專(zhuān)利名稱(chēng)：苊并雜環(huán)類(lèi)化合物、其環(huán)糊精包合物、配結(jié)物及其在制備Bcl-2家族蛋白抑制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類(lèi)新的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物以及利用納米技術(shù)制備的這類(lèi)化合物的 環(huán)糊精包合物或者配結(jié)物；并涉及這些化合物在體內(nèi)、體外的模擬BH3-0nly蛋白，競(jìng)爭(zhēng)性 結(jié)合和拮抗Bcl-2，Bcl-xL和Mcl-I蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用和作為抗癌化合物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
分子靶向抗腫瘤藥物正在成為繼細(xì)胞毒劑類(lèi)抗腫瘤藥物之后，新藥研發(fā)的熱點(diǎn)和 市場(chǎng)化的新生代產(chǎn)品。Bcl-2蛋白，是拮抗和逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤永生性的最重要的分子靶點(diǎn)。所 以，特異性拮抗Bcl-2蛋白的藥物，將通過(guò)專(zhuān)一誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，終于實(shí)現(xiàn)高選擇性、安 全、高效、低痛苦抗癌的目標(biāo)。在Bcl-2抑制劑中，以BH3類(lèi)似物(BH3mimetiCS)的抗腫瘤 效果最為顯著，藥效學(xué)活性最好，毒副作用最低。此外，也必須同時(shí)具備廣譜拮抗Bcl-2家 族蛋白的抗凋亡成員(包括Bcl-2，Bcl-XL和Mcl-I蛋白)的能力。但到目前為止，以Bcl-2為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物尚無(wú)上市產(chǎn)品，僅有的19個(gè)臨床前 Bcl-2抑制劑中，有三個(gè)效果最優(yōu)的分別處于臨床I，II，III期。分別是由美國(guó)伊利諾州 阿伯特實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的ABT-737，Gemin X公司研發(fā)的Obatoclax (GX15-070)，和美國(guó)Ascenta 公司的AT-101。它們都是BH3類(lèi)似物，與Bcl-2蛋白的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合常數(shù)達(dá)到nM級(jí)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 其它15個(gè)同類(lèi)分子。但是它們都存在不足G0SSyp0l，Obatoclax的BH3類(lèi)似程度不足，不 是絕對(duì)的BH3類(lèi)似物，也就是具有不依賴(lài)BAX/BAK的細(xì)胞毒性，說(shuō)明存在其他的作用靶點(diǎn)， 因此具有毒副作用。Obatoclax正因此面臨淘汰。ABT-737雖然是絕對(duì)的BH3類(lèi)似物，但是 不能與Mcl-I作用，不能廣譜抑制Bcl-2家族蛋白，因而嚴(yán)重限制了其使用范圍。本發(fā)明人既往研究的成果中公開(kāi)了一系列8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈的 苊并雜環(huán)類(lèi)化合物，并且這類(lèi)化合物具有通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制腫瘤生長(zhǎng)的活性(中國(guó)專(zhuān) 利，授權(quán)公告號(hào)CN1304370C)。然而，作為潛在的以凋亡為基礎(chǔ)的抗腫瘤藥物，其開(kāi)發(fā)同樣面 對(duì)此類(lèi)藥物開(kāi)發(fā)的難點(diǎn)凋亡信號(hào)通路復(fù)雜及潛在的強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性及其所必然導(dǎo)致的用 藥的盲目性，而這是導(dǎo)致該類(lèi)藥物的開(kāi)發(fā)失敗的重要原因。因此，研究中需要突出強(qiáng)調(diào)藥 物作用的靶向性。另一方面，藥物的理化性狀是影響藥效發(fā)揮的重要原因，也可能影響藥物開(kāi)發(fā)過(guò) 程中對(duì)藥效的準(zhǔn)確評(píng)估。本發(fā)明的前期研究中就注意到此類(lèi)問(wèn)題。既往研究中的這些化合 物的水溶性較差，嚴(yán)重的限制其研究和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在獲得靶向性更強(qiáng)的可作為BH3類(lèi)似物類(lèi)Bcl-2家族蛋白(包括Bcl_2， Bcl-xL和Mcl-I蛋白)抑制劑的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物；并進(jìn)而在此基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代納米技 術(shù)通過(guò)環(huán)糊精包合或者配結(jié)的手段，改善化合物的水溶性，提高生物利用度，以充分地開(kāi)發(fā)此類(lèi)化合物在作為靶向性抗腫瘤制劑方面的用途。本發(fā)明所述的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物具有如下的分子結(jié)構(gòu)通式 其中(I)R1 = XR5、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基或硫嗎啉基，R2 = H，R3 = H，R4 = CN、C00H、 COOR6 或 CONHR7 ；(II)R1 = H, R2 = XR5、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基或硫嗎啉基，R3 = H, R4 = CN, COOH, COOR6 或 CONHR7 ；(III)R1 = H，R2 = H，R3 = H、XR5、四氫吡喃_4_氧基、四氫噻喃_4_氧基、噻吩甲 氧基、噻吩甲氨基或硫嗎啉基，R4 = CN ；(IV) R1 = XR5, R2 = H, R3 = XR5, R4 = CN ；其中X = 0、S、羰基、酯基或酰胺；R5 = a、(CH2)nAr-(ο, m, ρ) Y，Y = CH3> NO2, Ph、F、Cl、Br、CF3> OCH3> SCH3 或 NH2 ；η =0 4 ；B、四氫吡喃基或四氫噻喃基；R6 = CH3 或 C2H5 ；R7 = CH3、C2H5 或 Ar。上述的取代基R1、! 2、R3和R4分別是8-氧-8Η-苊并[l，2_b]吡咯母核雜環(huán)上3、 4、6、9位的取代基。本發(fā)明的化合物合成主要分為兩種途徑。第一種合成途徑是以具有很好的剛性共平面性并且強(qiáng)缺電子的8-氧-8H-苊并 [1，2-b]吡咯-9-腈為原料，與親核試劑醇、硫醇或酚、硫酚類(lèi)發(fā)生芳香氫親核取代反應(yīng)，得 到3-取代，4取代或6-取代的8-氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯_9_腈，腈基再經(jīng)過(guò)水解，酯
化，酰胺化得到相應(yīng)的酸，酯，酰胺，反應(yīng)式如下 8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈在溶劑(四氫呋喃，乙腈，吡唳，二甲基甲酰胺 或二甲基亞砜)中，與適量的醇，硫醇，酚，硫酚類(lèi)親核試劑反應(yīng)，溫度為20 100°C，反應(yīng)時(shí) 間0. 5 24小時(shí)。冷卻后減壓蒸出部分溶劑后，過(guò)濾或直接柱層析即可得產(chǎn)品3或6-單 取代氧基-8-氧代-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈。3或6-單取代氧基-8-氧代-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈在濃硫酸的條件下水解 可以得到其對(duì)應(yīng)的酸類(lèi)，在與相應(yīng)的醇或者胺反應(yīng)即可得到相應(yīng)的酯類(lèi)及酰胺類(lèi)化合物。第二種合成途徑是以苊醌為原料，以濃硫酸作溶劑，加入液溴回流2小時(shí)，得到溴 代苊醌。先用溴代苊醌與醇，硫醇，酚，硫酚反應(yīng)得到相應(yīng)的取代苊醌。取代苊醌與乙腈在 硅膠弱酸性催化的條件下反應(yīng)得到3- (2-氧代_2氫-苊)-丙二腈之后，在K2CO3催化，乙 腈回流0. 5 6小時(shí)冷卻后減壓蒸除部分溶劑后，過(guò)濾或直接柱層析即可制得相應(yīng)的3或 4_單取代氧基-8-氧代-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈。之后的水解，酯化，酰胺化條件同 第一條合成路徑。第二條合成路徑不同于第一條的條件在于先取代，后成環(huán)，這樣可以得到3，4位 兩種同分異構(gòu)體而不是以前的3，6位。反應(yīng)式如下
以及它們對(duì)Mcl-I和Bcl-2的抑制作用。結(jié)果表明，本發(fā)明的上述苊并雜環(huán)類(lèi)化合物具有 極高的BH3類(lèi)似程度，可以有效抑制Mcl-I和Bcl-2蛋白?；诖?，該類(lèi)化合物可用于制備 BH3類(lèi)似物Bcl-2家族蛋白抑制劑，并進(jìn)一步用于制備靶向性高的抗腫瘤藥物。
