專利名稱：：穩(wěn)定蛋白質制劑的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明大體上涉及含有CTLA4Ig分子的穩(wěn)定制劑，包括用于各種給藥途徑(包括例如靜脈內(IV)和皮下(SC))的低壓凍干和液體制劑。
背景技術：
：在過去20年中，重組DNA技術使許多蛋白質療法商業(yè)化。蛋白質藥物最常規(guī)的給藥途徑為靜脈內(IV)給藥，這是由于絕大多數其它給藥途徑的生物利用度低、臨床給藥時需要更多的監(jiān)控以及更快速的藥物研發(fā)。對于需要頻繁和長期給藥的產品而言，另一種皮下(SC)給藥途徑更具有吸引力。當與預充式注射器和自動注射器技術聯(lián)合使用時，SC給藥允許家庭給藥并提高了給藥的順應性。使用高于lmg/kg或IOOmg/劑量的高劑量治療時需要研發(fā)濃度超過100mg/ml的制劑，這是由于小體積(<1.5ml)才可以通過SC途徑給藥。對于在更高濃度容易聚集的蛋白質而言，達到這樣高濃度的制劑是一種研發(fā)挑戰(zhàn)。甚至對于可以大體積給藥的IV給藥途徑而言，高劑量給藥方案可能需要幾十mg/ml的蛋白濃度，而這一濃度會影響一些蛋白質的穩(wěn)定性?？刂频鞍踪|溶解度的原理比小合成分子的更復雜，因此克服蛋白質的溶解度問題需要不同的策略。在操作上，蛋白質的溶解度可描述為在輔溶質存在下并因此溶液保持澄清(例如，沒有蛋白質沉淀、結晶或凝膠)時蛋白質的最大量。蛋白質的溶解度對離子強度、鹽形式、PH、溫度和某些賦形劑的依賴性可由重力水(bulkwater)表面張力的變化和蛋白質與水和離子的結合與自身結合的對比進行機械學解釋，見Arakawa等，Theoryofproteinsolubility(蛋白質溶解度原理)，MethodsofEnzymology,11449-77,1985；ScheinSolubilityasafunctionofproteinstructureandsolventcomponents(溶解度作為蛋白質結構和溶劑組分的函數)，BioTechnology8(4)=308-317,1990JenkinsThreesolutionsoftheproteinsolubilityproblem(蛋白質溶角軍度問題的三禾中角軍答)，ProteinScience7(2):376_382，1998；及其它。蛋白質與某些賦形劑或鹽的結合可通過蛋白質構象的變化或遮蓋參與自身結合的某些氨基酸影響溶解度。蛋白質也會優(yōu)先被某些鹽、氨基酸和糖水化(并穩(wěn)定化形成更緊致的構象)，導致其溶解度變化。聚集需要兩分子之間的碰撞，是蛋白質溶液中的主要降解途徑。濃度與形成聚集的關系取決于聚集物的大小和結合機制。蛋白質聚集可引起共價(例如二硫鍵連接)或非共價(可逆或不可逆)結合。由非共價結合引起的不可逆聚集通常經由可改變蛋白質天然構象的由溫度、機械或化學過程暴露的疏水區(qū)域發(fā)生。蛋白質聚集可影響蛋白質活性、藥物代謝動力學和安全性，例如由于免疫原性。最小化聚集作用的典型方法為限制蛋白質的移動性以降低碰撞次數。用適當的賦形劑低壓凍干可防止聚集提高蛋白質的穩(wěn)定性，其方式為降低蛋白質的移動性和限制構象的柔性，其另外的益處為由于去除水分使水解反應降至最低。加入適當的賦形劑，包括凍干保護劑，可防止在凍干和終產品的保存過程中發(fā)生聚集。有效保護的關鍵參數為凍干保護劑與蛋白質的摩爾比值。通常要求3001或更高的摩爾比值以提供適當的穩(wěn)定性，尤其是對于室溫保存。然而這些比值也可弓I起不利的粘度增加。低壓凍干可設計具有適當穩(wěn)定性和張力的制劑。雖然SC給藥并不一定要求等滲性，但對于降低給藥時的疼痛還是有需要的。親液物的等滲性較難達到，這是由于在重新溶解的過程中蛋白質和賦形劑都被濃縮。如果終蛋白濃度的目標>100mg/ml，5001的賦形劑與蛋白質的摩爾比將得到高滲制劑。如果要得到等滲制劑，那么各種可供選擇的較低的賦形劑與蛋白質摩爾比將可能得到較不穩(wěn)定的制劑。確定可達到的最高蛋白質濃度仍然取決于經驗，這是由于蛋白質構象的易變性和其與自身、與表面和特定溶質相互作用的傾向性?？蓮腟C制劑中獲益的受試者實例為其病癥需要頻繁或長期給藥的患者，例如患有免疫系統(tǒng)疾病、類風濕性關節(jié)炎和與移植物移植相關的免疫紊亂的受試者。可購買的用于治療類風濕性關節(jié)炎的蛋白質產品包括HUMIRA,ENBREL和REMICADE。HUMIRA(Abbott)的包裝為一次性、Iml的預充式玻璃注射器作為無菌的、不含防腐劑的溶液用于皮下給藥。HUMIRA溶液澄清、無色，pH約為5.2。每一支注射器可釋放0.8ml(40mg)的藥品。每0.8mlHUMIRA含有40mg阿達木單抗、4.93mg氯化鈉、0.69mg二水合磷酸二氫鈉、1.22mg二水合磷酸氫二鈉、0.24mg檸檬酸鈉、1.04mg一水合檸檬酸、9.6mg甘露醇、0.8mg聚山梨酯80和注射用水USP。必要時加入氫氧化鈉調節(jié)pH。ENBREL(Amgen)的包裝為一次性、Iml的預充式注射器作為無菌的、不含防腐劑的溶液用于皮下給藥。ENBREL溶液澄清、無色，pH為6.3士0.2。每一支ENBREL一次性預充式注射器含有0.98ml的50mg/ml依那西普溶液，其中含10mg/ml蔗糖、5.Smg/ml氯化鈉、5.3mg/mlL-精氨酸鹽酸鹽、2.6mg/ml一水合磷酸二氫鈉和0.9mg/ml無水磷酸氫二鈉。如果將管形瓶重新溶解并按照建議給藥，給藥一支50mg/ml的ENBREL預充式注射器相當于2支25rng的ENBREL凍干管形瓶。ENBREL多次使用管形瓶含有無菌、白色、不含防腐劑的凍干粉末。用Iml所提供的抑菌性注射用水(BWFI)，USP(含有0.9%苯甲醇)可都得到多次使用、澄清、無色溶液，PH為7.4士0.3，含有25mg依那西普、40mg甘露醇、IOmg蔗糖和1.2mg氨丁三醇。REMICADE(Centocor)為用于靜脈輸注的無菌、白色、凍干粉末。在用IOml無菌注射用水USP重新溶解后，所得PH接近7.2。每一支一次性管形瓶含有IOOmg英夫利昔單抗、500mg蔗糖、0.5mg聚山梨酯80、2.2mg—水合磷酸二氫鈉和6.Img二水合磷酸二氫鈉。不添加防腐劑?？少徺I的用于治療與移植物移植相關的免疫紊亂的蛋白質產品包括SIMULECT*ZENAPAX。藥品SIMTJLECT(Novartis)為無色凍干物，其包裝為6ml無色玻璃管形瓶，含量為IOmg和20mg。每一支ΙΟ-mg管形瓶含有IOmg巴利昔單抗、3.61mg—水合磷酸二氫鈉、0.50mg磷酸氫二鈉(無水)、0.80mg氯化鈉、IOmg蔗糖、40mg甘露醇和20mg甘油，用2.5ml無菌注射用水USP重新溶解。每一支20-mg管形瓶含有20mg巴利昔單抗、7.2Img磷酸二氫鉀、0.99mg磷酸氫二鈉(無水)、1.6Img氯化鈉、20mg蔗糖、80mg甘露醇和40mg甘油，用2.5ml無菌注射用水USP重新溶解。不添加防腐劑。ZENAPAX(RocheLaboratories)，25mg/5ml，為用于進一步稀釋和靜脈內給藥的澄清、無菌、無色濃縮物。每毫升ZENAPAX含有5mg達克珠單抗和3.6mg一水合磷酸二氫鈉、Ilmg七水合磷酸氫二鈉、4.6mg氯化鈉和0.2mg聚山梨酯80并且可含有鹽酸或氫氧化鈉以調節(jié)PH至6.9。不添加防腐劑。CTLA4Ig分子可通過抑制⑶28-B7相互作用干擾T細胞協(xié)同刺激。因此，CTLA4Ig分子可用于治療免疫系統(tǒng)疾病，例如類風濕性關節(jié)炎和與移植物移植相關的免疫紊亂。我們需要一種含有CTLA4Ig分子用于治療免疫系統(tǒng)紊亂的穩(wěn)定、有效、方便的制劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供了治療免疫系統(tǒng)紊亂的制劑，其方式為給予受試者CTLA4Ig分子，其可與B7陽性細胞上的B7分子結合并因此抑制內源性B7分子與CTLA4和/或⑶28在T-細胞上的結合。本發(fā)明的凍干制劑包含CTLA4Ig分子，其蛋白質與凍干保護劑的重量比至少為12。凍干保護劑優(yōu)選糖，更優(yōu)選雙糖，最優(yōu)選蔗糖或麥芽糖。凍干制劑也可含有一種或多種選自緩沖劑、表面活性劑、填充劑和防腐劑中的組分。在某些實施方案中，用于穩(wěn)定凍干藥品的蔗糖或麥芽糖的量為蛋白質與蔗糖或麥芽糖的重量比至少為12，優(yōu)選蛋白質與蔗糖或麥芽糖的重量比至少為12至15，更優(yōu)選蛋白與蔗糖或麥芽糖的重量比約為12。本發(fā)明的皮下(SC)制劑在含水載體中含有蛋白濃度至少為100mg/ml的CTLA4Ig分子與穩(wěn)定化水平的糖，優(yōu)選至少為125mg/ml的蛋白質濃度與穩(wěn)定化水平的糖。該糖的優(yōu)選重量比至少為蛋白質與糖11.1。穩(wěn)定劑的使用量優(yōu)選不大于可能引起SC注射器給藥時不利或不適當粘度的量。