專利名稱：穩(wěn)定蛋白質(zhì)制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上涉及含有CTLA4Ig分子的穩(wěn)定制劑，包括用于 各種給藥途徑(包括例如靜脈內(nèi)(IV)和皮下(SC))的低壓凍干和液體 制劑。
背景技術(shù)：
在過去20年中，重組DNA技術(shù)使許多蛋白質(zhì)療法商業(yè)化。 蛋白質(zhì)藥物最常規(guī)的給藥途徑為靜脈內(nèi)(IV)給藥，這是由于絕大多 數(shù)其它給藥途徑的生物利用度低、臨床給藥時需要更多的監(jiān)控以及 更快速的藥物研發(fā)。對于需要頻繁和長期給藥的產(chǎn)品而言，另一種 皮下(SC)給藥途徑更具有吸引力。當(dāng)與預(yù)充式注射器和自動注射 器技術(shù)聯(lián)合使用時，SC給藥允許家庭給藥并提高了給藥的順應(yīng)性。
使用高于1 mg/kg或100 mg /劑量的高劑量治療時需要研發(fā) 濃度超過100 mg/ml的制劑，這是由于小體積(<1.5 ml)才可以通過 SC途徑給藥。對于在更高濃度容易聚集的蛋白質(zhì)而言，達(dá)到這樣高 濃度的制劑是一種研發(fā)挑戰(zhàn)。甚至對于可以大體積給藥的IV給藥途徑而言，高劑量給藥方案可能需要幾十mg/ml的蛋白濃度，而這一 濃度會影響 一些蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性?？刂频鞍踪|(zhì)溶解度的原理比小合成分子的更復(fù)雜，因此克服 蛋白質(zhì)的溶解度問題需要不同的策略。在操作上，蛋白質(zhì)的溶解度 可描述為在輔溶質(zhì)存在下并因此溶液保持澄清(例如，沒有蛋白質(zhì) 沉淀、結(jié)晶或凝膠)時蛋白質(zhì)的最大量。蛋白質(zhì)的溶解度對離子強(qiáng) 度、鹽形式、pH、溫度和某些賦形劑的依賴性可由重力水(bulk water)表面張力的變化和蛋白質(zhì)與水和離子的結(jié)合與自身結(jié)合的對比 進(jìn)行機(jī)械學(xué)角竿釋，見Arakawa等，T7zec^ 。/so/m&7z'Cv (蛋白 質(zhì)溶解度原理),Methods of Enzymology, 114:49-77, 1985; Schein
解度作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和溶劑組分的函數(shù))，BioTechnology 8(4):308-317, 1990; Jenkins 7T^ee so/w"o"s o/f/ieso/砲鄉(xiāng)( 蛋 白質(zhì)溶解度問題的三種解答)，Protein Science 7(2):376-382， 1998;及 其它。蛋白質(zhì)與某些賦形劑或鹽的結(jié)合可通過蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化或 遮蓋參與自身結(jié)合的某些氨基酸影響溶解度。蛋白質(zhì)也會優(yōu)先被某
些鹽、氨基酸和糖水化(并穩(wěn)定化形成更緊致的構(gòu)象)，導(dǎo)致其溶 解度變化。聚集需要兩分子之間的碰撞，是蛋白質(zhì)溶液中的主要降解途 徑。濃度與形成聚集的關(guān)系取決于聚集物的大小和結(jié)合機(jī)制。蛋白 質(zhì)聚集可引起共價(例如二硫鍵連接)或非共價(可逆或不可逆) 結(jié)合。由非共價結(jié)合引起的不可逆聚集通常經(jīng)由可改變蛋白質(zhì)天然 構(gòu)象的由溫度、機(jī)械或化學(xué)過程暴露的疏水區(qū)域發(fā)生。蛋白質(zhì)聚集 可影響蛋白質(zhì)活性、藥物代謝動力學(xué)和安全性，例如由于免疫原 性。最小化聚集作用的典型方法為限制蛋白質(zhì)的移動性以降低碰 撞次數(shù)。用適當(dāng)?shù)馁x形劑低壓凍干可防止聚集提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定 性，其方式為P爭低蛋白質(zhì)的移動性和限制構(gòu)象的柔性，其另外的益處為由于去除水分使水解反應(yīng)降至最低。加入適當(dāng)?shù)馁x形劑，包括 凍干保護(hù)劑，可防止在凍干和終產(chǎn)品的保存過程中發(fā)生聚集。有效 保護(hù)的關(guān)鍵參數(shù)為凍干保護(hù)劑與蛋白質(zhì)的摩爾比值。通常要求
300: 1或更高的摩爾比值以提供適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，尤其是對于室溫保 存。然而這些比值也可引起不利的粘度增加。低壓凍千可設(shè)計具有適當(dāng)穩(wěn)定性和張力的制劑。雖然SC給 藥并不 一 定要求等滲性，但對于降低給藥時的疼痛還是有需要的。 親液物的等滲性較難達(dá)到，這是由于在重新溶解的過程中蛋白質(zhì)和 賦形劑都凈皮濃縮。如果終蛋白濃度的目標(biāo)>100 mg/ml， 500:1的賦形 劑與蛋白質(zhì)的摩爾比將得到高滲制劑。如果要得到等滲制劑，那么 各種可供選擇的較低的賦形劑與蛋白質(zhì)摩爾比將可能得到較不穩(wěn)定 的制劑。確定可達(dá)到的最高蛋白質(zhì)濃度仍然取決于經(jīng)驗，這是由于蛋 白質(zhì)構(gòu)象的易變性和其與自身、與表面和特定溶質(zhì)相互作用的傾向 性?？蓮腟C制劑中獲益的受試者實例為其病癥需要頻繁或長期 給藥的患者，例如患有免疫系統(tǒng)疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和與移植物 移植相關(guān)的免疫紊亂的受試者?？少徺I的用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 的蛋白質(zhì)產(chǎn)品包括HUMIRA⑧，ENBREL⑧和REMICADE 。
