專利名稱：一種含有二氮雜環(huán)丙烯基的非天然核苷、其制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種非天然核苷，具體地說，涉及一種含有二氮雜環(huán) 丙烯基的非天然核苷、其制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
將非天然核苷引入到寡聚核苷酸中，對于基因測序和識(shí)別異?；?br> 因、通過反義寡核苷酸調(diào)控基因和蛋白的表達(dá)、探測DNA-NDA、 DNA-RNA和DNA-蛋白之間的相互作用、描述DNA分子中電荷轉(zhuǎn) 移反應(yīng)的性質(zhì)以及評(píng)價(jià)氫鍵和7i 7i相互作用在穩(wěn)定DNA分子中的功 效，是非常有效的。
眾所周知，包含光敏基團(tuán)的非天然核苷已經(jīng)被用來識(shí)別核酸 - 核 酸、核酸-蛋白相互作用。例如，Koudan發(fā)展了光活的2，-脫氧尿苷 衍生物(乂所omo/. 6^w"wre Z^"",'" 2002, 2(9(3)， 421-428 ); Taranenko發(fā)展了帶三氟甲基二氮雜環(huán)丙烯基芳基的非天然核苷(五w /歷oc/ze附.2003， 270， 2945-2949 ); Dezhurov發(fā)展了含有4-疊氮-2，5畫 二氟-3-氯吡P定基的非天然核苷 / C/2激2003, 2柳, 66-72)。目前，結(jié)構(gòu)新穎的含有光敏基團(tuán)特別是含有二氮雜環(huán)丙烯基 的非天然核苷有廣泛的巿場需求。
二氮雜環(huán)丙烯基衍生物已經(jīng)被廣泛用于研究核酸、蛋白和其他各 種大分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能。相比其他光親和基團(tuán)，二氮雜環(huán)丙烯 具有如下幾個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)第一，它在350-360納米波長范圍內(nèi)能被迅 速光解，而對于大多數(shù)生物大分子來說，這個(gè)波長在它們的吸收波長 之外；第二， 二氮雜環(huán)丙烯被光解之后可以形成高反應(yīng)活性的卡賓中 間體，卡賓可以和包括惰性的脂肪族碳?xì)滏I在內(nèi)的各種各樣的官能團(tuán) 發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)；第三，與卡賓偶聯(lián)產(chǎn)生的碳鍵在通常的實(shí)驗(yàn)條件下是穩(wěn)定的；第四，相比其他光活基團(tuán)，二氮雜環(huán)丙烯基衍生物的空間位 阻較小，在中等強(qiáng)度的實(shí)驗(yàn)室照明的情況下具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性。 核苷分子可以發(fā)生分子內(nèi)和分子間的偶聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將形 成一個(gè)新的共價(jià)鍵。當(dāng)偶聯(lián)反應(yīng)在分子間進(jìn)行時(shí)，核苷分子可以和另 一個(gè)生物分子(例如核苷、肽以及抗體等)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。這種研究
工作可以應(yīng)用于(i)研究蛋白/DNA或蛋白/RNA經(jīng)光致偶聯(lián)而發(fā)生 的相互作用；(ii)捕獲和描述不同細(xì)胞的DNA/RNA相互作用、DNA 修復(fù)以及修飾蛋白同含有類似物的核算探針之間的相互作用；(m) 將這些探針分子引入到siRNA或任何與這些分子偶聯(lián)的RNA片段 中，從而確認(rèn)RNA分子的靶細(xì)胞(例如，將一個(gè)小"尾巴"引入到RNA 探針分子中可以幫助找出產(chǎn)生于體內(nèi)或體外的RNA/蛋白偶聯(lián)復(fù)合 物)；(iv)將這些探針分子引入到DNA或PNA反義分子中，以闡明 在基因組DNA中的結(jié)合位點(diǎn)或在基因療法中其他潛在的靶 DNA/PNA。 DNA鏈內(nèi)部的偶聯(lián)反應(yīng)是一種最有效的殺死細(xì)胞的手 段，同時(shí)也是例如治療癌癥的藥物-順鉑等幾種化學(xué)藥物的作用方式。
通常的癌癥治療策略是引起DNA損傷從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的凋亡。 一些在臨床上使用的最為有效的抗癌藥(例如環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C 以及順鉑)就是通過引起DNA鏈交聯(lián)來實(shí)現(xiàn)抗癌功效。這在Hurley (淑C騰er2002, 2， 188-200)、 Wang (淑.i ev. Dn/gD/助v. 2005， 《307-320)、 Wang ( /. C7ze附.& c. 2003, "5， 1116-1117)和
Yoshimura (A^c/e/c Symp. 5"a 2004， 81-82)的文章中都有論述。 但是目前的治療策略只能在病毒復(fù)制過程中起作用，作用過程沒有選 擇性，會(huì)殺死正常的細(xì)胞，毒性很大。
因此，對于設(shè)計(jì)治療癌癥和病毒感染的藥物而言，能夠引起DNA 鏈交聯(lián)的核苷類似物是非常有吸引力的分子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有光敏基團(tuán)的含有二氮雜環(huán)丙烯基的非天然核苷。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含有二氮雜環(huán)丙烯基的非天然核 苷的制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種含有二氮雜環(huán)丙烯基的非天然核 苷在作為光敏交聯(lián)劑中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明具有結(jié)構(gòu)式(I )的含有二氮雜環(huán) 丙烯基的非天然核苷化合物
其中，式中W為氫、取代或未取代的C^ C8的烷基，n為0、 1、 2或3，但最好是0。
