專利名稱：：紫草酸酯類化合物在制備治療瘧疾藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥物，具體涉及一種紫草酸酯類化合物在制藥中的應(yīng)用，尤其涉及紫草酸酯類化合物在制備治療由瘧原蟲引起的瘧疾藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：瘧疾是地球上發(fā)生最頻繁的寄生蟲病，是由按蚊進(jìn)行傳播、具有潛在致命危險(xiǎn)的疾病。每年全球有5億左右的瘧疾病例，導(dǎo)致超過(guò)100萬(wàn)人死亡，絕大部分發(fā)生在非洲。世界衛(wèi)生組織指出瘧疾平均每30秒殺死一個(gè)5歲以下的兒童。瘧疾由瘧原蟲引起。帶有瘧原蟲的雌按蚊叮咬人體后，將瘧原蟲注入人體，經(jīng)1020天會(huì)發(fā)生典型的瘧疾臨床癥狀，可分為四期發(fā)冷期、發(fā)熱期、出汗期和間歇期。瘧疾的反復(fù)發(fā)作后，病人會(huì)出現(xiàn)貧血、肝脾腫大，甚至出現(xiàn)腦型、超高熱型、厥冷型和胃腸型等兇險(xiǎn)癥狀，甚至危及生命。隨著已有抗瘧藥物的耐藥性的不斷增加，瘧疾的發(fā)病率日益增加，亟待具有新型治療作用的抗瘧藥物的發(fā)現(xiàn)。紅細(xì)胞內(nèi)期的瘧原蟲在其酸性食物泡內(nèi)水解宿主的血紅蛋白以獲得自身生命所需的能量和氨基酸。生物學(xué)研究表明，在瘧原蟲的食物泡內(nèi)包涵一系列的水解酶，如天冬氨酸蛋白酶(plasm印sins)，半胱氨酸蛋白酶(falcipains)，和金屬蛋白酶(falcilysins)。這些酶已成為瘧疾化學(xué)治療的潛在靶標(biāo)。半胱氨酸蛋白酶是MT約為21000-30000的蛋白質(zhì)，在pH4_6.5時(shí)具有最高水解活性，它的活性部位具有半胱氨酸殘基。瘧原蟲的半胱氨酸蛋白酶屬于木瓜蛋白酶家族。已知的瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶有四個(gè)亞型，falcipain-l(瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶-l)，falcipain-2A(瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶-2A)，falcipain-2B(瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶-2B)，falcipain-3(瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶-3)。Falcipain1是第一個(gè)表達(dá)得到的瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶，其生物學(xué)研究表明，它對(duì)瘧原蟲的無(wú)性生殖階段并無(wú)影響，但能顯著的影響卵囊的功能。Falcipain-2A，falcipain-2B具有97%的同源性，僅在氨基酸序列的7位有所不同。通過(guò)寡核苷酸探針的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，falcipain-2BmRNA的表達(dá)水平比f(wàn)alcipain-2A低。然而falcipain-2A和falcipain-2B在癥原蟲營(yíng)養(yǎng)體晚期其表達(dá)的時(shí)間依賴性和峰值極為相似，這表明兩種不同的亞型具有相似的生物學(xué)功能。Falcipain-3與falcipain-2在催化域有66.6%的同源性，但是它們表達(dá)的階段有所不同。Falcipain-2在營(yíng)養(yǎng)體階段表達(dá)達(dá)到最高峰，而falcipain-3在更為成熟的瘧原蟲階段表達(dá)達(dá)到高峰。在這幾種亞型中，對(duì)于falcipain-2的研究最多，因此其抑制劑的開(kāi)發(fā)亦受到更為廣泛的關(guān)注。中醫(yī)中藥治療瘧疾已經(jīng)有很長(zhǎng)的歷史，比如在《素問(wèn)*剌虐論》中就提出了用針灸預(yù)防治療瘧疾，在中草藥方面，除了聞名世界的青蒿外，威靈仙、水蜈蚣、鴉膽子、常山、鵝不食草、檳榔、翻白草、石龍芮等也在民間用來(lái)治療瘧疾。從中藥青蒿中發(fā)現(xiàn)的活性化合物青蒿素用于治療瘧疾取得了很好的效果，廣泛用于臨床。中藥在治病強(qiáng)身方面有著神奇的療效已經(jīng)被世界所承認(rèn)，因此從中藥中尋找具有抗虐活性的化合物意義重大。