專利名稱：No供體藥物及其合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及既能釋放NO又能清除氧自由基的抗缺血/再灌注損傷的藥 物及其合成方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
心臟病是人類頭號(hào)殺手，據(jù)統(tǒng)計(jì)，心臟病是排名首位的死亡原因，每 年死于心臟病的人數(shù)占死亡總?cè)藬?shù)的1/3。而心肌缺血再灌注損傷是引發(fā) 多種心臟病的重要原因。因此，研發(fā)預(yù)防和治療心肌缺血再灌注藥物具有 非常重要的意義。
發(fā)明人所在課題組從分子水平對(duì)心肌缺血再灌注的發(fā)病機(jī)理做了系統(tǒng) 深入研究，發(fā)現(xiàn)缺血心臟再灌注時(shí)會(huì)爆發(fā)產(chǎn)生大量活性氧自由基，其中超 氧陰離子自由基((V)可與保護(hù)因子NO反應(yīng)迅速生成過氧亞硝基陰離子 (ONOCT)，并直接參與了缺血心肌損傷病理過程。上述研究結(jié)果提示使用 NO供體藥物時(shí)，需要同時(shí)清除體內(nèi)過量的氧自由基。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一類抗缺血/再灌注損傷的藥物及其合成方法，該 藥物將具有抗脂質(zhì)過氧化、清除氧自由基作用的丹參素與NO供體結(jié)構(gòu)鍵 合，形成新型藥物，這些藥物既能釋放NO又能清除氧自由基，對(duì)缺血/再 灌注損傷有明顯防治作用。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)過程如下
通式(I)表示的化合物，O
(I)
其中Ri=H R2 =
本發(fā)明藥物的合成方法 合成方法1:
以丹參素1為原料，將其酚羥基及醇羥基進(jìn)行保護(hù)(保護(hù)基可以是酰 基或烴基)，羥基保護(hù)的丹參素2與二氯亞砜(SOCl2)反應(yīng)得到酰氯，酰 氯再與單硝酸異山梨醇酯或甘油1，3-二硝酸酯在三乙胺的存在下反應(yīng)得到 目標(biāo)化合物3 。所需目標(biāo)產(chǎn)物R產(chǎn)H時(shí)，則需要將化合物3再進(jìn)行羥基脫 保護(hù)即可。具體合成路線如下
o
，Phd;1—， (:2~<:6的?；?，pw:h廠或c廣Ce的烴基
h
CH2ON02 —— 或 CH,ONO,
.ONO，
合成方法2:
以丹參素1為原料，將其酚羥基及醇羥基進(jìn)行保護(hù)(保護(hù)基可以是酰 基或烴基)，羥基保護(hù)的丹參素2與單硝酸異山梨醇酯或甘油1，3-二硝酸酯 在DMAP (N，N-二甲氨基吡嚏)和縮合劑(可以是1，3-二環(huán)己基碳二亞胺 DCC， 1，3-二異丙基碳二亞胺DIC， l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺EDC)存在下發(fā)生縮合反應(yīng)得到目標(biāo)化合物3 。所需目標(biāo)產(chǎn)物R產(chǎn)H時(shí)， 則需要將化合物3再進(jìn)行羥基脫保護(hù)即可。具體合成路線如下
本發(fā)明合成的化合物藥理學(xué)試驗(yàn)證明該類藥物對(duì)缺血心肌有保護(hù)作 用，可減少M(fèi)I/R對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，使心肌的抗氧化能力提高，對(duì)抗缺血 /再灌注損傷有明顯防治作用。 說明書附圖


圖1為不同藥物治療組對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠心肌損傷指標(biāo)的影響 其中，A:心肌梗塞面積(MIS); B:血清肌酸激酶(CK)活性；C:
血清乳酸脫氫酶(LDH)活性；t士s， n = 8;與溶劑對(duì)照組比較，*><0.01;