研究中還發(fā)現(xiàn)，水溶性較差是本發(fā)明的上述苊并雜環(huán)類(lèi)化合物的突出問(wèn)題，嚴(yán)重 限制其研究及應(yīng)用。參考現(xiàn)代藥物制劑技術(shù)(環(huán)糊精化學(xué)——制備與應(yīng)用.化學(xué)工業(yè)出 版社，2009 ； β -環(huán)糊精包合技術(shù)及應(yīng)用·醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究，2006，3 (3) :31_33 ；Chem. Pharm. Bull，2006，54(1) 26-32)，本發(fā)明的另一項(xiàng)內(nèi)容在于利用環(huán)糊精包合或配結(jié)此類(lèi)化合物，形 成包合物或配結(jié)物，從而改善其水溶性，提高生物利用度。本發(fā)明所述的上述苊并雜環(huán)類(lèi)化合物的環(huán)糊精包合物是由下述方法制備①稱(chēng)取一定質(zhì)量的環(huán)糊精，加入水中，加熱攪拌使其成為飽和溶液，所述的環(huán)糊精 為β -環(huán)糊精、Y “環(huán)糊精、2-羥丙基-β -環(huán)糊精、甲基-β -環(huán)糊精或羥丙基_ Y _環(huán)糊精；②稱(chēng)取待包合的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物，該化合物與環(huán)糊精的摩爾比為1 3 10;③將待包合的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物以5 lOmg/mL的濃度溶于丙酮，將所得溶液以 線狀逐滴加入到環(huán)糊精的水溶液中，40 65°C，加熱攪拌1 6天，有沉淀析出；④將上述溶液過(guò)濾，用少量蒸溜水洗滌濾餅，再用少量的丙酮洗去游離狀態(tài)的化合 物，50 70°C真空干燥，24 48小時(shí)后得到權(quán)利要求1的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物的環(huán)糊精包合物。本發(fā)明所述的上述苊并雜環(huán)類(lèi)化合物的環(huán)糊精配結(jié)物是由下述方法制備①稱(chēng)取干燥的環(huán)糊精及待配結(jié)的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物，環(huán)糊精與該化合物的摩爾 比為1 1.5 3;所述的環(huán)糊精為β-環(huán)糊精、Y-環(huán)糊精、2-羥丙基-β-環(huán)糊精、甲 基-β -環(huán)糊精或羥丙基_ Y _環(huán)糊精；②將待配結(jié)的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物與N，N'-羰基二咪唑以1 1 2的摩爾比混合 后溶解到DMSO中，使待配結(jié)的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物在DMSO溶液中的濃度為0. 2 0. 5mmol/ mL，常溫?cái)嚢?0 60分鐘；③往上述DMSO溶液中加入步驟①所稱(chēng)取的環(huán)糊精及0. 1 0. 3mmol/mL的三乙醇 胺，常溫反應(yīng)18 24小時(shí)；④往步驟③的反應(yīng)體系中加入0. 50 1. Omg/mL的丙酮，減壓析出沉淀；⑤過(guò)濾，沉淀經(jīng)純化得權(quán)利要求1的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物的環(huán)糊精配結(jié)物。該純化可以采用離子交換柱進(jìn)行，條件為采用Diaion HP-20離子交換樹(shù)脂做吸 附劑，解析采用甲醇與水的混合溶劑。逐漸增大混合溶劑中甲醇的比例，淋洗過(guò)程用薄層色 譜檢測(cè)。當(dāng)洗脫劑中甲醇所占比例達(dá)到40 55%時(shí)配結(jié)物部分被淋洗得到。將所得淋洗 液中的甲醇減壓旋干之后，剩余溶液冷凍干燥得到配結(jié)物。本發(fā)明采用相溶解度法、熒光光譜法、圓二色譜法、紅外光譜法、熱重分析、掃描電鏡 和H核磁、質(zhì)譜以及X單晶衍射等表征手段對(duì)所得到的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物的環(huán)糊精包合物或 配結(jié)物進(jìn)行表征，并對(duì)比檢測(cè)了包合或配結(jié)前后苊并雜環(huán)類(lèi)化合物的溶解度以及對(duì)Mcl-I和 Bcl-2的抑制作用的對(duì)比，結(jié)果表明環(huán)糊精包合或配結(jié)的處理方法大大提高了苊并雜環(huán)類(lèi)化 合物在水中的溶解度，并且在一定程度上提高了抑制Bcl-2和Mcl-I蛋白的能力。該制劑也可 用于制備BH3類(lèi)似物類(lèi)Bcl-2家族蛋白抑制劑，并進(jìn)一步用于制備靶向性高的抗腫瘤藥物。因此，本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)上文所述的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物、該苊并雜環(huán)類(lèi)化 合物的環(huán)糊精包合物以及配結(jié)物在制備BH3類(lèi)似物Bcl-2家族蛋白抑制劑中的應(yīng)用。上述的Bcl-2家族蛋白抑制劑或相應(yīng)的抗腫瘤藥物可以是化合物的單質(zhì)制劑、化 合物的環(huán)糊精包合物或配結(jié)物制劑，或者是有效量的所述苊并雜環(huán)類(lèi)化合物或其環(huán)糊精包 合物、配結(jié)物與適量的藥用輔劑混合形成的組合物。并可以根據(jù)藥用需要，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的制劑方法將其制成需要的劑型。


本發(fā)明附圖14幅附圖1是熒光偏振方法檢測(cè)化合物與FAM-Bid肽段競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Bcl-2蛋白的動(dòng)力學(xué) 曲線；附圖2是化合物在細(xì)胞水平上干擾Bcl-2/Bax之間相互作用結(jié)果示圖(不同濃 度)；附圖3是化合物在細(xì)胞水平上干擾Bcl-2/Bax之間相互作用結(jié)果示圖(不同作用 時(shí)間)；附圖4是Bax蛋白與線粒體共定位檢測(cè)化合物的BH3類(lèi)似度陽(yáng)性結(jié)果示圖；附圖5是Bax蛋白與線粒體共定位檢測(cè)化合物的BH3類(lèi)似度陰性結(jié)果示圖；附圖6是化合物依賴(lài)BAX/BAK的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Gossypol為非特異性對(duì)照)；附圖7是化合物對(duì)Mcl-I抑制作用Western印記檢測(cè)電泳圖；附圖8是化合物對(duì)Bcl-2抑制作用Western印記檢測(cè)電泳圖；附圖9是化合物3-硫嗎啉8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯_9_腈抑制Mcl-I蛋白 作用半定量曲線；附圖10是化合物3-硫嗎啉8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯_9_腈抑制Bcl_2蛋白
作用半定量曲線；附圖11是比較苊并雜環(huán)類(lèi)化合物及其環(huán)糊精包合物和配結(jié)物對(duì)Mcl-I和Bcl-2 的抑制作用的Western印記檢測(cè)電泳圖；附圖12是3-硫嗎啉8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯_9_腈及其包合物對(duì)Mcl-I蛋 白抑制作用的半定量曲線；附圖13是3-硫嗎啉8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯_9_腈及其包合物對(duì)Bcl_2蛋 白抑制作用的半定量曲線；附圖14是實(shí)對(duì)比化合物和包和物在腫瘤模型動(dòng)物體內(nèi)對(duì)Mcl-I和Bcl-2的抑制 作用的Western印記檢測(cè)電泳圖，其中1、空白對(duì)照組；2、對(duì)照組①；3、對(duì)照組②，4、實(shí)驗(yàn)組 ①；5、實(shí)驗(yàn)組②；6、實(shí)驗(yàn)組③；7、實(shí)驗(yàn)組④。
具體實(shí)施例方式下面以具體實(shí)施例的方式對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的說(shuō)明。第一部分苊并雜環(huán)類(lèi)化合物制備及其表征實(shí)施例；實(shí)施例1 :8_氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯_9_腈的合成及表征在500mL單口燒瓶中，依次加入0. Imol苊醌，0. Ilmol丙二腈，150mL乙腈，加熱至 回流，反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)混合物由淡黃色渾濁變?yōu)槌燃t透明，冷至室溫后，過(guò)濾，收集橙紅色 濾餅，得到1-二氰基亞甲基-2-氧-苊。在500mL單口燒瓶中，依次加入1_ 二氰基亞甲 基-2-氧-苊0. 05mol,碳酸鉀lg，200mL乙腈，加熱至回流，反應(yīng)4小時(shí)，大量土黃色固體產(chǎn) 析出。過(guò)濾，收集濾餅。將濾餅用大量溫水洗滌后干燥，稱(chēng)重，產(chǎn)率95%。Μ. ρ· 275-277 0C ；1H NMR(400M, DMS0) δ 8. 705 (d，J = 8. OHz，1H)，8· 662 (d，J =8. 8Ηζ，1Η)，8· 631 (d，J = 8. 0Hz，1H)，8. 411 (d，J = 8. 0Ηζ，1Η)，8· 06 (t, J = 8. ΟΗζ,ΙΗ)，
7.984 (t，J = 8. OHz, 1Η)。實(shí)施例2 :3-(4_甲基苯氧基)-8_氧-8Η-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈的合成及表征50mL乙腈中加入Ig 8_氧-8H苊并[1，2_b]吡咯_9_腈，0. 47g對(duì)甲基苯酚，回 流攪拌3小時(shí)，蒸出部分溶劑，層析柱分離得產(chǎn)品3-(4_甲基苯氧基)-8_氧-8H-苊并[1， 2-b]吡咯-9-腈，收率40%。結(jié)構(gòu)測(cè)定:M.p. 232-233 °C ； 1HNMR(400M, CDC13) δ 8. 916 (dd, J = 8·8Ηζ，1Η)，
