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氯喹類(lèi)化合物或其鹽類(lèi)在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用的制作方法

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專(zhuān)利名稱(chēng)::氯喹類(lèi)化合物或其鹽類(lèi)在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,尤其涉及治療急性白血病藥物的藥物,特別是一種氯喹類(lèi)化合物或其鹽類(lèi)在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
:申請(qǐng)人:在公開(kāi)號(hào)為CN101333530A的《一種凋亡相關(guān)基因及以其為靶點(diǎn)用于治療白血病的藥物》的專(zhuān)利申請(qǐng)文件中,描述到“由于CHMP5/PNAS-2參與多泡體(MVB)的組成,而MVB是局限分布于細(xì)胞漿的,由此可見(jiàn)PNAS-2蛋白的應(yīng)該是較局限定位于細(xì)胞漿而非彌漫性分布于細(xì)胞漿中的。因此,PNAS-2蛋白在U937細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位很可能存在異常。PNAS-2蛋白在急性白血病細(xì)胞株中存在的亞細(xì)胞定位異常參與了白血病的發(fā)生?!鄙暾?qǐng)人考慮到PNAS-2的亞細(xì)胞定位異常很可能是由于多泡體膜穩(wěn)定性下降導(dǎo)致PNAS-2蛋白從中滲出進(jìn)入細(xì)胞漿所致,如果能穩(wěn)定多泡體膜,很可能對(duì)白血病有治療作用。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,氯喹、羥基氯喹或其鹽類(lèi)具有穩(wěn)定生物膜的作用(KorandaF.C.Antimalarials.JAmAcadDermatol,1981.4(6):p.650-655.)。因此氯喹、羥基氯喹或其鹽類(lèi)很可能對(duì)白血病有治療作用。氯喹、羥基氯喹或其鹽類(lèi)目前在臨床上主要用于治療惡性瘧、間日瘧及三日瘧。并可用于瘧疾癥狀的抑制性預(yù)防。也可用于治療腸外阿米巴病、結(jié)締組織病、光敏感性疾病等,但未用于臨床治療白血病。白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤,由于骨髓、脾、肝等造血器官中白血病細(xì)胞過(guò)度增生、凋亡減少所致。目前白血病的治療方法有化療、中西醫(yī)結(jié)合治療、骨髓移植、生物調(diào)節(jié)劑治療等方面。骨髓移植的效果較佳,但需要找到合適的供者,把握好移植的時(shí)機(jī),花費(fèi)大;中西醫(yī)結(jié)合、生物調(diào)節(jié)劑等療效欠佳,只能作為輔助性治療?;熓悄壳爸委煱籽〉闹饕侄?,但傳統(tǒng)意義上的化療毒副反應(yīng)大,常見(jiàn)耐藥現(xiàn)象,總體療效不佳,因此需要尋找新的藥物。但是新藥開(kāi)發(fā)周期長(zhǎng),需要投入大量的人力、財(cái)力,我國(guó)的血液病研究者根據(jù)我國(guó)的國(guó)情,在老藥新用上作出了重要的貢獻(xiàn)應(yīng)用原先治療皮膚病的全反式維甲酸及傳統(tǒng)中藥三氧化二砷聯(lián)合治療急性早幼粒細(xì)胞白血病,取得了五年生存率高達(dá)95%左右的良好效果,使急性早幼粒細(xì)胞白血病成為第一個(gè)可認(rèn)為已被攻克的白血病。原先用于治療妊娠反應(yīng)的藥物沙利度胺應(yīng)用于多發(fā)性骨髓瘤的治療,也取得了良好的療效,提示老藥新用具有很好的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種氯喹類(lèi)化合物或其鹽類(lèi)在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用,所述的這種藥物要解決現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有有效藥物治療急性白血病的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明提供了一種氯喹類(lèi)化合物或其鹽類(lèi)在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用。進(jìn)一步的,所述的氯喹類(lèi)化合物或鹽類(lèi)選自氯喹、磷酸氯喹、羥基氯喹、鹽酸氯喹、硫酸氯喹、矽酸氯喹或氨基氯喹中的任意一種。進(jìn)一步的,所述的治療急性白血病藥物的劑型為粉劑、或者注射液、或者膠囊、或者片劑、或者口服液。氯喹類(lèi)化合物及鹽類(lèi)治療白血病的機(jī)理為1,穩(wěn)定MVB膜,阻止PNAS-2蛋白由MVB滲出,減少異常定位的PNAS-2蛋白,從而促白血病細(xì)胞凋亡。