與ISMN組比較，##尸<0.01， #尸<0.05。
圖2為不同藥物治療組對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠心功能指標(biāo)的影響 其中，A:左室發(fā)展壓(LVDP); B:左室等容收縮期壓力上升最大速
率(+ dP/dtmax); C:左室等容舒張期壓力下降最大速率(-dP/dWax);
n = 8;與溶劑對(duì)照組比較，*><0.01;與ISMN組比較，##尸<0.01。
圖3為不同藥物治療組對(duì)心肌缺血/再灌注大鼠血清一氧化氮(NO)生
成量和丙二醛(MDA)含量的影響
;±"n = 8;與溶劑對(duì)照組比較，**尸<0.01;與ISMN組比較，##尸<0.01。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:乙酰丹參素單硝酸異山梨醇酯(AcDI-302)的合成
o
R，H, PhC—, Cr"Ce的?；琍hCH2—, d-C6的烴基(1) 乙酰丹參素(AcDSS)的合成
將2.97g (15mmol)丹參素和60 mL醋酸酐置于250 mL圓底單口燒 瓶中，加入催化量高氯酸，攪拌反應(yīng)2.5 h,薄層層析(TLC)監(jiān)控反應(yīng)。 待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液小心傾倒入置有碎冰的燒杯中，待冰全部溶化后， 用乙酸乙酯萃取，依次用水和飽和食鹽水洗滌有機(jī)層，合并，用無水硫酸 鈉干燥。蒸除溶劑后，得亮黃色油狀殘余物，將其用適量二氯甲烷溶解， 快速柱層析，得無色透明蠟狀物4.298,產(chǎn)率88%。
(2) AcDI-302的合成 方法1:
將3.24 g (10 mmol) AcDSS置于100mL圓底燒瓶中，緩慢加入二氯 亞砜20mL，回流3h。減壓除去殘余的二氯亞砜，析出固體，即為酰氯。 稱單硝酸異山梨醇酯(ISMN) 2.02g (10.6mmo1)，加入THF 100mL，室溫 攪拌至全溶，同時(shí)加入4.2mL三乙胺。將上述酰氯溶解于lOmLTHF中， 緩慢滴入到上述ISMN溶液中，室溫反應(yīng)8 12h, TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢后， 將反應(yīng)液過濾后除去溶劑，柱層析分離得白色粉末3.88g，總產(chǎn)率78%。
方法2:
將3.24 g ( 10 mmol) AcDSS和1.91 g ( 10 mmol) ISMN溶于150 mL 干CH2Cl2中，室溫?cái)嚢柘录尤?.46g(12mmo1) 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 和0.12 g (1.0 mmol) 二甲氨基吡^^ (DMAP )，室溫?cái)嚢?.5 h, TLC監(jiān)控 反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，濾除不溶物，減壓除去溶劑，柱層析分離得白色至 無色透明蠟狀物4.52g，真空干燥后成白色粉末為AcDI-302,稱重為4.47g， 產(chǎn)率為90%。
實(shí)施例2: 3-(3'，4'-二芐氧苯基)-2-節(jié)氧基丙酸二硝酸甘油酯 (BzDG-403)的合成(1) 3-(3',4'-二節(jié)氧苯基)-2-節(jié)氧基丙酸(BzDSS)的合成
將2.97 g ( 15 mmol)丹參素溶于100 mL氯仿/甲醇混合液(2:1)，加 入無水K2C03 14.07 g( 90 mmol )， 60。C攪拌15min,緩慢滴加節(jié)基溴6.6 mL (56rnrno1)， 60'C攪拌6 12h， TLC監(jiān)控。待反應(yīng)結(jié)東后，減壓除去溶劑， 剩余物中加入200mL水，用乙酸乙酯萃取(3x200 mL),萃取液用無水硫 酸鈉干燥。蒸除溶劑后，快速柱層析，得白色固體3.93g,產(chǎn)率56%.