8.623 (d, J = 8. 8Hz, 1Η)，8· 447 (d, J = 6. 4Hz, 1Η)，7. 859 (t, J = 8. OHz, 1Η)，8· 324 (d, J = 8. 4Ηζ,2Η)，7. 101 (d, J = 8. 4Ηζ,2Η)，7. 016 (d, J = 8. 4Hz, 1Η)，3. 256 (s, 3Η)。實(shí)施例3 :3_苯氧基-8-氧-8Η-苊并[1，2_b]吡咯_9_腈(A)和4_苯氧 基-8-氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈⑶的合成及表征稱(chēng)取0. 93g 3-苯氧基苊醌，0. 3g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅膠柱中，快 速淋洗，過(guò)柱完畢之后旋干得紅色固體。稱(chēng)重10. lg，產(chǎn)率92%。取0.6g 3-苯氧基-(2-氧 代-2氫-苊)_丙二腈，加入0. 08g K2CO3, 20mL乙腈加熱回流3小時(shí)，反應(yīng)完畢之后旋干反 應(yīng)液。層析柱分離(CH2Cl2 石油醚=2 1)得到橙紅色固體，核磁檢驗(yàn)同分異構(gòu)體比例 1 0.3。利用制備液相分離的到兩種同分異構(gòu)體。第一組分A :M. ρ· 265-267 °C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 927 (d，J = 8. OHz，1H)， 8. 630 (d, J = 8. 8Hz, 1H)，8· 450 (d, J = 7. 2Hz, 1H)，7. 876 (t, J = 8. OHz, 1Η)，7. 754 (t, J = 8. 0Hz，2H)，7. 392 (t, J = 7. 6Hz, 1H)，7. 233 (d, J = 7. 6Hz,2H)，7. 028 (d, J = 8. 4Hz, 1H)。第二組分B :M. p. 282-283°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 9. 047 (dd, J = 8. OHz，1H)， 8. 850(dd, J = 7. 6Hz, 1H)，8· 213 (d，J = 8. 2Hz, 1Η)，7. 999 (t, J = 8. OHz, 1Η)，7. 561 (t，J = 8. 0Hz，2H)，7· 410 (t，J = 7. OHz, 1H)，7. 251 (d，J = 8. 8Hz，2H)，6. 899 (d，J = 8. 4Hz, 1H)。實(shí)施例4 :3_(對(duì)甲基苯氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈㈧和4_(對(duì) 甲基苯氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈(B)的合成及表征稱(chēng)取l.Og 3-對(duì)甲苯氧基苊醌，0.3g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅膠柱中， 快速淋洗，過(guò)柱完畢之后旋干得紅色固體。稱(chēng)重11. 2g，產(chǎn)率93%。取0.7g3-苯氧基-(2-氧代-2氫-苊)_丙二腈，加入0.08g K2CO3, 20mL乙腈加熱回流4 小時(shí)，反應(yīng)完畢之后旋干反應(yīng)液。層析柱分離(CH2Cl2 石油醚=1 1)得到橙紅色固體， 核磁檢驗(yàn)同分異構(gòu)體比例1 0.4。利用制備液相分離的到兩種同分異構(gòu)體。第一組分A :M. ρ· 232-233°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 916 (dd, J = 8. 8Hz, 1H)， 8. 623 (d, J = 8. 8Hz, 1H)，8· 447 (d, J = 6. 4Hz, 1Η)，7. 859 (t, J = 8. OHz, 1Η)，8· 324 (d, J = 8. 4Ηζ,2Η)，7. 101 (d, J = 8. 4Ηζ,2Η)，7. 016 (d, J = 8. 4Hz, 1Η)，2. 351 (s, 3Η)。第二組分B :Μ. p. 258-260°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 987 (dd, J = 8. 8Hz, 1H)， 8. 858 (d, J = 8. 8Hz, 1H)，8. 208 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，7. 986 (t, J = 8. OHz, 1Η)，8. 333 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，7· 112 (d，J = 8. 4Ηζ，2Η)，6· 889 (d，J = 8. 4Hz, 1Η)，2. 349(s，3H)。實(shí)施例5 :3-(間甲基苯硫基)-8-氧-8Η-苊并[1，2-b]吡咯_9_腈㈧和4_ (間 甲基苯硫基)-8_氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈(B)的合成及表征稱(chēng)取1. Og 3-間甲苯巰基苊醌，0. 3g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅膠柱中， 快速淋洗，過(guò)柱完畢之后旋干得紅色固體。稱(chēng)重12. 2g，產(chǎn)率91 %。取0. 7g2-苯巰基-(2-氧代-2氫-苊)_丙二腈，加入0. 08g K2CO3, 20mL乙腈加熱回流4小時(shí)，反應(yīng)完畢之后旋干 反應(yīng)液。層析柱分離(CH2Cl2 石油醚=1 1)得到紅色固體，核磁檢驗(yàn)同分異構(gòu)體比例 1 0.25。利用制備液相分離的到兩種同分異構(gòu)體。第一組分A :M. ρ· 255-257°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 826 (dd, J = 8. 8Hz, 1H)， 8. 513 (d，J = 8. 8Hz, 1H)，8· 327 (d, J = 6. 4Hz, 1H)，7· 659 (t, J = 8. OHz, 1Η)，8· 014 (d，J = 8. 4Ηζ，2Η)，6· 901 (d，J = 8. 4Ηζ，2Η)，6· 896 (d，J = 8. 4Hz, 1Η)，2. 353(s，3H)。第二組分B :Μ. p. 269-2710C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 877 (dd, J = 8. 8Hz, 1H)， 8. 748 (d, J = 8. 8Hz, 1H)，8· 108 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，7. 856 (t, J = 8. OHz, 1Η)，8· 123 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，6· 892 (d，J = 8. 4Ηζ，2Η)，6· 679 (d，J = 8. 4Hz, 1Η)，2. 355(s，3H)。實(shí)施例6 :6-(噻吩基-2-甲氧基)-8_氧-8Η-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈的合成及 表征50mL乙腈中加入lg8_氧-8H苊并[l，2_b]吡咯_9_腈，0. 5g噻吩甲醇，回流攪拌 6小時(shí)，蒸發(fā)部分溶劑，層析柱分離得產(chǎn)品6-(2_噻吩甲氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2-b]吡 咯-9-腈，收率45%。M. p. 241-243°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 685 (dd, J = 8. 7Hz, 1H)，8· 433 (d，J = 8. 7Hz, 1H) ,8. 014 (d, J = 6. 4Hz，lH)，7. 75 (t, J = 8. 0Hz，lH)，7. 251 (t，J = 8. 4Hz，lH)，
7.181 (d，J = 8. 4Hz, 1H)，6. 985 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，6. 232 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，3. 454(s，2H)。實(shí)施例7 :3- (3-氟代苯甲?；?-8-氧_8H_苊并[1，2_b]吡咯_9_腈㈧和 4-(3-氟代苯甲?；?-8-氧-8!1-苊并[l，2-b]吡咯_9_腈(B)的合成及表征稱(chēng)取l.Og 3-間氟苯羰基苊醌，0.4g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅膠柱 中，快速淋洗，過(guò)柱完畢之后旋干得深紅色固體。稱(chēng)重10. 5g，產(chǎn)率85%。取0.8g 2-氟羰 基_ (2_氧代_2氫-苊)-丙二腈，加入0. 08g K2CO3, 20mL乙腈加熱回流3小時(shí)，反應(yīng)完畢 之后旋干反應(yīng)液。層析柱分離(CH2Cl2 石油醚=2 1)得到深紅色固體，核磁檢驗(yàn)同分 異構(gòu)體比例1 0.2。利用制備液相分離得到兩種同分異構(gòu)體。第一組分A :M. ρ· 285-287°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 726 (dd, J = 8. 8Hz, 1H)，
8.423 (d, J = 8. 8Hz, 1H)，8· 015 (d，J = 6. 4Hz, 1H)，7. 598 (t, J = 8. OHz, 1H)，8· 003 (d, J = 8. 4Hz，2H)，6. 853 (d, J = 8. 4Hz，2H)，6. 756 (d, J = 8. 4Hz，1H)。第二組分B :M. ρ· 269-2710C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 568 (dd, J = 8. 8Hz, 1H)， 8. 478 (d, J = 8. 8Hz, 1H)，8. 006 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，7. 568 (t, J = 8. OHz, 1H)，8. 045 (d, J = 8. 4Hz，2H)，6. 908 (d, J = 8. 4Hz，2H)，6. 596 (d, J = 8. 4Hz，1H)。實(shí)施例8 :3-(N-苯基甲?；?-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈(A)和4_(N_苯 基甲?；?-8_氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈⑶的合成及表征稱(chēng)取l.Og 3-苯基酰胺苊醌，0.4g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅膠柱中，快 速淋洗，過(guò)柱完畢之后旋干得深紅色固體。稱(chēng)重11. 2g，產(chǎn)率86%。取0.8g苯酰胺-(2-氧 代-2氫-苊)-丙二腈，加入0. 08g K2CO3, 20mL乙腈加熱回流3小時(shí)，反應(yīng)完畢之后旋干反 應(yīng)液。層析柱分離(CH2Cl2 石油醚=2 1)得到深紅色固體，核磁檢驗(yàn)同分異構(gòu)體比例 1 0.4。利用制備液相分離得兩種同分異構(gòu)體。第一組分 A :M. ρ· 281-283°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 9. 112 (d，J = 8. OHz, 1Η)，8. 945 (d, J = 8. 8Hz，lH)，8. 682(d，J = 7. 2Ηζ,1Η),8. 452 (t, J = 8. OHz, 1H), 8. 312 (s, 1H), 7. 986 (t, J =
