比較測定利用原花青素能與Fe2+離子生成有色絡合物的特性，在波長578nm處有特征吸收峰，其吸光度與絡合物的濃度成正比。利用絡合濃度的差別來比較沒食子?；昂蟮脑ㄇ嗨鼗钚圆顒e。稱取實施例2中制備的沒食子?；ㄇ嗨卦嚇?.2062g(精確至0.lmg)，溶于200mL蒸餾水中，其濃度為0.1031g/mL;原花青素試樣O.2024g(精確至0.lmg)，溶于200mL蒸餾水中，其濃度為0.1012g/mL;稱取O.3684g(精確至0.lmg)FeCl241120，溶于lOOmL蒸餾水中，F(xiàn)e2+濃度為1.62mg/mL。在5mL的原花青素溶液和沒食子?；ㄇ嗨厝芤褐校謩e加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.OmL的Fe2+溶液，再分別用蒸餾水定容至10mL，用分光光度計在578nm處(1cm比色皿)分別測定吸光度，當Fe2+溶液加入量增加至吸光度保持恒定時，表明試樣溶液對Fe2+離子的絡合已經飽和。記錄此時加入的Fe"離子用量。由此分別計算兩種溶液對Fe2+離子的絡合能力，得到原花青素溶液對Fe2+離子的飽和絡合能力為0.973mg/mg，沒食子?；ㄇ嗨氐哪芰?.416mg/mg。結果數據表明，沒食子?；ㄇ嗨貙饘匐x子的絡合能力得到增強。實施例7:本發(fā)明中沒食子?；ㄇ嗨睾驮ㄇ嗨貙ψ杂苫那宄芰Ρ容^測定以二苯基-苦基-肼基自由基(DPPH，美國Sigma公司)為標準物，用分光光度法分別測定本發(fā)明中目標產物沒食子酰化原花青素和原花青素對DPra清除率并作比較。配制工作溶液DPra的乙醇溶液，濃度為0.025mg/mL;落葉松提取原花青素試樣的乙醇溶液，濃度為0.05mg/mL;目標產物沒食子?；ㄇ嗨卦嚇拥囊掖既芤?，濃度為0.05mg/mL。分光光度計測定(A=517nm;lcm比色皿)DPPH溶液原始吸光度DPPH溶液5mL加乙醇lmL，吸光度為0.441。加入目標產物試樣的DPra溶液的吸光度變化情況DPra溶液5mL加入目標產物試樣溶液，然后用乙醇定容至6mL，混合后即開始測定吸光度，隨后每間隔lmin測定1次，吸光度持續(xù)下降，當吸光值持續(xù)下降至恒定不變時，記錄達到吸光值恒定時需要的時間(TS)和吸光值(As)。按上述同樣方法對落葉松提取原花青素試樣進行對比試驗。按下面公式計算清除效率SE(%)和清除速率SR/g(mgmin)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>式中A。_不加清除劑的DPra溶液的吸光值；m「試液中DPffl的質量，g;m2_試液中清除劑的質量，mg;TS-達到吸光值恒定時需要的時間，min。測定結果見表2:表2清除DPra自由基的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從結果可以看出，在加入相同用量試樣的DPra溶液中，加入沒食子?；ㄇ嗨卦嚇游舛认陆抵梁愣ㄖ档臅r間比加入原花青素的試樣用時少，通過計算得到的DPra清除率和清除速率也可以看出目標產物沒食子?；ㄇ嗨氐那宄杂苫芰Φ玫皆鰪?。權利要求一種增強原花青素生物活性的分子修飾方法，其特征在于，步驟為第一步，合成三乙?；鶝]食子酰化原花青素按原花青素與3，4，5-三乙?；鶝]食子酰氯物質的量比為1∶5～1∶7(mol∶mol)，將原花青素與3，4，5-三乙?；鶝]食子酰氯溶于溶劑，在催化劑存在下于50～100℃下進行?；磻?，反應結束后減壓蒸餾去除溶劑和過量催化劑，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓去除乙酸乙酯，干燥，得到三乙?；鶝]食子?；ㄇ嗨?；第二步，脫除乙酰保護基向第一步反應得到的三乙?；鶝]食子?；ㄇ嗨乇芤褐屑訅A溶液控制溶液pH值在7.5～8.5，在0～5℃下脫除乙酰基，然后，調節(jié)溶液pH值在2～4；第三步，純化處理得到沒食子?；ㄇ嗨貙⒌诙矫摮阴１Ｗo基后的溶液，蒸除丙酮得固體產物，將固體產物溶于乙酸乙酯、水洗，蒸除乙酸乙酯即得到沒食子?；ㄇ嗨?。2.如權利要求1所述的增強原花青素生物活性的分子修飾方法，其特征在于，所述的原花青素為從落葉松以及其它松屬樹皮提取分離得到的原花青素。3.如權利要求1所述的增強原花青素生物活性的分子修飾方法，其特征在于，所述的催化劑為吡啶，用量為三乙?；鶝]食子酰氯的物質的量(mol)的1.01.5倍。4.如權利要求1所述的增強原花青素生物活性的分子修飾方法，其特征在于，第一步中所述的溶劑為1，4-二氧六環(huán)。5.如權利要求1所述的增強原花青素生物活性的分子修飾方法，其特征在于，所述的堿溶液為0.050.lmol/L的NaOH或KOH。全文摘要本發(fā)明涉及一種增強原花青素生物活性的分子修飾方法，以落葉松或其它松屬樹皮提取的原花青素為原料，通過酰化反應對其分子進行修飾，在其分子中原有的羥基位置引入沒食子?；栽黾臃肿又朽彿恿u基的數量和密度，合成目標產物沒食子酰化原花青素，實現(xiàn)增強生物活性。其特征是以1，4-二氧六環(huán)為溶劑，吡啶為催化劑，在一定溫度下使原花青素與3，4，5-三乙?；鶝]食子酰氯反應，制得中間產物，而后脫去三乙?；?，經過后處理獲得目標產物沒食子?；ㄇ嗨?。文檔編號A61K31/352GK101747308SQ20091026483公開日2010年6月23日申請日期2009年12月24日優(yōu)先權日2009年12月24日發(fā)明者吳冬梅,吳在嵩,張亮亮,徐曼,汪詠梅,陳笳鴻申請人:中國林業(yè)科學研究院林產化學工業(yè)研究所