專利名稱：含海藻糖的穩(wěn)定化因子ix制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實(shí)施方式涉及在凍干和儲(chǔ)存期間蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性的穩(wěn)定化，具體而 言，涉及凝血因子如因子IX的穩(wěn)定化。
背景技術(shù)：
因子IX是參與凝血途徑的單鏈糖蛋白。因子IX是一種含有氨基末端信號(hào)肽 和前原(prepro)前導(dǎo)序列(二者在分泌進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)之前斷裂)以及負(fù)責(zé)Ca2+結(jié)合的 Gla結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)復(fù)雜分子(或結(jié)構(gòu)性配分子，structurally complex molecule)。鈣結(jié) 合通過結(jié)合至凝血活性所需的蛋白以及誘導(dǎo)其構(gòu)象變化而在因子IX功能中發(fā)揮重要作 用。鈣結(jié)合導(dǎo)致之前埋藏的疏水結(jié)合位點(diǎn)暴露，這些結(jié)合位點(diǎn)有利于結(jié)合至有效凝血的 磷脂。為了產(chǎn)生活性蛋白，維持因子IX的鈣結(jié)合性質(zhì)是必要的。一旦活化肽被切割，則 單鏈因子IX變成活化的酶因子IXa，一種經(jīng)由鏈間二硫鍵連接的雙鏈糖蛋白。另外，該分 子含有多個(gè)N和0-連接的糖基化位點(diǎn)。因子IX的缺乏導(dǎo)致B型血友病，對(duì)該病目前可 利用多種療法，包括BeneFIX ，一種因子IX的重組形式，和Mononine ，其來源于人 體血漿。Mononine 的制劑由組氨酸、甘露醇、氯化鈉和聚山梨醇酯80組成。這些主 要是已知在冷凍期間表現(xiàn)出共晶轉(zhuǎn)變(eutectictransition)(結(jié)晶行為)的賦形劑。然 而，Mononine 制劑不含防凍劑或穩(wěn)定劑，僅有緩沖劑、疏松劑(或蓬松劑，bulking agent)、等張劑和表面活性劑。因此，在冷凍、凍干和隨后的儲(chǔ)存期間，該蛋白相對(duì)地未進(jìn)行 物理保護(hù)且由于暴露于冰、水和空氣而產(chǎn)生變性效應(yīng)。這里解決的技術(shù)問題是一種改良的 因子IX制劑，其中改善了冷凍、凍干和儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在冷 凍、凍干和儲(chǔ)存期間，在因子IX組合物中包含海藻糖穩(wěn)定了因子IX的鈣結(jié)合能力并維持了 這種純化蛋白的生物活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實(shí)施方式涉及包含因子IX和海藻糖的凍干組合物。優(yōu)選地，海藻糖以在 凍干和25°C下儲(chǔ)存6個(gè)月期間足以保留超過90%的因子IX的鈣結(jié)合性質(zhì)的量存在。優(yōu)選地，海藻糖按體積計(jì)以0. 5 3%的量存在。且更優(yōu)選地，海藻糖按體積計(jì)以 1 2%的量存在。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，該組合物包含作為緩沖劑的組氨酸。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，該組合物包含甘露醇。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，該組合物包含氯化鈉。在一些優(yōu)選實(shí) 施方式中，該組合物包含聚山梨醇酯80。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物包含因子IX和海藻糖，并另外地包含濃度為 5 20mM的組氨酸、按體積計(jì)濃度為2 5%的甘露醇、濃度為50 80mM的氯化鈉、和按 體積計(jì)濃度為0. 