糖優(yōu)選為二糖，最優(yōu)選為蔗糖。SC制劑也可含有一種或更多種選自緩沖劑、表面活性劑和防腐劑的組分。在某些實施方案中，用于穩(wěn)定CTLA4Ig分子SC藥品的蔗糖用量為蛋白質與蔗糖的重量比至少為11，優(yōu)選蛋白質與蔗糖的重量比為13至15，更優(yōu)選蛋白質與蔗糖的重量比約11.4。本發(fā)明的液體制劑在含水載體中包含蛋白質濃度至少為20mg/ml的CTLA4Ig分子與穩(wěn)定化水平的糖，優(yōu)選至少25mg/ml與穩(wěn)定化水平的糖。優(yōu)選糖的重量比至少為蛋白質與糖11。糖優(yōu)選雙糖，最優(yōu)選蔗糖。該液體制劑也可含有一種或更多種選自緩沖劑、表面活性劑和防腐劑的組分。在某些實施方案中，用于穩(wěn)定液體藥品的蔗糖用量為蛋白質與蔗糖的重量比至少為11，優(yōu)選蛋白質與蔗糖的重量比為12至110，更優(yōu)選蛋白質與蔗糖的重量比約12。在本發(fā)明的另一個實施方案中提供了制造品，其包括藥品并優(yōu)選提供其使用說明。本發(fā)明進一步提供了給予本發(fā)明CTLA4Ig分子制劑治療免疫系統(tǒng)疾病和耐受誘導作用的方法。附圖簡介圖1顯示了CTLA4Ig分子表達盒一部分的核苷酸序列(SEQIDNO:1)。也顯示了由該核酸編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。可由該表達盒生產的CTLA4Ig分子包括具有以下殘基的氨基酸序列(i)SEQIDNO:2的26-383，(ii)SEQIDNO:2的26-382，(iii)SEQIDNO2的27-383或(iv)SEQIDNO2的26-382，或任選(v)SEQIDNO2的25-382或(vi)SEQIDNO:2的25-383。該表達盒包含以下區(qū)(a)抑瘤素M信號序列(SEQIDNO:1的核苷酸11-88；SEQIDNO2的氨基酸1-26)；(b)人CTLA4的胞外結構域(SEQIDNO1的核苷酸89-463；SEQIDNO2的氨基酸27-151)；(c)人IgGl恒定區(qū)的被修飾部分(SEQIDNO1的核苷酸464-1159；SEQIDNO2的氨基酸152-383)，包括被修飾的絞鏈區(qū)(SEQIDNO1的核苷酸464-508；SEQIDNO2的氨基酸152-166)，被修飾的人IgGlCH2結構域(SEQIDNO1的核苷酸509-838；SEQIDNO2的氨基酸167-276)和人IgGlCH3結構域(SEQIDNO1的核苷酸839-1159；SEQIDNO2的氨基酸277-383)。圖2描述了CTLA4-L104EA29Y-Ig(也稱作“L104EA2OTIg”和“LEA29Y”)的核苷酸(SEQIDNO3)和氨基酸(SEQIDNO4)序列，其含有信號肽；突變的CTLA4胞外結構域，起于+1位的甲硫氨酸止于+124位的天冬氨酸或起于-1位的丙氨酸止于+124位的天冬氨酸；和Ig區(qū)。SEQIDNO3和4分別描述了L104EA29YIg的核苷酸和氨基酸序列，其含有有信號肽；突變的CTLA4胞外結構域，起于+27位置的甲硫氨酸止于+150位的天冬氨酸或起于+26位的丙氨酸止于+150位的天冬氨酸；和Ig區(qū)。L104EA29YIg可具有以下殘基的氨基酸序列(i)SEQIDNO4的26-383，(ii)SEQIDNO4的26-382；(iii)SEQIDNO4的27-383或(iv)SEQIDNO4的27-382，或任選(v)SEQIDNO4的25-382，或(vi)SEQIDNO:4的25-383。發(fā)明詳述如本文中使用“穩(wěn)定的”制劑或藥品為在保存過程中其中的CTLA4Ig分子可基本保持其物理和化學穩(wěn)定性和完整性的制劑或藥品。可在所選溫度下經過所選時間段后測定CTLA4Ig分子制劑的穩(wěn)定性。例如，凍干和保存后聚集形成的增加可作為凍干的CTLA4Ig分子制劑不穩(wěn)定性的指標。除了聚集形成之外，在保存期間原有澄清度、顏色和氣味的保持都可用作監(jiān)控CTLA4Ig分子溶液穩(wěn)定性的指標。HMW種類為多聚體(例如，四聚體，七聚體等)，其分子量大于CTLA4Ig分子二聚體。通常，一種“穩(wěn)定的”藥品為于2-8°C保存一年其中的聚集增加(通過高分子量種類(％HMW)的增加測定)小于約5%并優(yōu)選3%的藥品。所生產的藥品優(yōu)選含有小于約25%的HMW種類，優(yōu)選小于約15%HMW種類，更優(yōu)選小于約10%HMW種類，最優(yōu)選小于約5%HMW種類?？赏ㄟ^分子排阻色譜(SEC)分離CTLA4Ig分子的單體、二聚體和HMW種類。SEC基于分子大小分離分子。當分子沿著柱子長度遷移時通過差別分子排阻或進入實現分離。因此，隨著柱子長度的增加分離度增加。可使用串聯(lián)了TSKGelG3000SWXL(300mmX7.8mm)禾口TSKGelG3000SWXL(40mmx6.0mm)柱(TosohBioscience,Montgomery,PA)的2695A1lianceHPLC(Waters，Milford，MA)分離CTLA4Ig分子樣品?？捎煤?.2MKH2PO4和0.9%NaCl，pH6.8的流動相在流速為1.0ml/min時分離10mg/ml(20μ1等分試樣)的樣品。使用Water’s2487雙波長檢測器于280nm處檢測樣品吸光值。使用這一系統(tǒng)，HMW種類的保留時間為7.5min士1.Omin。對每一個峰的峰下面積積分。HMW種類峰面積除以總峰面積可計算得到％HMW種類?！爸匦氯芙狻敝苿橥ㄟ^將凍干制劑溶解于含水載體制備的制劑，這樣CTLA4Ig分子被溶解至重新溶解的制劑中。該重新溶解的制劑適用于對需要的病人進行靜脈內給藥(IV)?！暗葷B”制劑為與人血液具有基本相同的滲透壓的制劑。等滲制劑的滲透壓通常為250至350m0smOl/KgH20。術語“高滲”用于描述滲透壓高于人血液滲透壓的制劑。例如可使用蒸汽壓或冰凍型滲透壓劑測量等滲性。術語“緩沖劑”指當加入至含水溶液中可防止加入酸或堿或溶劑稀釋時溶液pH變化的一種或多種組分。除了磷酸鹽緩沖液，也可使用甘氨酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液及類似緩沖液，其中鈉、鉀或銨可作為平衡離子。“酸”為可在含水溶液中產生氫離子的物質?！八帉W可接受酸”包括無機和有機酸，其在制劑中使用的濃度和方式是無毒性的。“堿”為可在含水溶液中產生羥基離子的物質?！八帉W可接受的堿”包括無機和有機堿，其在制劑中使用的濃度和方式是無毒性的。“凍干保護劑”為當與相關蛋白質結合時可防止或降低該蛋白質在凍干和之后的儲存過程中化學和/或物理不穩(wěn)定性的分子。“防腐劑”為可降低細菌作用的試劑，可選擇性加入本文的制劑中。加入防腐劑可，例如，輔助多劑量制劑的生產?？捎玫姆栏瘎嵗ㄊ送榛谆S基氯化銨、氯己雙銨、苯扎氯銨(十八烷基二甲基芐基氯化銨的混合物，其中的烷基為長鏈化合物)和氯化芐乙銨。其它類型的防腐劑包括芳族醇，例如苯酚、丁基和苯甲基醇，烷基尼泊金類，例如甲基或丙基尼泊金，兒茶酚，間苯二酚，環(huán)己醇，3-戊醇和間甲酚?！氨砻婊钚詣睘楹惺杷糠?例如烷基鏈)和親水部分(例如羧基和羰酸基團)的表面活性分子?？蓪⒈砻婊钚詣┘尤氡景l(fā)明的制劑中。適用于本發(fā)明制劑的表面活性劑包括但不限于聚山梨酯(例如聚山梨酯20或80)；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)；山梨坦酯及其衍生物；Triton；十二烷基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；十二烷基、十四烷基、亞油酰_或硬脂酰_磺基甜菜堿；十二烷基、十四烷基、亞油?；蛴仓肌氨酸；亞油酰_、十四烷基或十六烷基_甜菜堿；月桂酰胺丙基_、椰油酰胺丙基_、亞油酰胺丙基_、肉豆蔻酰胺丙基_、棕櫚酰胺丙基-或異硬脂酰胺丙基甜菜堿(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基_、棕櫚酰胺丙基_或異硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油?；；撬徕c或甲基油?；；撬岫c；和M0NAQUAT系列(MonaIndustries,Inc.，Paterson,N.J.)；聚乙二醇，聚丙醇以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，Pluronics,PF68等)?！八幬铩敝赣糜谒幬锝K產品制劑的起始材料。通常CTLA4Ig藥物組合物含有濃度為20mg/ml至60mg/ml，pH7至8的蛋白質并且％HMW<5%?！耙雅渲瞥傻目傮w溶液”指注入容器之前的最終制劑，例如注入管形瓶用于凍干前的已配制成的溶液或注入用于SC注射的注射器之前的已配制成的溶液?！