HUMIRA (Abbott)的包裝為一次性、lml的預(yù)充式玻璃注射 器作為無菌的、不含防腐劑的溶液用于皮下給藥。HUMIRA 溶液 澄清、無色，pH約為5.2。每一支注射器可釋放0.8ml(40mg)的藥 品。每0.8 ml 1^]\411^@含有40mg阿達(dá)木單抗、4.93 mg氯化鈉、 0.69 mg 二水合磷酸二氫鈉、1.22 mg 二水合磷酸氫二鈉、0.24 mg 檸檬酸鈉、1.04 mg —水合檸檬酸、9.6 mg甘露醇、0.8 mg聚山梨 酯80和注射用水USP。必要時加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。
ENBREL (Amgen)的包裝為一次性、lml的預(yù)充式注射器作 為無菌的、不含防腐劑的溶液用于皮下給藥。ENBREI^溶液澄清、無色，pH為6.3士0.2。每一支ENBREL逸 一次性預(yù)充式注射器含有 0.98 ml的50 mg/ml依那西普溶液，其中含10 mg/ml蔗糖、5.8 mg/ml氯化鈉、5.3 mg/mlL-精氨酸鹽酸鹽、2.6 mg/ml—水合磷酸二 氫鈉和0.9 mg/ml無7K磷酸氫二鈉。如果將管形瓶重新溶解并按照建 議給藥，給藥一支50 mg/ml的ENBREL⑧預(yù)充式注射器相當(dāng)于2支 25mg的ENBREL⑧凍干管形瓶。ENBREL⑧多次使用管形瓶含有無 菌、白色、不含防腐劑的凍干粉末。用lml所提供的抑菌性注射用 水(BWFI), USP (含有0.9%苯曱醇)可都得到多次使用、澄清、無色 溶液，pH為7.4 ±0.3，含有25 mg依那西普、40 mg甘露醇、10 mg蔗糖和1.2 mg氨丁三醇。 REMICADE (Centocor)為用于靜脈輸注的無菌、白色、凍干 粉末。在用10ml無菌注射用水USP重新溶解后，所得pH接近 7.2。每一支一次性管形瓶含有100 mg英夫利昔單抗、500 mg蔗 糖、0.5 mg聚山梨酯80、 2.2 mg—水合磷酸二氫鈉和6.1 mg 二水 合磷酸二氫鈉。不添加防腐劑。可購買的用于治療與移植物移植相關(guān)的免疫紊亂的蛋白質(zhì)產(chǎn) 品包括SIMULECT⑧和ZENAPAX 。藥品SIMULECT (Novartis)為無色凍干物，其包裝為6ml無 色玻璃管形瓶，含量為10mg和20mg。每一支10-mg管形瓶含有10 mg巴利昔單抗、3.61 mg —水合磷酸二氪鈉、0.50 mg磷酸氫二鈉 (無水)、0.80 mg氯化鈉、10 mg蔗糖、40 mg甘露醇和20 mg甘 油，用2.5 ml無菌注射用水USP重新溶解。每一支20-mg管形瓶 含有20mg巴利昔單抗、7.21mg磷酸二氫鉀、0.99mg磷酸氫二鈉 (無水)、1.61 mg氯化鈉、20 mg蔗糖、80 mg甘露醇和40 mg甘 油，用2.5ml無菌注射用水USP重新溶解。不添加防腐劑。
ZENAPAX (Roche Laboratories), 25 mg/5 ml，為用于進(jìn)一步 稀釋和靜脈內(nèi)給藥的澄清、無菌、無色濃縮物。每毫升ZENAPAX 含有5 mg達(dá)克珠單抗和3.6 mg —水合磷酸二氫鈉、11 mg七水合磷酸氫二鈉、4.6 mg氯化鈉和0.2 mg聚山梨酯80并且可含有鹽酸或 氫氧化鈉以調(diào)節(jié)pH至6.9。不添加防腐劑。 CTLA4Ig分子可通過抑制CD28-B7相互作用干擾T細(xì)胞協(xié)同 刺激。因此，CTLA4Ig分子可用于治療免疫系統(tǒng)疾病，例如類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎和與移植物移植相關(guān)的免疫紊亂。我們需要一種含有CTLA4Ig分子用于治療免疫系統(tǒng)紊亂的穩(wěn) 定、有效、方便的制劑。
發(fā)明概迷本發(fā)明提供了治療免疫系統(tǒng)紊亂的制劑，其方式為給予受試 者CTLA4Ig分子，其可與B7陽性細(xì)胞上的B7分子結(jié)合并因此抑 制內(nèi)源性B7分子與CTLA4和/或CD28在T-細(xì)胞上的結(jié)合。
本發(fā)明的凍干制劑包含CTLA4Ig分子，其蛋白質(zhì)與凍干保護(hù) 劑的重量比至少為1: 2。凍干保護(hù)劑優(yōu)選糖，更優(yōu)選雙糖，最優(yōu)選 蔗糖或麥芽糖。凍干制劑也可含有一種或多種選自緩沖劑、表面活 性劑、填充劑和防腐劑中的組分。在某些實施方案中，用于穩(wěn)定凍干藥品的蔗糖或麥芽糖的量 為蛋白質(zhì)與蔗糖或麥芽糖的重量比至少為1: 2,優(yōu)選蛋白質(zhì)與蔗糖 或麥芽糖的重量比至少為1: 2至1: 5,更優(yōu)選蛋白與蔗糖或麥芽 糖的重量比約為1: 2。本發(fā)明的皮下(SC)制劑在含水載體中含有蛋白濃度至少為 100mg/ml的CTLA4Ig分子與穩(wěn)定化水平的糖，優(yōu)選至少為 125mg/ml的蛋白質(zhì)濃度與穩(wěn)定化水平的糖。該糖的優(yōu)選重量比至少 為蛋白質(zhì)與糖1: 1.1。穩(wěn)定劑的使用量優(yōu)選不大于可能引起SC注 射器給藥時不利或不適當(dāng)粘度的量。糖優(yōu)選為二糖，最優(yōu)選為蔗 糖。SC制劑也可含有一種或更多種選自緩沖劑、表面活性劑和防腐 劑的組分。
在某些實施方案中，用于穩(wěn)定CTLA4Ig分子SC藥品的蔗糖 用量為蛋白質(zhì)與蔗糖的重量比至少為1: 1，優(yōu)選蛋白質(zhì)與蔗糖的重 量比為1: 3至1: 5,更優(yōu)選蛋白質(zhì)與蔗糖的重量比約1: 1.4。
本發(fā)明的液體制劑在含水載體中包含蛋白質(zhì)濃度至少為 20mg/ml的CTLA4Ig分子與穩(wěn)定化水平的糖，優(yōu)選至少25mg/ml與 穩(wěn)定化水平的糖。優(yōu)選糖的重量比至少為蛋白質(zhì)與糖1: 1。糖優(yōu)選 雙糖，最優(yōu)選蔗糖。該液體制劑也可含有一種或更多種選自緩沖 劑、表面活性劑和防腐劑的組分。在某些實施方案中，用于穩(wěn)定液體藥品的蔗糖用量為蛋白質(zhì)
與蔗糖的重量比至少為1: 1,優(yōu)選蛋白質(zhì)與蔗糖的重量比為1: 2