001 0. 005%的聚山梨醇酯80。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及制備因子IX的穩(wěn)定干燥組合物的方法，該方法通過混合 含有因子IX和海藻糖的溶液以獲得一種防凍溶液并冷凍干燥該防凍溶液而獲得因子IX的 穩(wěn)定干燥組合物。優(yōu)選地，因子IX的干燥組合物在25°c下儲(chǔ)存6個(gè)月后保留超過90%的 鈣結(jié)合活性。優(yōu)選地，海藻糖按體積計(jì)以0. 5 3%的量存在。而更優(yōu)選地，海藻糖按體積計(jì)以 1 2%的量存在。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述溶液包含作為緩沖劑的組氨酸。在一些優(yōu)選實(shí)施方 式中，所述溶液包含甘露醇。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，所述溶液包含氯化鈉。在一些優(yōu)選實(shí) 施方式中，所述溶液包含聚山梨醇酯80。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述溶液包含因子IX和海藻糖并另外地包含濃度 為5 20mM的組氨酸、按體積計(jì)濃度為2 5%的甘露醇、濃度為50 80mM的氯化鈉、和 按體積計(jì)濃度為0. 001 0. 005%的聚山梨醇酯80。優(yōu)選地，冷凍干燥操作包括一個(gè)退火步驟。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及通過包括以下步驟中的一個(gè)或多個(gè)的方法凍干包含因子 IX和海藻糖的藥物制劑的方法(a)在-40°C或更低的溫度下冷凍包含因子IX和海藻糖的藥物制劑；(b)在約-20°C和-35°C之間退火該藥物制劑；(c)將該藥物制劑的溫度降低至-40°C或更低；(d)在5°C 20°C于減壓下在第一干燥步驟中干燥該藥物制劑；和(e)在45°C 55°C于減壓下在第二干燥步驟中干燥該藥物制劑。優(yōu)選地，該藥物制劑還包含濃度為5 20mM的組氨酸、按體積計(jì)濃度為2 5% 的甘露醇、濃度為50 80mM的氯化鈉、和按體積計(jì)濃度為0. 001 0. 005%的聚山梨醇酯 80。根據(jù)以下對(duì)優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其他方面、特征和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)顯而 易見。


現(xiàn)在將參照優(yōu)選實(shí)施方式的附圖，描述本發(fā)明的這些和其他特征，這些優(yōu)選實(shí)施 方式用于舉例說明本發(fā)明而非限制本發(fā)明。圖1示出了因子IX在40°C/75% RH下的穩(wěn)定性?！啊ぁ北硎驹贗OmM組氨酸、3%甘 露醇、66mM NaCl,0. 0075%聚山梨醇酯 80 (pH6. 8)中的 0. 4mg/mL 因子 IX 蛋白(Rl)?！? ” 表示在IOmM組氨酸、3%甘露醇、66mM NaCl、0. 0075%聚山梨醇酯80 (pH 6.8)中并具有
海藻糖的0. 4mg/mL因子IX蛋白(R2)。圖2示出了在儲(chǔ)存12周之后因子IX組合物的SE-HPLC洗脫曲線圖。圖2A示出
4了在IOmM組氨酸、3%甘露醇、66mM NaCl和0. 0075%聚山梨醇酯80 (pH 6.8)中的0. 4mg/ mL因子IX蛋白(Rl)。圖2B示出了在IOmM組氨酸、3%甘露醇、66mM NaCl、0. 0075%聚山 梨醇酯80 (pH 6. 8)中并具有海藻糖的0. 4mg/mL因子IX蛋白(R2)。圖3示出了在儲(chǔ)存12周之后因子IX的SE-HPLC(鈣)洗脫曲線圖。圖3A示出了 在IOmM組氨酸、3%甘露醇、66mM NaCl和0. 0075%聚山梨醇酉旨80 (pH 6. 8)中的0. 4mg/mL 因子IX蛋白(Rl)。圖3B示出了在IOmM組氨酸、3%甘露醇、66mM NaCl、0. 0075%聚山梨醇 酯80 (pH 6. 