八幤贰敝赴b于容器中的最終制劑，其可在使用前被重新溶解，例如凍干藥品；使用前被稀釋，例如液體藥品；或被用作SC溶液藥品。術語“CTLA4-Ig”或“CTLA4-Ig分子”或“CTLA4Ig分子”可交換使用，指至少包含具有CTLA4胞外結構域或其部分片段和免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分片段的多肽的蛋白質分子。該胞外結構域和免疫蛋白恒定區(qū)可為野生型，或突變型或修飾型，和哺乳動物型，包括人和小鼠。該多肽可進一步包括附加蛋白結構域。CTLA4-Ig分子也可指該多肽的多聚體形式，例如二聚體、四聚體和七聚體。CTLA4-Ig分子也可與⑶80和/或⑶86結合。術語“B7-1”指CD80；術語“B7-2”指CD86；術語“B7”指B7-1和B7-2(CD80和CD86)兩者。術語“B7-1-Ig”“或“B7-lIg”指CDSO-Ig；術語“B7-2_Ig”或“B7_2Ig”指CD86-Ig。在一個實施方案中，“CTLA4Ig”指具有以下殘基的氨基酸序列的蛋白質分子(i)SEQIDNO:2的26-383，(ii)SEQIDNO:2的26-382；(iii)SEQIDNO:2的27-383，或(iv)SEQIDNO:2的27-382，或任選(v)SEQIDNO:2的25-382，或(vi)SEQIDNO:2的25-383。在單體形式中，這些蛋白質可在本文中指“SEQIDNO:2單體，”或“具有SEQIDNO:2序列的”單體。這些SEQIDNO:2單體可二聚體化，這些二聚體組合可包括，例如(i)和(i)；(i)和(ii)；⑴和(iii)；⑴和(iv)；(i)和(ν)；(i)和(vi)；(ii)和(ii)；(ii)和(iii)；()和(iv)；(ii)和(ν)；(ii)和(vi)；(iii)和(iii)；(iii)和(iv)；(iii)和(ν)；(iii)和(vi)；(iv)和(iv)；(iv)和(ν)；(iv)和(vi)；(ν)和(ν)；(ν)和(vi)；和，(vi)和(vi)。這些不同的二聚體組合也可以相互組合形成四聚體CTLA4Ig分子。這些單體、二聚體、四聚體和其它多聚體可在本文中指“SEQIDNO:2蛋白質”或“具有SEQIDNO:2序列”的蛋白質。(編碼如SEQIDNO2中所示CTLA4Ig的DNA按照布達佩斯條約的規(guī)定于1991年5月31日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBlvd.，Manassas，VA20110-2209，ATCC登錄號ATCC68629；表達如SEQIDNO:2所示CTLA4Ig的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系于1991年5月31日保藏，ATCC標識號為CRL-10762)。如本文所使用，"Abatac印t”指SEQIDN0:2蛋白。在一個實施方案中，CTLA4-L104EA29Y_Ig(有時稱作“LEA29Y”或“L104EA29Y”)為基因工程融合蛋白，與SEQIDNO1所示的CTAL4_Ig分子具有相似的結構。L104EA29Y-Ig具有被修飾的人CTLA4功能性胞外結合結構域和IgGl類人免疫球蛋白的Fc結構域。對CTLA4結構域B7結合區(qū)域的兩個氨基酸進行修飾以產生L104EA29Y，將104位(L104E)的亮氨酸突變?yōu)楣劝彼?在SEQIDNO2的130位)并將29位(A29Y)的丙氨酸突變?yōu)槔野彼?在SEQIDNO2的55位)。SEQIDNOS3和4分別描述了含有信號肽的L104EA29YIg的核苷酸和氨基酸序列；突變的CTLA4胞外結構域，起于+27位的甲硫氨酸，止于+150位的天冬氨酸，或起于+26位的丙氨酸，止于+150位的天冬氨酸；和Ig區(qū)。編碼L104EA29Y-Ig的DNA按照布達佩斯條約的規(guī)定于2000年6月20日保存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。ATCC登錄號為PTA-2104。美國專利7094874(頒發(fā)于2006年8月22日)和WO01/923337A2中進一步描述了L104EA29Y_Ig，均以其整體并于本文以作參考。在哺乳細胞中表達L104EA29YIg可產生N-和C-端突變體，因此所產生的蛋白質可具有以下殘基的氨基酸序列(i)SEQIDNO4的26-383，(ii)SEQIDNO4的26-382；(iii)SEQIDNO:4的27-383或(iv)SEQIDNO:4的27-382，或任選(ν)SEQIDNO:4的25-382，或(vi)SEQIDNO:4的25-383。如果為單體形式，這些蛋白質在本文中可指“SEQIDNO:4單體”或“具有SEQIDNO:4序列”的單體。這些蛋白質可二聚體化，這些二聚體組合可包括，例如⑴和⑴；⑴和()；⑴和(iii)；⑴和(iv)；⑴和(ν)；⑴和(vi)；()和()；()和(iii)；()和(iv)；(ii)和(ν)；(ii)和(vi)；(iii)和(iii)；(iii)和(iv)；(iii)和(ν)；(iii)和(vi)；(iv)和(iv)；(iv)和(ν)；(iv)和(vi)；(ν)和(ν)；(ν)和(vi)；和，(vi)和(Vi)0這些不同的二聚體組合也可以相互組合形成四聚體L104EA29YIg分子。這些單體、二聚體、四聚體和其它多聚體在本文中可指“SEQIDN0:4蛋白質”或“具有SEQIDNO:4序列”的蛋白質。如本文所使用，“Belatac印t”指SEQIDNO4蛋白。CTLA4-lg單體和多聚體CTLA4-Ig分子包括，例如CTLA4_Ig蛋白單體、二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體或其它多聚體形式。CTLA4-Ig分子可包含至少具有一個CTLA4胞外結構域和一個免疫球蛋白恒定區(qū)的蛋白質融合。CTLA4-Ig分子可具有野生型或突變型序列，例如CTLA4的胞外域和免疫球蛋白恒定區(qū)序列。單獨CTLA4-Ig單體或二聚體、四聚體或其它多聚體形式均可被糖基化。在一些實施方案中，本發(fā)明提供至少具有一定百分比的二聚體或其它多聚體分子的CTLA4-Ig分子群。例如，本發(fā)明提供CTLA4-Ig二聚體大于90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的CTLA4-Ig分子群。在一個實施方案中，本發(fā)明提供含有約95%至約99.5%CTLA4-Ig二聚體和約0.5%to至約5%CTLA4_Ig四聚體的CTLA4_Ig分子群。在另一個實施方案中，CTLA4-Ig分子群含有約98%的CTLA4-Ig二聚體、約1.5%的CTLA4_Ig四聚體和約0.5%的CTLA4-Ig單體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了基本不含CTLA4_Ig單體分子的CTLA4_Ig分子群?；静缓珻TLA4-Ig單體分子可指具有少于1%、0.5%或0.1%單體的CTLA4_Ig分子群。W052]在一個實施方案中，本發(fā)明提供了基本不含大于二聚體，例如四聚體、六聚體等的CTLA4-Ig多聚體的CTLA4-Ig分子群?；静缓笥诙垠w的CTLA4_Ig多聚體可指含有少于6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%或0.1%大于二聚體的CTLA4_Ig多聚體的CTLA4_Ig分子群。在一個實施方案中，CTLA4_Ig單體分子可具有，例如，以下氨基酸序列(i)SEQIDNO2的26-383，(ii)SEQIDNO2的26-382(iii)SEQIDNO2的27-383，或(iv)SEQIDNO2的27-382或任選(v)SEQIDNO2的25-382或(vi)SEQIDNO2的25-383。當在CHO細胞中表達含有SEQIDNO:1氨基酸序列的表達盒時，所表達的大多數單體形式具有甲硫氨酸(SEQIDNO:2的殘基27)N-端氨基酸殘基，其與野生型人CTLA4的N-端氨基酸殘基一致。但是，由于SEQIDNO1也包括抑瘤素M信號序列(SEQIDNO1的11-88核苷酸)的編碼序列，所以從SEQIDNO:1表達的蛋白質包括抑瘤素M信號序列。在蛋白質運出細胞質或分泌出細胞的過程中，該信號序列從所表達的蛋白質上剪切下來。但是該剪切過程可產生N-端突變體，例如氨基酸殘基25至26之間的剪切(得到殘基26的N-端，如“丙氨酸變異體”)，或氨基酸殘基24至25之間(得到殘基2的N-端，如“天冬氨酸-丙氨酸變異體”)，與氨基酸殘基26至27之間的剪切相反(得到殘基27的N-端)。例如，天冬氨酸_丙氨酸變異體可以約1%存在于CTLA4-Ig分子混合物中，丙氨酸變異體可以8-10%存在于CTLA4-Ig分子混合物中。