本發(fā)明人通過(guò)多年的基礎(chǔ)研究積累了2000多種，并建立了天然產(chǎn)物庫(kù)，通過(guò)對(duì)庫(kù)中化合物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了具有抗虐作用的紫草酸酯類化合物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于研究設(shè)計(jì)紫草酸酯類化合物在制備治療瘧疾藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種紫草酸酯類化合物，具有下述結(jié)構(gòu)通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式中Ri為甲基或正丁基；I^為氫或甲基。紫草酸酯類化合物分布在許多種植物中，可以從植物中分離得到，也可以用化學(xué)合成的方式獲得。所述的紫草酸酯類化合物為紫草酸二甲酯、紫草酸丁酯。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供了紫草酸酯類化合物在制備治療瘧疾藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明化合物紫草酸丁酯與Falcipain-2蛋白酶結(jié)合活性測(cè)定，結(jié)果顯示紫草酸丁酯與FP-2蛋白有明顯的結(jié)合；紫草酸酯類化合物對(duì)falcipain-2有較高的抑制率；紫草酸酯類化合物體外抗瘧活性測(cè)定，結(jié)果顯示紫草酸丁酯和紫草酸二甲酯均有較好的體外抗瘧原蟲活性。因此，紫草酸酯類化合物可用于制備治療瘧疾的藥物。本發(fā)明又一個(gè)目的是提供以紫草酸酯類化合物為活性成分，用于制備治療瘧疾的藥物組合物。尤其是制備由瘧原蟲引起的瘧疾的藥物組合物。本發(fā)明所述藥物組合物含有治療有效量的紫草酸酯類化合物為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。其中活性成分在藥物組合物中的重量含量為5-95%。所述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如水燈；填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如明膠、聚乙烯吡咯烷酮；濕潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如碳酸鈣、碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、聚乙二醇等、另外還可以在組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。本發(fā)明化合物可以組合物的形式通過(guò)口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時(shí)，可將其職稱常規(guī)的固體制劑如片劑、顆粒劑、膠囊等或制成液體制劑如水或油懸浮劑、糖漿等；用于腸胃外給藥時(shí)，可將其制成注射用的溶液、水貨油性懸浮劑等。本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:紫草酸二甲酯和紫草酸丁酯的制備松葉青蘭10kg粉碎成粗粉后，用80%乙醇回流提取3次，將提取液減壓回收得到的浸膏溶于水中，先用乙酸乙酯萃取，回收得乙酸乙酯部分(200g)，水液部分再用正丁醇萃取，回收得正丁醇部分(700g)。正丁醇部分經(jīng)過(guò)硅膠柱色譜，以氯仿-丙酮i:o-i:i梯度洗脫，分為5個(gè)大的流分。其中第4流分濃縮干燥后21.3g經(jīng)甲醇溶解后經(jīng)過(guò)反相硅膠色譜，以甲醇_水梯度洗脫，分為6個(gè)流分。其中第2流分經(jīng)過(guò)S印hadexLH-20葡聚糖色譜，以氯仿甲醇i:l洗脫，經(jīng)硅膠薄層色譜檢測(cè)，共有3個(gè)組分，其中組分i濃縮干燥后為黃色粉末，稱重為510mg，結(jié)構(gòu)鑒定為紫草酸丁酯，組分2濃縮干燥后為淡黃色粉末，稱重為625mg，結(jié)構(gòu)鑒定為紫草酸二甲酯。紫草酸丁酯的結(jié)構(gòu)如下(本法制得的紫草酸丁酯和紫草酸二甲酯用于下列實(shí)施例2-5)紫草酸二甲酯的結(jié)構(gòu)如下實(shí)施例2:本發(fā)明化合物紫草酸丁酯與Falcipain-2蛋白酶結(jié)合活性測(cè)定Falcipain-2蛋白酶與紫草酸丁酯結(jié)合活性的篩選和動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定基于SPR(表面等離子共振)原理，使用的儀器是Biacore3000(BiacoreAB，Uppsala，Sweden)。