8)中并具有海藻糖的0. 4mg/mL因子IX蛋白(R2)。圖4示出了在40°C /75% RH下因子IX鈣結(jié)合穩(wěn)定性。“·”表示在IOmM組氨酸、 3%甘露醇、66mM NaCl、0. 0075%聚山梨醇酯 80(pH 6.8)中的 0. 4mg/mL 因子 IX 蛋白(Rl)。 “ · ”表示在IOmM組氨酸、3%甘露醇、66mM NaCl、0. 0075%聚山梨醇酯80 (pH 6.8)中并具 有海藻糖的0. 4mg/mL因子IX蛋白(R2)。圖5示出了在非還原㈧和還原⑶條件下儲(chǔ)存12周之后，因子IX制 劑的SDS-PAGE分析。圖A 泳道1，空白；泳道2，標(biāo)記物；泳道3，因子IX參考標(biāo)準(zhǔn) (Mononine )；泳道 4，0. 4mg/ml，R1，凍干(Iyo)-20 °C ；泳道 5，0. 4mg/ml，R2，凍 干-200C ；泳道 6,0. 4mg/ml, R1，凍干 2 8°C ；泳道 7,0. 4mg/ml, R2，凍干 2 8°C ；泳道 8， 0. 4mg/ml，Rl，凍干 251;泳道9，0. 4mg/mL，R2，凍干 25°C;泳道 10，0. 4mg/mL，Rl，凍干 40°C; 泳道11，0. 4mg/ml，R2，凍干40 V ；泳道12，標(biāo)記物。圖B 泳道1和2，標(biāo)記物；泳道3，因子 IX 參考標(biāo)準(zhǔn)(Mononine )；泳道 4，0· 4mg/ml，R1，凍干-20°c ；泳道 5，0· 4mg/ml，R2， 凍干-20°C ；泳道 6,0. 4mg/mL, R1，凍干 2 8°C ；泳道 7,0. 4mg/mL, R2，凍干 2 8°C ；泳道 8,0. 4mg/mL, R1，凍干 25°C ；泳道 9，0. 4mg/mL, R2，凍干 25°C ；泳道 10，0. 4mg/ml, Rl，凍干 40 °C ；泳道 11，0. 4mg/ml，R2，凍干 40 °C ；泳道 12，標(biāo)記物。圖6示出了因子IX組合物在儲(chǔ)存12周之后的陰離子交換HPLC洗脫曲線圖。圖 6A示出了在IOmM組氨酸、3%甘露醇、66mM NaCl和0. 0075%聚山梨醇酯80 (pH 6.8)中的 0. 4mg/mL因子IX蛋白(Rl)。圖6B示出了在IOmM組氨酸、3%甘露醇、66mMNaCI、0. 0075% 聚山梨醇酯80 (pH 6.8)中并具有海藻糖的0.4mg/mL因子IX蛋白(R2)。
具體實(shí)施例方式盡管所描述的實(shí)施方式代表了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是應(yīng)該理解，對(duì)于本領(lǐng) 域技術(shù)人員而言可以進(jìn)行變形而不會(huì)偏離本發(fā)明的精神。因此本發(fā)明的范圍將僅僅由所附 權(quán)利要求進(jìn)行確定。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及在海藻糖存在下凍干因子IX的方法以及含海藻糖的因子 IX制劑。在添加和沒有添加海藻糖的情況下對(duì)因子IX制劑進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中海藻糖是一種在 凍干工藝期間不會(huì)結(jié)晶的防凍劑。隨著冷凍至較低溫度，海藻糖保持為一種經(jīng)歷玻璃轉(zhuǎn)化 的濃縮物。因此，在海藻糖存在下，蛋白得以保存，通過冷凍和凍干而保持混合無定形狀態(tài) 并被穩(wěn)定化。海藻糖改善了儲(chǔ)存的因子IX蛋白的穩(wěn)定性并防止了聚集。還令人驚奇地發(fā) 現(xiàn)，在制劑中包含海藻糖顯著地改善對(duì)于因子IX活性所需的鈣誘導(dǎo)構(gòu)象變化的保持。鈣結(jié) 合能力的明顯損失與效能損失相關(guān)。這種鈣結(jié)合能力和效能的損失在包含海藻糖的制劑中 被大大地延遲。