此外，由于不完全加工，從SEQIDNO:1表達的蛋白質可具有C-端變異體。大多數C-端為SEQIDNO:2殘基382的甘氨酸。在CTLA4_Ig分子混合物中可存在例如約4-5%具有C-端賴氨酸(SEQIDNO:2的殘基383)的單體。CTLA4-Ig單體分子可含有人CTLA4的胞外結構域。在一個實施方案中，該胞外結構域可包含編碼SEQIDNO:2的氨基酸27-151的SEQIDNO1的核苷酸89-463的核苷酸序列。在另一個實施方案中，該胞外結構域可包含人CTLA4的突變序列。在另一個實施方案中，該胞外結構域可包含SEQIDNO:1核苷酸89-463的核苷酸變化，這樣就改變了保守氨基酸。在另一個實施方案中，該胞外結構域可包含至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%與5￡0IDNO:1核苷酸89-463相同的核苷酸序列。CTLA4_Ig單體分子可含有人免疫球蛋白的恒定區(qū)。該恒定區(qū)可為一個恒定區(qū)的一部分；該恒定區(qū)可具有野生型或突變型序列。該恒定區(qū)可源自人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、化1、1841、1842、180或化￡。該恒定區(qū)可源自免疫球蛋白的輕鏈或重鏈。當該恒定區(qū)源自IgG、IgD或IgA分子時，該恒定區(qū)含有一個或更多個以下恒定區(qū)結構域CL、CHI、鉸鏈區(qū)、CH2或CH3。當該恒定區(qū)源自IgM或IgE時，該恒定區(qū)含有一個或更多個以下恒定區(qū)結構域(^、011、012、013或014。在一個實施方案中，該恒定區(qū)可包含一個或更多個源自IgG、IgD、IgA、IgM或IgE的結構域。在一個實施方案中，CTLA4_Ig單體分子含有被修飾的人IgGl鉸鏈區(qū)(SEQIDNO1的核苷酸464-508；SEQIDNO2的氨基酸152-166)，其中SEQIDNO2的氨基酸殘基156、162和165的絲氨酸來自于野生型序列中的半胱氨酸。在一個實施方案中，CTLA4_Ig單體分子含有被修飾的人IgGlCH2區(qū)和野生型CH3區(qū)(具有SEQIDNO:1核苷酸509-838和SEQIDNO:2氨基酸167-276的被修飾人IgGlCH2結構域；含有SEQIDNO:1核苷酸839-1159和SEQIDNO:2氨基酸277-383的人IgGlCH3結構域)。在一個實施方案中，CTLA4_Ig分子群含有具有以下序列的單體，如2006年8月22日頒發(fā)的美國專利7，094，874的圖7、8或9中任一個或多個中以及公布號為US20030083246和US20040022787的美國專利申請中所顯示的序列，其均以其整體并于本文作為參考。在一個實施方案中，CTLA4_Ig四聚體分子含有兩對CTLA4_Ig多肽或兩個CTLA4-Ig多肽二聚體，其中各多肽具有以下氨基酸序列之一(i)SEQIDNO2的26-383，(ii)SEQIDNO:2的26-382，(iii)SEQIDNO:2的27-383，或(iv)SEQIDNO:2的27-382，或任選(v)SEQIDNO2的25-382或(vi)SEQIDNO2的25-383。多肽對或二聚體的每一成員與另一成員共價連接，并且兩對多肽之間非共價連接并由此形成四聚體。該四聚體分子可與⑶80或⑶86結合。在另一個實施方案中，該四聚體分子可與⑶80或⑶86結合，其親和力至少比CTLA4-Ig二聚體(其單體具有上述氨基酸序列之一)與⑶80或⑶86的親和力大2倍。在另一個實施方案中，該四聚體可與⑶80或⑶86結合，其親和力至少比野生型CTLA4與⑶80或CD86的親和力大2倍。這一更大的親和力有助于在治療免疫紊亂和其它下述疾病中的達到更高的藥效。此外，更高或經提高的親和力可產生更高的藥效強度。例如，含有CTLA4-Ig四聚體的醫(yī)藥組合物將具有更高的親和力并因此比相同量的含有CTLA4-Ig單聚體的醫(yī)藥組合物具有更高的藥效強度。在另一個實施方案中，該四聚體分子對T細胞增殖的抑制比CTLA4-Ig二聚體相(其單聚體具有以上氨基酸序列之一)大2倍。在另一個實施方案中，該四聚體分子對T細胞增殖的抑制比野生型CTLA4分子至少大2倍。可使用本
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的標準測定法檢測T細胞增殖，例如，最常用的檢測T細胞增殖的方法之一為通過抗原或TCR的激動性抗體激活T細胞并檢測，例如氚(titrated)-胸腺嘧啶(3H-TdR)摻入增殖T細胞的情況，或增殖T細胞釋放至培養(yǎng)基中的細胞因子的量?？捎纱藴y定CTLA4-Ig分子對T細胞激活或增殖的抑制作用。CTLA4-Ig分子的親和性為該分子與單鏈，包括CD80、CD86或CD80Ig或CD86Ig融合蛋白的結合力?？墒褂美缁诒砻娴入x振子技術的結合相互作用分析(BIA)測定CTLA4-Ig與配體的親和性。除了檢測結合力，它還使結合動力學例如結合和解離速率常數等得以實時測定。將一種由金屬薄膜包被的玻片(與表面基質共價結合)組成的傳感器芯片用相互作用物之一即CTLA4-Ig或配體之一包被。使含有其它相互作用物的溶液流過該表面。將一連續(xù)光束照射表面的另一側，測量其反射角。當CTLA4-Ig與配體結合時，光束的共振角發(fā)生變化(因為其取決于傳感器反應側鄰近介質的屈光指數，其與介質中溶解物質的濃度直接相關)。接著由計算機輔助分析。在一個實施方案中，可在BIAcore儀器(BIAcoreAG，Uppsala，Sweden)上通過表面等離子共振(SPR)進行CTLA4-Ig結合試驗。CTLA4-Ig可通過伯胺基團共價偶聯(lián)至BIAcore傳感器芯片上的羧甲基葡聚糖基質上，從而將CTLA4-Ig固定至芯片上?；蛘?，可用抗恒定區(qū)抗體將CTLA4-Ig通過Ig片段間接固定至傳感器表面。然后，將配體加入芯片以檢測CTLA4-Ig與配體的結合?？筛鶕anderMerwe,P.等，J.Exp.Med.(1997)185(3)393-404描述的方法進行親和力測定。可測定CTLA4_Ig分子的親和力。親和力可定義為兩個分子或細胞之間在多位點上的總結合力。親和力(avidity)與親和性(affinity)不同，后者為一個分子上的某一位點與其配體的結合強度。不受理論的約束，更高的CTLA4-Ig分子親合力可增強CTLA4-Ig分子對T-細胞增殖和激活的藥效強度。可通過兩類固相分析測定親合力，例如a)競爭抑制檢測和b)洗脫檢測。在兩種情況下，配體均與固相載體結合。在競爭性抑制檢測中，將固定濃度的CTLA4-Ig分子與不同濃度的配體加入溶液中，測定可抑制50%固相結合的配體數量。所需配體越少，親合力越強。在洗脫檢測中，將配體加入溶液中。在達到平衡態(tài)之后，加入不同濃度的離液劑或變性劑(如異硫氰酸鹽、尿素或二乙胺)干擾CTLA4-Ig/配體相互作用。然后用ELISA測定CTLA4-Ig抗性洗脫液的量。親合力越高，用于洗脫某一數量CTLA4-Ig所需的離液劑越多。CTLA4-Ig分子異質混合物的相對親合力可以表示為親和力指數(AI)，等于洗脫50%結合CTLA4-Ig分子所需的洗脫劑濃度。可通過測定不同濃度的洗脫劑洗脫的CTLA4-Ig百分比進行精細分析。生產本發(fā)明CTLA4-lg分子的方法可在原核細胞中表達CTLA4_Ig分子。各種細菌株可通常代表大多數的原核細胞。細菌可為革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性。通常優(yōu)選革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌(E.coli)。也可使用其它微生物株。將如上所述的編碼CTLA4_Ig分子的序列插入用于表達外原序列的原核細胞載體中，例如大腸桿菌。這些載體可包括通常使用的原核控制序列，其在本文定義為包括用于起始轉錄的啟動子，任選含有操縱子，以及核糖體結合位點序列，包括這些常用的啟動子例如內酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)啟動子系統(tǒng)(Chang，等，(1977)Nature198:1056)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(Goeddel，等，(1980)NucleicAcidsRes.84057)以及入衍生Pl啟動子和N-基因核糖體結合位點(Shimatake，等，(1981)Nature292:128)。這樣的表達載體也包括復制起點和可篩選標記，例如使其具有抗生素抗性的內酰胺酶和新霉素磷酸轉移酶基因，這樣載體可在細菌內復制并且可在抗生素(例如氨芐西林或卡那霉素)存在下生長從而篩選攜帶質粒的細胞?？