(1)Falcipain-2質(zhì)粒(pQE30-Fa12)的構(gòu)建根據(jù)Falcipain-2cDNA序列設(shè)計(jì)引物，正向和反向引物分另U為5，CGTGGATCCCAAATGAATTATGAAG3，和5，ATATGTCGACTTATTCAATTAATGGAATG3，，包含BamHI和SalI酶切位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增Falcipain-2片段，將酶切后的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pQE30連接后鑒定正確，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌M15進(jìn)行表達(dá)。(2)Falcipain-2(FP-2)蛋白的表達(dá)與純化將構(gòu)建好的質(zhì)粒pQE30-Fa12轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15中得到表達(dá)工程菌，將工程菌培養(yǎng)于含100iig/mL氨芐青霉素和50iig/mL卡那霉素的10mLLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L)。然后按1:100轉(zhuǎn)接入1L含氨芐青霉素和卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37t:下，220轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)。當(dāng)0D600達(dá)到約0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度0.5mM，同時(shí)將溫度降到25t:培養(yǎng)12小時(shí)進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。4000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘收集菌體，收集好后放于-8(TC超低溫冰箱保存過(guò)夜。將菌體用20mL的緩沖液1(20mMTris-Cl，O.5MNaCl，and10mM咪唑，pH8.0)懸起，將懸浮液冰浴上超聲波破碎(300W，工作30分鐘，一次5秒，中間間隔10秒)。破碎后得到的細(xì)胞勻漿在4°C，以10000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，棄上清，用20mL的buffer2(6M胍HC120mMTris_Cl250mMNaCl20mM咪唑，pH8.0)溶解沉淀，室溫下溫和攪拌1小時(shí)，10000轉(zhuǎn)/分離心30min，并將上清上樣到用綁定緩沖液(Bindingbuffer)2(6MguanidineHCl，20mMTris-Cl，250mMNaCl，pH8.0)平衡好的N產(chǎn)-NTA柱上，先后用沖洗緩沖液l(8M尿素，20mMTris-Cl，500mMNaClpH8.0)和沖洗緩沖液2(8M尿素，20mMTris-Cl，30mM咪唑)各30ml洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白，再用洗脫緩沖液(8M尿素，20MmTris-Cl，IM咪唑)10ml洗去目的蛋白，用SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的分子量和純度。(3)FP-2包涵體蛋白的復(fù)性將純化得到的蛋白加入10mMDTT，37。C下溫浴45分鐘后，將蛋白溶液稀釋到10g/ml進(jìn)行透析(透析液100mMTris-Cl，lmMEDTA，20%甘油，250mML-精氨酸，lmM谷胱甘肽，lmM氧化型谷胱甘肽(GSSG)，pH8.0)過(guò)夜。將透析好的蛋白濃縮即可用作酶抑制活性的測(cè)定。(4)FP-2蛋白的偶聯(lián)徹底清洗Biacore3000機(jī)器后，用PBS緩沖液(10mM4-羥基哌嗪乙磺酸，150mMNaCl，3mMEDTAand0.005%(v/v)表面活性劑P20，pH7.4)平衡機(jī)器至基線平穩(wěn)。0.2MN-乙基-N'-二甲基氨丙基碳二亞胺和50rnMMN_羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)1:1混和，以5iiL/min進(jìn)樣7分鐘以活化芯片表面。