2,穩(wěn)定白血病細(xì)胞膜,使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升,線(xiàn)粒體膜電位崩塌,從而激活CaSpaSe3,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本發(fā)明采用對(duì)細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定作用的氯喹類(lèi)藥物處理白血病細(xì)胞株、原代細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)處理后可使白血病細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯、顯著增加白血病細(xì)胞的凋亡率,表明氯喹類(lèi)化合物及鹽類(lèi)可用于白血病的治療。圖1顯示了MTT測(cè)得磷酸氯喹作用于U937細(xì)胞的抑制率曲線(xiàn)(η=3)。橫坐標(biāo)為磷酸氯喹對(duì)白血病細(xì)胞株U937的抑制率;縱坐標(biāo)為取IoglOC的磷酸氯喹濃度,C的單位為μg/ml0圖2顯示了磷酸氯喹作用24h后U937細(xì)胞的凋亡情況流式細(xì)胞儀檢測(cè)得到對(duì)照組的凋亡百分率為(2.71士1.35)%,加藥組的凋亡百分率為(39.86士13.59)%,P<0.05。圖3顯示了激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)得到的U937細(xì)胞凋亡圖象限I為檢測(cè)PI得到的圖像,紅色為陽(yáng)性細(xì)胞;象限II為光鏡;象限III為檢測(cè)ArmexinV-AlexaFluor488得到的圖像,綠色為陽(yáng)性細(xì)胞;象限IV為各象限信號(hào)重疊圖像。我們可以從圖中看到A是未染色狀態(tài)良好的未凋亡細(xì)胞;B是ArmexinV-AlexaFluor488單陽(yáng)性的早期凋亡細(xì)胞;D是PI單陽(yáng)性的死亡細(xì)胞;C是同時(shí)染有紅綠二色的細(xì)胞,在重疊圖像上顯示為黃色,可以看到核碎裂及凋亡小體形成,此類(lèi)細(xì)胞為中晚期凋亡細(xì)胞。圖4顯示了激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)得到未加磷酸氯喹的對(duì)照組中,PNAS-2的亞細(xì)胞定位圖像。左上象限為檢測(cè)PNAS-2蛋白得到的圖像;右上象限為光鏡像;左下象限為檢測(cè)核染料DAPI得到的圖像;右下象限為三者融合像??梢?jiàn)PNAS-2蛋白除了在核周存在小顆粒狀的正常分布外(即在多泡體中),還存在游離在多泡體外、彌散分布于整個(gè)細(xì)胞中PNAS-2蛋白。圖5顯示了激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)得到加磷酸氯喹的實(shí)驗(yàn)組中,PNAS-2的亞細(xì)胞定位圖像??梢?jiàn)PNAS-2蛋白恢復(fù)了在核周的小顆粒狀正常分布外,未見(jiàn)彌散分布于整個(gè)細(xì)胞中的游離PNAS-2蛋白。圖6顯示了加/不加磷酸氯喹對(duì)白血病細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。熒光值越大,說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度越高。未加磷酸氯喹時(shí)細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的平均值為28.99,加藥后71.31,ρ<0.0001,表明加藥后U937細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯上升。圖7顯示了加/不加磷酸氯喹對(duì)線(xiàn)粒體膜電位的影響。未加磷酸氯喹時(shí)U937細(xì)胞中線(xiàn)粒體膜電位崩塌細(xì)胞的比例為2.92%,加藥后64.73%,ρ=0.0001,表明加藥后線(xiàn)粒體膜電位崩塌的U937細(xì)胞比例明顯上升。圖8顯示了加/不加磷酸氯喹對(duì)白血病細(xì)胞內(nèi)CaSpaSe3活性的影響。流式細(xì)胞儀檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)未加磷酸氯喹時(shí)U937細(xì)胞中的CaSpaSe3的活性24.68%,加藥后53.11%,P<0.05,表明加藥后U937細(xì)胞中的CaSpaSe3的活性明顯上升。圖9顯示了肽段KC14免疫小鼠所得血清行WesternBlot的檢測(cè)結(jié)果。圖10顯示了S-31-7雜交瘤誘生腹水行WesternBlot檢測(cè)結(jié)果圖,圖中,shl為PNAS-2基因的RNA干擾組,shcon為PNAS-2的RNA干擾對(duì)照組。在可見(jiàn)干擾組未見(jiàn)條帶,但對(duì)照組可見(jiàn)一條約28KD的蛋白質(zhì)條帶,表明成功得到了PNAS-2單抗。