赏ㄟ^各種標準方法將表達質粒導入原核細胞，包括但不限于CaCl2休克(Cohen，(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA692110和Sambrook等.(eds.)，“分子克隆實驗室手冊”("MolecularCloning:ALaboratoryManual”)，第二版，冷泉港出版社(1989))和電穿孔。與本發(fā)明的實踐一致，真核細胞也可為適當的宿主細胞。真核細胞的實例包括任何動物細胞，原始的或固定化的，酵母(例如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和畢赤酵母(Pichiapastoris))和植物細胞。骨髓瘤、COS和CH0細胞為可作為宿主的動物細胞實例。尤其是CH0細胞包括但不限于DG44(Chasin，等，1986Som.Cell.Molec.Genet.12:555_556;Kolkekar1997Biochemistry36:10901-10909)、CH0-K1(ATCCNo.CCL-61)、CH0-K1Tet-On細胞系(Clontech)、標為ECACC85050302的CH0(CAMR,Salisbury,Wiltshire,UK)，CH0克隆13(GEIMG，Genova,IT)、CH0克隆B(GEIMG，Genova,IT)、標為ECACC93061607的CH0-K1/SF(CAMR,Salisbury,Wiltshire,UK)和標為ECACC92052129的RR-CH0K1(CAMR，Salisbury,Wiltshire,UK)。示例性植物細胞包括煙草(全植物、細胞培養(yǎng)物或愈傷組織)、玉米、大豆和水稻細胞。玉米、大豆和水稻細胞也可接受。也可將上述編碼CTLA4Ig分子的核酸序列插入用于表達外源序列的真核宿主中。該載體的調控元件依具體的真核宿主而不同。用于表達載體的常用真核控制序列包括與哺乳動物細胞相容的啟動子和控制序列，例如CMV啟動子(CDM8載體)和鳥類肉瘤病毒(ASV)(jiLN載體)。其它常用啟動子包括猿猴病毒40(SV40)(Fiers，等，(1973)Nature273:113)的早期和晚期啟動子，或其它病毒啟動子，例如衍生自多瘤、腺病毒2和牛乳頭狀瘤病毒的啟動子。也可使用誘導型啟動子，例如hMTII(Karin，等，(1982)Nature299:797_802)。在真核細胞中表達CTLA4Ig分子的載體也可攜帶被稱作增強子區(qū)的序列。這些對于優(yōu)化基因表達是非常重要的并且存在于啟動子區(qū)的上游或下游。用于真核宿主細胞的表達載體實例包括但不限于哺乳動物宿主細胞載體(例如，BPV-1、pHyg、pRSV、pSV2、pTK2(Maniatis)；pIRES(Clontech)；pRc/CMV2、pRc/RSV、pSFVl(LifeTechnologies)；pVPakc載體、pCMV載體、pSG5載體(Stratagene))、逆轉錄病毒載體(例如，pFB載體(Stratagene))，pCDNA-3(Invitrogen)或其修飾形式、腺病毒載體；腺伴隨病毒載體、桿狀病毒載體、酵母載體(例如，PESC載體(Stratagene))?？蓪⒕幋aCTLA4Ig分子的核酸序列整合至真核宿主細胞的基因組中并按照宿主基因組復制的方式復制。或者，攜帶CTLA4Ig分子的載體可含有允許染色體外復制的復制起點。對于在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表達核酸序列，可使用來自酵母質粒的復制起點2y環(huán)(Broach,(1983)Meth.Enz.101:307)?；蛘?，可使用來自酵母基因組可啟動自主復制的序列(見例如，Stinchcomb等，(1979)Nature28239；Tschemper等，(1980)Gene10157；和Clarke等，(1983)Meth.Enz.101300)。酵母載體的轉錄控制序列包括用于合成糖酵解酶(Hess等.，(1968)J.Adv.EnzymeReg.7149；Holland等，(1978)Biochemistryl74900)的啟動子。本
技術領域：
已知的其它啟動子包括CDM8載體(Toyama核Okayama，(1990)FEBS268217~221)中提供的CMV啟動子、3-磷酸甘油酸酯激酶的啟動子(Hitzeman等.，(1980)J.Biol.Chem.2552073)和其它糖酵解酶的啟動子。其它啟動子為誘導型，因為它們受環(huán)境刺激和細胞生長培養(yǎng)基的調節(jié)。這些誘導型啟動子包括熱休克蛋白、醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酯酶、與氮分解代謝相關的酶和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的基因。調控序列可位于編碼序列的3’端。這些序列可穩(wěn)定信使RNA。這些終止子存在于一些由酵母衍生和哺乳動物基因的編碼序列之后的3’非翻譯區(qū)。示例性植物載體和植物細胞包括但不限于農桿菌質粒、花椰菜花葉病毒(CaMV)和番茄金花葉病毒(TGMV)。哺乳細胞的轉化方法包括但不限于磷酸鈣存在下的轉染、顯微注射、電穿孔或通過病毒載體轉導。將外源DNA導入植物或酵母基因組的方法包括(1)機械方法，例如將DNA顯微注射入單核細胞或原生質體，在DNA存在下與玻璃珠一起渦旋細胞或將DNA包被的鎢或金微粒射入細胞或原生質體；(2)用聚乙二醇處理或高電壓電脈沖(電穿孔)使細胞膜可透過大分子；或(3)使用可與細胞膜融合的脂質體(含有cDNA)。美國專利申請美國公開號20050019859和美國專利申請美國公開號20050084933教導了用動物或哺乳動物細胞培養(yǎng)生產本發(fā)明蛋白質，特別是重組糖蛋白產品的方法，這些文獻通過引用并入本文。在細胞培養(yǎng)過程的蛋白質生產階段之后，使用本領域技術人員已知的技術從細胞培養(yǎng)基中回收CTLA4Ig分子。尤其是將CTLA4Ig分子作為分泌型多肽從培養(yǎng)基中回收。首先將培養(yǎng)基離心去除細胞碎片和顆粒。然后從污染性DNA、可溶性蛋白和多肽中純化所需要的蛋白質，使用以下本
技術領域：
已建立的非限制性純化操作SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；乙醇沉淀；免疫親和或離子交換色譜分級分離；反相HPLC；二氧化硅色譜或陰離子交換樹脂例如QAE或DEAE色譜；色譜聚焦；使用例如S印hadexG-75柱凝膠過濾；和使用蛋白AS印harose柱去除污染物例如IgG。加入蛋白酶抑制劑，例如苯甲基磺酰氟化物13(PMSF)或者也可使用蛋白酶抑制劑混合物抑制純化過程中的蛋白水解降解。本領域技術人員將認識到適用于感興趣蛋白質(例如糖蛋白)的純化方法需要一些改變以應對在重組細胞培養(yǎng)中表達時蛋白質性質的改變。為糖蛋白的糖基團選用的純化技術和方法也屬于本發(fā)明范疇。例如，該技術包括HPLC或使用陽離子-或陰離子-樹脂的離子交換色譜法，其中收集堿性或酸性更強的流分，這取決于所選擇的糖。使用這些技術也可同時去除污染物。純化方法可進一步包括將可能存在于哺乳細胞系細胞培養(yǎng)基中的病毒和/或逆轉錄病毒失活和/或去除的附加步驟?？衫迷S多清除病毒的步驟，包括但不限于用離液劑處理，離液劑例如尿素或胍、去污劑；附加的超濾/透析步驟；常規(guī)分離，例如離子交換或分子排阻色譜；極端PH；加熱；蛋白酶；有機溶劑或其任何組合。在保存或進一步處理之前，已純化的CTLA4Ig分子需要濃縮和交換緩沖液?？墒褂肞allFiltronTFF系統(tǒng)濃縮并將來自之前純化柱的洗脫液交換成適用于藥物的終緩沖液。在一方面，可將已純化的CTLA4lg分子(已濃縮并經過透析)裝入2_LBiotainer瓶、50-L生物加工袋或任何其它適當的容器中。這些容器中的CTLA4Ig分子可于2°C至8°C在冰凍之前保存60天。CTLA4Ig分子于2°C至8°C更長時間的保存可能導致HMW的增加。因此，對于長期保存，可在保存前將CTLA4Ig分子于-70°C冷凍并于約-40°C保存。冷凍溫度的可變范圍為約-50°C至約-90°C。冷凍時間可以變化，主要取決于含有CTLA4Ig分子的容器的容積和冷凍箱中裝載容器的數量。例如，在一個實施方案中，CTLA4Ig分子保存在2-LBiotainer瓶中。在冷凍箱中裝載少于4個2-LBiotainer瓶時需要約14-18小時的冷凍時間。裝載至少4個2-LBiotainer瓶時需要約18-24小時的冷凍時間。將裝有冰凍CTLA4Ig分子的容器保存于_35°C至約_55°C。在_35°C至約_55°C的保存時間可以變化并且可短至18小時?？捎锌刂频貙⒗鋬鏊幬锶芙庥糜谂渲扑幤?。