Ar是5元至IO元的雜芳環(huán)或5元至IO元的芳環(huán)，這些芳環(huán)需 要具備兩個(gè)條件(a)至少有一個(gè)含糖、糖類似物、核苷或核苷類 似物的取代基；(b) 0到3個(gè)包括取代或未取代的d C8的烷基、 羥基和氨基。Ar也可以是帶取代基的6元至IO元的芳環(huán)，例如苯基 或萘基。所述的Ar可以帶核糖或脫氧核糖等取代基。或者，Ar可以 帶核苷亞磷酰胺單體或脫氧核苷亞磷酰胺單體的糖類似物取代基?；?者，Ar可以帶重復(fù)的糖-磷酸結(jié)構(gòu)單元、重復(fù)的經(jīng)修飾的糖-磷酸結(jié)構(gòu) 單元或核苷類似物等核苷取代基?；蛘?，Ar可以帶肽核酸等核苷類 似物等取代基。
一般說來，Ar帶有一個(gè)如分子式(II)所示的取代基
R2、 R3、尺4或115是氫或羥基；W是經(jīng)保護(hù)或未經(jīng)保護(hù)的單、雙 或三磷酸基；或者W和W兩個(gè)基團(tuán)中的一個(gè)能與聚核苷鏈反應(yīng)偶 聯(lián)。通常，W和W兩個(gè)基團(tuán)中的一個(gè)是亞磷酰胺，R2、 W或W是氫或羥基。
亞磷酰胺單體化學(xué)的藝術(shù)已經(jīng)廣為人知。例如，DNA可以用 Matteucci在丄爿m. C77e附.5bc. 1981,川3， 3185中所述、或者用Yoo在 J. C/zem. 1989， 7", 17078中所述的使用亞磷酰胺單體固相合成 的方法或者其他眾所周知的方法進(jìn)行合成。
另外，Ar可以帶一個(gè)式(III)所示的取代基<formula>formula see original document page 9</formula>
W和W是能與聚核苷鏈進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)的基團(tuán)；RS是氫或者羥基。
通常，W和W是羥基或者亞磷酰胺。
通常，式(I)中的Ri是CX3， X是鹵素。X—般是F元素。 優(yōu)選的是，符合結(jié)構(gòu)式(I)的化合物是式(IV)到式(VII)中
的一個(gè)<formula>formula see original document page 9</formula>
式中所示的RW是H、取代或未取代的d-C8的烷基、羥基或者 氨基中的一種；R是糖基、糖基類似物、核酸基或者具有核酸骨架的 類似物；n和W如式(I)中所述。
進(jìn)一步優(yōu)選的是，符合結(jié)構(gòu)式(i)的化合物是式(vin)到式(xm)
中的一個(gè)
<formula>formula see original document page 9</formula><formula>formula see original document page 10</formula>
R如式(IV)中所述。
更優(yōu)選的是，符合結(jié)構(gòu)式(I)的化合物是式(XIV)到式(XVII)
中的一水.<formula>formula see original document page 10</formula>
本發(fā)明結(jié)構(gòu)式(I)化合物的制備方法，按如下化學(xué)反應(yīng)過程進(jìn)
打:<formula>formula see original document page 10</formula>其中，化合物6經(jīng)過五步合成得到?？蓞⒖嘉墨I(xiàn)(AN Topin iV"c/eoy/cfey c& iVwc/eo^fey 1998, /7， 1163-1175 )制備。
化合物6被用來制備最終的亞磷酰化試劑XIV(路線2中的14)。
具體見下面的化學(xué)反應(yīng)過程。<formula>formula see original document page 11</formula>化合物9的制備可參考文獻(xiàn)(MA Cameron， Jowma/ Orgam'c Cfe/m'Wr;/1997, 62, 9065-9069)從2-脫氧胸腺嘧P定制備。 本發(fā)明中結(jié)構(gòu)式XIV的制備方法，包括如下步驟 1)將3-(4-碘代苯基)-3-(三氟甲基)-3樂二氮雜環(huán)丙烯(6)、 1,4-脫 水-3,5-二氧沐丁基二甲基硅基)-l脫氧-D-赤式-戊-l-烯糖(9)、氮， 氮-二環(huán)己基甲基胺、醋酸鈀、四丁基氯化銨、研細(xì)的4A分子篩和重 蒸氮，氮-二甲基甲酰胺混合，以形成懸浮液，在氮?dú)夥諊录訜嶂?6(TC，并保溫40小時(shí)，用乙酸乙酯提取，有機(jī)相洗滌干燥后過濾濃縮得到油狀物(2R， 5R)-2-((叔丁基而甲基硅氧基)甲基)-5-(4-(3-三氟甲 基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)二氫呋喃-3(2氫)-酮(10);
2) 然后向冰浴至0。C的(2R, 5R)-2-((叔丁基而甲基硅氧基)甲 基)_5_(4-(3-三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)二氫呋喃-3(2氫)-酮 (IO)的四氫吹喃溶液中，依次加入冰醋酸和四丁基氟化銨的四氫吹喃 溶液，反應(yīng)混合物在0'C下攪拌1.5小時(shí)后濃縮，分離純化得到油狀 物(2R， 5R)-2-(羥甲基)-5-(4-(3-三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基) 二氫呋喃-3(2氫)-酮(ll);
3) 向冰鹽浴冷卻至-10。C的(2R, 5R)-2-(羥甲基)-5-(4-(3-三氟甲 基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)二氫呋喃-3(2氫)-酮(ll)的乙腈和冰醋 酸的溶液中，加入三乙氧基硼氫化鈉，在氮?dú)夥諊?，?l(TC攪拌 30分鐘后濃縮，分離純化，得到白色粉末(lR)-l，4-脫水-2-脫氧 小C—(4-(3-(三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖(12)
4)0'C下，(1R)-l,4-脫水-2-脫氧-l-C-(4-(3-(三氟甲基)-3氫-二氮 雜環(huán)丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖(12)的重蒸吡啶溶液攪拌IO分鐘后， 向其中依次加入4，4，-二甲氧基三苯基氯甲烷和4-(二甲基氨基)*定， 在氮?dú)夥諊?，反?yīng)液于0。C下攪拌6小時(shí)后用乙醚(2x50亳升)萃取, 合并有機(jī)相，干燥，過濾，濃縮濾液，分離純化得到(lR)-l，4-脫水-2-脫氧-5-氧-(4,4，-二甲氧基)三苯基-l-C-(4-(3-(三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán) 丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖(13);