108.0Hz, 2H)，7. 627 (t, J = 7. 6Hz, 1H)，7. 433 (d, J = 7. 6Hz,2H)，7. 241 (d, J = 8. 4Hz, 1H)。第二組分B :M. p. 293-294°C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 9. 213 (dd, J = 8. OHz, 1Η)，
9.012 (dd, J = 7. 6Hz, 1H)，8· 685 (d，J = 8. 2Hz, 1Η)，8· 428 (t，J = 8. OHz, 1Η)，8· 320 (s, 1Η)，7· 896 (t, J = 8. 0Ηζ，2Η)，7· 675 (t, J = 7. OHz, 1Η)，7. 531 (d, J = 8. 8Ηζ，2Η)，7· 015 (d， J = 8. 4Hz, 1Η)。實(shí)施例9 3-(四氫-2Η-吡喃基~4~氧基)_8_氧_8Η_苊并[1，2_b]吡咯_9_腈(A) 和4-(四氫-2H-吡喃基-4-氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈(B的合成及表征稱(chēng)取l.Og 3-(4-四氫吡喃氧基)苊醌，0.4g丙二腈用二氯甲烷溶解之后，加入硅 膠柱中，快速淋洗，過(guò)柱完畢之后旋干得深紅色固體。稱(chēng)重11. 2g，產(chǎn)率86%。取0. Sg 4-四 氫吡喃“(2-氧代_2氫-苊)-丙二腈，加入0. 08g K2CO3, 20mL乙腈加熱回流9小時(shí)，反應(yīng) 完畢之后旋干反應(yīng)液。層析柱分離(CH2Cl2 石油醚=2 1)得到深紅色固體，核磁檢驗(yàn) 同分異構(gòu)體比例1 0.4。利用制備液相分離的到兩種同分異構(gòu)體。第一組分A :M. ρ· 230-231 "C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 601 (d, J = 8. OHz, 1H)， 8. 134 (d, J = 8. 8Hz, 1H)，7. 945 (dd, J = 8. OHz, 1H)，7. 452 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，3. 822 (t, J =4. 8Ηζ，4Η)，3· 815 (t，J = 5. 0Ηζ，4Η)，3· 766 (t，J = 5. 2Hz, 1H)。第二組分 B :M. p. 242-244 °C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 8. 568 (d，J = 8. OHz，1H)， 8. 115 (d，J = 8. 8Hz, 1H)，7. 856 (dd, J = 8. OHz, 1H)，7. 326 (d，J = 8. 4Hz, 1H)，3. 796 (t，J =4. 8Hz，4H)，3. 807 (t，J = 5. 0Hz，4H)，3. 791 (t，J = 5. 2Hz, 1H)。實(shí)施例10 3-苯氧基-8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯_9_甲酸的合成及表征在50mL單口燒瓶中，加入60mL濃硫酸或者25mL發(fā)煙硫酸，在0 5°C下，分批加入 0. 05mol的3-苯氧基-8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈，1小時(shí)內(nèi)加完，加完后在室溫繼續(xù) 反應(yīng)16小時(shí)，反應(yīng)混合物為粘稠的深棕紅色。然后小心緩慢的將其滴入碎冰中，同時(shí)劇烈攪 拌，滴完后靜置，濾餅用大量水洗滌，直至濾餅呈中性，濾餅干燥后得深黃色產(chǎn)品。產(chǎn)率96%。Μ. ρ· 248 "C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 11. 42 (s, 1H)，8· 965 (dd, J = 8. OHz, 1Η)， 8. 750(dd, J = 7. 8Hz, 1H)，8· 313 (d，J = 8. 2Hz, 1H)，7. 999 (t, J = 8. 2Hz, 1H)，7. 561 (t，J = 8. 2Hz，2H)，7. 410 (t，J = 7. OHz, 1H)，7. 251 (d，J = 8. 8Hz，2H)，6. 963 (d，J = 8. 4Hz, 1H)。實(shí)施例11 :3_苯氧基-8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_甲酸甲酯的合成及表征在IOOmL單口燒瓶中，依次加入0. Olmol 3-苯氧基-8-氧_8H_苊并[1，2_b]吡 咯-9-腈，50mL乙腈做溶劑，0. 02mmol的碳酸鉀做縛酸劑，過(guò)量10倍的碘甲烷，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加 熱至40°C反應(yīng)15小時(shí)。減壓蒸去乙腈，加入二氯甲烷使反應(yīng)物充分溶解，過(guò)濾之后旋干濾液，得 黃棕色粗產(chǎn)品。硅膠柱層析分離，展開(kāi)劑二氯甲烷-甲醇(40 1)，得深黃色產(chǎn)品。產(chǎn)率92%。Μ·ρ·213 "C ；1H NMR(400M, CDCl3) δ 9. 102 (d, J = 7. 2Hz, 1H) ,8. 965 (dd, J = 8. OHz, 1Η)，8· 850 (dd, J = 7. 8Hz, 1Η)，8· 233 (d，J = 8. 2Hz, 1Η)，7. 856 (t，J = 8. 2Hz, 1Η)， 7. 453 (t, J = 8. 2Ηζ，2Η)，7· 350(t, J = 7. 2Hz, 1Η)，7. 325 (d, J = 8. 4Ηζ，2Η)，3· 213(s，3H)。實(shí)施例12 3-苯氧基-8-氧-8Η-苊并[1，2_b]吡咯_9_N_叔丁基酰胺的合成及 表征在IOOmL單口燒瓶中，依次加入0. Olmol 3_甲氧基_8_氧_8H_苊并[l，2_b]吡 咯-9-酸，50mL DMF 做溶劑，0. 02mmol 的三乙胺，0. Olmmol 的(EtO) 2P( = 0)CN，過(guò)量 10 倍 的叔丁胺，常溫反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完畢得到黃色固體，產(chǎn)率85%。MpJSTtVH NMR(400M,CDCl3) δ 8. 746 (dd, J = 8. OHz, 1H) ,8. 650 (dd, J = 7. 8Hz, 1H)，8. 213 (d，J = 8. 2Hz, 1H)，
7.846 (t, J = 8. OHz, 1H)，7. 352 (t, J = 8. 0Hz，2H)，7. 210 (t, J = 7. 4Hz, 1H)，7. 051 (d, J =8. 4Ηζ，2Η)，6· 963 (d, J = 8. 4Ηζ，1Η)，3· 721(s，3H)，3. 113 (m，2Η)，1. 568 (dd，J = 5. 6Hz, 2H),1.421(m, J = 5. 7Hz，2H)，0. 968 (t, J = 6. 2Hz，3H)。實(shí)施例13 :3-(4_溴代苯硫基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈的合成及表征50mL乙腈中加入Ig 8_氧_8H_苊并[1，2_b]吡咯_9_腈，3. 2g對(duì)溴苯硫酚，常溫 反應(yīng)2小時(shí)，蒸出部分溶劑，層析柱分離得化合物3-(4_溴代苯硫基)-8_氧-8H-苊并[1， 2-b]吡咯-9-腈，收率40%。M. p. 262-263°C;lH NMR(400M, CDC13) δ 8. 852 (dd, J = 8. 8Hz, 1H)，8· 813(d, J =
8.8Hz, 1Η)，8. 015 (d，J = 6. 4Hz, 1Η)，7. 945 (t，J = 8. OHz, 1Η)，7. 560 (d，J = 8. 4Ηζ，2Η)，
7.096 (d, J = 8. 4Ηζ,2Η)，7. 006 (d, J = 8. 4Hz, 1Η)。實(shí)施例14 :3，6- 二 (4-溴代苯硫基)_8_氧_8Η_苊并[1，2_b]吡咯_9_腈的合成 及表征50mL乙腈中加入Ig 8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈，6. 5g對(duì)溴苯硫酚，常溫 反應(yīng)36小時(shí)，蒸出部分溶劑，層析柱分離得化合物3，6- 二(4-溴代苯硫基)-8-氧-8H-苊 并[1,2-b]吡咯-9-腈，收率20%。M. p. 262-263°C;lH NMR(400M, CDC13) δ 8. 815 (dd, J = 8. 8Hz，1H)，8. 671 (d，J =
8.8Hz, 1H)，7· 881 (t，J = 6. 4Hz, 1H)，7. 551 (q, J = 8. 0Hz，4H)，7. 215 (q，J = 8. 4Hz，4H)，
6.472 (s，1H)。實(shí)施例15 :6-(4-氨基苯硫基)-8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈的合成及表征50mL乙腈中加入Ig 8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈，2. 5g對(duì)氨基苯硫酚，常 溫反應(yīng)2小時(shí)，蒸出部分溶劑，層析柱分離得化合物6-(4-氨基苯硫基)-8-氧-8H-苊并 [1,2-b]吡咯-9-腈，收率 30%。M. p. 255-257°C ；IH NMR(400M, CDC13) δ 8. 832 (dd, J = 8. 8Hz，lH)，8. 801(d，J = 8. 8Hz，1H)，7. 985 (d，J = 6. 4Hz，1H)，7. 925 (t，J = 8. OHz, 1H),