在2005年12月20日申請的同時待審美國專利申請序列號60/752267和2006年10月5日申請的06/849543和2006年12月19日申請的標題為“細胞系、組合物和生產該組合物的方法”，發(fā)明人為KirkLeister的PCT專利申請10734PCT描述了通過動物或哺乳細胞培養(yǎng)生產本發(fā)明蛋白質特別是重組糖蛋白產品的方法。本發(fā)明的低壓凍干制劑本發(fā)明的低壓凍干制劑包含CTLA4Ig分子，其中蛋白質與凍干保護劑的重量比至少為12。凍干保護劑優(yōu)選糖，更優(yōu)選雙糖，最優(yōu)選蔗糖或麥芽糖。低壓凍干制劑也可包含一種或多種選自緩沖劑、表面活性劑、填充劑和防腐劑的組分。在藥物制劑開發(fā)研究中評價各種賦形劑對CTLA4Ig分子的溶液-穩(wěn)定性和凍干、固相-穩(wěn)定性的影響。不存在穩(wěn)定劑時凍干CTLA4Ig分子的不穩(wěn)定性明顯說明了需要在制劑中包含凍干保護劑。起始篩選研究表明藥品在糖(例如麥芽糖和蔗糖)和氨基酸(例如精氨酸和賴氨酸)存在下是穩(wěn)定的。多元醇(例如甘露醇)和多糖(例如右旋糖酐40)不利于其穩(wěn)定性。優(yōu)選的凍干保護劑為二糖麥芽糖和乳糖。實施例VI描述了凍干Abatac印t藥品在麥芽糖存在下保存于50°C的穩(wěn)定性研究。14使用穩(wěn)定性-指示分子排阻色譜(SE-HPLC)測定法監(jiān)控所有高分子量(HMW)種類的增加。結果表明麥芽糖存在下CTLA4Ig分子凍干固相形式的穩(wěn)定性增強。用于穩(wěn)定化低壓凍干藥品的蔗糖或麥芽糖的量為蛋白質與蔗糖或麥芽糖的重量比至少為12，優(yōu)選蛋白質與蔗糖或麥芽糖的重量比為12至15，更優(yōu)選蛋白質與蔗糖或麥芽糖的重量比約為12。如果必要的話，在低壓凍干之前加入藥學可接受的酸和/或堿設定制劑的pH。優(yōu)選的藥學可接受的酸為鹽酸。優(yōu)選的堿為氫氧化鈉。在制劑開發(fā)中，作為pH的函數而研究凍干藥品的穩(wěn)定性。實施例VI描述了作為pH函數的凍干Abatac印t藥品的穩(wěn)定性研究。在凍干之前將溶液pH調至6至8。將樣品放置于穩(wěn)態(tài)并使用穩(wěn)定性-指示分子排阻色譜(SE-HPLC)測定法檢測各時間點高分子量種類的增加。在建議保存條件2°_8°C下，沒有觀察到HMW種類形成速度的顯著變化。此外；在早期研發(fā)過程中得到的溶液狀態(tài)穩(wěn)定性數據顯示最大穩(wěn)定性的PH為7至8。低壓凍干藥品可接受的PH范圍為7-8，優(yōu)選的目標pH為7.5。在另一方面，可加入至少10mM的鹽或緩沖液組分，優(yōu)選10_200mM。這些鹽和/或緩沖液為藥學可接受的并衍生自已知的酸(無機的和有機的)和“可形成堿”的金屬或胺。除了磷酸緩沖液，也可使用甘氨酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液及類似緩沖液，其中鈉、鉀或銨離子可作為平衡離子?！疤畛鋭睘榭稍黾拥蛪簝龈苫旌衔镔|量并有利于低壓凍干結塊的物理結構(例如有助于產生可保持開孔結構的基本均一的低壓凍干結塊)的化合物。示例性填充劑包括甘露醇、甘氨酸、聚乙二醇和山梨醇。本發(fā)明的低壓凍干制劑可包含這些填充劑。本發(fā)明制劑可任選加入防腐劑以降低細菌作用。加入防腐劑，例如，可有助于生產多次使用(多劑量)制劑。本領域技術人員可選擇裝入管形瓶中的藥品量，取決于所需要的劑量和具體治療的給藥方案。例如，每支管形瓶中CTLA4Ig的濃度可在50-300mg/管形瓶的范圍內變化，優(yōu)選100-250mg/管形瓶。典型低壓凍干Abatac印t藥品的組成如表1所示。表1低壓凍干Abatac印t藥品(250mg/管形瓶)的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>a包括5%過量填充用于補償管形瓶、針頭、注射器損失13這些組分存在于abatac印t藥物溶液中典型低壓凍干Belatac印t藥品的組成如表2所示。表2低壓凍干Belatac印t藥品(lOOmg/管形瓶)的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>3每支管形瓶包含10%過量填充用于補償重新溶解的溶液在管形瓶、針頭、注射器中的殘留用含水載體溶解低壓凍干藥品。本文感興趣的含水載體為藥學可接受的(對于人體給藥安全無毒)并在低壓凍干之后可用于制備液體制劑的載體。示例性稀釋劑包括無菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH經緩沖的溶液(磷酸鹽緩沖生理鹽水)、無菌生理鹽水溶液、林格氏液或葡萄糖溶液。本發(fā)明的低壓凍干藥品優(yōu)選用無菌注射用水、USP(SWFI)或0.9%氯化鈉注射，USP溶解。在溶解過程中，低壓凍干粉末快速溶解形成澄清、無色溶液。通常，用10ml無菌注射用水USP(SWFI)或0.9%氯化鈉注射液將本發(fā)明的低壓凍干藥品溶解至約25mg/ml。將溶解得到的溶液進一步用0.9%氯化鈉注射液USP稀釋至l-10mg/ml。被稀釋的注射藥品是等滲的并適用于靜脈輸注給藥。在早期的臨床研發(fā)中發(fā)現配制的低壓凍干藥品溶液與常用于制備和腸道外產品給藥的一次性硅化處理注射器不相容。具體而言，當配制的藥品溶液在這些注射器中保存超過10-15分鐘后會形成絲狀凝膠顆粒。進一步研究表明這一不相容性是由于藥品與硅油(二甲基硅醚)之間發(fā)生反應。這些顆粒的形成并不影響藥品溶液在使用中的藥效。優(yōu)選使用無硅氧烷注射器配制藥品并將從管形瓶中配制的溶液轉移至靜脈袋中?；蛘撸部稍谥苿┲屑尤氡砻婊钚詣┮越档突蚍乐古渲频乃幤放c硅化處理的注射器發(fā)生反應，例如加入足夠量的表面活性劑。低壓凍干制劑的建議保存條件為2_8°C，建議保存期限為至少12個月。低壓凍干制劑的制備低壓凍干藥品生產過程包含將已配制的總體溶液分批低壓凍干、無菌過濾、裝入管形瓶、在冷凍干燥室冷凍，然后低壓凍干、加塞和加蓋。實施例III和IV分別描述了生產低壓凍干Abatac印t和Belatac印t藥品。通常將已配制的總體溶液設定為固定的蛋白質濃度，這樣裝入管形瓶的體積可保持恒定。在加入凍干保護劑時，將混合儀速度控制在250士50rpm以盡量減少批溶液中的泡沫并確保凍干保護劑在10-20分鐘內完全溶解。已配制的總體溶液在低壓凍干前可于2。_8°C或室溫日光下保存至少32小時。由于CTLA4Ig分子的熱敏感性，已配制的總體溶液不進行終滅菌?？墒褂靡幌盗械?.22-umMilliporeMillipak除菌級濾膜在注入管形瓶低壓凍干之前將已配制的總體溶液滅菌。對選供本產品使用的冷凍干燥周期加以優(yōu)化，以在干燥的第一和第二相中分別達到有效升華和蒸發(fā)而不降低產品質量。為了輔助低壓凍干粉末的快速溶解并防止配制藥品中形成過量泡沫，在低壓凍干周期的末期在500士100微米室壓下將低壓凍干管形瓶加塞。本領域技術人員將意識到需要將容器過量填充以補償制備和注射中管形瓶、針和注射器的殘留。例如，每支Abatac印t藥品管形瓶為250mg/ml含有5%過量填充藥品以補償重新配制和抽取時的損失。液體皮下制劑本領域技術人員將認識到對于需要頻繁、長期治療的患者而言IV制劑的不方便?；颊咝枰洺５结t(yī)院去進行靜脈輸注以獲得藥物，輸注的時間可能長至1小時。因此，皮下制劑可實現家庭自給藥，對于上述患者是很有益的。對于皮下給藥，需要高蛋白濃度的劑量。用大于lmg/kg(>lOOmg/劑量)的高劑量治療需要研發(fā)濃度超過100mg/ml的制劑，這是由于小體積(<1.5ml)才可通過SC途徑給藥。為了防止形成高分子量種類優(yōu)化高濃度的長期穩(wěn)定性，進行制劑開發(fā)研究以評價各種賦形劑對本發(fā)明的液體SC制劑溶液狀態(tài)穩(wěn)定性的作用。本發(fā)明的SC制劑包含蛋白濃度至少為100mg/ml的CTLA4Ig分子與穩(wěn)定化水平的糖，優(yōu)選含水載體中蛋白質濃度至少為125mg/ml與穩(wěn)定化水平的糖。優(yōu)選蛋白質與糖的重量比至少為11.1。穩(wěn)定劑的用量優(yōu)選不大于可能引起SC注射器給藥中不利或不適粘度的量。糖優(yōu)選雙糖，最優(yōu)選蔗糖。SC制劑也可包含一種或多種選自緩沖劑、表面活性劑和防腐劑的組分。在各種包括糖、多糖、氨基酸、表面活性劑、聚合物、環(huán)糊精、蛋白質等的穩(wěn)定劑存在下評價SC制劑的穩(wěn)定性曲線。在所有被評價的賦形劑中，糖例如蔗糖、甘露醇和海藻糖具有更好的防止高分子量種類形成的穩(wěn)定化作用。實施例V和VIII分別描述了蔗糖存在下于不同溫度保存不同時間的SCBelatacept和Abatac印t藥品的穩(wěn)定性研究。使用穩(wěn)定性_指示分子排阻色譜(SE-HPLC)測定法監(jiān)測高分子量種類的增加。結果顯示蔗糖的存在可以增加SC制劑中CTLA4Ig分子的穩(wěn)定性。