5 ) (1R)畫1,4-脫水-2-脫氧-5-氧隱(4,4，- 二甲氧基)三苯基 小0(4_(3-(三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖(l3), 氮，氮-二異丙基乙基胺和2-氰乙氧基-氮，氮-二異丙基氯化亞磷酰胺 的重蒸二氯甲烷溶液在氮?dú)夥諊掠?匸下攪拌1.5小時(shí)，分離純化， 得到白色泡沫狀物(lR)-l，4-脫水-2-脫氧-5-氧-(4,4，-二甲氧基)三苯基 小C-(4-(3-(三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖-2-氰 乙氧基二異丙基亞磷酰胺(l4)。本發(fā)明核苷能用熟知的方法轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的核糖核苷三磷酸化單 體，核糖核苷亞磷酰胺單體，脫氧核糖核苷三磷酸化單體或脫氧核糖 核苷亞磷酰胺單體。
對于結(jié)構(gòu)式XV的化合物可釆用3-(3-砩代苯基)-3-(三氟甲 基)-3H-二氮雜環(huán)丙烯，按照結(jié)構(gòu)式XIV的制備過程合成而成。
對于符合結(jié)構(gòu)式XVI的化合物可由化合物(lR)-l,4-脫水-2-脫氧 小C-(4—(3-(三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖(12) 釆用三磷酸化反應(yīng)制備。對于符合結(jié)構(gòu)式XVII的化合物可由類似的 反應(yīng)制備。
本發(fā)明的含有二氮雜環(huán)丙烯基的非天然核苷化合物具有以下幾 個(gè)優(yōu)點(diǎn)
1. 本發(fā)明的核苷能產(chǎn)生一個(gè)高活性的卡賓，此卡賓甚至能打破 脂肪族的C-H鍵，并且在納秒內(nèi)完成反應(yīng)；
2. 本發(fā)明的核苷能在較高的波長下光解(~360nm);
3. 在中等的實(shí)驗(yàn)室照明條件下就可以操作；
4. 本發(fā)明的核苷與天然的核苷空間結(jié)構(gòu)類似，能直接摻雜到天 然核苷酸中。
本發(fā)明的核苷三磷酸化單體能被酶識(shí)別，例如鏈端轉(zhuǎn)移酶，以非 模板的直接方式延伸到核酸鏈的3，端。此種方式產(chǎn)生的核苷三磷酸尾 可以用抗體直接識(shí)別而不需要任何報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記。核苷參雜到寡核苷 酸或核酸鏈中后仍然能被核酸修飾酶例如限制性內(nèi)切酶和連接酶識(shí) 別。
本發(fā)明的核苷還包括其它的非天然核苷酸，例如在此基礎(chǔ)上修飾 報(bào)告基團(tuán)。發(fā)明的化合物增加了現(xiàn)有的核苷類似物的分子多樣性。應(yīng) 用本發(fā)明中的核苷制備的寡核苷酸能增加對靶分子的親和力。
本發(fā)明所述的寡核苷酸可以用標(biāo)準(zhǔn)的亞磷?；椒?例如M. D. Matteucci在乂為.C7 綴6bc. 1981,風(fēng)3185-3191中描述的方法)來核酸堿基類似物XIV和XV作為光致交聯(lián)反應(yīng)探針能通過固相合
成摻雜到DNA、 RNA或其他核酸高聚物中。這些帶有二氮雜環(huán)丙烯 分子片段的堿基相對于核酸-蛋白之間的相互作用而言，具有非常小 的空間位阻效應(yīng)，在紫外光照射下能夠釋放氮?dú)猓煽ㄙe活性中間 體?？ㄙe中間體是有效的光致交聯(lián)物種，能夠與鄰近的蛋白和核酸殘
基進(jìn)行交聯(lián)。
通過固相DNA合成，亞磷酰胺單體14被引入到DNA分子中。 三聚物TBT和15元5'-ATCAAGNGCAAGAC-3，(序列號(hào)1 )以及 5'-ATGAACCNGGAAAAC-3，(序列號(hào)3)被合成和純化(在序列 號(hào)1和序列號(hào)3中N = B, B是新合成的包含二氮雜環(huán)丙烯基的堿基 類似物14)。
為檢驗(yàn)二氮雜環(huán)丙烯基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)的固相寡聚核苷合成條件下的穩(wěn) 定性，三聚物TBT在室溫下用濃氨水反應(yīng)過夜以脫保護(hù)。在基質(zhì)輔 助解析飛行時(shí)間質(zhì)譜中，脫保護(hù)的化合物給出三個(gè)峰，這三個(gè)峰分別 與三聚物的分子量、三聚物脫去氮?dú)獾姆肿恿?二氮雜環(huán)丙烯基在基 質(zhì)輔助解析的條件下可以脫去氮?dú)?以及三聚物同基質(zhì)反應(yīng)得到的產(chǎn) 物的分子量相吻合。當(dāng)脫保護(hù)的化合物在水相中用近紫外光(hv〉300 納米)照射時(shí)，它的基質(zhì)輔助解析飛行時(shí)間質(zhì)譜給出一個(gè)新的對應(yīng)于 卡賓與水反應(yīng)的產(chǎn)物的峰，同時(shí)伴隨著前述的三個(gè)峰的消失。這項(xiàng)觀 察明確的表明了三聚物中二氮雜環(huán)丙烯基團(tuán)的存在。
與dNTP和NTP相類似的化合物(例如像分子式XVI和XVII 的化合物)可以通過類似的方案來合成。這些化合物可以作為dATP、dGTP、 dTTP和dCTP的類似物，具有潛在的生物標(biāo)記和偶聯(lián)作用。 它們也能通過聚合酶催化的核酸合成被引入到DNA和RNA中。
本發(fā)明中確認(rèn)含有二氮雜環(huán)丙烯基的光交聯(lián)DNA堿基類似物能 與鄰近的核酸或蛋白殘基的進(jìn)行髙效的光交聯(lián)。
本發(fā)明中的核苷可以進(jìn)入細(xì)胞，就像已知核苷類似物，如.5-氟尿 苷和疊氮胸苷參與細(xì)胞內(nèi)新生物大分子的合成。摻入光交聯(lián)試劑的生 物大分子可以作為光化學(xué)治療試劑，誘導(dǎo)分子內(nèi)或分子間交聯(lián)。
本發(fā)明中的核苷摻入到核酸后，利用核酸的雜交特性可以用于反 義核酸領(lǐng)域。
本發(fā)明的核苷性質(zhì)與天然核苷不同，因而適合其它用途。例如， 本發(fā)明的核苷與酶在體內(nèi)的相互作用有重要的生物學(xué)意義，對新的抗 病毒治療方法有重要影響。
本發(fā)明中的寡核苷酸(帶有一個(gè)親和基團(tuán)或熒光基團(tuán))能作為 siRNAs進(jìn)入到活細(xì)胞中。兩光子刺激可以誘導(dǎo)體內(nèi)交聯(lián)。交聯(lián)復(fù)合 物能夠通過熒光基團(tuán)變?yōu)榭梢?，也可以通過親和基團(tuán)分離得到。
用15-聚5'ATCAAAGNGCAAGAC-3'(序列號(hào)1 ) (N-B,B是 新合成的包含二氮雜環(huán)丙烯基的堿基類似物14)制備4個(gè)dsDNA探 針15，修飾堿基B分別與A、 T、 G、 C對應(yīng)。二氮雜環(huán)丙烯基被摻 雜在15-聚單鏈DNA的中間。通過單鏈DNA與互補(bǔ)鏈退火得到雙鏈 DNA探針，A、 T、 G、 C分別與B配對。<image>image see original document page 15</image>