FP-2蛋白用10mM乙酸鈉，pH4.2，稀釋至終濃度為69iig/ml，以5iiL/min流速進(jìn)樣。最后，用1M鹽酸乙醇胺，pH8.5以5yL/min流速進(jìn)樣7分鐘，封閉芯片表面，最終FP-2蛋白的偶聯(lián)量為9300RU左右。[OO37](5)化合物篩選底物Z-Phe-Arg-pNAHC1(BachemAG)作為陽(yáng)性對(duì)照。紫草酸丁酯用100%DMSO溶解，母液濃度為10mM。用HBS-EP緩沖液稀釋化合物，至終濃度為1yM禾P10yM，匿SO的終濃度為O.1%。根據(jù)紫草酸丁酯與芯片上FP-2蛋白的結(jié)合的RU(ResponseUnit，共振單位)值，判斷化合物是否具有結(jié)合活性。有結(jié)合活性的化合物可進(jìn)行詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證明紫草酸丁酯與FP-2蛋白有明顯的結(jié)合。[OO39](6)動(dòng)力學(xué)測(cè)定紫草酸丁酯用工作緩沖液HBS-EP(含0.1%DMSO)，分別配成不同的濃度梯度，以30l/min進(jìn)樣lmin，解離2min，然后用相同緩沖液穩(wěn)定2min。得到紫草酸丁酯與FP_2蛋白相互作用的傳感圖，再用Biacore分析軟件中的1:1(Langmuir)結(jié)合模型或穩(wěn)態(tài)模型進(jìn)行擬合，得到確切的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)常數(shù)。(7)試驗(yàn)結(jié)果表1陽(yáng)性對(duì)照和紫草酸丁酯與FP-2蛋白結(jié)合常數(shù)的測(cè)試結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例3本發(fā)明化合物對(duì)falcipain-2蛋白酶百分抑制活性的測(cè)定(1)Falcipain-2(FP-2)蛋白的表達(dá)與純化和FP_2包涵體蛋白的復(fù)性參見(jiàn)實(shí)施例2(2)本發(fā)明化合物對(duì)FP-2酶抑制活性的測(cè)定在197iiL的lOOmMNaOAc，10mMDTT，pH5.5的緩沖液體系中加入FP-2蛋白(終濃度10g/ml)和溶于匿SO的待測(cè)化合物溶液，終濃度10M和OM(陰性對(duì)照)，室溫下孵育30min后用MDSpectraMaxM5酶標(biāo)儀于激發(fā)波長(zhǎng)(excitation)355nm;發(fā)射波長(zhǎng)(emission)460nm處連續(xù)測(cè)15min內(nèi)的RFU值，計(jì)算出反應(yīng)速率Km，以下列公式得出待測(cè)化合物在IOM下百分抑制率，計(jì)算公式為(對(duì)照組Km值-實(shí)驗(yàn)組Km值)/對(duì)照組Km值X100%(3)化合物活性測(cè)試結(jié)果表2.紫草酸酯類化合物對(duì)falcipain-2抑制率數(shù)據(jù).<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例4本發(fā)明化合物對(duì)falcipain-2蛋白酶半數(shù)有效抑制濃度(IC5。)的測(cè)定選取10M抑制率在50%以上的化合物測(cè)IC5。，實(shí)驗(yàn)方法和體系如實(shí)施例3。根據(jù)化合物在不同濃度下FP-2酶活的反應(yīng)速率Km，計(jì)算化合物在不同濃度下對(duì)FP-2酶活的抑制率，使用Sigmoidal公式用origin軟件進(jìn)行擬合得到化合物的1(:5。值，結(jié)果見(jiàn)表3。表3.紫草酸酯類化合物對(duì)falcipain-2酶活抑制IC5。序號(hào)編號(hào)IC5。(M)_1紫草酸丁酯3.182紫草酸二甲酯3.77實(shí)施例5紫草酸酯類化合物體外抗瘧活性測(cè)定抗癥活性可以通過(guò)測(cè)量癥原蟲LDH活性來(lái)確定(Jain，M.;Khan，S.I.;Tekwani，B丄；Jacob，M.R.;Singh，S.;Singh，P.P.;Jain，R.Synthesis,antimalarial,antileishmanial，andantimicrobialactivitiesofsome8_quinolinamineanalogues.Bioorg.Med.Chem.2005，13，4458-4466.).。