更高的蔗糖蛋白質重量比可得到更好的穩(wěn)定化效果?；谶@些研究，選擇以可提供最佳穩(wěn)定性而不會引起SC溶液過高滲透性的比例的蔗糖作為穩(wěn)定劑。可用于SC藥品穩(wěn)定化的蔗糖量為蛋白質與蔗糖重量比至少為11，優(yōu)選蛋白質與蔗糖重量比為11.3-11.5，更優(yōu)選蛋白質與蔗糖重量比約為11.4。如果必要的話，加入藥學可接受的酸和/或堿設定制劑的pH。優(yōu)選的藥學可接受酸為鹽酸。優(yōu)選的堿為氫氧化鈉。在制劑開發(fā)研究中，作為pH的函數研究SC藥品的穩(wěn)定性。實施例V描述了作為pH的函數研究SCBelatacept藥品的穩(wěn)定性。將SC制劑pH調至7-8.2。將樣品放置于穩(wěn)態(tài)并使用穩(wěn)定性-指示分子排阻色譜(SE-HPLC)測定法檢測各時間點高分子量種類的增加。在建議保存條件2°_8°C下，沒有觀察到HMW種類形成速度的顯著變化。除聚集外，脫酰胺作用為發(fā)酵、收獲/細胞凈化、純化、藥物/藥品保存和樣品分析中可能發(fā)生的肽和蛋白質的常見產品變體。脫酰胺作用為從形成可水解的琥珀酰亞胺中間體的蛋白質失去NH3。該琥珀酰亞胺中間體可導致母體肽的質量減少17u。之后的水解可導致質量減少18u。由于在含水條件下不穩(wěn)定，難以純化琥珀酰亞胺中間體。這樣，由于質量增加了lu脫酰胺作用通常是可檢測的。天冬酰胺脫酰胺作用可得到天冬氨酸或異天冬氨酸。影響脫酰胺作用速率的參數包括PH、溫度、溶劑介電常數、離子強度、一級序列、局部多肽構象和三級結構。肽鏈中與Asn相鄰的氨基酸殘基可影響脫酰胺速率。蛋白質序列中Asn之后存在Gly和Ser可使對脫酰胺作用更加敏感。前期的實驗室規(guī)模穩(wěn)定性研究表明脫酰胺作用可超過使用pH7.8的SCabatacept制劑在24個月的肽作圖檢測方法中的參比水平。2_8°C和25°C，60%濕度下的六個月數據表明PH7.2時的脫酰胺速率較低，pH7.8時的脫酰胺速率較高。實施例IX和XII描述了用于評價SC制劑在pH范圍6.3-7.2的脫酰胺作用。SC藥物制劑可接受的pH范圍為6-8，優(yōu)選6-7.8，更優(yōu)選6_7.2。在另一方面，可加入至少10mM的鹽或緩沖液組分，優(yōu)選10_200mM。這些鹽和/或緩沖液為藥學可接受的并衍生自已知的酸(無機的和有機的)和“可形成堿”的金屬或胺。除了磷酸鹽緩沖液，也可使用甘氨酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液及類似緩沖液，其中鈉、鉀或銨離子可作為平衡離子。實施例VIII描述了緩沖液強度對abataceptSC藥品的作用。對于pH7.5、濃度為100mg/mL的abatacept藥品，與5mM磷酸鹽緩沖液相比，10mM磷酸鹽緩沖液中的穩(wěn)定性更好。而且，10mM磷酸鹽緩沖液具有更高的緩沖能力，與5mM緩沖液相比可更好地控制制劑pH。本文感興趣的含水載體為藥學可接受的(對于人體給藥安全無毒)并可用于制備液體制劑的載體。示例性載體包括無菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH經緩沖的溶液(磷酸鹽緩沖生理鹽水)、無菌生理鹽水溶液、林格氏液或葡萄糖溶液。本發(fā)明制劑可任選加入防腐劑以降低細菌作用。加入防腐劑，例如，可有助于生產多劑量制劑。如在低壓凍干藥品中所討論，CTLA4Ig分子與標準注射器中的硅氧烷不相容，其與硅氧烷反應生成可見顆粒，因此限制了患者使用無硅氧烷注射器。SC制劑可任選包含表面活性劑以防止硅氧烷存在下生成可見顆粒。實施例V和VIII分別描述了表面活性劑例如聚山梨酯80和帕洛沙姆188對belatacept和abatacept藥品溶液穩(wěn)定性的作用，研究發(fā)現表面活性劑對SC制劑中CTLA4Ig分子的穩(wěn)定性沒有影響。評價不同水平的帕洛沙姆188，結果發(fā)現4mg/ml-8mg/ml，優(yōu)選8mg/ml的濃度可有效防止制劑中硅氧烷相關顆粒的形成。125mg/ml(lOOmg/管形瓶)belataceptSC藥品的典型組成如表3所示表3125mg/ml(lOOmg/管形瓶)belataceptSC藥品的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>6包括40%過量填充用于補償管形瓶、針頭和注射器的損失。125mg/ml(125mg/管形瓶)AbataceptSC藥品的典型組成如表4所示表4125mg/ml(125mg/管形瓶)AbataceptSC藥品的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>6包括40%過量填充用于管形瓶、針頭和注射器的損失。裝入注射器中的125mg/mlAbataceptSC藥品的典型組成如表5所示表5125mg/ml(125mg/注射器)AbataceptSC藥品的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>SC制劑的建議保存條件為2_8°C，建議保存期限為至少12個月。在環(huán)境溫度下使用Mettler-Toledo密度計測定abataceptSC和匹配安慰劑的密度。用5-mL樣品測量三份。abataceptSC制劑的密度為1.lg/cc，安慰劑產品的密度為1.065g/cc。通常SCCTLA4Ig制劑的密度為約1.Og/cc-約1.2g/cc，優(yōu)選約1.Og/cc-約1.15g/cc，更優(yōu)選約1.095g/cc-約1.105g/cc。在環(huán)境溫度下使用Brookfield電流計測定abataceptSC制劑的粘度。在測量中使用9.3cps的參比標準。SC藥品的粘度為125mg/mL，abatacept濃度為13士2cps。通常125mg/mLSCCTLA4Ig制劑的粘度約9-約20cps，優(yōu)選約9-約15cps，更優(yōu)選12-約15cps。使用蒸汽壓方法測定SCabatac印t藥品和安慰劑制劑的摩爾滲透壓濃度。數據顯示濃度為125mg/mLabataceptSC制劑的摩爾滲透壓濃度為770士25m0sm/kgH20。通常125mg/mLSCCTLA4Ig制劑的摩爾滲透壓濃度為約250-約800m0sm/kgH20，優(yōu)選約700-約800m0sm/kgH20,更優(yōu)選約750-約800m0sm/kgH20。SC制劑的制備SC制劑的生產過程通常包含與糖和表面活性劑復合，然后無菌過濾并裝入管形瓶或注射器，任選在此之前使用超濾裝置對藥物進行透析(緩沖液交換)和濃縮。實施例I和II分別描述了SCBelatacept和Abatacept藥品的生產。本領域技術人員將意識到需要將容器過量填充以補償制備和注射中管形瓶、針頭和注射器的殘留。例如，每支SC液體制劑管形瓶含有40%過量藥品以補償重新配制和抽取時的損失并確?？蓮墓苄纹砍槿?.8ml含有100mgBelatacept的溶液。液體制劑在具體情況下，IV制劑可能是優(yōu)選的給藥途徑，例如移植手術后的住院病人通過IV途徑接受所有的藥物。本領域技術人員將認識到低壓凍干制劑分別對生產者和醫(yī)護人員的不利和風險。對于醫(yī)護人員的不利和風險與重新配制時的污染、起泡和產品損失以及醫(yī)護人員配制IV制劑所需要的時間相關。此外，去除生產過程中的低壓凍干步驟可降低儀器的生產損耗和員工時間。所有這些原因足以促使我們設計IV用途的液體制劑。優(yōu)選的液體制劑應類似第一次配制成蛋白濃度約25mg/ml之后的低壓凍干藥品?？稍谑褂脮r由醫(yī)護人員用0.9%氯化鈉注射液USP將購買的液體制劑進一步稀釋至需要的藥品濃度l-10mg/ml。被稀釋的注射藥品是等滲的并適于靜脈輸注給藥。如上述討論，液體制劑的長期穩(wěn)定性是蛋白質藥品面臨的一個問題。為了確定防止高分子量種類形成的溶液長期穩(wěn)定性，進行制劑開發(fā)研究以評價本發(fā)明液體制劑的溶液穩(wěn)定性。本發(fā)明的液體制劑在含水載體中包含蛋白濃度至少為20mg/ml的CTLA4Ig分子與穩(wěn)定化水平的糖，優(yōu)選至少25mg/ml與穩(wěn)定化水平的糖。糖的用量優(yōu)選為蛋白質與糖的重量比至少為11。糖優(yōu)選雙糖，最優(yōu)選蔗糖。該液體制劑也可包含一種或多種選自緩沖劑、表面活性劑和防腐劑的組分。用于穩(wěn)定化液體藥品的蔗糖量為蛋白質與蔗糖的重量比至少為11，優(yōu)選蛋白質與蔗糖的重量比12至110，更優(yōu)選蛋白質與蔗糖的重量比約12。如果必要的話，加入藥學可接受的酸和/或堿設定制劑的pH。優(yōu)選的藥學可接受的酸為鹽酸。優(yōu)選的堿為氫氧化鈉。在制劑研發(fā)中，在目標pH7.5研究液體藥品的穩(wěn)定性。