dsDNA探針15經(jīng)UV照射檢測B與反義DNA鏈的光交聯(lián)活性。 變性DNA凝膠用于分析交聯(lián)。低遷移條帶的出現(xiàn)表明交聯(lián)dsDNA 的形成。作為對照，T代替B被參雜到反義DNA鏈中。經(jīng)不同時(shí)間的紫外照射，B與A、 T、 G、 C配對的樣品被檢測。實(shí)驗(yàn)表明，5分 鐘內(nèi)光反應(yīng)可以結(jié)東，延長光照時(shí)間對交聯(lián)效率并沒有顯著改進(jìn)。然 而，正如預(yù)期的，二氮雜環(huán)丙烯能被快速光解，光解產(chǎn)物-卡賓的壽 命只有納秒的時(shí)間。紫外交聯(lián)實(shí)驗(yàn)清楚的表明二氮雜環(huán)丙烯堿基與反 義鏈以不同的效率交聯(lián)。G與B在5分鐘照射后有50。/。的交聯(lián)，T與 B的交聯(lián)其次，A或C與B的交聯(lián)產(chǎn)率也很可觀。
表1
序號(hào)dsDNA序列SEQ ID NO:Tm(。C)
18(B:A)5'陽ATGAACCJVGGAA AAC-3' 3 ，-TAC TTG G 4 C CTT TTG-5'SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4n.a.
29(B:T)5'隱ATGAACCtVGGAA AAC-3' 3'-TAC TTG GTC CTT TTG-5'SEQ ID NO:3 SEQ ID NO :545
IO(B:G)5'-ATGAACCWGGAA AAC-3' 3，-TAC TTG GG C CTT TTG-5'SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:648
4ll(B:C)5，-ATGAACCWGGAA AAC-3' 3'-TAC TTG GC C CTT TTG-5'SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:746
12(T:A)5'-ATGAACCTGGAA AAC-3' 3'-丁AC TTG GJ C CTTTTG-5'SEQ ID NO :8 SEQ ID NO:455
613(C:G)5'-ATGAACCCGGAA AAC-3' 3'國TAC TTG GG C CTT TTG-5'SEQ ID NO:9 SEQ ID NO:658
為了確定這些結(jié)果，表1中的四個(gè)DNAs(dsDNA 8-ll)在0。C經(jīng) 不同時(shí)間的紫外照射(30uMdsDNA溶于10 mM三(羥甲基)氨基 甲烷鹽酸鹽，pH7.4, 100mMNaCl)，然后變性，用20%聚丙酰胺凝膠分析。低遷移條帶的出現(xiàn)說明鏈內(nèi)交聯(lián)DNA產(chǎn)物的形成，然而沒經(jīng)
UV照射，即使是痕量的產(chǎn)物也檢測不到。與B配對的堿基不同，DNA 鏈內(nèi)交聯(lián)效率也不同。B與A配對產(chǎn)率只有5-10%, B與G配對的 產(chǎn)率高達(dá)30-40%。實(shí)驗(yàn)還表明，二氮雜環(huán)丙烯的交聯(lián)反應(yīng)在IO分鐘 內(nèi)可以結(jié)東。延長照射時(shí)間對交聯(lián)效率沒有顯著的改進(jìn)。這是符合預(yù) 期的，因?yàn)槎s環(huán)丙烯能被快速光解，光解產(chǎn)物-卡賓的壽命只有 納秒的時(shí)間。
經(jīng)純化的15元寡聚核苷5'-ATGAACCNGGAAAAC-3，(序歹iJ號(hào) 3)(N = B, B是新合成的包含二氮雜環(huán)丙烯基的堿基類似物14),與含 有能和B互補(bǔ)的A、 T、 G或C的互補(bǔ)鏈退火成雙鏈。用差示掃描量 熱法測量雙鏈DNAs( 10mM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽，PH7.4，100 MmNaCl)的解鏈溫度(Tm)(見表1)。除B:A配對(序號(hào)1，表l) 沒有檢測到解鏈行為，其佘三種配對(序號(hào)2， 3和4,表1)都低 于正常DNA(序號(hào)5， 6,表l)配對的Tm值18~21% ( 10~ 12°C )。 這種相對溫和的Tm值降低有點(diǎn)令人驚訝，事實(shí)上， 一條dsDNA鏈 中有一個(gè)簡單的苯基修飾堿基類似物與A、 T、 G、 C互補(bǔ)時(shí)都會(huì)劇 烈的減少雙鏈的穩(wěn)定性(相對于正常的DNA配對的Tm減少31 ~ 41%)。 二氮雜環(huán)丙烯基在堿基配對中的潛在角色還有待于進(jìn)一步的 結(jié)構(gòu)研究，但是苯基(三氟甲基)二氮雜環(huán)丙烯基在DNA配對中的 表現(xiàn)與單一的苯基不同是很清楚的。
為了測試核酸分子與蛋白的交聯(lián)能力，檢測了四個(gè)dsDNA探針 15和DNA修補(bǔ)，具有超螺旋堿基結(jié)構(gòu)的蛋白AlkA的光交聯(lián)反應(yīng)。 蛋白聚丙酰胺凝膠用于分析交聯(lián)反應(yīng)，檢測蛋白樣品本身和蛋白 AlkA與各個(gè)dsDNA探針經(jīng)UV照射或無UV照射的樣品。所有四個(gè) 探針都可以作為有效光交聯(lián)試劑連接蛋白和DNA。探針中所含B若 能與A配對，交聯(lián)效率最高。
上述實(shí)驗(yàn)闡明了含有二氮雜環(huán)丙烯基的光交聯(lián)DNA堿基類似物能與鄰近的核酸或蛋白殘基的進(jìn)行高效的光交聯(lián)，為生物化學(xué)和生物 醫(yī)學(xué)的研究提供了強(qiáng)有力的工具。
本發(fā)明中所述的核苷分子的進(jìn)一步的用途是將這些分子同DNA
或PNA分子結(jié)合起來用作光化治療藥物。 一旦這些藥物存在于單個(gè) 細(xì)胞中，光輻射將導(dǎo)致DNA鏈內(nèi)部的偶聯(lián)反應(yīng)或者通過光化治療藥 物與 一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的雙鏈DNA發(fā)生共價(jià)作用以形成三鏈DNA。這種原 位形成的DNA偶聯(lián)反應(yīng)將有效地使目標(biāo)細(xì)胞凋亡。光輻射可以有效 地控制在某一個(gè)區(qū)域，這樣將只有很少的細(xì)胞會(huì)以這種方式凋亡。這 些光化治療藥物可能與端?；蛳嚓P(guān)的復(fù)合物為靶，或者被設(shè)計(jì)用來與 已知的癌細(xì)胞內(nèi)的基因序列相關(guān)聯(lián)而作用。