至l: 10,更優(yōu)選蛋白質(zhì)與蔗糖的重量比約1: 2。在本發(fā)明的另一個實施方案中提供了制造品，其包括藥品并
優(yōu)選提供其使用說明。本發(fā)明進(jìn)一步提供了給予本發(fā)明CTLA4Ig分子制劑治療免疫 系統(tǒng)疾病和耐受誘導(dǎo)作用的方法。
附圖簡介

圖1顯示了 CTLA4Ig分子表達(dá)盒一部分的核苷酸序列(SEQ ID N0:1)。也顯示了由該核酸編碼的氨基酸序列(SEQ ID N0.'2)。可 由該表達(dá)盒生產(chǎn)的CTLA4Ig分子包括具有以下殘基的氨基酸序列 (i) SEQ ID NO:2的26-383 , (ii) SEQ ID NO:2的26-382 , (iii) SEQ ID NO:2的27-383或(iv) SEQ ID NO:2的26-382 ,或任選(v) SEQ ID NO:2的25-382或(vi) SEQ ID NO:2的25-383。該表達(dá)盒包含以下 區(qū)(a)抑瘤素M信號序列(SEQ ID NO: 1的核苷酸ll-88; SEQ ID NO:2的氨基酸1-26 ); (b)人CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:l的核苷酸89-463; SEQ ID NO:2的氨基酸27-151); (c)人IgGl 恒定區(qū)的被修飾部分(SEQ ID NO: 1的核苷酸464-1159 ; SEQ ID NO:2的氨基酸152-383 ),包括被修飾的絞鏈區(qū)(SEQ ID NO:i的核苷 酸464-508 ; SEQ ID NO:2的氨基酸152-166 ),被修飾的人IgGlCH2結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:l的核苷酸509-838 ; SEQ ID NO:2的氨基 酸167-276 )和人IgGl CH3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:l的核苷酸839-1159 ; SEQ ID NO:2的氨基酸277-383 )。如本文中使用"穩(wěn)定的"制劑或藥品為在保存過程中其中的CTLA4Ig分子可 基本保持其物理和化學(xué)穩(wěn)定性和完整性的制劑或藥品?？稍谒x溫 度下經(jīng)過所選時間段后測定CTLA4Ig分子制劑的穩(wěn)定性。例如，凍 干和保存后聚集形成的增加可作為凍干的CTLA4Ig分子制劑不穩(wěn)定 性的指標(biāo)。除了聚集形成之外，在保存期間原有澄清度、顏色和氣 味的保持都可用作監(jiān)控CTLA4Ig分子溶液穩(wěn)定性的指標(biāo)。HMW種 類為多聚體(例如，四聚體，七聚體等)，其分子量大于CTLA4Ig 分子二聚體。通常， 一種"穩(wěn)定的"藥品為于2-8 。C保存一年其中的 聚集增加(通過高分子量種類(。/。HMW)的增加測定)小于約5%并優(yōu) 選3。/。的藥品。所生產(chǎn)的藥品優(yōu)選含有小于約25%的HMW種類，優(yōu)選小于約15% HMW種類，更優(yōu)選小于約10% HMW種類，最 優(yōu)選小于約5% HMW種類?？赏ㄟ^分子排阻色譜(SEC)分離CTLA4Ig分子的單體、二 聚體和HMW種類。SEC基于分子大小分離分子。當(dāng)分子沿著柱子 長度遷移時通過差別分子排阻或進(jìn)入實現(xiàn)分離。因此，隨著柱子長 度的增加分離度增加。可使用串聯(lián)了 TSK Gel G3000SWXL (300mm x 7.8mm)和TSK Gel G3000SWXL (40mm x 6.0mm)柱 (Tosoh Bioscience, Montgomery, PA)的2695 Alliance HPLC (Waters, Milford, MA)分離CTLA4Ig分子樣品。可用含有0.2 M KH2P04和 0.9% NaCl, pH 6.8的流動相在流速為1.0 m/min時分離10 mg/ml (20|il等分試樣)的樣品。使用Water's 2487雙波長檢測器于280腿 處檢測樣品吸光值。使用這一系統(tǒng)，HMW種類的保留時間為7.5 min ± 1.0 min。對每一個峰的峰下面積積分。HMW種類峰面積除 以總峰面積可計算得到。/。HMW種類。"重新溶解"制劑為通過將凍干制劑溶解于含水載體制備的制 劑，這樣CTLA4Ig分子被溶解至重新溶解的制劑中。該重新溶解的 制劑適用于對需要的病人進(jìn)行靜脈內(nèi)給藥(IV)。"等滲"制劑為與人血液具有基本相同的滲透壓的制劑。等滲 制劑的滲透壓通常為250至350 mOsmol/KgH20。術(shù)語"高滲"用于 描述滲透壓高于人血液滲透壓的制劑。例如可使用蒸汽壓或冰凍型 滲透壓劑測量等滲性。術(shù)語"緩沖劑"指當(dāng)加入至含水溶液中可防止加入酸或堿或溶 劑稀釋時溶液pH變化的一種或多種組分。除了磷酸鹽緩沖液，也 可使用甘氨酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽緩沖液及類似緩沖液，其中 鈉、鉀或銨可作為平衡離子。"酸，，為可在含水溶液中產(chǎn)生氫離子的物質(zhì)。"藥學(xué)可接受酸" 包括無機(jī)和有機(jī)酸，其在制劑中使用的濃度和方式是無毒性的。
"堿"為可在含水溶液中產(chǎn)生羥基離子的物質(zhì)。"藥學(xué)可接受的 堿"包括無機(jī)和有機(jī)堿，其在制劑中使用的濃度和方式是無毒性的。"凍干保護(hù)劑"為當(dāng)與相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合時可防止或降低該蛋白 質(zhì)在凍干和之后的儲存過程中化學(xué)和/或物理不穩(wěn)定性的分子。