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在冷凍、凍干和儲(chǔ)存期間通過在因子IX組合物中包含海藻糖，因子IX的至少50 %，更優(yōu)選至少70 %，還更優(yōu)選至少80%，還更優(yōu)選至少90 %的鈣結(jié) 合能力得以保持。優(yōu)選地，海藻糖以在冷凍、凍干和在25°C下儲(chǔ)存至少3個(gè)月，更優(yōu)選在 25°C下儲(chǔ)存至少6個(gè)月并且還更優(yōu)選在25°C下儲(chǔ)存至少1年期間，足以保持超過90%的因 子IX鈣結(jié)合性質(zhì)的量存在。制劑組分在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的因子IX組合物包含緩沖劑、疏松劑、等張劑、表面活 性劑和防凍劑/穩(wěn)定劑。在一些實(shí)施方式中，也可以包含其他賦形劑。這些組合物最大化 了因子IX在凍干制備物(或制劑，pr印arations)中以及其液體狀態(tài)的穩(wěn)定性。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物中包含緩沖劑。在凍干和儲(chǔ)存期間，pH應(yīng)該優(yōu)選維 持在6 8的范圍，并且更優(yōu)選pH為約6. 8。緩沖劑可以是具有作為緩沖劑的能力的任何 生理上可接受的化學(xué)物質(zhì)(chemical entity)或化學(xué)物質(zhì)的組合，包括組氨酸、三_(羥甲 基)_氨基甲烷(TRIS)、1，3-二-[三-(羥基-甲基)甲氨基]-丙烷(BIS-Tris丙烷)、 哌嗪-N，N，-二 - (2-乙磺酸)(PIPES)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、N-2-羥乙基-哌 嗪-N，-2-乙磺酸(HEPES)、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)和N-2-乙酰胺-2-氨基乙磺酸 (ACES)。典型地，所包含的緩沖劑濃度為5 20mM。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方式中，緩沖劑是 濃度為約IOmM的組氨酸。疏松劑是在經(jīng)過凍干之后對(duì)藥物制備物的“餅(或塊，cake)，，或殘存固體物質(zhì)提 供結(jié)構(gòu)并保護(hù)它以防止坍塌的那些化學(xué)物質(zhì)。在本發(fā)明制劑中所使用的疏松劑選自包括但 不限于甘露醇、甘氨酸和丙胺酸的組。甘露醇、甘氨酸或丙氨酸以1 10%，優(yōu)選2 5%， 且更優(yōu)選約3%的量存在。在本發(fā)明制劑中所包含的氯化鈉的量為30 IOOmM,優(yōu)選50 80mM，并且最優(yōu)選 約 66mM。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，因子IX組合物包含表面活性劑，優(yōu)選含量為0. 1 %或 更低，并且更優(yōu)選含量為0.001 0.005%。表面活性劑例如可以選自，包括但不限于 聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、復(fù)合多元醇加聚物(或聚氧丙烯和聚氧乙烯的加聚物， pluronicpolyols)和BRIJ35 (聚氧乙烯23月桂基醚)的組?？梢垣@得幾種級(jí)別的復(fù)合多 元醇加聚物(以商標(biāo)名PLUR0NIC進(jìn)行銷售，由BASFWyandotte Corporation生產(chǎn))。這些 不同分子量(從1，000至超過16，000)和物理化學(xué)性質(zhì)的多元醇都已經(jīng)被用作表面活性 劑。分子量為5，000的PLUR0NIC F-38和分子量為9，000的PLUR0NICF-68，都包含(按重 量計(jì))80 %的親水聚氧乙烯基團(tuán)和20 %的疏水聚氧丙烯基團(tuán)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所包 含的聚山梨醇酯80的濃度為約0. 0075%。