而且，這些光化治療藥物可能只對細(xì)胞中的一段基因序列起作 用。這將對根除反轉(zhuǎn)錄病毒整合到細(xì)胞染色體上特別有用，例如HIV 感染細(xì)胞。靶向感染細(xì)胞的光化學(xué)治療試劑代表了一類新奇的治療策 略，因?yàn)榧词故菨撛诘母腥炯?xì)胞也能被靶向反轉(zhuǎn)錄病毒的光交聯(lián)策略 殺死。能摧毀這些代謝失活，潛在的感染細(xì)胞對于治療感染HIV的 病人是非常需要要的，目前治療策略只能在病毒復(fù)制過程中起作用。
本發(fā)明中的核苷類似物能在光的照射下與DNA雙鏈交聯(lián)，參與 形成三鏈寡核苷酸序列，使其喪失功能。下調(diào)特定靶基因的表達(dá)是治 療人類疾病的一個(gè)非常有前景的策略，Da Ros、 Besch、 Buchini和 Leumann對生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了描述(Cwr. Met/. Ozew. 2005， 72:71-88; C匿Drwg 2004， 5:691-703^ C匿(9盧.C/z麼腺.2003,
7:717-726) DNA三鏈?zhǔn)腔诖瞬呗缘囊粋€(gè)應(yīng)用。
本發(fā)明的另 一 個(gè)應(yīng)用是將本發(fā)明中所述的核苷與短鏈的DNA或 PNA相結(jié)合進(jìn)而發(fā)生光致偶聯(lián)反應(yīng)，從而得到一個(gè)特定DNA分子的 序列。
本發(fā)明中的核苷可以進(jìn)入細(xì)胞，就像已知核苷類似物，如5-氟尿 苷和疊氮胸苷參于細(xì)胞內(nèi)新生物大分子的合成。摻入光交聯(lián)試劑的生物大分子可以作為光化學(xué)治療試劑，誘導(dǎo)分子內(nèi)或分子間交聯(lián)。
核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)影響核酶的功能。本發(fā)明的核苷能影響核酸二
級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，而天然核苷或其它修飾核苷衍生物卻不具備此作用。 本發(fā)明中的核苷摻入到核酸后，利用核酸的雜交特性可以用于反
義核酸領(lǐng)域。
本發(fā)明中的核苷性質(zhì)與天然核苷不同，因而適合其它用途。例如， 本發(fā)明中的核苷與酶在體內(nèi)的相互作用有重要的生物學(xué)意義，對新的 抗病毒治療方法有重要影響。
本發(fā)明中的寡核苷酸(帶有一個(gè)親和基團(tuán)或熒光基團(tuán))能作為
siRNAs進(jìn)入到活細(xì)胞中。兩光子刺激可以誘導(dǎo)體內(nèi)交聯(lián)。交聯(lián)復(fù)合
物能夠通過熒光基團(tuán)變?yōu)榭梢?，也可以通過親和基團(tuán)分離得到。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例l核苷的合成
3-(4-碘代苯基)-3-(三氟甲基)-3//-二氮雜環(huán)丙烯(6)
化合物(6 )參考文獻(xiàn)(ANTopin， A^c/eowWes & iVwc/eo"cfe 1998, 〃，1163-1175)從1,4-二碘代苯制備(1)。
1,4-脫水-3，5-二-氧沐丁基二甲基硅基)-2-脫氧-D-赤式-戊-l-烯糖 1，4-脫水-3，5-二-氧沐丁基二甲基硅基)-2-脫氧-D-赤式-戊-l-烯糖(9)
化合物(9 )參考文獻(xiàn)(MA Cameron, Jowrw"/ o/(9rga"/c C77柳&" 1997， 62， 9065-9069)從2-脫氧胸腺嘧嚏制備。
(2R, 5R)-2-((叔丁基而甲基硅氧基)甲基)-5-(4-(3-三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)二氫吹喃-3(2氫)-酮(10)
向一個(gè)干燥過的圓底燒瓶中依次加入3-(4-碘代苯基)-3-(三氟甲 基)-3樂二氮雜環(huán)丙烯(6)(0.368克，1.18亳摩爾)、l,4-脫水-3，5-二-氧(叔 丁基二甲基硅基)-2-脫氧-D-赤式-戊-l-烯糖(9)(0.488克，1.42毫摩爾)、 氮，氮-二環(huán)己基甲基胺(0.30亳升，1.4毫摩爾)、醋酸鈀(0.026克，0.12毫摩爾)、四丁基氯化銨(0.328克，1.18亳摩爾)、研細(xì)的4A分 子篩和3.0亳升重蒸氮，氮-二甲基甲酰胺，以形成懸浮液。反應(yīng)混合 物在室溫下攪拌，通入氮?dú)饧s30分鐘后，在氮?dú)夥諊录訜嶂?(TC， 并保溫40小時(shí)。此后，反應(yīng)混合物用水(50亳升)稀釋，用乙酸乙酯 (lx50毫升)提取。有機(jī)相用飽和碳酸氫鈉溶液(50毫升)、飽和食鹽水 (50亳升)依次洗滌，用無水硫酸鎂干燥后過濾濃縮。濃縮物用硅膠柱 色譜分離純化，得到油狀物(2R, 5R)-2-((叔丁基而甲基硅氧基)甲 基"-(4-(3-三氟甲基)-3氫_二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)二氫呋喃-3(2氫)-酮 (10)(0.225克，產(chǎn)率46%)。核磁共振氫譜(500兆赫，氘代氯仿) 5 7.54 ( d, J = 8.4 Hz, 2H ), 7.21 ( d， J = 8.4 Hz, 2H ), 5.19 ( dd， J = 11.0， 5.9 Hz, 1H )， 4.04 (t, J = 2.5 Hz, 1H ), 3.97 ( m， 2H ), 2.82 ( dd， J = 17.6， 5.9 Hz, 1H )， 2.38 ( dd, J = 17.6， 11.0 Hz， 1H )， 0.87 ( s， 9H )， 0.08 ( s， 3H ),0.06(s， 3H)。
(2R, 5R)-2-(羥甲基)-5-(4-(3-三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯 基)二氫呋喃-3(2氫)-酮(11)
向冰洛至(TC的(2R, 511)-2-((叔丁基而甲基硅氧基)甲基)-5-(4-(3-三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)二氫呋喃-3(2氫)-酮(10)(0.460 克，1.11毫摩爾)的四氫吹喃溶液中(5亳升)，依次加入冰醋酸(0.2亳 升)和1.0摩爾/升的西丁基氟化銨的四氫呋喃溶液(3.0亳升)。反應(yīng)混 合物在0。C下攪拌1.5小時(shí)后濃縮。濃縮物用硅膠柱色譜分離純化， 得到油狀物(2R, 5R)-2-(羥甲基)-5-(4-(3-三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯 基)苯基)二氫呋喃-3(2氫)-酮(ll)(0.308克，產(chǎn)率92%)。核磁共振氫譜 (500兆赫，氘代氯仿.)5 7.49 ( d, J = 8.1 Hz, 2H )， 7.24 ( d， J = 8.1 Hz, 2H )， 5.24 ( dd， J = 11.0, 5.9 Hz， 1H )， 4.06 (t, J = 3.3 Hz, 1H )， 3.96 ( m， 2H), 2.90 (dd,J= 18.0, 5.9 Hz, 1H ), 2.48 ( dd, J = 18.0， 11.0 Hz, 1H)。