具體實(shí)施例方式以白血病細(xì)胞株U937為例,以氯喹類(lèi)藥物中的磷酸氯喹為例,說(shuō)明氯喹類(lèi)藥物在穩(wěn)定細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)中的作用,以及對(duì)白血病細(xì)胞的治療作用。實(shí)施例1細(xì)胞培養(yǎng)白血病細(xì)胞株U937由上海血液研究所提供。在含10%的胎牛血清及青霉素、鏈霉素各100u/ml的RPMI1640培養(yǎng)基中,于37°C,含5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),每2天傳代1次。實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)進(jìn)行。實(shí)施例2=MTT實(shí)驗(yàn)磷酸氯喹購(gòu)于sigma公司,用生理鹽水溶解,0.22μm無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌后,配成各濃度,避光凍存。四甲基偶氮唑藍(lán)(methylthiazolyltetrazolium,MTT)干粉購(gòu)自Sigma公司。細(xì)胞調(diào)整至2X105個(gè)/ml,分設(shè)對(duì)照組和用藥組,磷酸氯喹的終濃度分別為0,2,10,50,250,1000μg/ml;每組設(shè)3復(fù)孔。培養(yǎng)24h后各孔加5%MTT液20μ1,37度培養(yǎng)箱孵育4h,離心棄去上清后,各孔加二甲亞砜(DMSO)200μ1,充分搖勻溶解,酶標(biāo)儀上檢測(cè)570nm的光密度值(D),3個(gè)復(fù)孔取平均值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。細(xì)胞增殖抑制率%=[(對(duì)照組A57tl-用藥組A5J/對(duì)照組A57JX100%。藥物對(duì)于白血病細(xì)胞株如U937細(xì)胞的增殖抑制率為濃度依賴(lài)性隨濃度上升,抑制率也相應(yīng)增大(R=0.982,P<0.01)(圖1);磷酸氯喹的IC50為46μg/ml即89.2μπιο1/L。各劑量組與對(duì)照組相比,細(xì)胞增殖率的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)施例3磷酸氯喹對(duì)白血病細(xì)胞凋亡作用的研究AnnexinV-AlexaFluor488/PI凋亡檢測(cè)試劑盒,購(gòu)于Invitrogen公司。U937細(xì)胞加入50μg/ml磷酸氯喹后培養(yǎng)24h,分別取2XIO5細(xì)胞,IXPBS洗滌一次,IXbindingbuffer200μ1重懸細(xì)胞。加AnnexinV-AlexaFluor4885μ1,PI2μ1避光孵育15min后,應(yīng)用流式細(xì)胞儀及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。U937細(xì)胞加入50μg/ml磷酸氯喹后培養(yǎng)24h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)得到對(duì)照組的凋亡百分率為(2.71+1.35)%,加藥組的凋亡百分率為(39.86士13.59)%,P<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。在激光共聚焦顯微鏡圖像上可見(jiàn)(圖3),象限I為檢測(cè)PI得到的圖像,紅色為陽(yáng)性細(xì)胞;象限II為光鏡;象限III為檢測(cè)ArmexinV-AlexaFluor488得到的圖像,綠色為陽(yáng)性細(xì)胞;象限IV為各象限信號(hào)重疊圖像。我們可以從圖中看到A是未染色狀態(tài)良好的未凋亡細(xì)胞;B是AnnexinV-AlexaFluor488單陽(yáng)性的早期凋亡細(xì)胞;D是PI單陽(yáng)性的死亡細(xì)胞;C是同時(shí)染有紅綠二色的細(xì)胞,在重疊圖像上顯示為黃色,可以看到核碎裂及凋亡小體形成,此類(lèi)細(xì)胞為中晚期凋亡細(xì)胞。就圖上計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù),以綠色或者紅色熒光或者黃色重疊熒光標(biāo)記細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。激光共聚焦顯微鏡下檢測(cè)對(duì)照組細(xì)胞405個(gè),其中凋亡細(xì)胞共16個(gè),凋亡率為3.95%;計(jì)數(shù)加藥組細(xì)胞358個(gè),其中106個(gè)細(xì)胞為凋亡細(xì)胞,得到的凋亡率為29.6%。上述結(jié)果表明磷酸氯喹對(duì)U937細(xì)胞有促細(xì)胞凋亡作用。實(shí)施例4:PNAS-2抗體的制備4.1PNAS-2抗原肽合成PNAS-2為一約28KD的親水性蛋白質(zhì),使用蛋白序列分析軟件ANTHEPR0T4.3等對(duì)該蛋白的親水曲線(xiàn)、疏水曲線(xiàn)、易溶性曲線(xiàn)、抗原性曲線(xiàn)、跨膜區(qū)域曲線(xiàn)及結(jié)合抗原性曲線(xiàn)等進(jìn)行分析后選取抗原性較好的親水α螺旋片段合成多肽。