"防腐劑"為可降低細(xì)菌作用的試劑，可選擇性加入本文的制 劑中。加入防腐劑可，例如，輔助多劑量制劑的生產(chǎn)?？捎玫姆栏?劑實例包括十八烷基二甲基千基氯化銨、氯己雙銨、苯扎氯銨(十八 烷基二曱基節(jié)基氯化銨的混合物，其中的烷基為長鏈化合物)和氯化 節(jié)乙銨。其它類型的防腐劑包括芳族醇，例如苯酚、丁基和苯甲基 醇，烷基尼泊金類，例如甲基或丙基尼泊金，兒茶酚，間苯二酚， 環(huán)己醇，3-戊醇和間甲酚。"表面活性劑"為含有疏水部分(例如烷基鏈)和親水部分 (例如羧基和羰酸基團(tuán))的表面活性分子?？蓪⒈砻婊钚詣┘尤氡?br> 梨酯(例如聚山梨酯20或80);泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188); 山梨坦酯及其衍生物；Triton;十二烷基^l酸鈉；辛基糖苷鈉；十二 烷基、十四烷基、亞油酰-或硬脂酰-磺基甜菜堿；十二烷基、十四烷 基、亞油酰或硬脂酰-肌氨酸；亞油酰-、十四烷基或十六烷基-甜菜 堿；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亞油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺 丙基-、棕櫚酰胺丙基-或異硬脂酰胺丙基甜菜堿(例如月桂酰胺丙基); 肉豆蔻酰胺丙基-、棕櫚酰胺丙基-或異硬脂酰胺丙基-二甲胺；曱基 椰油酰基?；撬徕c或甲基油?；；撬岫c；和MONAQUAT 系 歹寸(Mona Industries, Inc.， Paterson, N丄)；聚乙二醇，聚丙醇以及乙 二醇和丙二醇的共聚物(例如，Pluronics,PF68等)。
"藥物，，指用于藥物終產(chǎn)品制劑的起始材料。通常CTLA4Ig藥 物組合物含有濃度為20 mg/ml至60 mg/ml， pH 7至8的蛋白質(zhì)并 JL%HMW < 5%。
ii
"已配制成的總體溶液"指注入容器之前的最終制劑，例如注
入管形瓶用于凍干前的已配制成的溶液或注入用于sc注射的注射 器之前的已配制成的溶液。"藥品"指包裝于容器中的最終制劑，其可在使用前被重新溶 解，例如凍干藥品；使用前被稀釋，例如液體藥品；或被用作SC ，容液藥品。術(shù)語"CTLA4-Ig"或"CTLA4-Ig分子"或"CTLA4Ig分子" 可交換使用，指至少包含具有CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域或其部分片段和免 疫球蛋白恒定區(qū)或其部分片段的多肽的蛋白質(zhì)分子。該胞外結(jié)構(gòu)域 和免疫蛋白恒定區(qū)可為野生型，或突變型或修飾型，和哺乳動物 型，包括人和小鼠。該多肽可進(jìn)一步包括附加蛋白結(jié)構(gòu)域。C.TLA4-Ig分子也可指該多肽的多聚體形式，例如二聚體、四聚體和七聚 體。CTLA4-Ig分子也可與CD80和/或CD86結(jié)合。
術(shù)語"B7-1"指CD80;術(shù)語"B7-2"指CD86;術(shù)語"B7" 指B7-l和B7-2 (CD80和CD86)兩者。術(shù)語"B7-1-Ig""或"B7-llg，，指CD80-Ig;術(shù)語"B7-2-Ig"或"B7-2Ig，，指CD86-Ig。
在一個實施方案中，"CTLA4Ig，，指具有以下殘基的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)分子(i) SEQ ID N0:2的26-383 , (ii) SEQ ID NO:2的26-382 ; (iii) SEQ ID NO:2的27-383 ,或(iv) SEQ ID NO:2的27-382 , 或任選(v) SEQ ID NO:2的25-382 ,或(vi) SEQ ID NO:2的25-383。 在單體形式中，這些蛋白質(zhì)可在本文中指"SEQ ID NO:2單體,"或 "具有SEQ ID NO:2序列的"單體。這些SEQ ID NO:2單體可二聚 體化，這些二聚體組合可包括，例如(i)和(i); (i)和(ii); (i)和
(iii) ; (i)和(iv); (i)和(v); (i)和(vi); (ii)和(ii); (ii)和(iii); (ii)和
(iv) ; (ii)和(v); (ii)和(vi); (iii)和(iii); (iii)和(iv); (iii)和(v); (iii) 和(vi); (iv)和(iv); (iv)和(v); (iv)和(vi); (v)和(v); (v)和(vi); 和，(vi)和(vi)。這些不同的二聚體組合也可以相互組合形成四聚體
CTLA4Ig分子。這些單體、二聚體、四聚體和其它多聚體可在本文中指"SEQ ID NO:2蛋白質(zhì)，，或"具有SEQ ID NO:2序列，，的蛋白 質(zhì)。(編碼如SEQIDNO:2中所示CTLA4Ig的DNA按照布達(dá)佩斯 條約的規(guī)定于1991年3月31日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 , ATCC登 錄號ATCC 68629;表達(dá)如SEQ ID NO:2所示CTLA4Ig的中國倉鼠 卵巢(CHO)細(xì)胞系于1991年3月31日保藏，ATCC標(biāo)識號為CRL-10762)。如本文所使用，"Abatacept"指SEQ ID NO:2蛋白。
在一個實施方案中，CTLA4-L104EA29Y-Ig (有時稱作 "LEA29Y"或"L104EA29Y")為基因工程融合蛋白，與SEQ ID NO: 1 所示的CTAL4-Ig分子具有相似的結(jié)構(gòu)。U04EA29Y-Ig具有4^務(wù)飾 的人CTLA4功能性胞外結(jié)合結(jié)構(gòu)域和IgGl類人免疫球蛋白的Fc結(jié) 構(gòu)域。對CTLA4結(jié)構(gòu)域B7結(jié)合區(qū)域的兩個氨基酸進(jìn)行修飾以產(chǎn)生 L104EA29Y,將104位(L104E)的亮氨酸突變?yōu)楣劝彼?在SEQ ID NO:2的130位)并將29位(A29Y)的丙氨酸突變?yōu)槔野彼?在SEQ ID NO:2的55位)。SEQ ID NOS: 3和4分別描述了含有信號肽的 L104EA29YIg的核苷酸和氨基酸序列；突變的CTLA4胞外結(jié)構(gòu) 域，起于+27位的甲硫氨酸，止于+150位的天冬氨酸，或起于+26 位的丙氨酸，止于+150位的天冬氨酸；和Ig區(qū)。編碼L104EA29Y-Ig的DNA按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于2000年6月20日保存于美 國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。 ATCC登錄號為PTA-2104。美國專 利7094874 (頒發(fā)于2006年8月22日)和WO 01/923337 A2中進(jìn) 一步描述了 L104EA29Y-Ig，均以其整體并于本文以作參考。