7.570 (d, J = 8. 4Hz,2H)，6. 997 (d, J = 8. 4Hz,2H)，7. 006 (d, J = 8. 4Hz, 1H)，6. 271 (s，2H)。實(shí)施例16 :3，6-二(4-氨基苯硫基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈的合成 及表征50mL乙腈中加入Ig 8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯-9-腈，5. Og對(duì)氨基苯 硫酚，常溫反應(yīng)30小時(shí)，蒸出部分溶劑，層析柱分離得化合物3，6_ 二(4-氨基苯硫 基)-8_氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈，收率25%。M. p. 288_290°C;1H NMR(400M,CDC13) δ 8. 835 (dd, J = 8. 8Hz, 1Η)，8. 682 (d, J = 8. 8Hz, 1Η)，7. 973 (t, J = 6. 4Hz, 1Η)，7. 581 (q, J = 8. 0Ηζ，4Η)，7· 234 (q, J = 8. 4Ηζ，4Η)，6· 651 (s，1Η)，6· 269(s，4H)。第二部分苊并雜環(huán)類(lèi)化合物環(huán)糊精包合物、配結(jié)物的制備及其表征實(shí)施例；本部分內(nèi)容包括苊并雜環(huán)類(lèi)化合物環(huán)糊精包合物、配結(jié)物的制備及對(duì)產(chǎn)物的表 征，所采用的表征手段包括紫外光譜、熒光光譜、圓二色光譜、紅外光譜、熱失重分析及SEM。 如無(wú)特殊說(shuō)明，本部分涉及的儀器及其檢測(cè)方法參考來(lái)源如下相溶解度圖按照文獻(xiàn)J. Agric. Food Chem.，2007，55 (9)，3535-3539 的方法繪制 相溶解度圖。紫外光譜HP8453 (美國(guó))；檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)Journal of PhotochemistryandPhotobiology A =Chemistry 173(2005)319—327。熒光光譜:PTI-700(美國(guó))；檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)J Fluoresc (2008) 18 :1103_1114。圓二色光譜J-810(日本)；檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)J. Phys. Chem. B，2006，110 (13)， 7044-7048。紅外光譜FT/IR_430(日本)；檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)Mol. Pharmaceutics，2008， 5(2)，358-363。熱失重分析TGA/SDT851e(瑞士)；檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)Mol. Pharmaceutics，2008， 5(2)，358-363。SEM :JSM-5600LV(日本)；檢測(cè)方法參考文獻(xiàn) J. Med. Chem. 2003，46，4634-4637。H 核磁=Bruker Avance II 400M(瑞士 )；檢測(cè)條件為(溶劑 CDC13，400M)。質(zhì)譜GC-TofMS (英國(guó))；檢測(cè)方法參考文獻(xiàn) J. Org. Chem. 2000，65，9013-9021。X單晶衍射XD_3A(日本)；檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)J. Org. Chem. 2008，73， 8305-83168305。實(shí)施例17 3-硫嗎啉-8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯_9_腈β -環(huán)糊精包合物的 制備及表征首先稱(chēng)取將經(jīng)過(guò)二次重結(jié)晶并充分干燥的β-環(huán)糊精1.85g(1.63mM0l)，加入 IOOmL水，加熱并攪拌使其溶解。稱(chēng)取待測(cè)化合物0. 179g(0. 54mMol)，用35mL丙酮溶解之 后，以線狀逐滴加入到β-環(huán)糊精的水溶液中，60°C加熱攪拌3天后，有沉淀析出，過(guò)濾，用 少量蒸餾水洗滌濾餅之后，再用少量的丙酮洗去游離狀態(tài)的化合物，真空下50°C干燥24小 時(shí)，得到淡紫色固體。紫外吸收檢測(cè)結(jié)果表明，隨著β -環(huán)糊精濃度的逐漸增大化合物的紫外吸收值逐 漸增大，其溶解度逐漸增大，表示包合物的形成。由相溶解度圖結(jié)果可知化合物的溶解度由原來(lái)的0.21 μ M增加到0.36 μ Μ，提高 了 1. 5 倍。熒光光譜檢測(cè)結(jié)果顯示固定待測(cè)化合物的濃度不變，熒光值隨著環(huán)糊精濃 度的逐漸增大而增大。熒光發(fā)射波長(zhǎng)不變，但是強(qiáng)度增大，原因化合物進(jìn)入環(huán)糊精空腔之 后，空腔環(huán)境的變化，保護(hù)了處于激發(fā)態(tài)的化合物分子，使之不與大體積分子和淬滅劑接 觸，這種熒光光譜的變化表明了化合物與環(huán)糊精生成了包合物。圓二色光譜檢測(cè)結(jié)果顯示在環(huán)糊精存在的情況下，待測(cè)化合物的誘導(dǎo)圓二 色在260nm到375nm有一個(gè)強(qiáng)的正Cotton效應(yīng)的峰，以及在400nm到500nm處有一個(gè)弱的 Cotton效應(yīng)的正峰，這說(shuō)明化合物進(jìn)入環(huán)糊精的手性空腔之后，產(chǎn)生了誘導(dǎo)圓二色效應(yīng)，表 明了包合物的形成。紅外光譜檢測(cè)結(jié)果顯示β -環(huán)糊精在3410. 18和1029. 22cm"1有強(qiáng)的吸收帶，同 時(shí)在579 911CHT1處有一系列的指紋區(qū)特征峰?；衔镌?218. 55cm"1和1625. 08cm"1有 兩個(gè)尖銳的特征吸收峰。紅外譜圖中2219. 13cm"1和1625. 48cm"1特征吸收峰強(qiáng)度變小，及 輕微的位移，同時(shí)在1706CHT1出現(xiàn)的一個(gè)新的尖峰，表明了包合物的形成。熱失重分析檢測(cè)結(jié)果顯示β -環(huán)糊精在298°C出現(xiàn)拐點(diǎn)，開(kāi)始降解。而包合物在 269°C即出現(xiàn)拐點(diǎn)，開(kāi)始降解，不同于β-環(huán)糊精，表明了包合物的形成。SEM結(jié)果顯示3_硫 嗎啉基-8-氧-8Η-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈化合物為針狀外形，β -環(huán)糊精為較大的方磚
13狀，化合物與β “環(huán)糊精物理混合SEM圖是針狀與方磚狀的混合外形，而化合物_ β _環(huán)糊 精包合物的表面形貌明顯不同于以上三者，其外形為規(guī)整的菱形。從外形結(jié)構(gòu)的明顯不同 可以看出包合物的形成。其他包合物的制備及表征采用與實(shí)施例17相同的方法，利用不同類(lèi)型環(huán)糊精包合同系列的其他化合物；同 樣采用紫外、熒光光譜、圓二色光譜、紅外光譜、熱失重分析及SEM對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了表征，證明 了包合物的形成，并通過(guò)相溶解度實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)比包合前后化合物與其包合物溶解度的變 化。具體結(jié)果如表1所示。從表1的檢測(cè)結(jié)果可以看出，不同類(lèi)型的環(huán)糊精包合的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物在水中 的溶解度較化合物本身均大大提高。表 1 實(shí)施例 18 γ I 孕鎏讁此 3-蓺-B暴-8—it-8H-鋪華〔1, 2-bu 異忝 If 蓉S垂蚋知媧m“忝 3-蓺屆暴-8-it-8H-鋪華〔1,2-bu 異忝-9— S (0. 263g,0. 75mmol)菩 N, N、(0. 二豸)磙繁埋31^浮0150書(shū)，滂加碑_雞4|30氺鑾^加，&> γ-孕蓬精(0. 6485g，0. 5mmol)及4mL的三乙醇胺。常溫反應(yīng)18小時(shí)。反應(yīng)完畢之后，加入約200mL 的丙酮于反應(yīng)液，減壓使析出沉淀。所得沉淀用離子交換柱提純，所得產(chǎn)品再用甲醇與水的 混合溶劑洗滌，溶液凍干得到0. 42g的3-硫嗎啉-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸 /Y-環(huán)糊精配結(jié)物。產(chǎn)率25%。H 核磁及質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果顯示=IH NMR(400M, D20_d6) δ (ppm) 8. 87 (d，J = 8. 5Hz， 1Η)，8. 58-8. 55(m，2H)，7. 91(t，J = 8· 5Hz，1Η)，7· 39 (d，J = 8· 5Hz，1Η)，5· 03 (m，8Η)， 3. 83 (m, 8Η)，3. 80 (m, 8Η)，3. 74 (m, 8H)，3. 72-3. 70 (m, 3_N (CH2*) 2 (CH2) 2S, 4H)，3. 59 (m, 8H)， 3. 52 (m, 8H)，2. 98-2. 96 (m, 3_N (CH2) 2 (CH2) 2*S, 4H) ； (ESI) m/z (M+H) - (1629m/z)。X單晶衍射表征結(jié)果顯示Y _環(huán)糊精在12°和15 23°之間有一系列的尖峰出 現(xiàn)，化合物3-硫嗎啉-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸只在11°和7°處有尖峰。而 配結(jié)物在11°處的尖峰消失，在6°有一個(gè)新的尖鋒，在14 18°以及20 25°出現(xiàn)一系 列的尖峰。相對(duì)于化合物與環(huán)糊精而言，配結(jié)物中有新的尖峰出現(xiàn)，表明了配結(jié)物的形成?；衔?-硫嗎啉-8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_甲酸與Y-環(huán)糊精配結(jié)之 后，在水中的溶解度明顯增大。相溶解度曲線擬合曲線方程為Y = 0.68+0. 14XX。3-硫 嗎啉-8-氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-甲酸在水中的溶解度由原來(lái)的0.68μΜ增加到 11. 2 μ Μ，提高了 16. 5 倍。