(2) BzDG-403的合成
將2.34g (5mmo1) BzDSS置于100mL圓底燒瓶中，緩慢加入二氯亞 砜10mL,回流3h。減壓除去殘余的二氯亞砜，析出固體，即為酰氯。將 0.97 g ( 5.3 mmol)甘油1,3-二硝酸酯(1，3-GDN)溶于50mLTHF,并加入 2.1 mL三乙胺。將上述酰氯溶解于5mLTHF中，緩慢滴入到上述1，3-GDN 溶液中，室溫下反應(yīng)8 12h, TLC檢測(cè)反應(yīng)完畢后，過濾，將濾液減壓蒸 去溶劑，柱層析分離得目標(biāo)產(chǎn)物2.02 g,總產(chǎn)率64%。
將2.34 g ( 5 mmol) BzDSS和0.91 g ( 5 mmol)甘油1，3-二硝酸酯溶于 75 mL CH2C12中，室溫?cái)嚢柘录尤?.23 g (6 mmol) DCC和0.06 g( 0.5 mmol) DMAP,室溫?cái)嚢? 5h， TLC監(jiān)控反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束后，濾除不溶物，減 壓除去溶劑，柱層析分離得得目標(biāo)產(chǎn)物2.218，產(chǎn)率為70%。
實(shí)施例3: 丹參素二硝酸甘油酯(DSDG-103)的合成
將實(shí)施例2中得到的BzDG-403 1.90 g ( 3 mmol)溶于300mL甲醇，加
方法1:
方法2:
8入1.2glO。/。Pd-C催化劑，以N2置換體系中的空氣，再以氫氣置換N2。 劇烈攪拌下氫解約4 8h,濾去催化劑，減壓除溶劑得目標(biāo)產(chǎn)物0.96g,產(chǎn) 率880/0。
實(shí)施例4: AcDI-302的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn) (1)心肌缺血模型的制備及實(shí)驗(yàn)方案
將SD大鼠以30g/L戊巴比妥鈉(40mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉后，按常 規(guī)方法制備大鼠MI/R (30min/3h)模型頸正中切口氣管插管，連接呼吸 機(jī)行正壓人工呼吸。經(jīng)右頸總動(dòng)脈插管至左心室記錄左室壓及其微分。開 胸暴露心臟，5-0絲線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支中上1/3處，心電圖ST段抬 高為結(jié)扎成功指標(biāo)。缺血30分鐘后松開絲線，再灌注3小時(shí)。將大鼠隨機(jī) 分為以下4組(1)假手術(shù)組(SHAM); (2)溶媒對(duì)照組(MI/R); ("ISMN 組給藥(MI/R + IS畫)；(4) AcDI-302組給藥(MI/R + AcDI-302 )。 IS畫 手術(shù)前15 min、 30mg/kg給藥，AcDI-302組手術(shù)前2 h、 9.47mg/kg給藥。
心臟功能檢測(cè)
通過多導(dǎo)生理記錄儀(RM-4200)持續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠心電及血流動(dòng)力學(xué)各指 標(biāo)。心電圖、左室發(fā)展壓(LVDP)、左室等容收縮/舒張期壓力上升或下降 最大速率(± dP/dtmax)等均通過數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)由計(jì)算機(jī)自動(dòng)采集、記錄并
CK、 LDH活性及MDA水平檢測(cè)
于再灌注3h后由頸動(dòng)脈取血2mL,常溫靜置30min后，3000r/min離 心20min，取血清嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作檢測(cè)CK、 LDH的活性。MDA 的含量用硫代巴比妥酸比色法測(cè)得(過氧化脂質(zhì)主要降解產(chǎn)物MDA在酸性 條件下與二分子硫代巴比妥縮合生成紅色物質(zhì))。
NO水平檢測(cè)
利用硝酸還原酶法檢測(cè)NO含量。NO在生物體內(nèi)經(jīng)歷一系列化學(xué)反應(yīng)， 最終形成相對(duì)穩(wěn)定的氧化產(chǎn)物亞硝酸鹽N02—和硝酸鹽N03—，利用硝酸還原酶法先把血清NOr還原為N02—，在pH7.5 8.1條件下，N02 —與對(duì)氨基 苯磺酸發(fā)生重氮化，再與N-(l-萘基)-乙二胺偶聯(lián)生成一深紫紅色的偶 氮化合物，用酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司SpectraMAX190)測(cè)定其吸 光度以確定NO濃度。 心肌梗死范圍測(cè)定