由上海吉爾生化有限公司化學(xué)合成PNAS-2多肽,序列為KAKPKAPPPSLTDC,此肽段簡(jiǎn)稱(chēng)KC14。多肽的純度>70%,與BSA偶聯(lián)。4.2動(dòng)物免疫先選5只BABL/c小鼠,250ug合成肽加0.5mlPBS稀釋?zhuān)?.5ml弗氏完全佐劑(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)責(zé)任有限公司),在小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射;二周后,再次免疫。將與初次等量的抗原肽原樣稀釋?zhuān)覫ml弗氏不完全佐劑(購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)責(zé)任有限公司),腹腔注射。三周后再免疫小鼠,具體方法同第二次免疫。最后一次免疫二周后,尾靜脈取血,取多克隆血清行WESTERNBLOT檢測(cè)特異性,發(fā)現(xiàn)KC14肽段能夠作為抗原決定簇,其所免疫小鼠能夠產(chǎn)生特異性PNAS-2抗體(圖9)。用ELISA法檢測(cè)KC14肽段免疫后的小鼠血清效價(jià)(表1)。最后選擇效價(jià)最高的4#小鼠再次腹腔加強(qiáng)免疫,抗原尾靜脈注射,不加佐劑;三天后,取脾臟細(xì)胞進(jìn)行融合。圖9中,shl為PNAS-2基因的RNA干擾組,shcon為PNAS-2的RNA干擾對(duì)照組。根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算得PNAS-2蛋白的分子量大概為28kd左右。所得到WesternBlot的結(jié)果顯示KC14肽段免疫小鼠所獲得多克隆血清能夠識(shí)別shcon泳道30kd左右的蛋白,并且,同時(shí)shl組泳道為陰性。證實(shí)KC14肽段能夠作為抗原決定簇,其所免疫小鼠能夠產(chǎn)生特異性PNAS-2抗體。表1肽段KC14免疫小鼠后,血清抗體效價(jià)的測(cè)定_Antibodytiter_Mouse_KC14-BSA_BSA_64,00016000Normal_<1000_<1000_4.3PNAS-2單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立將免疫后4#小鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合,融合劑為PEG(聚乙二醇,購(gòu)于Sigma公司)。細(xì)胞融合及選擇性培養(yǎng)均按常規(guī)方法進(jìn)行(徐志凱.實(shí)用單克隆抗體技術(shù).西安陜西科技出版社,1992(31-41).),我們得到的融合率為91.23%。以IOug/ul合成肽包被ELISA板,ELISA法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清。以BSA為陰性對(duì)照,免疫后BALB/c小鼠血清為陽(yáng)性對(duì)照。采用有限稀釋法對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性孔細(xì)胞進(jìn)行3次克隆化,直到克隆生長(zhǎng)孔單抗陽(yáng)性率達(dá)100%,最終獲得穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞株S-31-7,S-289-2,S-176-12,建立了單克隆細(xì)胞株。將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)增培養(yǎng)后,液氮凍存。4.4單克隆抗體的鑒定44.1單抗腹水制備及效價(jià)測(cè)定BALB/c小鼠腹腔注射石蠟油,每只0.5ml。1到2周后,再經(jīng)腹腔接種陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,每一只BALB/c小鼠接種5XIO6個(gè)細(xì)胞。兩周后收集腹水,常規(guī)ELISA方法檢測(cè)腹水效價(jià)(表2)。表2以ELISA法對(duì)獲得腹水行檢測(cè)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4.4.2Ig類(lèi)和亞類(lèi)的鑒定采用小鼠Ig類(lèi)檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自Sigma公司)對(duì)所獲得的單抗進(jìn)行鑒定,具體方法參照試劑盒中說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)S-31-7為IgGl;S-289-2為IgG2α;S-176-12為IgGl。4.4.3WesternBlot檢測(cè)抗體的特異性分別將RNA干擾PNAS-2表達(dá)的U937細(xì)胞和RNA無(wú)意義干擾的U937細(xì)胞抽提蛋白。