其他配結(jié)物的制備及表征采用與實(shí)施例18相同的方法，利用不同類(lèi)型環(huán)糊精配結(jié)同系列的其他化合物；同 樣采用H核磁、質(zhì)譜和X單晶衍射對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了表征，證明了配結(jié)物的形成，并通過(guò)相溶解 度實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)比配結(jié)前后化合物與其配結(jié)物溶解度的變化。具體結(jié)果如表2所示。從表2的檢測(cè)結(jié)果可以看出，不同類(lèi)型的環(huán)糊精配結(jié)的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物在水 中的溶解度較化合物本身均大大提高。表2 第三部分苊并雜環(huán)類(lèi)化合物、其環(huán)糊精包合物、配結(jié)物的理化活性檢測(cè)實(shí)施例19 通過(guò)熒光偏振分析法檢測(cè)化合物的ΒΗ3類(lèi)似程度合成一個(gè)帶有21個(gè)氨基酸的Bid ΒΗ3肽段(氨基酸79_99 QEDIIRNIARHLAQVGDSMDR)，并在N端標(biāo)記上6-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(FAM)作為熒光標(biāo) 簽(FAM-Bid)。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)中所用的反應(yīng)體系為GST-Bcl-2蛋白(40nM)或Mcl-I蛋白， 和FAM-Bid多肽(5nM)溶于反應(yīng)緩沖液中(IOOmM K3PO4,pH 7.5 ；100yg/mL牛γ白蛋白；0.02%疊氮化鈉)。在96孔板中，每孔加入IOOyL反應(yīng)體系，然后加入IyL不同濃度的 溶于DMSO的待檢測(cè)化合物3-硫嗎啉-8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯-9-腈母液至實(shí)驗(yàn)設(shè) 計(jì)所需終濃度。同時(shí)設(shè)立兩個(gè)對(duì)照組，一個(gè)對(duì)照組為反應(yīng)體系中只含有Bcl-2或Mcl-I和 FAM-Bid(相當(dāng)于0%抑制率)，另一對(duì)照組中的反應(yīng)體系只含有FAM-Bid肽段。96孔板經(jīng) 過(guò)4個(gè)小時(shí)的避光孵育后，進(jìn)行酶標(biāo)儀上檢測(cè)。熒光極化值(mP)在由530nm波長(zhǎng)激發(fā)產(chǎn)生 的485nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)量。Ki值根計(jì)算公式推導(dǎo)得出。試驗(yàn)結(jié)果如附圖1所示。該化合物 與Bcl-2蛋白的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合常數(shù)為310nM。按照上述相同的試驗(yàn)方法檢測(cè)其他9個(gè)化合物的BH3類(lèi)似程度，它們與Bcl_2和 Mcl-I蛋白的結(jié)合常數(shù)(表3中簡(jiǎn)稱(chēng)結(jié)合常數(shù))在也是nM級(jí)，具體結(jié)果如表3所示。表3
3，6- 二(4-氨基苯硫基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈7. 03_(四氧-2H-吡喃基-4-氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈600. 04-苯氧基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈890. 06_(噻吩基-2-甲氧基)-8_氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈560. 03-苯氧基-8-氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-甲酸甲酯790. 0 實(shí)施例20 活細(xì)胞內(nèi)熒光偏振能量轉(zhuǎn)移(FRET)檢測(cè)化合物的ΒΗ3類(lèi)似性利用磷酸鈣共沉淀的方法將2 μ gBcl-2-CFP和Bax-YFP質(zhì)粒分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染至 Hela細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板(2 X IO5個(gè)/孔)，加入溶于DMSO的 待檢測(cè)化合物3-硫嗎啉8-氧-8Η-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈至終濃度(2，5，10和15 μ M), 藥物作用24小時(shí)后(如附圖2)，PBS清洗細(xì)胞3次，用GENIOS熒光酶標(biāo)儀(TECAN，Swiss) 檢測(cè)熒光值。在時(shí)間依賴(lài)的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于6孔板后，加入40 μ M化合物，藥 物作用3、6和24小時(shí)(附圖3)，讀板檢測(cè)熒光。在只轉(zhuǎn)染Bcl-2-CFP質(zhì)粒的細(xì)胞組中記錄 475nm發(fā)射波長(zhǎng)值，激發(fā)波長(zhǎng)為433nm。在只轉(zhuǎn)染Bax-YFP質(zhì)粒的細(xì)胞組中記錄527nm發(fā)射 波長(zhǎng)值，激發(fā)波長(zhǎng)為505nm。對(duì)共轉(zhuǎn)染Bcl-2-CFP和Bax-YFP質(zhì)粒的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組記錄527nm 和475nm發(fā)射波長(zhǎng)值，激發(fā)波長(zhǎng)為433nm。527nm發(fā)射熒光與475nm發(fā)射熒光相比值即為 FRET，將單獨(dú)轉(zhuǎn)染對(duì)照組的FRET值設(shè)為1. 0，表示兩蛋白未發(fā)生熒光偏振能量轉(zhuǎn)移。在共轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞中，由于Bcl-2蛋白和Bax蛋白的相互作用使得FRET值增加至2. 0，而隨著加藥濃 度和時(shí)間的增加，對(duì)兩蛋白相互作用的干擾增強(qiáng)，F(xiàn)RET隨之減弱。細(xì)胞活力由MTT法進(jìn)行 測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果如附圖2和附圖3所示，該化合物在2 μ Μ,作用3小時(shí)即可干擾Bcl-2/Bax 之間的相互作用，呈濃度時(shí)間依賴(lài)趨勢(shì)。按照上述相同的試驗(yàn)方法檢測(cè)其他7個(gè)化合物，試驗(yàn)證明這些化合物在不同作用 濃度和作用時(shí)間的條件下，均具有細(xì)胞內(nèi)模擬BH3-only蛋白的作用，能明顯干擾Bcl-2/ Bax之間的相互作用。具體結(jié)果如表4所示。
其中濃度和時(shí)間表示測(cè)試化合物在該濃度下干擾Bcl-2/Bax之間的相互作用發(fā)生 的時(shí)間。表4 實(shí)施例21 通過(guò)Bax蛋白與線粒體共定位檢測(cè)化合物的BH3類(lèi)似度利用磷酸鈣共沉淀方法將5 μ g Bax-YFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MCF-7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24小 時(shí)后，將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板(0. 2X IO6個(gè)/孔)，加入10 μ M待檢測(cè)化合物3-硫嗎啉 8-氧-8Η-苊并[1,2-b]吡咯-9-腈，作用6小時(shí)后，PBS清洗并同50nM MitoTracker Red CMXRos (線粒體特異探針；紅色)避光孵育1011^11，？83清洗三次后，1^肚￡111(^2000激光共聚 焦顯微鏡(Bio-Rad，USA)掃描熒光圖像。同時(shí)進(jìn)行雙通道掃描，一個(gè)通道掃描Bax-YFP的 綠色熒光，另一通道掃描指示線粒體的CMXRos探針紅色熒光，兩通道圖像相互疊加顯示共 定位情況。當(dāng)Bax蛋白定位于線粒體上，綠色熒光與紅色熒光疊加成橘色，如附圖4所示； 對(duì)照附圖5顯示不能驅(qū)動(dòng)BAX向線粒體移位，共定位失敗的試驗(yàn)結(jié)果。按照上述相同的試驗(yàn)方法檢測(cè)其他8個(gè)化合物，結(jié)果顯示他們?cè)诓煌饔脻舛群?作用時(shí)間的條件下，均具有驅(qū)動(dòng)BAX向線粒體移位的作用，說(shuō)明具有細(xì)胞內(nèi)模擬BH3-only 蛋白的作用。具體結(jié)果如表5所示，其中濃度和時(shí)間表示測(cè)試化合物在該濃度下模擬 BH3-only蛋白驅(qū)動(dòng)BAX向線粒體移位的作用發(fā)生的時(shí)間。表 5