按本室建立的方法檢測(cè)心肌梗死范圍。簡述如下再灌注3h結(jié)東后， 再次結(jié)扎冠脈，向左心室腔注入2%伊文藍(lán)(1-2 mL)。速取出心臟，凍 存于-20'C。用心臟切片器垂直于心臟長軸將其切成lmm厚的薄片，分片置 于含2 mL 1%TTC ( pH 7.4 )的12孔培養(yǎng)皿中，37'C孵育15min。用數(shù)碼相 機(jī)拍照并輸入計(jì)算機(jī)。采用單盲法分別將伊文藍(lán)染色區(qū)(非缺血區(qū))、TTC 染色區(qū)(紅染，缺血但仍存活組織)以及非TTC染色區(qū)(梗死心肌)，用 SigmaScan占總?cè)毖獏^(qū)面積(AAR)的百分比表示。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用GraphPad Prism software 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和曲線擬 合，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以z士s。多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析(ANOVA)，若總體 差異顯著，再以t檢驗(yàn)分析相應(yīng)兩組間的顯著性差別。以P〈0.05為差異顯 著的界限。
(2)心肌梗死范圍、血清CK、 LDH活性結(jié)果
從減小MIS方面，觀察AcDI-302對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用。AcDI-302 三組間總?cè)毖秶?AAR/LV%)無明顯差異。缺血30min再灌3 h造成 大鼠明顯心肌梗死，ISMN及AcDI-302組較溶媒對(duì)照劑組有明顯縮小 [(35.5±3.9 ) %和(18± 5.6) % vs. (56 ± 6) %, n = 8,尸< 0.01 ]，而 ACDI-302組MIS較ISMN組也有明顯縮小(i5 < 0.05)。不同處理組大鼠 MI/R3h后心肌梗死情況見圖1A。當(dāng)心肌細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞膜完整性遭到 破壞，導(dǎo)致膜通透性增加，心肌細(xì)胞內(nèi)CK和LDH大量外漏。發(fā)明人檢測(cè) 了大鼠缺血30min再灌3h血清中LDH、 CK活性。結(jié)果顯示，MI/R使血清中CK活性較假手術(shù)組組明顯增加(11 ± 1.3 vs. 1.5 士 0.5 U'mr1， n = 8，尸< 0.01),與溶媒對(duì)照劑組比,ISMN組(6.3 ± 0.8 U.ml1 )、 AcDI-302組(3.4 土 0.7 U.mr1)血清中CK活性都明顯降低(n = 8，尸< 0.01), AcDI-302組也 明顯低于ISMN組(n = 8，P<0.05)。不同處理組大鼠MI/R3 h血清中CK 活性見圖1B。血清中LDH活性也有相似趨勢(shì)MI/R使血清中LDH活性 較假手術(shù)組組明顯增加(5677 ± 738 vs. 606 ± 227 U.mr1， n = 8, i3 < 0.01 )， 與溶媒對(duì)照劑組比，ISMN組(3765 ± 526 U.mr1, n = 8，尸< 0.01 )和ACDI-302 組(2691 ± 216 U.mr1, n = 8，戶< 0.01 )都明顯降低。不同處理組大鼠MI/R3 h血清中LDH活性見圖1C。上述結(jié)果提示，ACDI-302可減少缺血心肌細(xì) 胞死亡，且這種作用強(qiáng)于ISMN。
(3) 心功能檢測(cè)結(jié)果
發(fā)明人監(jiān)測(cè)了大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。缺血前各指標(biāo)Baseline值無明顯 差異。再灌注后，各組間心率(HR)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；LVDP值正常對(duì)照組 為136±29mmHg，溶媒對(duì)照劑組比假手術(shù)組組有顯著降低(58 ± 10 vs. 136 ± 29 mmHg, n = 8,戶< 0.01 )， IS畫(93 ± 4腿Hg， n = 8， P < 0.05 )和 AcDI-302 ( 106 ± 6 mmHg， n = 8， P < 0.01)均使LVDP較溶媒對(duì)照劑組有顯 著升高；左室內(nèi)壓微分也有相似趨勢(shì)，正常對(duì)照組+dP/dtn^值為3970±275 mV.s"， -dP/dtmax值為-4042 ± 245 mV.s",溶媒對(duì)照劑組+dP/dt鵬較假手術(shù) 組組有顯著降(1052 ± 288 vs. 3686 ± 288 mV.s"， n = 8, P < 0.01 )， -dP/dtmax (-1286 ± 314 vs. -3487 ± 284 kPa's"， n = 8,尸< 0.01 )， IS畫(1793 ± 185 mV.s", -2212 ± 95 mV.s")和AcDI-302 (2638 ± 224 mV-s", -2842 ± 163 mV's")均使士dP/dU^較溶媒對(duì)照劑組有顯著升高(11 = 8,尸均小于0.01)。 不同處理組大鼠心肌缺血再灌注3h心功能恢復(fù)情況見圖2?？梢姡珹cDI-302 可以改善缺血心肌的心功能，而且保護(hù)作用強(qiáng)于ISMN。
(4) 血清NO釋放量和MDA含量