優(yōu)選地，在本發(fā)明的制劑中使用穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑選自，包括但不限于蔗糖、海藻糖、 棉子糖和精氨酸的組。這些試劑在本發(fā)明的制劑中存在的量為0.5% 3%，優(yōu)選 2%，更優(yōu)選約1%。在高度優(yōu)選的實(shí)施方式中，在組合物中所包含的海藻糖濃度為1%。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在本發(fā)明組合物中所使用的因子IX是高度純化的人血漿 來源的因子IX或更優(yōu)選地可以是重組生產(chǎn)的因子IX。重組因子IX能夠通過用帶有編碼因 子IX分子的DNA序列的載體轉(zhuǎn)染的中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)。用于產(chǎn)生這樣的 轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的方法，尤其描述于Toole，Jr.的美國專利No. 4，757，006中，盡管可替代的 方法在本領(lǐng)域內(nèi)也是已知的(參見，例如，也是Toole，，Jr.的美國專利No. 4，868，112、及PCT 國際申請(qǐng) W0-A-91/09122)。盡管本申請(qǐng)中描述的因子IX組合物能夠在所指定濃度下進(jìn)行凍干和重構(gòu)，但是 本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)該理解到，這些制備物(或制劑，pr印arations)也能夠以更加稀釋 的形式進(jìn)行重構(gòu)。例如，被凍干和/或一般在2mL溶液中重構(gòu)的根據(jù)本發(fā)明的制備物也能 夠在更大稀釋體積，如5mL中進(jìn)行重構(gòu)。這在因子IX制備物將向患者立即注射時(shí)是尤其適 合的，因?yàn)樵谶@種情況下因子IX更不易于失活，這種失活在因子IX更稀的溶液中更快速地 發(fā)生。實(shí)施例重組因子IX在用編碼人體因子IX的cDNA轉(zhuǎn)染的中華倉鼠卵巢細(xì)胞中進(jìn)行制備。 因子IX采用包括陰離子和陽離子交換色譜的工藝從條件培養(yǎng)基(conditioned media)中 進(jìn)行純化，以從包含宿主細(xì)胞蛋白和DNA的培養(yǎng)基組分中分離所期望的產(chǎn)物。通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法實(shí)施凍干。有關(guān)凍干的信息可以在Carpenter， J. F. and Chang, B. S., Lyophilization of ProteinPharmaceuticals, Biotechnology and BiopharmaceuticalManufacturing, Processing and Preservation, K. E. Avis and V. L. ffu,eds. (Buffalo Grove, 111. Jnterpharm Press, Inc.),pp. 199-264(1996)中找到。 在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“冷凍干燥”和“凍干”可以互換使用，以包括用于樣品濃縮的所有 步驟，包括退火和干燥步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，凍干包括1 3個(gè)退火步驟。在優(yōu)選的 實(shí)施方式中，凍干利用一個(gè)退火步驟進(jìn)行。術(shù)語“退火”是指在經(jīng)受凍干的藥物制備物的凍 干工藝中，在制備物冷凍干燥之前的步驟，其中制備物的溫度從較低溫度向較高溫度升高， 然后在一定時(shí)間后再次冷卻。干燥步驟在減壓下進(jìn)行，典型地是在50 300微巴下進(jìn)行。示例性方案在下表1中舉例說明。表 1 采用因子IX—步凝血測定來確定活性。一步測定在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。