在哺乳細(xì)胞中表達(dá)L104EA29YIg可產(chǎn)生N-和C-端突變體， 因此所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可具有以下殘基的氨基酸序列(i) SEQ ID NO: 4的26-383 , (ii) SEQ ID NO:4的26-382 ; (iii) SEQ ID NO:4的27-383 或(iv) SEQ ID NO:4的27-382 ,或任選(v) SEQ ID NO:4的25-382, 或(vi) SEQ ID NO:4的25-383。如果為單體形式，這些蛋白質(zhì)在本 文中可指"SEQ ID NO:4單體"或"具有SEQ ID NO:4序列"的單
13體。這些蛋白質(zhì)可二聚體化，這些二聚體組合可包括，例如(i)和
(i) ; (i)和(ii); (i)和(i)和(iv); (i)和(v); (i)和(vi); (ii)和
(ii) ; (ii)和(iii); (ii)和(iv); (ii)和(v); (ii)和(vi); (iii)和(iii); (iii) 和(iv); (iii)和(v); (iii)和(vi); (iv)和(iv); (iv)和(v); (iv)和(vi); (v)和(v);(v)和(vi);和，(vi)和(vi)。這些不同的二聚體組合也可 以相互組合形成四聚體L104EA29YIg分子。這些單體、二聚體、四 聚體和其它多聚體在本文中可指"SEQ ID NO:4蛋白質(zhì)"或"具有 SEQIDNO:4序列，，的蛋白質(zhì)。如本文所使用，"Belatacept"指SEQ IDNO:4蛋白。
CTLA4-Ig單體和多聚體 CTLA4-Ig分子包括，例如CTLA4-Ig蛋白單體、二聚體、三 聚體、四聚體、五聚體、六聚體或其它多聚體形式。CTLA4-Ig分子 可包含至少具有一個CTLA4胞外結(jié)構(gòu)域和一個免疫球蛋白恒定區(qū)的 蛋白質(zhì)融合。CTLA4-Ig分子可具有野生型或突變型序列，例如 CTLA4的胞外域和免疫球蛋白恒定區(qū)序列。單獨CTLA4-Ig單體或 二聚體、四聚體或其它多聚體形式均可被糖基化。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供至少具有一定百分比的二聚 體或其它多聚體分子的CTLA4-Ig分子群。例如，本發(fā)明提供 CTLA4-Ig 二聚體大于90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 99,5%的CTLA4-Ig分子群。在一個實施方案中，本發(fā)明提供含有約 95%至約99.5。/。CTLA4-Ig二聚體和約0.5% to至約5%CTLA4-Ig四 聚體的CTLA4-Ig分子群。在另一個實施方案中，CTLA4-Ig分子群 含有約98%的CTLA4-Ig 二聚體、約1.5%的CTLA4-Ig四聚體和約 0.5%的CTLA4-Ig單體。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了基本不含CTLA4-Ig單體 分子的CTLA4-Ig分子群。基本不含CTLA4-Ig單體分子可指具有少 于1%、 0.5%或0.1%單體的CTLA4-Ig分子群。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了基本不含大于二聚體，例如四聚體、六聚體等的CTLA4-Ig多聚體的CTLA4-Ig分子群?；?不含大于二聚體的CTLA4-Ig多聚體可指含有少于6%、 5%、 4%、 3%、 2%、 1%、 Q.5。/?；?.1%大于二聚體的CTLA4-Ig多聚體的 CTLA4-Ig分子群。在一個實施方案中，CTLA4-Ig單體分子可具有，例如，以 下氨基酸序列(i) SEQ ID NO:2的26-383， (ii) SEQ ID NO:2的26-382 (iii) SEQ ID NO:2的27-383,或(iv) SEQ ID NO:2的27-382或 任選(v) SEQ ID NO:2的25-382或(vi) SEQ ID NO:2的25-383。當(dāng) 在CHO細(xì)胞中表達(dá)含有SEQ ID NO: 1氨基S吏序列的表達(dá)盒時，所 表達(dá)的大多數(shù)單體形式具有甲硫氨酸(SEQ ID NO:2的殘基27 )N-端 氨基酸殘基，其與野生型人CTLA4的N-端氨基酸殘基一致。但 是，由于SEQ ID NO:l也包括抑瘤素M信號序列(SEQ ID NO: 1的 11-88核苷酸)的編碼序列，所以從SEQ ID NO:l表達(dá)的蛋白質(zhì)包括 抑瘤素M信號序列。在蛋白質(zhì)運出細(xì)胞質(zhì)或分泌出細(xì)胞的過程中， 該信號序列從所表達(dá)的蛋白質(zhì)上剪切下來。但是該剪切過程可產(chǎn)生 N-端突變體，例如氨基酸殘基25至26之間的剪切(得到殘基26的 N-端，如"丙氨酸變異體")，或氨基酸殘基24至25之間(得到殘 基2的N-端，如"天冬氨酸-丙氨酸變異體")，與氨基酸殘基26至 27之間的剪切相反(得到殘基27的N-端)。例如，天冬氨酸-丙氨 酸變異體可以約1%存在于CTLA4-Ig分子混合物中，丙氨酸變異體 可以8-10%存在于CTLA4-Ig分子混合物中。此外，由于不完全加 工，從SEQIDNO:l表達(dá)的蛋白質(zhì)可具有C-端變異體。大多數(shù)C-端 為SEQ ID NO:2殘基382的甘氨酸。在CTLA4-Ig分子混合物中可 存在例如約4-5%具有C-端賴氨酸(SEQ ID NO:2的殘基383 )的單 體。 CTLA4-Ig單體分子可含有人CTLA4的胞外結(jié)構(gòu)域。在一個 實施方案中，該胞外結(jié)構(gòu)域可包含編碼SEQ ID NO:2的氨基酸27-151的SEQ ID NO:l的核苷酸89-463的核苷酸序列。在另一個實施方案中，該胞外結(jié)構(gòu)域可包含人CTLA4的突變序列。在另一個實施 方案中，該胞外結(jié)構(gòu)域可包含SEQ ID NO:l核芬酸89-463的核香酸 變化，這樣就改變了保守氨基酸。在另一個實施方案中，該胞外結(jié) 構(gòu)域可包含至少75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98% 或99%與SEQ ID NO:l核香酸89-463相同的核苷酸序列。