缺血30 min再灌3 h造成大鼠血清中NO含量較假手術(shù)組組有升高(21 ±3 vs. 7.2 ±2.1 Mmol.L"，n-8，尸〈0.01), IS顧組(312士50 ,l.L隱1) 及AcDI-302組(355士31 pmol'I/1 )較溶媒對(duì)照劑組也有明顯升高(n = 8,各 組P均小于0.01 )。不同處理組大鼠MI/R 3 h后血清中NO含量見圖3-3A。 由結(jié)果可見，當(dāng)AcDI-302組摩爾用藥量僅為是ISMN的八分之一時(shí)，血清 中NO含量即大于ISMN組的1/2。 MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含 量增加反應(yīng)細(xì)胞膜經(jīng)過氧化反應(yīng)后的破壞程度。MI/R使血清中MDA含量 較假手術(shù)組明顯增加(11.9士1.2vs.2.6士0.8nmol'ml",n二8,尸〈0.01)，與 溶媒對(duì)照劑組比，ISMN組(10.0 ± 0.7 nmol.mr1, n = 8, P < 0.05)和 AcDI-302組(4.7 ± 0.6 nmol.mr1, n = 8,戶< 0.01)血清中MDA含量都明顯 降低。不同處理組大鼠MI/R 3 h血清中MDA含量見圖3B。 NO與MDA 檢測(cè)結(jié)果提示，AcDI-302保護(hù)缺血心肌可能與其釋放NO并減少ROS對(duì)細(xì) 胞損傷有關(guān)。
權(quán)利要求
1、一種由通式(I)表示的化合物，其中R1＝H， id="icf0002" file="A2009100232990002C2.tif" wi="14" he="11" top= "72" left = "58" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>C2～C6的?；?，PhCH2-或C1～C6的烴基 id="icf0003" file="A2009100232990002C3.tif" wi="34" he="16" top= "92" left = "41" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>或 id="icf0004" file="A2009100232990002C4.tif" wi="39" he="21" top= "88" left = "86" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="yes"/>
2、權(quán)利要求l所述化合物的合成方法，其特征在于以丹參素為原料，將 其酴羥基及醇羥基用?；驘N基進(jìn)行保護(hù)，羥基保護(hù)的丹參素與二氯亞砜反應(yīng) 制備酰氯，酰氯與單硝酸異山梨醇酯或甘油1，3-二硝酸酯反應(yīng)得到目標(biāo)化合物； 目標(biāo)化合物羥基脫保護(hù)得到&為H的產(chǎn)物，具體合成路線如下■OH羥基保護(hù)R,O.d)SOCI2OR, (2)R2OH,Et3N0II= H , PhC-C2 Cs的?；?，PhCH2—, d^s的烴基 H'Q.ON02CH2ON02R2=—… 、、、'CH2ON02 ' H' o
3、權(quán)利要求l所述化合物的合成方法，其特征在于以丹參素為原料，將 其酚羥基及醇羥基用酰基或烴基進(jìn)行保護(hù)，羥基保護(hù)的丹參素與單硝酸異山梨 醇酯或甘油1，3-二硝酸酯在DMAP和縮合劑存在下進(jìn)行縮合反應(yīng)得到目標(biāo)化合 物；目標(biāo)化合物羥基脫保護(hù)得到R,為H的產(chǎn)物，具體合成路線如下<image>image see original document page 3</image>
4、根據(jù)權(quán)利要求3所述化合物的合成方法，其特征在于縮合劑是l，3-二 環(huán)己基碳二亞胺，1,3-二異丙基碳二亞胺或l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺。
5、 權(quán)利要求1所述化合物在制備預(yù)防和治療缺血/再灌注損傷藥物中的應(yīng)用。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于該藥物是由含有有效應(yīng)用量的 權(quán)利要求1所示化合物和藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于該藥物是片劑、膠囊劑、散劑、 丸劑、顆粒劑或乳劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)構(gòu)通式(I)表示的NO供體藥物及其合成方法。本發(fā)明將具有抗脂質(zhì)過氧化、清除自由基作用的丹參素與NO供體結(jié)構(gòu)鍵合，形成新型藥物，這些藥物分子兼具有釋放NO又能清除氧自由基的特征，對(duì)缺血/再灌注損傷有明顯防治作用，可以有效地縮小心肌梗死范圍，使血清中CK、LDH活性和MDA濃度顯著降低。
文檔編號(hào)A61P39/06GK101597231SQ200910023299
公開日2009年12月9日 申請(qǐng)日期2009年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月10日
發(fā)明者茹 姜, 孫曉莉, 王平安, 王愉臻, 惠 陳 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)