實施例VII描述了在pH7.5研究液體Belatac印t藥品的穩(wěn)定性。將液體制劑pH調至7.5。將樣品放置于穩(wěn)態(tài)并使用穩(wěn)定性-指示分子排阻色譜(SE-HPLC)測定法檢測各時間點高分子量種類的增加。在建議保存條件2°_8°C下，沒有觀察到HMW種類形成速度的顯著變化。除聚集外，脫酰胺作用和片段化為發(fā)酵、收獲/細胞凈化、純化、藥物/藥品保存和樣品分析中可能發(fā)生的肽和蛋白質的常見產品變體。前期的實驗室規(guī)模穩(wěn)定性研究表明脫酰胺作用會超過肽作圖檢測方法(上升超過5%T26a或T26b(%T30)最大值)中的參比水平并且片段化將超出使用保存于2。-8°C的belatac印t(20mg/ml于pH7.5)在24個月的SDS-PAGE檢測方法(降低至主帶最小值的96%以下)中的參比水平。液體制劑數據(見以上SC數據)表明存在于本發(fā)明制劑中的脫酰胺作用速率隨著制劑pH的降低而降低。液體藥品可接受的pH范圍為6-8，優(yōu)選6-7.8，更優(yōu)選6_7.2。在另一方面，可加入至少約10mM的鹽或緩沖液組分，優(yōu)選10_200mM。這些鹽和/或緩沖液為藥學可接受的并衍生自已知的酸(無機的和有機的)和“可形成堿”的金屬或胺。除了磷酸緩沖液，也可使用甘氨酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液及類似緩沖液，其中鈉、鉀或銨離子可作為平衡離子。本文感興趣的含水載體為藥學可接受的(對于人體給藥安全無毒)并可用于制備液體制劑的載體。示例性載體包括無菌注射用水(SWFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、pH經緩沖的溶液(磷酸鹽緩沖生理鹽水)、無菌生理鹽水溶液、林格氏液或葡萄糖溶液。本發(fā)明制劑可任選加入防腐劑以降低細菌作用。加入防腐劑，例如，可有助于生產多劑量制劑。如在低壓凍干藥品中所討論，CTLA4Ig分子與標準注射器中的硅氧烷不相容，其與硅氧烷反應生成可見顆粒，因此限制了患者使用無硅氧烷注射器。液體制劑可任選包含表20面活性劑以防止硅氧烷存在下生成可見顆粒。20mg/ml(250mg/管形瓶)Belatac印t液體藥品的典型組成如表6所示表620mg/ml(250mg/管形瓶)Belatac印t液體藥品的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>a包括40%過量填充用于補償管形瓶、針頭和注射器的損失。液體制劑的建議保存條件為2_8°C，建議保存期限為至少12個月。液體制劑的制備液體藥品生產過程通常包含與糖和任選表面活性劑復合、然后無菌過濾、裝入管形瓶、加塞和加蓋。通常將已配制的總體溶液設定為固定的蛋白質濃度，這樣裝入管形瓶的體積可保持恒定。在加入糖和藥物時，將混合儀速度控制在250士50rpm以盡量減少批溶液中的泡沫并確保糖在10-20分鐘內完全溶解。已配制的總體溶液在填充前可于2°_8°C或室溫日光下保存至少24小時。由于CTLA4Ig分子的熱敏感性，已配制的總體溶液未進行終滅菌?？墒褂靡幌盗械?.22-umMilliporeMillipak除菌級濾膜在裝入管形瓶之前將已配制的總體溶液滅菌。本領域技術人員將意識到需要將容器過量填充以補償制備和注射中管形瓶、針頭和注射器的殘留。例如，每支Belatac印t藥品管形瓶為20mg/ml(250mg/管形瓶)，含有4%過量藥品以補償重新配制和抽取時的損失。制造品在本發(fā)發(fā)明另一個實施方案中提供了制造品，其包含藥品并優(yōu)選提供其使用說明。制造品包含容器。適當的容器包括，例如瓶子、管形瓶、注射器和試管。該容器可由各種材料例如玻璃、塑料或金屬形成。該容器盛有低壓凍干或液體制劑。容器上或與容器相連的標簽可標明重新配制的說明和/或用法。例如，該標簽可標明25mg/mlbelatac印t應稀釋至上述蛋白濃度。該標簽可進一步標明SC制劑可用于或專用于皮下給藥。盛有制劑的容器可為多劑量管形瓶，其允許反復給藥(例如2-6次)，例如皮下制劑?；蛘咴撊萜鳛楹欣缙は轮苿┑念A充式注射器。制造品可進一步包含第二個容器，其含有例如低壓凍干制劑的適當載體。制造品可進一步包括從商業(yè)和使用者角度需要的其它物質，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾膜、針頭、注射器和有使用說明的包裝插頁。對于無表面活性劑的藥品優(yōu)選使用無硅氧烷注射器，例如在配制低壓凍干藥品和21/或將管形瓶中的溶液轉移至靜脈袋時，也可與藥品管形瓶一起包裝。使用方法本發(fā)明進一步提供了治療免疫系統(tǒng)疾病或耐受性誘導的方法，其包括給予有效量的本發(fā)明CTLA4Ig分子制劑。在具體實施方案中，免疫系統(tǒng)疾病由⑶28-和/或CTLA4-陽性細胞與CD80/CD86-陽性細胞相互作用介導。在進一步的實施方案中，T細胞相互作用被抑制。免疫系統(tǒng)疾病包括但不限于自身免疫疾病、免疫增生性疾病、移植相關病癥。這些方法包括給予受試者本發(fā)明的CTLA4Ig分子制劑以調節(jié)T細胞與CD80-和/或CD86-陽性細胞的相互作用。移植相關疾病的實例包括移植物抗宿主疾病(GVHD)(例如由骨髓移植或在耐受誘導中引起的疾病)、與移植物移植排斥、長期排斥和組織或細胞自身_或異種移植物(包括實質器官、皮膚、島(islets)、肌肉、肝細胞、神經元)相關的免疫病癥。免疫增生性疾病的實例包括但是不限于牛皮癬、T細胞淋巴瘤、T細胞急性成淋巴細胞白血病、睪丸血管中心T細胞淋巴瘤、良性淋巴脈管炎和自身免疫疾病例如狼瘡(如紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎)、Hashimoto's甲狀腺炎、原發(fā)性粘液水腫、Graves'病、惡性貧血、自身免疫性萎縮性胃炎、艾迪生病、糖尿病(如胰島素依賴型糖尿病、I型糖尿病)Goodpasture’s綜合癥、眼葡萄膜炎、多發(fā)性硬化、自身免疫性溶血性貧血、特發(fā)性血小板減少、原發(fā)性膽汁性肝硬化、慢性肝炎、潰瘍性結腸炎、Sjogren’s綜合癥、風濕性疾病(例如風濕性關節(jié)炎)、多發(fā)性肌炎、硬皮癥和混合性結締組織病。本發(fā)明進一步提供了抑制受試者對實質性器官和/或組織移植排斥的方法，該受試者為移植組織的接受者。通常，在組織移植中，對移植物的排斥是由于其被T細胞識別為外源性物質起始的，然后產生可破壞該移植物的免疫應答。本發(fā)明的CTLA4Ig分子制劑通過抑制T淋巴細胞增殖和/或細胞因子的分泌可降低對組織的破壞并且誘導抗原_特異性T細胞無應答性使不需要全身免疫抑制即可長期接受移植物。而且本發(fā)明的CTLA4Ig分子制劑可與其它藥物聯(lián)合使用，包括但不限于皮質激素、環(huán)孢霉素A、雷怕霉素、麥考酚酸嗎乙酯、硫唑嘌呤、他克莫司(tacrolismus)、巴利昔單抗和/或其它生物制品。本發(fā)明也提供了抑制受試者中移植物抗宿主病的方法。該方法包括單獨給予或與附加配體(與IL-2、IL-4或干擾素反應)一起給予受試者本發(fā)明制劑。例如可將本發(fā)明的CTLA4Ig分子SC制劑給予骨髓移植接受者用于抑制供體T細胞的同種異體反應性。或者在移植前使骨髓移植物中的供體T-細胞在活體外對接受者的同種異體抗原產生耐受。本發(fā)明CTLA4Ig分子制劑對T細胞應答的抑制也可用于治療自身免疫病癥。許多自身免疫病癥是由對自身抗原具有反應性的T細胞的不當活化引起的，其可促進細胞因子和自身抗體的產生，這些均與該疾病的病理相關。給予患有或易患自身免疫疾病的受試者CTLA4Ig分子制劑可防止自身反應性T細胞的活化并可降低或消除疾病癥狀。這一方法也包含單獨或與附加配體(與IL-2、IL-4或Y_干擾素反應)一起給予受試者本發(fā)明制劑。本發(fā)明制劑最有效的給藥方式和劑量方案取決于疾病的嚴重程度和進程、患者的健康狀況和對治療的響應性以及治療醫(yī)師的判斷。依據本發(fā)明的實踐，治療患者的有效劑量為約0.1-約10mg/受試者公斤體重。而且，有效量也可為約1-約10mg/kg受試者公斤體重?？山o予受試者足以阻斷內源性B7(例如CD80和/或CD86)分子與它們各自的配體在受試者體內結合的量和時間(例如一段時間或多次)的本發(fā)明CTLA4Ig分子制劑。阻斷內源性B7/配體的結合可由此抑制B7-陽性細胞(例如CD80-和/或CD86-陽性細胞)與⑶28-和/或CTLA4-陽性細胞的相互作用。CTLA4Ig分子的劑量取決于許多因素，包括但不限于受累組織類型、被治療疾病的類型、疾病的嚴重程度、受試者的健康狀況和受試者對治療藥劑的反應性。因此，藥物劑量可因受試者和給藥方式而變化。美國專利申請美國發(fā)明者C·E·達爾黑姆,M·M·達利,M·內魯爾卡,R·B·甘地,S·波爾薩迪亞,V·H·納林格雷卡申請人:布里斯托爾—邁爾斯斯奎布公司