CTLA4-Ig單體分子可含有人免疫球蛋白的恒定區(qū)。該恒定區(qū) 可為一個恒定區(qū)的一部分；該恒定區(qū)可具有野生型或突變型序列。 該恒定區(qū)可源自人IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgAl、 IgA2、 IgD或IgE。該恒定區(qū)可源自免疫球蛋白的輕鏈或重鏈。當(dāng)該恒定 區(qū)源自IgG、 IgD或IgA分子時，該恒定區(qū)含有一個或更多個以下 恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域CL、 CH1、鉸鏈區(qū)、CH2或CH3。當(dāng)該恒定區(qū)源自 IgM或IgE時，該恒定區(qū)含有一個或更多個以下恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域 CL、 CH1、 CH2、 CH3或Ca4。在一個實施方案中，該恒定區(qū)可包 含一個或更多個源自IgG、 IgD、 IgA、 IgM或IgE的結(jié)構(gòu)域。
在一個實施方案中，CTLAHg單體分子含有一皮修飾的人 IgGl鉸鏈區(qū)(SEQ ID NO: 1的核苷酸464-508; SEQ ID NO:2的氨 基酸152-166),其中SEQ ID NO:2的氨基酸殘基156、 162和165 的絲氨酸來自于野生型序列中的半胱氨酸。在一個實施方案中，CTLA4-Ig單體分子含有被修飾的人 IgGl CH2區(qū)和野生型CH3區(qū)(具有SEQ ID NO: 1核苷酸509-838 和SEQ ID NO:2氨基酸167-276的被修飾人IgGl CH2結(jié)構(gòu)域；含 有SEQ ID NO:l核苷酸839-1159和SEQ ID NO:2氨基酸277-383 的人IgGl CH3結(jié)構(gòu)域)。在一個實施方案中，CTLA4-Ig分子群含有具有以下序列的 單體，如2006年8月22日頒發(fā)的美國專利7,094,874的圖7、 8或 9 中任一個或多個中以及公布號為 US20030083246和 US20040022787的美國專利申請中所顯示的序列，其均以其整體并 于本文作為參考。
在一個實施方案中，CTLA4-Ig四聚體分子含有兩對CTLA4-Ig多肽或兩個CTLA4-Ig多肽二聚體，其中各多肽具有以下氨基酸 序列之一(i) SEQ ID NO:2的26-383 ， (ii) SEQ ID NO:2的26-382 , (iii) SEQ ID NO:2的27-383 ,或(iv) SEQ ID NO:2的27-382 ,或任 選(v) SEQ ID NO:2的25-382或(vi) SEQ ID NO:2的25-383。多肽 對或二聚體的每一成員與另 一成員共價連接，并且兩對多肽之間非
共價連接并由此形成四聚體。該四聚體分子可與CD80或CD86結(jié) 合。在另一個實施方案中，該四聚體分子可與CD80或CD86結(jié) 合，其親和力至少比CTLA4-Ig 二聚體(其單體具有上述氨基酸序 列之一)與CD80或CD86的親和力大2倍。在另一個實施方案 中，該四聚體可與CD80或CD86結(jié)合，其親和力至少比野生型 CTLA4與CD80或CD86的親和力大2倍。這一更大的親和力有助 于在治療免疫紊亂和其它下述疾病中的達(dá)到更高的藥效。此外，更 高或經(jīng)提高的親和力可產(chǎn)生更高的藥效強(qiáng)度。例如，含有CTLA4-Ig 四聚體的醫(yī)藥組合物將具有更高的親和力并因此比相同量的含有 CTLA4-Ig單聚體的醫(yī)藥組合物具有更高的藥效強(qiáng)度。在另一個實施 方案中，該四聚體分子對T細(xì)胞增殖的抑制比CTLA4-Ig 二聚體相 (其單聚體具有以上氨基酸序列之一)大2倍。在另一個實施方案 中，該四聚體分子對T細(xì)胞增殖的抑制比野生型CTLA4分子至少 大2倍?？墒褂帽炯夹g(shù)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)測定法檢測T細(xì)胞增殖，例如，最 常用的檢測T細(xì)胞增殖的方法之一為通過抗原或TCR的激動性抗體 激活T細(xì)胞并檢測，例如氚(titrated)-胸腺嘧啶(3H-TdR)摻入增殖T 細(xì)胞的情況，或增殖T細(xì)胞釋放至培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子的量?？捎?此測定CTLA4-Ig分子對T細(xì)胞激活或增殖的抑制作用。
CTLA4-Ig分子的親和性為該分子與單鏈，包括CD80、 CD86 或CD80Ig或CD86Ig融合蛋白的結(jié)合力。可使用例如基于表面等離振子技術(shù)的結(jié)合相互作用分析(BIA)測定CTLA4-Ig與配體的親和 性。除了檢測結(jié)合力，它還使結(jié)合動力學(xué)例如結(jié)合和解離速率常數(shù) 等得以實時測定。將一種由金屬薄膜包被的玻片(與表面基質(zhì)共價 結(jié)合)組成的傳感器芯片用相互作用物之一即CTLA4-Ig或配體之 一包被。使含有其它相互作用物的溶液流過該表面。將一連續(xù)光束 照射表面的另一側(cè)，測量其反射角。當(dāng)CTLA4-Ig與配體結(jié)合時， 光束的共振角發(fā)生變化(因為其取決于傳感器反應(yīng)側(cè)鄰近介質(zhì)的屈 光指數(shù)，其與介質(zhì)中溶解物質(zhì)的濃度直接相關(guān))。接著由計算機(jī)輔