本文中 所用的測定利用作為因子IX活性標(biāo)準(zhǔn)的通用凝血定標(biāo)血漿(UCRP)和用于稀釋校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)和 未知樣品的因子IX-缺乏血漿。該測定涉及將血漿與活化劑和氯化鈣混合以啟動(dòng)凝血級(jí) 聯(lián)，其中通過在微板閱讀器上的吸光度而檢測纖維蛋白凝塊的形成。在該測定中檢測的凝 血時(shí)間是aPTT(激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間)，吸光度越過預(yù)定閾值所需的時(shí)間。因子 IX活性的精確確定通過比較未知物與同時(shí)測定的因子IX參照標(biāo)準(zhǔn)(UCRP)的信號(hào)而實(shí)現(xiàn)。 注意，提供的所有數(shù)據(jù)都來自每個(gè)溫度每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的1個(gè)小瓶(vial)。實(shí)施例1在含有海藻糖的穩(wěn)定仆滿丨布丨中的因子IX在25°C和40°CT·儲(chǔ)存其月間表現(xiàn)+MU曾高的
穩(wěn)定件。因子IX在如下表2中所示的兩個(gè)候選制劑的每一個(gè)中進(jìn)行凍干。這兩個(gè)制劑都包 含IOmM組氨酸、3%甘露醇、66mM NaCl、0. 0075%聚山梨醇酯80，pH 6.8。制劑之一 (R2)另 外還含有海藻糖(1 % )。制劑在26周內(nèi)在-20°C和2 8°C的實(shí)時(shí)儲(chǔ)存條件以及25°C /60% RH和40°C /75% RH的條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)。在0. 4mg/mL的因子IX在整個(gè)研究中通過包括體 積排阻(SE)-HPLC、離子交換(IE)-HPLC、反相(RP)-HPLC、SDS-PAGE的系列分析方法，評(píng)價(jià) 蛋白濃度、濁度、PH、可視外觀(餅和重構(gòu)液體)、殘留水分和活性。制劑配制(formulation configuration)是在IOmL玻璃小瓶中填充5mL。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得的測定結(jié)果通過將每一儲(chǔ)存條件的檢測值除以配制產(chǎn)品 在-20°C下儲(chǔ)存獲得的檢測值而進(jìn)行歸一化，通過定義，這取作表示100%。采用這種方法 是為了在研究的時(shí)間期內(nèi)盡量最小化研究實(shí)驗(yàn)室測定的變化性。表 2穩(wěn)定性評(píng)價(jià)時(shí)間點(diǎn) 表 3 如表3所示結(jié)果表明的，海藻糖(1%)的加入顯著改善了凍干因子IX在 400C /75RH儲(chǔ)存期間的穩(wěn)定性。海藻糖制劑的特定活性，即重構(gòu)藥物產(chǎn)品中的因子IX活性 單位/mg蛋白，在40°C /75% RH下儲(chǔ)存12周期間下降至 15%，而用海藻糖配制的因子 IX的特定活性僅僅輕微下降。如圖1中所示，在12周時(shí)間期內(nèi)的特定活性衰減速率分析表明，海藻糖將在 400C /75% RH下的衰減速率降低幾乎20倍(-0. 0096wk_1對(duì)-0. 187wk_1)。海藻糖對(duì)在室溫條件(一般25°C /60% )下儲(chǔ)存的凍干因子IX的穩(wěn)定性的保護(hù) 效應(yīng)也是顯著的。海藻糖的表觀效應(yīng)是將特定活性衰減速率降低 5倍，從0. OlQBwk-1至 0. 0039 !^ (表3)。用海藻糖配制的因子IX的衰減表觀速率表明，該凍干產(chǎn)品在室溫下儲(chǔ) 存長達(dá)26周(6個(gè)月)也將是穩(wěn)定的。檢測和計(jì)算的特定活性值提供了海藻糖配制的因子 IX可以在26周保持 90%的活性的支持(表3)。