2個(gè)泳道均加量60ug量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳;電泳后轉(zhuǎn)于NC膜,分別將三株雜交瘤誘導(dǎo)所生腹水用TBS稀釋后孵育,然后行二抗孵育,洗滌,上機(jī)觀察。只有S-31-7雜交瘤誘生腹水檢測(cè)得shcon泳道28kd的蛋白,shl泳道為陰性表現(xiàn),其他二株雜交瘤誘生腹水未能檢測(cè)出shcon泳道PNAS-2蛋白。故此,唯S-31-7雜交瘤誘生腹水能夠用于WesternBlot檢測(cè)(圖10)。4.4.4PNAS-2單抗的基因信息對(duì)于各種單抗來(lái)說(shuō),區(qū)分彼此的重要特征就是產(chǎn)生該單抗的雜交瘤細(xì)胞的重鏈可變區(qū)(VH)及輕鏈可變區(qū)(VL)基因序列的不同。為了明確PNAS-2單抗重鏈及輕鏈可變區(qū)的基因序列,常規(guī)抽提了可產(chǎn)生PNAS-2特異性單抗的S-31-7雜交瘤的總RNA,常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄后應(yīng)用TAKARA公司的rTaq酶行PCR,引物為VL上游引物5-GACATTGTGATGACCCAGTCTCC-3,VL下游引物5-TTTTATTTCCAGCTTGGTGCCTC-3。重鏈可變區(qū)的引物VH上游引物5-GCTACAAACGCGTACGCTCAGGTGAAGCTG_3,VH下游引物5-GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGT-3。PCR反應(yīng)條件均為為94°C2min;94°C30s,60°C130s,72°CImin循環(huán)5次;94°C30s,58°C130s,72°CImin循環(huán)5次;94°C30s,56°C130s,72°CImin循環(huán)5次;94°C30s,54°C30s,72°C2min,循環(huán)19次;72°C20min,4°C20min結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳后割膠純化回收,使用北京鼎國(guó)生物公司的DNA快速純化/回收試劑盒,操作的大致步驟如下(1).紫外燈下切取含DNA片段的瓊脂糖(100mg-300mg)并移入1.5mlEP管中,用移液器吸頭搗碎后按切取重量溶液A的體積比為13的比例加入溶液A。(2).65°C水浴5-lOmin,振蕩2次,待膠完全融化后置室溫,加入15μ1溶液B,充分混勻后轉(zhuǎn)入離心柱中,靜置2min,IOOOOrpm30s,棄下清。(3).加500μ1溶液C于離心柱中,IOOOOrpm30s,棄下清。重復(fù)此步驟一次。(4).12000rpm再次離心lmin,棄下清。將離心柱裝入新的離心管中,敞開(kāi)離心管管口室溫靜置lOmin。(5).加入20μ150°C水浴預(yù)熱的溶液D,靜置2min,13000rpm離心lmin,管底液體即為回收的DNA。之后進(jìn)行TOPOTA克隆,試劑盒(TOPOTACloningKitforSequencing)購(gòu)自Invitrogen公司。取回收的PCR產(chǎn)物4μl,SaltSolution1μl,pCR4_T0P0質(zhì)粒載體1μ1,室溫孵育5min后置于冰上。取新鮮T0P010化學(xué)感受態(tài)菌200μ1,加2μ1連接產(chǎn)物,小心混勻,冰上放置lOmin。42°C熱休克30秒,冰上放置2min后加入250μ1S.0.C培養(yǎng)基,置于細(xì)菌搖床37°C200rpm振搖2h。取40μ1菌液涂于含50μg/μ1氨芐青霉素的LB瓊脂平板上,37°C孵育過(guò)夜后挑選典型的單個(gè)菌落入3ml含100μg/μ1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中,37°C200rpm振搖培養(yǎng)過(guò)夜后取2ml菌液,送上海生工生物工程公司測(cè)序。測(cè)序得到的PNAS-2單克隆抗體輕鏈可變區(qū)(VL)基因序列為5-GACATTGTGATGACCCAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGAGGCACCAAGCTGGAAATAAAA-3。測(cè)序得到的PNAS-2單克隆抗體重鏈可變區(qū)(VH)基因序列為5-GGGAATTCATGGAGGTGAAGCTGCTGGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGAATTCGATTTTAGTAGATACTGGATGAGTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTAGAATGGATTGGAGAAATTAATCCAGAGAGCACTACGATAAGCTATACGCCATCTCTAAAGGATAAATTCATCATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTTCTGTGCAAGGTATTACTACGATTATATCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3。