助分析。在一個實施方案中，可在BIAcore儀器(BIAcore AG, Uppsala, Sweden)上通過表面等離子共振(SPR)進(jìn)行CTLA4-Ig結(jié)合試驗。 CTLA4-Ig可通過伯胺基團(tuán)共價偶聯(lián)至BIAcore傳感器芯片上的羧曱 基葡聚糖基質(zhì)上，從而將CTLA4-Ig固定至芯片上?；蛘?，可用抗 恒定區(qū)抗體將CTLA4-Ig通過Ig片段間接固定至傳感器表面。然 后，將配體加入芯片以檢測CTLA4-Ig與配體的結(jié)合?？筛鶕?jù)van der Merwe, P.等,J. Exp. Med. (1997) 185 (3):393-404描述的方法進(jìn)行 親和力測定?？蓽y定CTLA4-Ig分子的親和力。親和力可定義為兩個分子 或細(xì)胞之間在多位點上的總結(jié)合力。親和力(avidity)與親和性 (affinity)不同，后者為一個分子上的某一位點與其配體的結(jié)合強(qiáng)度。 不受理論的約束，更高的CTLA4-Ig分子親合力可增強(qiáng)CTLA4-Ig分 子對T-細(xì)胞增殖和激活的藥效強(qiáng)度?？赏ㄟ^兩類固相分析測定親合 力，例如a)竟?fàn)幰种茩z測和b)洗脫檢測。在兩種情況下，配體均 與固相載體結(jié)合。在竟?fàn)幮砸种茩z測中，將固定濃度的CTLA4-Ig 分子與不同濃度的配體加入溶液中，測定可抑制50%固相結(jié)合的配 體數(shù)量。所需配體越少，親合力越強(qiáng)。在洗脫片企測中，將配體加入 溶液中。在達(dá)到平衡態(tài)之后，加入不同濃度的離液劑或變性劑(如 異硫氰酸鹽、尿素或二乙胺)干擾CTLA4-Ig/配體相互作用。然后用EUSA測定CTLA4-Ig抗性洗脫液的量。親合力越高，用于洗脫 某一數(shù)量CTLA4-Ig所需的離液劑越多。CTLA4-Ig分子異質(zhì)混合物 的相對親合力可以表示為親和力指數(shù)(AI),等于洗脫50%結(jié)合 CTLA4-Ig分子所需的洗脫劑濃度?？赏ㄟ^測定不同濃度的洗脫劑洗 脫的CTLA4-Ig百分比進(jìn)行精細(xì)分析。 生產(chǎn)本發(fā)明CTLA4-Ig分子的方法可在原核細(xì)胞中表達(dá)CTLA4-Ig分子。各種細(xì)菌株可通常代 表大多數(shù)的原核細(xì)胞。細(xì)菌可為革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性。通常 優(yōu)選革蘭氏陰性菌例如大腸桿菌(五.co")。也可使用其它微生物抹。
將如上所述的編碼CTLA4-Ig分子的序列插入用于表達(dá)外原 序列的原核細(xì)胞載體中，例如大腸桿菌。這些載體可包括通常使用 的原核控制序列，其在本文定義為包括用于起始轉(zhuǎn)錄的啟動子，任 選含有操縱子，以及核糖體結(jié)合位點序列，包括這些常用的啟動子 例如卩-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)啟動子系統(tǒng)(Chang，等， (1977) Nature 198:1056)、色氨酸(trp )啟動子系統(tǒng)(Goeddel,等， (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057)以及人衍生Pi啟動子和N-基因核糖 體結(jié)合位點(Shimatake，等，(1981) Nature 292:128)。
這樣的表達(dá)載體也包括復(fù)制起點和可篩選標(biāo)記，例如使其具 有抗生素抗性的p-內(nèi)酰胺酶和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，這樣載體可 在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制并且可在抗生素(例如氨芐西林或卡那霉素)存在下 生長從而篩選攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞。可通過各種標(biāo)準(zhǔn)方法將表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入原核細(xì)胞，包括但不限 于CaCl2休克(Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110和 Sambrook等.(eds.),"分子克隆:實驗室手冊"("Molecular Cloning: A Laboratory Manual"),第二版，冷泉港出版社(1989))和電穿孔。
與本發(fā)明的實踐一致，真核細(xì)胞也可為適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。真 核細(xì)胞的實例包括任何動物細(xì)胞，原始的或固定化的，酵母(例如 酉良酒酵母 (Sacc/mromyces cerev^siae )、 粟酒裂歹直酵母(iSWn'msacc/jflramyces / om6e )和畢赤酵母(尸fc/n'a ，加& ))和 植物細(xì)胞。骨髓瘤、COS和CHO細(xì)胞為可作為宿主的動物細(xì)胞實 例。尤其是CHO細(xì)胞包括但不限于DG44 (Chasin,等.，1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901-10909)、 CHO-K1 (ATCC No. CCL-61)、 CHO-K1 Tet陽On細(xì)胞系 (Clontech)、標(biāo)為ECACC 85050302的CHO (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), CHO克隆13 (GEIMG, Genova， IT)、 CHO克隆B (GEIMG, Genova, IT)、標(biāo)為ECACC 93061607的CHO-K1/SF (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)和標(biāo)為ECACC 9205229的RR-CHOK1 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK)。示例性植物細(xì)胞包括煙草