(1R)-l,4-脫水-2-脫氧-l-C-(4-(3-(三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基) 苯基)-D-赤式-戊糖(12)向冰鹽洛冷卻至-10。C的(2R, 5R)-2-(羥甲基)-5-(4-(3-三氟甲基)-3 氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)二氫呋喃-3(2氫)-酮(ll)的乙腈(10亳升)和 冰醋酸(2亳升)的溶液中， 一次性加入三乙氧基硼氫化鈉(0.529克， 2.50亳摩爾)。反應(yīng)混合物在氮?dú)夥諊?，?10'C攪拌30分鐘后濃縮。 濃縮物用硅膠柱層析分離純化，得到白色粉末(lR)-l,4-脫水-2-脫氧 _ 1 _C_(4-(3 -(三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖 (12)(0.170克，產(chǎn)率56%)。核磁共振氫譜(500兆赫，氘代氯 仿.)S 7.37 ( d， J = 8.4 Hz, 2H )， 7.17 ( d, J = 8.4 Hz, 2H ), 5.16 ( dd, J = 9.9， 5.5 Hz， 1H ), 4.40 ( m， 1H ), 4.02 ( m， 1H )， 3.75 ( m, 2H ), 2.24 ( m， 1H)，1.95(m， 1H)。
(1R)-l,4-脫水-2-脫氧-5-氧-(4,4，-二甲氧基)三苯基-l-C-(4-(3-(三 氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖(13)
(TC下，(lR)-l,4-脫水-2-脫氧-l-C-(4-(3-(三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán) 丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖(12)(0.170克，0.562亳摩爾)的重蒸吡啶(5 毫升)溶液攪拌IO分鐘后，向其中依次加入4,4，-二甲氧基三苯基氯甲 烷(0.286克，0.844毫摩爾)和4-(二甲基氨基)P比啶(0.004克，0.03亳摩 爾)。在氮?dú)夥諊?，反?yīng)液于0。C下攪拌6小時(shí)后用水(50亳升)稀釋， 然后用乙醚(2x50毫升)萃取。合并有機(jī)相，用無水硫酸鎂干燥。過濾， 濃縮濾液。濃縮物用硅膠柱層析分離純化，得到白色粉末(lR)-l,4-脫 水-2-脫氧-5-氧-(4,4，-二甲氧基)三苯基-l—C-(4-(3-(三氟甲基)-3氫-二 氮雜環(huán)丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖(13)(0.242克，產(chǎn)率71%)。核磁共 振氫譜(500兆赫，氖代氯仿)S 7.44 ( m, 2H )， 7.39 ( d， J = 8.4 Hz, 2H ), 7.33 ( m， 4H ), 7.26 ( m, 2H )， 7.21 ( m， 1H )， 7.14 ( d, J = 8.4 Hz， 2H ), 6.81 ( m, 4H ), 5.17 ( dd, J = 9.9， 5.5 Hz, 1H )， 4.40 ( m, 1H ), 4.06 ( m, 1H ), 3.78 ( s, 6H )， 3.33 ( dd, J = 9.9, 4.4 Hz, 1H), 2.24 ( ddd， J =13.2， 5.5， 1.8 Hz， 1H)， 1.97(ddd， J= 13.2， 9.9， 6.0 Hz, 1H)。核磁共 振碳譜(126兆赫，氘代氯仿)5 158.6， 144.9， 144.1, 136.1， 130.2， 128.3， 128.2, 128.0, 127.0, 126.6, 126.5， 122.3 ( q, J = 274,8 Hz ), 113.3, 86.6,86.4， 79.4， 74.6， 64.5, 55.3， 43.9, 28.5 ( q, J = 40.1 Hz )。
(lR)-l，4-脫水-2-脫氧-5-氧-(4,4，-二甲氧基)三苯基-l-C-(4-(3-(三 氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖2-氰乙氧基二異丙 基亞磷酰胺單體(14)
(1R)-l，4-脫水-2-脫氧-5-氧-(4,4，-二甲氧基)三苯基-l-C-(4-(3-(三 氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖(13) (0.121克，0.200 亳摩爾)，氮，氮-二異丙基乙基胺(0.10亳升，0.57毫摩爾)和2-氰乙 氧基-氮，氮-二異丙基氯化亞磷酰胺(0.07亳升，0.3毫摩爾)的重蒸二 氯甲烷溶液(2亳升)在氮?dú)夥諊掠贠'C下攪拌1.5小時(shí)。反應(yīng)溶液直 接用硅膠柱層析分離純化，得到白色泡沬狀物(lR)-l，4-脫水-2-脫氧-5-氧-(4,4，-二甲氧基)三苯基-l-C-(4-(3-(三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基) 苯基)-D-赤式-戊糖2-氰乙氧基二異丙基亞磷酰胺單體(14)(0.136克， 產(chǎn)率84%)。核磁共振氫譜(500兆赫，氖代氯仿)S 7.46-7.43 (m，4H), 7.35-7.25 ( m, 9H ), 6.83-6.79 ( m， 4H )， 5.25-5.15 ( m， 1H ), 4.55-4.45 ( m， 1H )， 4.25-4,15 ( m, 1H )， 3.90—3.20 ( m, 12H )， 2.70—1.90 (m,4H)， 1.35—1.05 (m, 12H)。核磁共振磷譜(202兆赫， 氘代氯仿)5 148.7, 148.6。 實(shí)施例2
1. 寡核苷酸的合成和鑒定
寡核苷酸釆用標(biāo)準(zhǔn)的P-腈乙基亞磷酰胺化學(xué)方法在Applied Biosystems Expedite核酸合成儀上進(jìn)行合成。所有的寡核苷酸以5'-端脫DMT的模式進(jìn)行合成，最后在濃氨水中室溫過夜，從CPG( alkyl controlled pore glass )固相載體上切下。寡核苷酸用20%的變性聚丙 酰胺凝膠電泳分離純化。假定二氮雜環(huán)丙烯基修飾的堿基的摩爾消光 系數(shù)在260nm下為零，用此波長的紫外吸收進(jìn)行定量。用MALDI 質(zhì)譜確定所有合成的寡核苷酸鏈的正確性。