實(shí)施例5磷酸氯喹處理后PNAS-2亞細(xì)胞定位的變化抗鼠TRITC二抗購(gòu)于KPL公司;DAPI購(gòu)于碧云天公司。以50μg/ml的磷酸氯喹處理U937細(xì)胞6h后取2XIO5個(gè)細(xì)胞;IXPBS洗滌二次,涂片,干燥后用4%多聚甲醛固定20min,IXPBS洗片3次;0.2%tritonlOO透膜2min,IXPBS洗片3次;5%BSA封閉IOmin后入加11000的PNAS-2單克隆抗體50μ1,4°C孵育過(guò)夜。次日用IXPBS洗滌3次;加入抗鼠TRITC二抗及DAPI于37°C孵育30min,IXPBS洗滌3次,激光共聚焦顯微鏡觀察蛋白亞細(xì)胞定位。如圖4所示,未加磷酸氯喹時(shí)U937細(xì)胞中的PNAS-2蛋白彌漫分布于細(xì)胞漿中,在細(xì)胞核周略有濃集,與本實(shí)驗(yàn)室之前用PNAS-2-GFP融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒得到的PNAS-2亞細(xì)胞定位基本一致;圖5所示的為加磷酸氯喹后U937細(xì)胞中PNAS-2蛋白的亞細(xì)胞定位,可以看見(jiàn)在胞漿內(nèi)彌漫分布的PNAS-2蛋白基本消失,并聚集于核周,與文獻(xiàn)報(bào)道及本實(shí)驗(yàn)室得到的PNAS-2蛋白在正常細(xì)胞中定位于核周的結(jié)論基本一致(WardDM,VaughnMB,ShiflettSL,etal.TheroleofLIP5andCHMP5inmultivesicularbodyformationandHIV-Ibuddinginmammaliancells.JBiolChem,2005.280(11):10548-55.)。證實(shí)磷酸氯喹能通過(guò)穩(wěn)定多泡體膜結(jié)構(gòu),減少PNAS-2蛋白的滲出。說(shuō)明磷酸氯喹治療白血病的機(jī)理之一為通過(guò)穩(wěn)定MVB膜,阻止PNAS-2蛋白由MVB滲出,減少異常定位的PNAS-2蛋白,從而促白血病細(xì)胞凋亡。實(shí)施例6磷酸氯喹處理后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化Fluo3-AM細(xì)胞鈣離子濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司,操作步驟如下每組細(xì)胞取5X106,加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液10ml,37°C5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育;加入Fluo3-AMIOul后繼續(xù)于37°C5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30min;1500rpm離心后棄上清,重新懸浮于0.5mLIXPBS緩沖液中后應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。每組至少檢測(cè)20個(gè)細(xì)胞的熒光值,熒光值越大,說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度越高。未加磷酸氯喹時(shí)細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的平均值為28.99,加藥后71.31(圖6),兩組之間的ρ<0.0001,表明加藥后U937細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯上升,而細(xì)胞內(nèi)鈣離子的上升可致內(nèi)源性凋亡通路的激活;同時(shí)也說(shuō)明了磷酸氯喹對(duì)細(xì)胞膜的確有穩(wěn)定作用。實(shí)施例7磷酸氯喹處理后細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體膜電位的變化線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒MitoProbe.JC-IAssayKit購(gòu)自MolecularProbes公司,操作步驟如下每組細(xì)胞取lX106,1500rpm離心后棄上清,重新懸浮于ImL37°C預(yù)熱的IXPBS緩沖液中。加入10μL200μΜ的JC-1,37°C,5%C02孵育30min。1500rpm離心后棄上清,重新懸浮于0.5ml37°C預(yù)熱的IXPBS緩沖液中后應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)未加磷酸氯喹時(shí)線(xiàn)粒體膜電位崩塌細(xì)胞的比例為2.92%,加藥后64.73%(圖7),兩組之間的p=0.0001,表明加藥后線(xiàn)粒體膜電位崩塌的U937細(xì)胞比例明顯上升,說(shuō)明磷酸氯喹可進(jìn)一步通過(guò)致白血病細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位崩塌而促此類(lèi)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性細(xì)胞凋亡。