在含10iiL連續(xù)稀釋測(cè)試樣本的96孔板的每個(gè)孔中加入感染了D6orW2株P(guān).falciparum瘧原蟲半胱氨酸蛋白酶的紅細(xì)胞混懸液(200iiL，在RPMI1640培養(yǎng)集中加入10%人血清和601g/mL阿米卡星，使瘧原蟲血癥達(dá)到2%，紅細(xì)胞壓積達(dá)到2%)，然后用90%N2，5%02，and5%C02組成的混合氣體沖洗板，在培育房?jī)?nèi)培育72小時(shí)，溫度保持在37°C。LDH活性用MalstatTM試劑(FlowInc.，Portland,OR)測(cè)定，測(cè)定程序參照Makler和Hinrichs的程序(M.T.MaklerandD.J.Hinrichs，MeasurementofthelactatedehydrogenaseactivityofPlasmodi咖falciparumasanassessmentofparasitemia.J.Am.J.Trop.Med.Hyg.1993，48(2):205-210)。簡(jiǎn)要說(shuō)來(lái)，就是將20iiL培育的混合物同100yLheMaistat試劑混合，在室溫下培育30分鐘.然后加入20微升NBT/PES的混合物(NBT/PES比例為1:1)(Sigma，St.Louis，MO)，在黑暗條件下培育1小時(shí)。之后，加入100iiL5%醋酸溶液終止這一反應(yīng)，并用650nm來(lái)檢測(cè)板.藥物對(duì)照組中加入青蒿素和氯喹。從劑量-效應(yīng)曲線中計(jì)算出IC5。。測(cè)定化合物抗瘧活性的選擇性指標(biāo)時(shí)，也要測(cè)定他們?cè)隗w外對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性.測(cè)試在96孔組織培養(yǎng)板中進(jìn)行(J.Mustafa,S.I.Khan，G.Ma，L.A.Walkerandl.A.Khan，SynthesisandAnticancerActivitiesofFattyAcidAnalogsofPodophyllotoxin.Lipids.2004,39(2):167-172.)。在96孔板中以25，000個(gè)/孔的密度種植非洲綠猴腎異倍體細(xì)胞并培育24小時(shí).加入不同濃度的樣品，即紫草酸丁酯溶液和紫草酸二甲酯匿SO溶液，濃度依次為528.8ng/ml、1586.4ng/ml、4760g/ml，繼續(xù)培育48小時(shí)。利用NeutralRedassay方法測(cè)定存活細(xì)胞數(shù)，從劑量_效應(yīng)曲線中計(jì)算出IC5。.用阿霉素作為陽(yáng)性對(duì)照藥物。紫草酸酯類化合物的對(duì)D6和W2的IC5。值如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結(jié)果顯示，紫草酸丁酯和紫草酸二甲酯均有較好的體外抗瘧原蟲活性。權(quán)利要求一種紫草酸酯類化合物在制備治療瘧疾藥物中的應(yīng)用，其特征在于紫草酸酯類化合物具有以下結(jié)構(gòu)通式式中R1為甲基或正丁基；R2為氫或甲基。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物為治療由瘧原蟲引起的瘧疾的藥物。3.—種治療瘧疾的藥物組合物，其特征在于含有如權(quán)利要求l中所述的紫草酸酯類化合物活性成分和藥學(xué)上可以接受的載體。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于所述活性成分紫草酸酯類化合物在藥物組合物中的重量含量為5-95%。全文摘要本發(fā)明提供了一種紫草酸酯類化合物在制備治療瘧疾藥物中的應(yīng)用，該紫草酸酯類化合物具有以下結(jié)構(gòu)通式；式中R1為甲基或正丁基；R2為氫或甲基。并提供了所述紫草酸酯類化合物活性成分和藥學(xué)上可以接受的載體組成的藥物組合物，活性成分在藥物組合物中的重量含量為5-95％。本發(fā)明化合物紫草酸丁酯與Falcipain-2蛋白酶結(jié)合活性測(cè)定試驗(yàn)等，結(jié)果顯示與FP-2蛋白有明顯的結(jié)合、對(duì)falcipain-2有較高的抑制率。體外抗瘧活性測(cè)定，結(jié)果顯示紫草酸丁酯和紫草酸二甲酯均有較好的體外抗瘧原蟲活性。因此，紫草酸酯類化合物可用于制備治療瘧疾的藥物。文檔編號(hào)A61P33/00GK101693028SQ20091019747公開(kāi)日2010年4月14日申請(qǐng)日期2009年10月21日優(yōu)先權(quán)日2009年10月21日發(fā)明者單磊,張衛(wèi)東,張壽德,張燕燕,李洪林,李蹊,蘇娟,辛偉,陳瞳,黃瑾申請(qǐng)人:華東理工大學(xué);中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué);