專利名稱:人干擾素α衍生物及其聚乙二醇化修飾物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及人干擾素α衍生物、人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物及其制備與用途。
背景技術(shù):
人干擾素(interferon,IFN)是一類體內(nèi)存在的具有廣譜抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)機(jī)能的活性蛋白質(zhì),是最早用于臨床治療的細(xì)胞因子之一。人干擾素可分為三型,即人干擾素-α,人干擾素-β,人干擾素-γ,還可根據(jù)各型IFN的氨基酸序列不同再分為若干亞型。經(jīng)大量臨床研究證明,人干擾素-α是一種重要的抗腫瘤和抗病毒治療藥物。目前我國(guó)在臨床使用最廣泛的主要是重組人干擾素α-1a、α-2a和α-1b。
人干擾素α由165個(gè)氨基酸組成,分子量在19000道爾頓左右。目前已發(fā)現(xiàn)人干擾素α的I型家族有20多個(gè)基因成員,其中大部分編碼功能蛋白,彼此在核苷酸水平上有大約90%的同源性。但是,無(wú)論是人干擾素α-2a、人干擾素α-1b和人干擾素α-1a,作為蛋白質(zhì)藥物,其抗病毒比活性僅為1×108IU/mg,并且由于易產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng),穩(wěn)定性差,血漿清除率高、大劑量時(shí)不良反應(yīng)多的缺點(diǎn),在臨床治療上受到很大限制。
目前,可以通過(guò)基因工程的手段大規(guī)模合成人重組蛋白,來(lái)制備人干擾素衍生物或類似物,很大程度上解決了異源蛋白引起的免疫原性問題,卻仍然無(wú)法克服穩(wěn)定性差、血漿清除快和生物利用度低的缺點(diǎn)。
這些缺點(diǎn)造成的結(jié)果是需頻繁注射人干擾素才能達(dá)到有效的血漿治療濃度,而且,每次注射后均會(huì)導(dǎo)致血藥濃度的較大波動(dòng),形成藥物濃度的“峰一谷”效應(yīng),這樣就增加了治療費(fèi)用以及不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。
聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的技術(shù)是近十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種用于改進(jìn)蛋白質(zhì)類藥物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)的新技術(shù)。它是將活化的聚乙二醇分子(PEG)鍵合到蛋白質(zhì)分子表面上,從而影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)各種生物化學(xué)性質(zhì)的改變。
PEG是由氧乙烯單體聚合而成的惰性長(zhǎng)鏈的兩性分子。現(xiàn)在已有多種不同的PEG可供利用。被活化的PEG其活性功能基因可以被聯(lián)結(jié)到治療分子的某特殊部位(比如氨基、巰基或其他親核物質(zhì)),可以有效控制修飾產(chǎn)物的純度,使工藝更簡(jiǎn)單并且產(chǎn)品質(zhì)量也更易評(píng)價(jià)。
序列分析發(fā)現(xiàn)人干擾素α族α1a、α2a及α1b的第1位N末端為半胱氨酸殘基,其-SH與29位Cys的-SH之間形成二硫鍵,從而使人干擾素α的多肽分子變成卷曲的空間構(gòu)型,若用聚乙二醇化PEG對(duì)現(xiàn)有的人干擾素α的氨基末端殘基進(jìn)行修飾,其聚乙二醇化修飾率非常低,僅達(dá)2~5%,且獲得的聚乙二醇化修飾物含有非氨基端修飾異構(gòu)體,影響人干擾素α的聚乙二醇化修飾物的純度。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是解決人干擾素α聚乙二醇化修飾率低的問題,提供一種人干擾素α衍生物,所述人干擾素α衍生物是在人干擾素α的氨基末端連接上4~7個(gè)甘氨酸,通式為Gly(n)-IFNα,其中n為4~7。
本發(fā)明的目的之二是提供一種人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物,即在上述人干擾素α衍生物氨基末端的氨基上通過(guò)酰胺鍵連接活化的聚乙二醇分子(PEG),其分子通式如下所示,其中n為4~7
本發(fā)明所述聚乙二醇平均分子量為10000~40000道爾頓。
本發(fā)明的目的之三是提供上述人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物的制備方法。
本發(fā)明的目的之四是提供人干擾素α衍生物及其聚乙二醇化修飾物在制備治療或預(yù)防病毒感染或腫瘤疾病的藥物中的用途。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下 本發(fā)明所述人干擾素α衍生物,是在人干擾素α的氨基末端連接上由4-7個(gè)甘氨酸組成的肽片斷。該肽片斷充分暴露了氨基末端的游離-NH2,有利于PEG對(duì)氨基末端的定點(diǎn)修飾。該肽片段優(yōu)選由5個(gè)甘氨酸組成。
本發(fā)明所述人干擾素α衍生物,包括人干擾素α1b(IFN-α1b),α2a(IFN-α2a),α2b(IFN-α2b)三種蛋白的衍生物,類似物,生物活性或藥物活性片段。
本發(fā)明還提供了編碼所述人干擾素α衍生物的核苷酸序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中,提供一種能在畢赤酵母中高表達(dá)的人干擾素α衍生物的核苷酸序列,其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本發(fā)明提供的所述人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物的制備方法,包括 1)制備人干擾素α衍生物; 2)聚乙二醇與人干擾素α衍生物偶聯(lián)反應(yīng); 3)人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物的純化。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中,經(jīng)基因重組技術(shù)在人干擾素α的氨基末端接上4~7個(gè)甘氨酸,用不需任何誘導(dǎo)劑的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)所述人干擾素α衍生物,獲得的人干擾素α衍生物充分暴露了氨基末端的游離-NH2,有利于PEG對(duì)的人干擾素α衍生物的氨基末端的游離-NH2進(jìn)行修飾,具有更高的修飾率達(dá)50%。
利用PEG對(duì)本發(fā)明所述人干擾素α衍生物的氨基末端進(jìn)行定點(diǎn)修飾獲得的人干擾素α衍生物聚乙二醇修飾物,穩(wěn)定性高、水溶性好、抗原性低,而且不含非氨基端修飾異構(gòu)體,純度高達(dá)95%以上,體內(nèi)存留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)9天,長(zhǎng)效作用明顯,具有良好的的臨床應(yīng)用前景。
圖1為pGAP-IFN酵母表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖; 圖2是陽(yáng)性表達(dá)菌種目的基因的PCR鑒定; 泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);泳道2-9及11-12分別為在Zeocin平板上生長(zhǎng)的不同陽(yáng)性單克隆菌落;泳道15是作為陰性對(duì)照的空菌落GS115;泳道10、13、14未加樣; 圖3是mPEG-Gly(5)-IFNα的SDS-PAGE電泳圖; 泳道1為SDS-PAGE低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì);泳道2為未純化的mPEG-Gly(5)-IFNα;泳道3為Gly(5)-IFNα;泳道4為純化后的mPEG-Gly(5)-IFNα。
圖4是mPEG-Gly(5)-IFNα在小鼠血液中的濃度-時(shí)間曲線圖; 圖5是mPEG-Gly(5)-IFNα在大鼠血液中的濃度-時(shí)間曲線圖; 圖6是短效干擾素在大鼠血液中的濃度-時(shí)間曲線圖。
具體實(shí)施例方式 以下通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。在下面的實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)材料如無(wú)特別說(shuō)明均可通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)得或通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法獲得。
實(shí)施例1gly-gly-gly-gly-gly-IFNα-2a(以下簡(jiǎn)稱Gly(5)-IFN α)在畢赤酵母中的分泌表達(dá) 1、目的基因的設(shè)計(jì)和獲得 IFNα-2a的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。通過(guò)Genebank獲知IFNα-2a的CDNA后將相應(yīng)的密碼子改成酵母偏愛性,并在N端加入gly-gly-gly-gly-gly相應(yīng)的核苷酸序列。該CDNA序列用于畢赤酵母GS115(購(gòu)自invitrogen)的pGAPZα表達(dá)質(zhì)粒(購(gòu)自invitrogen)的構(gòu)建。轉(zhuǎn)化GS115宿主菌后實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。因此在設(shè)計(jì)中加入KEX2的酶識(shí)別位點(diǎn)CTC GAG AAA AGA,其中CTC GAG為XhoI酶切位點(diǎn)。同時(shí)3′端引入雙終止密碼子TGA TAA和NotI酶切序列GCG GCCGC。用于酵母表達(dá)載體的IFN的CDNA序列如SEQ ID No.2所示。
所述的CDNA序列由上海生物工程有限公司全人工基因合成,經(jīng)測(cè)序后裝入pBluescript II SK(+)(購(gòu)自Fermentas life sciences)上,插入位點(diǎn)為XhoI/NotI。命名為pblue-IFN。
2、質(zhì)粒pGAPZα-IFN的構(gòu)建。
把pblue-IFN中的目的基因用XhoI和NotI核酸內(nèi)切酶雙酶切膠回收目的片段,備連接。
將pGAPZα質(zhì)粒用核酸內(nèi)切酶XhoI和NotI雙酶切回收大片段作為載體,與上述IFN片段用T4連接酶連接,16℃過(guò)夜,再用CaCl2法轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α中,用酶切法篩選陽(yáng)性克隆,命名為pGAPZα-IFN,pGAPZα-IFN質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖如圖1所示。
3、表達(dá)工程菌的獲得 將pGAPZα-IFN質(zhì)粒用BspHI線形化后轉(zhuǎn)入到酵母GS115中,并繼續(xù)陽(yáng)性重組子的選擇,其過(guò)程是 (1)制備感受態(tài)酵母GS115; (2)加入線形化的質(zhì)粒pGAPZα-IFN; (3)混勻后加入到轉(zhuǎn)化杯中; (4)用電穿孔儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化,點(diǎn)擊條件0.5kv,2.5Uf,1500hm; (5)用1.0ml,1.0M山梨醇洗出; (6)涂布于含有Zeocin平板上,30℃培養(yǎng),24小時(shí)后長(zhǎng)出單菌落; (7)挑取單菌落重新涂布于含有不同濃度Zeocin的平板上,以純化和篩選高表達(dá)菌; (8)用PCR的方法鑒定陽(yáng)性表達(dá)菌種里的目的基因,結(jié)果如圖2所示,顯示陽(yáng)性表達(dá)菌種含有目的基因。
4、工程菌的表達(dá) 在Zeocin的平板上挑取單克隆工程菌,在10ml的YPD培養(yǎng)液中培養(yǎng),30℃,300rpm,過(guò)夜。第二天用0.1ml的培養(yǎng)菌放在50ml的YPD中以同樣條件培養(yǎng),分別在0,24,48,72,96小時(shí)收獲1ml菌液,用SDS-PAGE的方法檢驗(yàn)蛋白表達(dá),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Gly(5)-IFNα在24小時(shí)出現(xiàn)蛋白表達(dá),在48小時(shí)表達(dá)量最高。
實(shí)施例2Gly(5)-IFNα的純化 第一步陽(yáng)離子凝膠柱(CM Sepharose F.F.凝膠購(gòu)自AmershamBiosciences)層析 采用pH3.8~4.6醋酸鹽緩沖液進(jìn)行上柱、洗脫,電泳監(jiān)測(cè)收集目標(biāo)物。然后使用pH7.5~8.5 Tris-HCl緩沖溶液對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行透析。
第二步陰離子凝膠柱(DEAE Sepharose F.F.凝膠購(gòu)自AmershamBiosciences)層析 采用pH7.5~8.5 Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行上柱、洗脫,收集目標(biāo)物。再用pH7.5~8.5磷酸鹽緩沖溶液對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行透析。
實(shí)施例3PEG偶聯(lián)修飾樣品的制備與純化 1、將實(shí)施例1所得Gly(5)-IFNα樣品用磷酸鹽緩沖液(PH為6.0)進(jìn)行透析,然后加入摩爾比為1∶3的ALD-PEG 40KD(購(gòu)自北京鍵凱科技有限公司)在2~15℃進(jìn)行修飾,反應(yīng)時(shí)間為40小時(shí)。將得到的修飾樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè),試驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)PEG偶聯(lián)修飾后,分子量提高,由原來(lái)的19000道爾頓提高到近90000道爾頓,修飾率達(dá)60%左右,得到目標(biāo)物mPEG-Gly(5)-IFNα。
2、mPEG-Gly(5)-IFNα的純化 將mPEG-Gly(5)-IFNα使用醋酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)(pH值為4.0~5.0)以終止反應(yīng),上陽(yáng)離子凝膠柱SP Sepharose F.F.凝膠柱進(jìn)行純化。用NaCl(0.15M)溶液進(jìn)行洗脫,收集目標(biāo)物,純度達(dá)95%以上。結(jié)果如圖3所示。
實(shí)施例4ELISA法檢測(cè)mPEG-Gly(5)-IFNα在小鼠體內(nèi)的濃度與時(shí)間變化關(guān)系 取昆明小鼠雌雄各半,體重在22-25克左右,小鼠腹腔注射實(shí)施例3所得人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物mPEG-Gly(5)-IFNα,劑量為50微克/千克,在給藥后24、72、120、168、216小時(shí)眼眶采血,每只小鼠采血0.8-1.0ml,不加抗凝劑,每次采血4只小鼠。采完血后蓋上離心管,靜置30分鐘,然后拿滅好菌的玻璃毛細(xì)管輕輕的繞離心管管壁刮一圖,把凝固的血液刮離管壁。2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘,取上清置-20℃冰箱保存,待所有的血清全部采完后按照ELISA試劑盒上的說(shuō)明書檢測(cè)。經(jīng)過(guò)體內(nèi)代謝后不同時(shí)間人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物在小鼠血液中的濃度如表1所示,其濃度與時(shí)間的變化曲線圖如圖4所示。
表1mPEG-Gly(5)-IFNα在小鼠血液中的濃度(pg/ml)
實(shí)驗(yàn)結(jié)論應(yīng)用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法檢測(cè)小鼠體內(nèi)mPEG-Gly(5)-IFNα的含量,可知50微克/kg mPEG-Gly(5)-IFNα樣品腹腔注射小鼠后,在216小時(shí)即9天時(shí)都能檢出,相對(duì)與現(xiàn)有技術(shù)中人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物6-7天的體內(nèi)存留時(shí)間,mPEG-Gly(5)-IFNα在體內(nèi)存留時(shí)間明顯延長(zhǎng)。
實(shí)施例5mPEG-Gly(5)-IFNα與重組人干擾素α-2b在大鼠體內(nèi)的血藥濃度比較 取清潔級(jí)SD大鼠9只,雄性,體重在200g左右。隨機(jī)分為2組,為長(zhǎng)效干擾素組7只和短效干擾素組2只。長(zhǎng)效干擾素組腹腔注射實(shí)施例3所得人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物mPEG-Gly(5)-IFNα劑量為50微克/千克,在給藥后24、72、120、168、216和264小時(shí)眼眶采血0.8ml,2500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘,取上清置-20℃冰箱冷藏待測(cè)。短效干擾素組腹腔注射市售藥品重組人干擾素α注射液(上海華新生物高技術(shù)有限公司生產(chǎn)),劑量為50微克/千克,在給藥4、10和12小時(shí)采血0.8ml,2500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘,取上清置-20℃冰箱冷藏待測(cè)。待所有的血清全部收集完畢用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法測(cè)血清中人干擾素-a的含量。經(jīng)過(guò)體內(nèi)代謝后不同時(shí)間人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物在小鼠血液中的濃度如表2、3所示,其濃度與時(shí)間的變化曲線圖如圖5、6所示。
表2mPEG-Gly(5)-IFNα在大鼠血液中的濃度(pg/ml)
表3短效干擾素在大鼠血液中的濃度(pg/ml)
實(shí)驗(yàn)結(jié)論應(yīng)用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法檢測(cè)干擾素在大鼠的血藥濃度,可知?jiǎng)┝繛?0微克/kg的短效干擾素重組人干擾素α藥代峰值為4小時(shí),代謝過(guò)程迅速,10小時(shí)基本到達(dá)基線水平;而50微克/kg的mPEG-Gly(5)-IFNα樣品腹腔注射大鼠后,在216小時(shí)即9天時(shí)都能檢出,說(shuō)明其在體內(nèi)的代謝達(dá)到長(zhǎng)效的效果。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,應(yīng)當(dāng)指出,對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾,這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
SEQUENCE LISTING
<110>海南四環(huán)心腦血管藥物研究院有限公司
北京四環(huán)制藥有限公司
海南四環(huán)醫(yī)藥有限公司
<120>人干擾素α衍生物及其聚乙二醇化修飾物
<130>MP090344
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>165
<212>PRT
<213>IFNα-2a蛋白
<400>1
Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met
1 510 15
Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
20 25 30
Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
35 40 45
Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
50 55 60
Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
85 90 95
Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
100 105 110
Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
115 120 125
Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
130 135 140
Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser
145 150 155 160
Leu Arg Ser Lys Glu
165
<210>2
<211>536
<212>DNA
<213>IFNα-2a的CDNA序列
<400>2
ctcgagaaaagaggaggcggtgggggttgtgatcttcctaaaacacactc
cttgggatct 60
aggcgtacattaatgttgttagcccagatgagacgaatctctttgttttc
ctgcttgaag 120
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gaaaaaaagtattctccttgtgcctgggaagtcgttagagccgaaatcat
gagatctttt 480
agtttgtcaa ctaatctgca ggagagtcta agatcaaagg agtaatgagc ggccgc
53權(quán)利要求
1.一種人干擾素α衍生物,其特征在于,在人干擾素α的N末端連接由4-7個(gè)甘氨酸組成的肽片斷。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人干擾素α衍生物,其特征在于,所述人干擾素α選自人干擾素α1b、人干擾素α2a、人干擾素α2b和所述三種蛋白的衍生物及類似物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人干擾素α衍生物,其特征在于,在人干擾素α的N末端連接由5個(gè)甘氨酸組成的肽片斷。
4.編碼權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述人干擾素α衍生物的核苷酸序列。
5.含有權(quán)利要求4所述核苷酸序列的表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的表達(dá)載體,其特征在于,所述表達(dá)載體為畢赤酵母。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物,其特征在于,聚乙二醇以酰胺鍵連接在所述人干擾素α衍生物的N末端。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物,其特征在于,聚乙二醇平均分子量為10000~40000道爾頓。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物的制備方法,包括以下步驟
1)制備人干擾素α衍生物;
2)聚乙二醇與人干擾素α衍生物偶聯(lián)反應(yīng);
3)人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物的純化。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述人干擾素α衍生物的聚乙二醇修飾物在制備治療或預(yù)防病毒感染或腫瘤疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人干擾素α衍生物及其聚乙二醇化修飾物。本發(fā)明所述人干擾素α衍生物是在人干擾素α的氨基末端連接上4~7個(gè)甘氨酸。本發(fā)明所述人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物由聚乙二醇以酰胺鍵連接在所述人干擾素α衍生物的氨基末端形成。本發(fā)明還提供上述人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物的制備方法及其在治療和預(yù)防病毒性感染或腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明的人干擾素α衍生物的聚乙二醇化修飾物不含非氨基末端修飾異構(gòu)體,純度高達(dá)95%以上,體內(nèi)留存時(shí)間長(zhǎng),具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P31/00GK101514229SQ200910131149
公開日2009年8月26日 申請(qǐng)日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者夏中寧, 然 吳, 張麗杰 申請(qǐng)人:海南四環(huán)心腦血管藥物研究院有限公司, 北京四環(huán)制藥有限公司, 海南四環(huán)醫(yī)藥有限公司