細(xì)胞，Western檢測(cè)RNA干擾后BAX和BAK蛋白表達(dá)情況，相同處理無(wú)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞組 設(shè)為對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板中(IXlO5個(gè)/孔)，平行進(jìn)行未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞 組的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度梯度加入待檢測(cè)化合物3-硫嗎啉8-氧-8H-苊并[1，2-b] 吡咯-9-腈，作用48小時(shí)后，MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果如附圖6所示，Gossypol作為非特異 性BH3類(lèi)似物與本發(fā)明的化合物對(duì)比平行處理，可見(jiàn)3-硫嗎啉8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡 咯-9-腈具有絕對(duì)依賴(lài)BAX/BAK的細(xì)胞毒性。按照上述相同的試驗(yàn)方法檢測(cè)其他8個(gè)化合物(如下所述化合物① ⑧)，結(jié)果顯 示所檢測(cè)化合物也均具有絕對(duì)依賴(lài)BAX/BAK的作用特點(diǎn)。這些化合物包括①8-氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯 _9_ 腈；②3- (4-溴代苯硫基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯_9_腈；③6-(4-氨基苯硫基)-8-氧_8!1-苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；④3，6-二(4-溴代苯硫基)-8_氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；⑤3，6-二(4-氨基苯硫基)-8_氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；⑥4-(3-氟代苯甲酰基)-8-氧_8!1-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈；⑦6_(噻吩基-2-甲氧基)-8_氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；⑧3-苯氧基-8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_甲酸。實(shí)施例23 =Western印記檢測(cè)化合物對(duì)Mcl-I和Bcl_2的抑制作用收集細(xì)胞樣品后，以1Χ 106/50 μ L 細(xì)胞裂解液(62. 5mM Tris-HCl pH 6.8 ；2% SDS 甘；50mM DTT ;0. 01 %溴酚藍(lán))低溫裂解，離心，取蛋白上清，100°C煮沸樣品5分 鐘，12% SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜，相應(yīng)抗體檢測(cè)目的蛋白，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗并結(jié)合ECL 顯色法檢測(cè)目的蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)量。附圖7和附圖8分別顯示待檢測(cè)化合物3-硫嗎 啉8-氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈對(duì)Mcl-I和Bcl-2的抑制作用。從圖中可以看出，隨 著待測(cè)化合物作用于腫瘤細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，Bcl-2和Mcl-I的蛋白條帶逐漸變淺，說(shuō)明化合 物具有抑制這兩個(gè)蛋白的作用。利用KODAK Gel Logic 1500成像系統(tǒng)軟件對(duì)Western圖 片中蛋白條帶濃度進(jìn)行半定量分析，歸一化處理后，蛋白條帶的濃度如附圖9和10所示。經(jīng)同樣方法對(duì)檢測(cè)下述8個(gè)化合物，它們均具有抑制Bcl-2和Mcl-I蛋白的作用， 這些化合物包括①8-氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯 _9_ 腈；②3- (4-溴代苯硫基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯_9_腈；③6-(4-氨基苯硫基)-8-氧_8!1-苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；④3，6- 二(4-溴代苯硫基)-8-氧_8H_苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；⑤3，6-二(4-氨基苯硫基)-8_氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；⑥3-苯氧基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-N-叔丁基酰胺；⑦6-(噻吩基-2-甲氧基)-8_氧-8H-苊并[1,2-b]吡咯_9_腈；⑧4_(四氫-2H-吡喃基-4-氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈；這些化合物下調(diào)Mcl-I蛋白和Bcl-2蛋白的半定量分析結(jié)果分別如表6和表7所 示表6 化合物①_⑧下調(diào)Mcl-I蛋白的半定量分析就結(jié)果 表7化合物①_⑧下調(diào)Bcl-2蛋白的半定量分析結(jié)果 實(shí)施例24 =Western印記檢測(cè)比較苊并雜環(huán)類(lèi)化合物及其環(huán)糊精包合物和配結(jié)物 對(duì)Mcl-I和Bcl-2的抑制作用將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板(2 X IO5個(gè)/孔)，化合物組加入溶于DMSO的化合物3-硫 嗎啉8-氧-8H-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈至終濃度10 μ M，包和物組加入溶于水溶液的相當(dāng) 于10 μ M化合物的Y -環(huán)糊精包和物，藥物作用24小時(shí)后，PBS清洗細(xì)胞3次，收集細(xì)胞樣 品后，以 1Χ 106/50 μ L細(xì)胞裂解液(62. 5mM Tris-HCl pH 6. 8 ；2% SDS ；10%甘；50mM DTT ； 0.01%溴酚藍(lán))低溫裂解，離心，取蛋白上清，100°C煮沸樣品5分鐘，12% SDS-PAGE電泳并 轉(zhuǎn)膜，相應(yīng)抗體檢測(cè)目的蛋白，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗并結(jié)合ECL顯色法檢測(cè)目的蛋白在 細(xì)胞中的表達(dá)量。檢測(cè)結(jié)果如附圖11所示?？梢钥闯?_硫嗎啉8-氧-8H-苊并[l，2-b] 吡咯-9-腈的Y -環(huán)糊精包和物對(duì)Mcl-I和Bcl-2蛋白的抑制作用明顯高于該化合物本身。 即Y-環(huán)糊精包和物明顯提高了抑制Bcl-2和Mcl-I蛋白的能力。利用KODAK Gel Logic 1500成像系統(tǒng)軟件對(duì)Western圖片中蛋白條帶濃度進(jìn)行 半定量分析，歸一化處理后，蛋白條帶的濃度如附圖12，13所示。本實(shí)施例還采用上述同樣方法檢測(cè)了 β _環(huán)糊精、2-羥丙基-β _環(huán)糊精、甲 基-β -環(huán)糊精和羥丙基_ Y _環(huán)糊精包和的3-硫嗎啉8-氧-8Η-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈， 以及下述化合物，均比化合物本身具有更高的細(xì)胞內(nèi)抑制Bcl-2和Mcl-I蛋白的能力。這 些化合物包括①8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯 _9_ 腈；②3- (4-溴代苯硫基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯_9_腈；③6-(4-氨基苯硫基)-8-氧_8!1-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈；④3，6- 二(4-溴代苯硫基)-8-氧_8H_苊并[1，2_b]吡咯_9_腈；⑤3，6- 二(4-氨基苯硫基)-8-氧_8H_苊并[1，2_b]吡咯_9_腈；⑥4_(四氫-2H-吡喃基-4-氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈；這些化合物及其包合物下調(diào)Mcl-I蛋白和Bcl-2蛋白的半定量分析結(jié)果分別如表 8和表9所示表8 化合物①_⑥和它們的包和物下調(diào)Mcl-I蛋白的半定量分析結(jié)果 表9 化合物①_⑥和它們的包和物下調(diào)Bcl-2蛋白的半定量分析結(jié)果 本實(shí)施例還采用上述同樣方法檢測(cè)了 Y-環(huán)糊精、2-羥丙基-β-環(huán)糊精、 甲基-β-環(huán)糊精或羥丙基-Υ-環(huán)糊精配結(jié)的其他同類(lèi)化合物，如3_(對(duì)甲基苯氧 基)-8_氧-8Η-苊并[l，2-b]吡咯-9-甲酰胺、3-(4_溴代苯硫基)-8_氧-8H-苊并[1， 2-b]吡咯-9-甲酸、3-硫嗎啉基-8-氧-8H-苊并[1,2-b]批咯_9_甲酰胺。試驗(yàn)表明這 些化合物的環(huán)糊精配結(jié)物均比化合物本身具有更高的細(xì)胞內(nèi)抑制Bcl-2和Mcl-I蛋白的能 力。實(shí)施例25 =Western印記檢測(cè)對(duì)比化合物和包和物在腫瘤模型動(dòng)物體內(nèi)對(duì)Mcl-I 和Bcl-2的抑制作用選擇飼養(yǎng)的中國(guó)昆明小鼠，隨機(jī)分組，每組10只。培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞H22，按 200 μ L/只接種于小鼠腋下皮下。于荷瘤5天后，皮下瘤塊形成。開(kāi)始腹腔注射待測(cè)化合 物3-硫嗎啉8-氧-8Η-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈，Y-環(huán)糊精包合的待測(cè)化合物，和口服 Y-環(huán)糊精包和包合的待測(cè)化合物。測(cè)試條件包括空白對(duì)照組皮下荷瘤后小鼠不經(jīng)任何處理；對(duì)照組①皮下荷瘤后給小鼠隔日腹腔注射DMSO溶液，共計(jì)10天；對(duì)照組②皮下荷瘤后給小鼠隔日腹腔注射環(huán)糊精溶液，共計(jì)10天；實(shí)驗(yàn)組①皮下荷瘤后給小鼠隔日腹腔注射0. 03mg/kg體重化合物的DMSO溶液， 共計(jì)10天；實(shí)驗(yàn)組②皮下荷瘤后給小鼠隔日腹腔注射0. 3mg/kg體重化合物的DMSO溶液，共 計(jì)10天；實(shí)驗(yàn)組③皮下荷瘤后給小鼠隔日腹腔注射相當(dāng)于0. 3mg/kg體重化合物的包和 物水溶液，共計(jì)10天；實(shí)驗(yàn)組④皮下荷瘤后給小鼠隔日灌胃相當(dāng)于0. 3mg/kg體重化合物的包和物水 溶液，共計(jì)10天。實(shí)驗(yàn)期間每周兩次測(cè)定腫瘤長(zhǎng)徑(a)及與之相垂直的短徑(b)，按公式l/2ab2計(jì) 算腫瘤體積。觀察動(dòng)物存活時(shí)間。實(shí)驗(yàn)第40天，按腫瘤體積計(jì)算抑瘤率。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組②(化合物DMSO溶液注射組)抑瘤率22.3%;實(shí)驗(yàn)組③(包和包合物注射組)抑瘤率61. 5% ；實(shí)驗(yàn)組④(包和包合物口服組)抑瘤率43. 7 %。對(duì)照組動(dòng)物平均生存時(shí)間為28士2. 1天，化合物組的平均壽命33士3. 1天，包和包 合物注射組平均生存時(shí)間為48士5. 1天，包合物口服組平均生存時(shí)間為42士 1. 1天。統(tǒng)計(jì) 學(xué)處理結(jié)果顯示P <0. 05。小鼠死亡或處死后，剝?nèi)⌒∈笃は履[瘤，按1 3體積用生理鹽水將組織勻漿制備