(全植物、細(xì)胞培養(yǎng)物或愈傷組織)、玉米、大豆和水稻細(xì)胞。玉 米、大豆和水稻細(xì)胞也可接受。也可將上述編碼CTLA4Ig分子的核酸序列插入用于表達(dá)外源 序列的真核宿主中。該載體的調(diào)控元件依具體的真核宿主而不同。
用于表達(dá)載體的常用真核控制序列包括與哺乳動物細(xì)胞相容 的啟動子和控制序列，例如CMV啟動子(CDM8載體)和鳥類肉瘤 病毒(ASV)(兀LN載體)。其它常用啟動子包括猿猴病毒40 (SV40) (Fiers,等，(1973) Nature 273:113)的早期和晚期啟動子，或其它病毒 啟動子，例如衍生自多瘤、腺病毒2和牛乳頭狀瘤病毒的啟動子。 也可使用誘導(dǎo)型啟動子，例如hMTII (Karin,等，(1982) Nature 299:797掘)。在真核細(xì)胞中表達(dá)CTLA4Ig分子的載體也可攜帶被稱作增強(qiáng) 子區(qū)的序列。這些對于優(yōu)化基因表達(dá)是非常重要的并且存在于啟動 子區(qū)的上游或下游。用于真核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體實例包括但不限于哺乳動物宿 主細(xì)胞載體(例如，BPV-1、 pHyg、 pRSV、 pSV2、 pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV2、 pRc/RSV、 pSFVl (Life Technologies); pVPakc載體、pCMV載體、pSG5載體(Stratagene))、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如，pFB載體(Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen)或其修飾形 式、腺病毒載體；腺伴隨病毒載體、桿狀病毒載體、酵母載體(例如, pESC載體(Stratagene))?？蓪⒕幋aCTLA4Ig分子的核S臾序列整合至真核宿主細(xì)胞的基 因組中并按照宿主基因組復(fù)制的方式復(fù)制?；蛘?，攜帶CTLA4Ig分 子的載體可含有允許染色體外復(fù)制的復(fù)制起點。對于在釀酒酵母(&cc/wtram_ycey cerev&ae )中表達(dá)核酸序 列，可使用來自酵母質(zhì)粒的復(fù)制起點2p環(huán)(Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307)?；蛘撸墒褂脕碜越湍富蚪M可啟動自主復(fù)制的序列(見 例如，Stinchcomb等，(1979) Nature 282:39; Tschemper等.，(1980) Gene 10:157;和Clarke等，(1983) Meth. Enz. 101:300)。
酵母載體的轉(zhuǎn)錄控制序列包括用于合成糖酵解酶(Hess等., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland等，(1978) Biochemistry 17:4900)的啟動子。本技術(shù)領(lǐng)域已知的其它啟動子包括CDM8載體 (Toyama核Okayama, (1990) FEBS 268:217-221)中提供的CMV啟動 子、3-磷酸甘油酸酯激酶的啟動子(Hitzeman等.，(1980) J. Biol. Chem. 255:2073)和其它糖酵解酶的啟動子。其它啟動子為誘導(dǎo)型，因為它們受環(huán)境刺激和細(xì)胞生長培養(yǎng) 基的調(diào)節(jié)。這些誘導(dǎo)型啟動子包括熱休克蛋白、醇脫氬酶2、異細(xì) 胞色素C、酸性磷酸酯酶、與氮分解代謝相關(guān)的酶和負(fù)責(zé)麥芽糖和 半乳糖利用的酶的基因。調(diào)控序列可位于編碼序列的3，端。這些序列可穩(wěn)定信使 RNA。這些終止子存在于一些由酵母衍生和哺乳動物基因的編碼序 列之后的3'非翻譯區(qū)。示例性植物載體和植物細(xì)胞包括但不限于農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒、 花椰菜花葉病毒(CaMV)和番茄金花葉病毒(TGMV)。
哺乳細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方法包括但不限于磷酸鈣存在下的轉(zhuǎn)染、顯 孩"主射、電穿孔或通過病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。
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將外源DNA導(dǎo)入植物或酵母基因組的方法包括(1 )機(jī)械方 法，例如將DNA顯樣"主射入單核細(xì)胞或原生質(zhì)體，在DNA存在下 與玻璃珠一起渦旋細(xì)胞或?qū)NA包被的鵠或金微粒射入細(xì)胞或原生 質(zhì)體；(2)用聚乙二醇處理或高電壓電脈沖(電穿孔)使細(xì)胞膜可 透過大分子；或(3)使用可與細(xì)胞膜融合的脂質(zhì)體(含有 cDNA)。美國專利申請美國公開號20050019859和美國專利申請美國
發(fā)明者C·E·達(dá)爾黑姆, M·M·達(dá)利, M·內(nèi)魯爾卡, R·B·甘地, S·波爾薩迪亞, V·H·納林格雷卡 申請人:布里斯托爾-邁爾斯斯奎布公司