2. dsDNA的鏈內(nèi)光交聯(lián)
DNA樣品溶于10mM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽，(pH7.4)， lOOmM NaCl的緩沖液中，在0。C照射不同時(shí)間段，所用的450瓦汞燈要用玻璃濾片濾除小于300nm的光波。用變性DNA聚丙酰胺凝膠 分析樣品。
3. AlkA (3-甲基腺P票呤DNA糖苷酶II)的表達(dá)和純化
轉(zhuǎn)化有AlkA表達(dá)質(zhì)粒的E.coli細(xì)胞，接入含氨節(jié)的LB培養(yǎng)基 中，37。C培養(yǎng)直到菌體密度OD6oo達(dá)到0.7,向培養(yǎng)液中加入IPTG(l Mm )， 3CTC誘導(dǎo)4h。離心收集菌體，儲(chǔ)存于-80'C。 接下來的步驟 都在4。C下進(jìn)行。將菌體重懸于20ml裂解液中U0mM三(羥甲基) 氨基甲烷鹽酸鹽，(pH7.4) , 100mMNaCl， 5%甘油，2mMCaCl2， 10mMMgCl2， 10mM2-巰基乙醇)，超聲破碎，12， 000轉(zhuǎn)離心20min。 上清液用sepharose快速柱(amersham biosciences)纟電化，柱子要先 用緩沖液AUOmM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽，(pH7.4), 10 mM 2-巰基乙醇)預(yù)平衡，用含0到l.OMNaCl的緩沖液A進(jìn)行梯度洗脫。 含有蛋白的組份超濾濃縮，用Mono-S離子交換柱(amersham biosciences)進(jìn)一步純化，洗脫液為含0到l.OMNaCl的緩沖液A。
4. dsDNA-AlkA交聯(lián)
純化后的蛋白與DNA探針溶于含10 mM三(羥甲基)氨基甲烷 鹽酸鹽，(PH7.4)和lOOmMNaCl的緩沖液中，0。C下付予不同時(shí)間 段，然后光照射5min，所用的450瓦汞燈要用玻璃濾片濾除小于300nm 的光波。樣品用變性聚丙酰胺凝膠分析。
以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用本發(fā)明所述制備的核苷化合物能在較 高的波長下光解(~360nm)產(chǎn)生一個(gè)高活性的卡賓，從而誘導(dǎo)分子 內(nèi)或分子間交聯(lián)反應(yīng)。本發(fā)明的核苷可以進(jìn)入細(xì)胞，參與細(xì)胞內(nèi)新生 物大分子的合成，摻入光交聯(lián)試劑的生物大分子可以作為光化學(xué)治療 試劑。
雖然，上文中已經(jīng)用 一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳 盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本 領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ) 上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。序列表
<U0>北京歐凱納斯科技有限公司
<120>含有二氮雜環(huán)丙烯基的非天然核苷、其制備方法及其應(yīng)用
<130> KHP09112512.1
<160> 9
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列 <220>
<221> misc—feature
<222> (8)..(8)
<223> "n"isfor包含二氮雜環(huán)丙烯基的堿基類似物14
<400> 1 atcaaagngc aagac
<210> 2
<211> 15
<212> DNA <213>人工序列 <220>
<221> misc一feature
<222> C8)..(8)
<223> "n" is for包含二氮雜環(huán)丙烯基的堿基類似物14
<400〉 2
tagtttcncg ttctg 15<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列 <220>
<221> misc一feature
<223> "n"isfor包含二氮雜環(huán)丙烯基的堿基類似物14 <220>
<221 > misc一feature
<222> (8).,(8)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3 atgaaccngg aaaac
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4 tacttggacc ttttg
<210〉 5 <211> 15 <212〉 DNA <213> 人工序列 <400> 5 tacttggtcc ttttg<210> 6 <211> 15 <212> DNA <213>人工序列 <400> 6 tacttgggcc ttttg
<210> 7 <211> 15 <212> DNA <213>人工序列 <400> 7 tacttggccc加g
<210> 8 <211〉 15 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 8 atgaacctgg aaaac
<210> 9 <211> 15 <212> DNA <213>人工序列 <400> 9 atgaacccgg aaaac
權(quán)利要求
1.具有結(jié)構(gòu)式(I)的含有二氮雜環(huán)丙烯基的非天然核苷化合物其中，式中R1為氫、取代或未取代的C1～C8的烷基，n為0、1、2或3，但最好是0；Ar是5元至10元的雜芳環(huán)或5元至10元的芳環(huán)，這些芳環(huán)需要具備兩個(gè)條件(a)至少有一個(gè)含糖、糖類似物、核苷或核苷類似物的取代基；(b)0到3個(gè)包括取代或未取代的C1～C8的烷基、羥基和氨基；Ar或是帶取代基的6元至10元的芳環(huán)，或是帶核糖或脫氧核糖取代基，或者是帶核苷亞磷酰胺單體或脫氧核苷亞磷酰胺單體的糖類似物取代基；或者，Ar是帶重復(fù)的糖-磷酸結(jié)構(gòu)單元、重復(fù)的經(jīng)修飾的糖-磷酸結(jié)構(gòu)單元或核苷類似物的核苷取代基；或者，Ar是帶肽核酸的核苷類似物的取代基。
2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的化合物，其特征在于，Ar帶有一個(gè)如 分子式(II)所示的取代基R2、 R3、 114或115是氫或羥基；W是經(jīng)保護(hù)或未經(jīng)保護(hù)的單、雙或 三磷酸基；或者W和W兩個(gè)基團(tuán)中的一個(gè)能與聚核苷鏈反應(yīng)偶聯(lián)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，W和W兩個(gè)基團(tuán)中的一個(gè)是亞磷酰胺。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于，Ar 帶一個(gè)式(III)所示的取代基R3 R5 (II)R、 /(III)W和I^是能與聚核苷鏈進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)的基團(tuán)；RS是氫或者羥基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于，結(jié)構(gòu)式(I)的 化合物是式(IV)到式(VII)中的一個(gè)R1rv v vi式中所示的RW是H、取代或未取代的d Cs的烷基、羥基或者氨 基中的一種；R是糖基、糖基類似物、核酸基或者具有核酸骨架的類 似物；n和R/如式(I)中所述。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，其特征在于，結(jié)構(gòu)式(I)的 化合物是式(VIII)到式(XIII)中的一個(gè)XII XIIIR如式(IV)中所述。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的化合物，其特征在于，結(jié)構(gòu)式(I)的化 合物是式(XIV)到式(XVII)中的一個(gè)<formula>formula see original document page 4</formula>
8.制備權(quán)利要求7所述的化合物的方法，其特征在于，包括如 下步驟1) 將3-(4-碘代苯基)-3-(三氟甲基)-3界二氮雜環(huán)丙烯、1，4-脫水 -3，5-二-氧(叔丁基二甲基硅基)-2_脫氧-0-赤式-戊小烯糖、氮，氮-二 環(huán)己基甲基胺、醋酸鈀、四丁基氯化銨、研細(xì)的4A分子篩和重蒸氮, 氮-二甲基甲酰胺混合，以形成懸浮液，在氮?dú)夥諊录訜嶂?(TC, 并保溫40小時(shí)，用乙酸乙酯提取，有機(jī)相洗滌干燥后過濾濃縮得到 油狀物(2R, 5R)-2-((叔丁基而甲基硅氧基)甲基)-5-(4-(3-三氟甲基)-3 氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)二氫呋喃-3(2氫)-酮；2) 然后向冰洛至0。C的(2R, 5R)J-((叔丁基而甲基硅氧基)甲 基)_5_(4_(3-三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)二氫呋喃-3(2氫)-酮 的四氫呋喃溶液中，依次加入冰醋酸和四丁基氟化銨的四氫呋喃溶 液，反應(yīng)混合物在0。C下攪拌1.5小時(shí)后濃縮，分離純化得到油狀物 (2R， 5R)-2-(羥甲基)-5-(4-(3-三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)二 氫吹喃-3(2氫)-酮；3) 向冰鹽浴冷卻至-10。C的(211， 511)-2-(羥甲基)-5-(4-(3-三氟甲 基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)二氫呋喃-3(2氫)-酮的乙腈和冰醋酸的溶液中，加入三乙氧基硼氫化鈉，在氮?dú)夥諊?，?l(TC攪拌30 分鐘后濃縮，分離純化，得到白色粉末(lR)-l，4-脫水-2-脫氧 小C乂4-(3-(三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖；`4)0。C下，(lR)-l,4-脫水-2-脫氧-l-C-(4-(3-(三氟甲基)-3氫-二氮 雜環(huán)丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖的重蒸吡啶溶液攪拌IO分鐘后，向其 中依次加入`4,4，-二甲氧基三苯基氯甲烷和4-(二甲基氨基)吡嚏，在氮 氣氛圍下，反應(yīng)液于0。C下攪拌6小時(shí)后用乙醚(2x50亳升)萃取，合 并有機(jī)相，干燥，過濾，濃縮濾液，分離純化得到(lR)-l，4-脫水-2-脫氧—5-氧-(4,4，-二甲氧基)三苯基-l-C-(4-(3-(三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán) 丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖；`5 ) (1R)-1，4-脫水-2-脫氧-5-氧-(4,4，- 二甲氧基)三苯基 小C—(4-(3-(三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖，氮， 氮-二異丙基乙基胺和2-氰乙氧基-氮，氮-二異丙基氯化亞磷酰胺的重 蒸二氯甲烷溶液在氮?dú)夥諊掠贠'C下攪拌1.5小時(shí)，分離純化，得 到白色泡沬狀物(lR)-l,4-脫水-`2-脫氧-5-氧-(4，4，-二甲氧基)三苯基 小C—(4-(3-(三氟甲基)-3氫-二氮雜環(huán)丙烯基)苯基)-D-赤式-戊糖-2-氰 乙氧基二異丙基亞磷酰胺單體。
9. 權(quán)利要求1-8所述的化合物在用于制備光致交聯(lián)反應(yīng)探針中 的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求l-8所述的化合物在用于制備光化治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有光敏基團(tuán)的含有二氮雜環(huán)丙烯基的非天然核苷，同時(shí)還公開了該化合物的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的核苷能在較高的波長(～360nm)下光解，產(chǎn)生一個(gè)高活性的卡賓；本發(fā)明提供的核苷可以進(jìn)入細(xì)胞參與細(xì)胞內(nèi)新生物大分子的合成，摻入光交聯(lián)試劑的生物大分子可以作為光化學(xué)治療試劑，誘導(dǎo)分子內(nèi)或分子間交聯(lián)。
文檔編號(hào)A61K41/00GK101575332SQ200910085779
公開日2009年11月11日 申請日期2009年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月31日
發(fā)明者劉迎春, 峰 許, 源 高 申請人:北京歐凱納斯科技有限公司