實(shí)施例8磷酸氯喹處理后細(xì)胞內(nèi)caSpaSe3活性的變化細(xì)胞內(nèi)caspase3活性檢測(cè)試劑盒NucView488Caspase-3AssayKitforLiveCells購(gòu)自Biotium公司,操作步驟如下每組細(xì)胞取1X106,1500rpm離心后棄上清,重新懸浮于ImLIXPBS緩沖液中;各取200μL細(xì)胞懸液加入流式檢測(cè)管中,加入5uL0.2mMNucView488Caspase-3底物儲(chǔ)存液,混勻;室溫孵育30min;加入0.3mlIXPBS緩沖液中后應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)未加磷酸氯喹時(shí)U937細(xì)胞中的CaSpaSe3的活性24.68%,加藥后53.11%(圖7),兩組之間的ρ=0.0161,<0.05,表明加藥后U937細(xì)胞中的caspase3的活性明顯上升。結(jié)合上述結(jié)果,說(shuō)明磷酸氯喹白血病細(xì)胞凋亡的另一機(jī)理為磷酸氯喹通過(guò)穩(wěn)定白血病細(xì)胞膜,使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升,線(xiàn)粒體膜電位崩塌,從而激活Caspase3,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。綜上所述,本發(fā)明應(yīng)用對(duì)細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定作用的藥物如氯喹類(lèi)藥物或其鹽類(lèi)處理白血病細(xì)胞株、原代細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)此類(lèi)藥物處理后可使白血病細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯、顯著增加白血病細(xì)胞的凋亡率,表明氯喹、羥基氯喹或其鹽類(lèi)可用于白血病的治療。本發(fā)明還顯示了氯喹、羥基氯喹或其鹽類(lèi)治療白血病的機(jī)理1,穩(wěn)定MVB膜,阻止PNAS-2蛋白由MVB滲出,減少異常定位的PNAS-2蛋白,從而促白血病細(xì)胞凋亡。2,穩(wěn)定白血病細(xì)胞膜,使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升,線(xiàn)粒體膜電位崩塌,從而激活CaSpaSe3,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。權(quán)利要求氯喹類(lèi)化合物或其鹽類(lèi)在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求1所述的氯喹類(lèi)化合物或其鹽類(lèi)在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用,其特征在于所述的氯喹類(lèi)化合物或鹽類(lèi)選自氯喹、磷酸氯喹、羥基氯喹、鹽酸氯喹、硫酸氯喹、矽酸氯喹或氨基氯喹中的任意一種。3.如權(quán)利要求1所述的氯喹類(lèi)化合物或其鹽類(lèi)在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用,其特征在于所述的治療急性白血病藥物的劑型為粉劑、或者注射液、或者膠囊、或者片劑、或者口服液。全文摘要本發(fā)明提供了一種氯喹類(lèi)化合物或其鹽類(lèi)在制備治療急性白血病藥物中的應(yīng)用,所述的氯喹類(lèi)化合物或鹽類(lèi)選自氯喹、磷酸氯喹、羥基氯喹、鹽酸氯喹、硫酸氯喹、矽酸氯喹或氨基氯喹中的任意一種。本發(fā)明采用對(duì)細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)有穩(wěn)定作用的氯喹類(lèi)藥物處理白血病細(xì)胞株、原代細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)處理后可使白血病細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯、顯著增加白血病細(xì)胞的凋亡率,表明氯喹類(lèi)化合物及鹽類(lèi)可用于白血病的治療。文檔編號(hào)A61P35/02GK101829115SQ20091015972公開(kāi)日2010年9月15日申請(qǐng)日期2009年7月10日優(yōu)先權(quán)日2009年7月10日發(fā)明者劉佳,王海嶸,陳芳源申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院
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