22細(xì)胞懸液，采用與實(shí)施例24相同的western檢測(cè)方法，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞Bcl_2、Mcl-I蛋白的 表達(dá)情況。結(jié)果如附圖14所示，其中，電泳道6的蛋白條帶比電泳道5的條帶淺，表明包合 物的體內(nèi)抑制Bcl-2、Mcl-I的能力高于化合物本身。β -環(huán)糊精、2-羥丙基-β -環(huán)糊精、甲基_ β _環(huán)糊精和羥丙基_ Y _環(huán)糊精包和 的3-硫嗎啉8-氧-8Η-苊并[l，2-b]吡咯-9-腈、以及下述化合物，均有同樣的體內(nèi)抗腫 瘤的作用。包括①在相同于實(shí)驗(yàn)組②的條件下，8-氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_腈的抑瘤率 約60% ；在相同于實(shí)驗(yàn)組③的條件下，羥丙基Y-環(huán)糊精包合的化合物29-1的抑瘤率約 80% ；②在相同于實(shí)驗(yàn)組②的條件下，3-(4_溴代苯硫基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡 咯-9-腈的抑瘤率約40%左右；在相同于實(shí)驗(yàn)組③的條件下，2-羥丙基-β -環(huán)糊精包合的 化合物29-2的抑瘤率約60% ；③在相同于實(shí)驗(yàn)組②的條件下，6-(4_氨基苯硫基)-8_氧-8Η-苊并[l，2_b]吡 咯-9-腈的抑瘤率約30% ；在相同于實(shí)驗(yàn)組③的條件下，Y-環(huán)糊精包合的化合物29-3抑 瘤率約40% ；④在相同于實(shí)驗(yàn)組②的條件下，3，6_二(4-溴代苯硫基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b] 吡咯-9-腈抑瘤率達(dá)到78% ；在相同于實(shí)驗(yàn)組③的條件下，甲基-β -環(huán)糊精包合的化合物 29-4的抑瘤率約85% ；⑤在相同于實(shí)驗(yàn)組②的條件下，3，6_二(4-氨基苯硫基)-8_氧-8Η-苊并[l，2_b] 吡咯-9-腈的抑瘤率為50% ；在相同于實(shí)驗(yàn)組③的條件下，Y -環(huán)糊精包合的化合物29-5 的抑瘤率約為60% ；⑥在相同于實(shí)驗(yàn)組②的條件下，4-(四氫-2H-吡喃基-4-氧基)_8_氧_8H_苊并 [l，2-b]吡咯-9-腈的抑瘤率在40%左右；在相同于實(shí)驗(yàn)組③的條件下，β-環(huán)糊精包合的 化合物29-6的抑瘤率約55%。其它化合物的抑瘤率在30 50%之間。它們的環(huán)糊精包合物組的抑瘤率普遍高 于化合物本身(P < 0. 05)。γ -環(huán)糊精、2-羥丙基-β -環(huán)糊精、甲基_ β _環(huán)糊精、和羥丙基_ Y _環(huán)糊精配結(jié) 的下述化合物，相對(duì)于這些化合物本身也具有更強(qiáng)的體內(nèi)抑制Bcl-2、Mcl-I的能力，和更 高的抑瘤率。其中3_(對(duì)甲基苯氧基)-8_氧-8H-苊并[l，2_b]吡咯_9_甲酰胺的抑瘤率為30%， 甲基- β -環(huán)糊精配結(jié)后抑瘤率達(dá)到38%左右；3-(4-溴代苯硫基)-8-氧_8!1-苊并[l，2_b]吡咯_9_甲酸抑瘤率為45%，羥丙 基-Y-環(huán)糊精配結(jié)后的產(chǎn)物抑瘤率為55% ；3-硫嗎啉基-8-氧-8H-苊并[1，2_b]吡咯_9_甲酰胺的抑瘤率為45%，2_羥丙 基-β -環(huán)糊精配結(jié)后達(dá)到60 %。
權(quán)利要求
一類(lèi)苊并雜環(huán)類(lèi)化合物，其分子結(jié)構(gòu)通式為其中(I)R1＝XR5、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基或硫嗎啉基，R2＝H，R3＝H，R4＝CN、COOH、COOR6或CONHR7；(II)R1＝H，R2＝XR5、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基或硫嗎啉基，R3＝H，R4＝CN、COOH、COOR6或CONHR7；(III)R1＝H，R2＝H，R3＝H、XR5、四氫吡喃 4 氧基、四氫噻喃 4 氧基、噻吩甲氧基、噻吩甲氨基或硫嗎啉基，R4＝CN；(IV)R1＝XR5，R2＝H，R3＝XR5，R4＝CN；其中X＝O、S、羰基、酯基或酰胺；R5＝a、(CH2)nAr (o，m，p)Y，Y＝CH3、NO2、Ph、F、Cl、Br、CF3、OCH3、SCH3或NH2；n＝0～4；b、四氫吡喃基或四氫噻喃基；R6＝CH3或C2H5；R7＝CH3、C2H5或Ar。F2009102099612C00011.tif
2.權(quán)利要求1的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物的環(huán)糊精包合物，其特征在于由下述方法制備①稱(chēng)取一定質(zhì)量的環(huán)糊精，加入水中，加熱攪拌使其成為飽和溶液，所述的環(huán)糊精為 β -環(huán)糊精、Y “環(huán)糊精、2-羥丙基-β -環(huán)糊精、甲基-β -環(huán)糊精或羥丙基_ Y _環(huán)糊精；②稱(chēng)取待包合的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物，該化合物與環(huán)糊精的摩爾比為1 3 10;③將待包合的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物以5 lOmg/mL的濃度溶于丙酮，將所得溶液以線狀 逐滴加入到環(huán)糊精的水溶液中，40 65°C，加熱攪拌1 6天，有沉淀析出；④將上述溶液過(guò)濾，用少量蒸餾水洗滌濾餅，再用少量的丙酮洗去游離狀態(tài)的化合物， 50 70°C真空干燥，24 48小時(shí)后得到權(quán)利要求1的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物的環(huán)糊精包合物。
3.權(quán)利要求1的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物的環(huán)糊精配結(jié)物，其特征在于由下述方法制備①稱(chēng)取干燥的環(huán)糊精及待配結(jié)的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物，環(huán)糊精與該化合物的摩爾比為 1 1.5 3 ；所述的環(huán)糊精為β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精、2-羥丙基-β-環(huán)糊精、甲基-β-環(huán) 糊精或羥丙基-Y-環(huán)糊精；②將待配結(jié)的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物與N，N'-羰基二咪唑以1 1 2的摩爾比混合后 溶解到DMSO中，使待配結(jié)的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物在DMSO溶液中的濃度為0. 2 0. 5mmol/mL, 常溫?cái)嚢?0 60分鐘；③往上述DMSO溶液中加入步驟①所稱(chēng)取的環(huán)糊精及0.1 0. 3mmol/mL的三乙醇胺， 常溫反應(yīng)18 24小時(shí)；④往步驟③的反應(yīng)體系中加入0.50 1. Omg/mL的丙酮，減壓析出沉淀；⑤過(guò)濾，沉淀經(jīng)純化得權(quán)利要求1的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物的環(huán)糊精配結(jié)物。
4.權(quán)利要求1的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物在制備BH3類(lèi)似物Bcl-2家族蛋白抑制劑中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物的環(huán)糊精包合物在制備BH3類(lèi)似物Bcl-2家族蛋白 抑制劑中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3的苊并雜環(huán)類(lèi)化合物的環(huán)糊精配結(jié)物在制備BH3類(lèi)似物Bcl-2家族蛋白 抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類(lèi)苊并雜環(huán)類(lèi)化合物，其環(huán)糊精包合物、配結(jié)物及其在制備Bcl-2家族蛋白抑制劑中的應(yīng)用。該苊并雜環(huán)類(lèi)化合物是在8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈的3，4，6位引入多種氧代物和硫代物，羰基化合物，酯基化合物以及?；衔?，或進(jìn)一步將9-腈取代為酸，酯，酰胺基所得到的化合物。它模擬BH3-only蛋白，在體外和細(xì)胞內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合和拮抗Bcl-2，Bcl-xL和Mcl-1蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，其環(huán)糊精包合物和配結(jié)物能提高其作用，它們均可被用于制備抗癌化合物。
文檔編號(hào)A61K31/541GK101928243SQ20091020996
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2009年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月11日
發(fā)明者吳桂葉, 宋婷, 張志超, 謝飛博 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)