實(shí)施例2如體積排阻HPLC(SE-HPLC)所表明的，含有海藻糖的因子IX制劑在凍干產(chǎn)品儲(chǔ)存 期間表現(xiàn)出更少的聚集。高分子量聚集體的形成，如通過體積排阻色譜HPLC(SE-HPLC)所檢測的，降低了 因子IX制備物的表觀純度和特定活性。向Rl制劑緩沖液中加入海藻糖(1% )看起來顯著防止在凍干產(chǎn)品儲(chǔ)存期間因子IX的聚集。在12周儲(chǔ)存之后，Rl和R2配制產(chǎn)品的SE-HPLC 洗脫曲線如圖2所示。因子IX 的體積排阻利用 Tosoh G3000Sffxl 柱(7. SnmX30cm，5 μ m，25θΑ )在 Agilent 1100 系列 HPLC 上實(shí)施。等度法(isocraticmethod)采用 50mM Tris、200mM NaCl PH 7. 5作為流動(dòng)相。實(shí)施例3在牽丐存在下，體積_陽.HPLC表明用海藻糖儲(chǔ)存的IX{呆持講行I丐i秀導(dǎo)豐勾象奪 化的能力。通過結(jié)合至對(duì)于凝血活性所需的蛋白并誘導(dǎo)其構(gòu)象變化，鈣離子在因子IX功能 中起重要作用。鈣誘導(dǎo)的構(gòu)象變化，其減小溶液中蛋白的流體動(dòng)力學(xué)體積，能夠通過諸如 SE-HPLC的方法作為表觀分子量的減小而進(jìn)行檢測。如在因子IX活性直接檢測時(shí)所觀察到的(表3)，向制劑緩沖液中加入海藻糖 (1% )，在保留因子IX的功能方面(在這種情況下，就是結(jié)合鈣并進(jìn)行鈣誘導(dǎo)構(gòu)象變化的 能力)，顯著地改進(jìn)了儲(chǔ)存期間凍干因子IX的穩(wěn)定性。在鈣存在下，對(duì)于存在(R2)和不存 在(Rl)海藻糖的因子IX組合物，在12周儲(chǔ)存之后，SE-HPLC洗脫曲線如圖3所示。雖然 在Rl配制的藥物產(chǎn)品(無海藻糖)中的功能因子IX的百分?jǐn)?shù)在40°C /75% RH下儲(chǔ)存12 周期間下降至 31%，但是在R2配制的藥物產(chǎn)品(+海藻糖)中的功能因子IX百分?jǐn)?shù)僅稍 微低于在低溫(_20°C，2 8°C )下儲(chǔ)存的因子IX。如圖4所示，在12周的時(shí)間內(nèi)的功能(鈣誘導(dǎo)的構(gòu)象變化)衰減速率的分析表明， 海藻糖將在40°C /75% RH下的衰減速率降低 19倍(-0. 0046wk^對(duì)-0. 0853wk^)，這非 常類似于效能的衰減速率降低的 20倍(圖1)。實(shí)施例4用海藻蒱配質(zhì)丨的因子IXm^mm^m^mm ΛΛΨ^實(shí)施SDS-PAGE以獲得在各種條件下在12周儲(chǔ)存之后，凍干因子IX的純度的直觀 比較。如圖5中圖A所示，在所有樣品中看起來存在痕量的高分子量污染物，但是這個(gè)量對(duì) 于已在高溫下儲(chǔ)存的因子IX是逐漸升高的。這在非還原SDS-PAGE凝膠的泳道8和10中 最易于觀察到，其中示出了分別保持在25°C /60% RH和40°C /75% RH下的來自Rl配制的 因子IX的樣品(無海藻糖)。在泳道9和11示出的來自R2(+海藻糖)配制的因子IX相 對(duì)應(yīng)的樣品，當(dāng)相比于儲(chǔ)存在2 8°C或-20°C下的Rl或R2配制的因子IX(泳道4 7) 時(shí)，表現(xiàn)出幾乎沒有高分子量污染物的量增多的跡象。盡管在用于本研究中的因子IX制備物中可檢測到因子IX的降解形式，但是含量 看起來在任何試驗(yàn)條件下并未隨著儲(chǔ)存時(shí)間增加。因子IX、(因子IXy)是一種因子IX的 截短的低分子量形式，其是在完整蛋白在Arg318-Ser319肽鍵或在Arg318_Ser319肽鍵附 近被蛋白水解切割以從該分子的羧基端區(qū)釋放IOkDa肽時(shí)形成的。在因子IX制劑中存在 的因子IXy，能夠在非還原的SDS-PAGE凝膠(圖A)中作為表觀分子量為約45kDa遷移的 次要帶觀察到。在圖5的圖A中所示的凝膠的視覺檢查表明，在本研究的時(shí)間期內(nèi)的儲(chǔ)存 期間并未發(fā)生因子IX顯著蛋白水解成因子IXy。實(shí)施例5離子交換代譜表日月，海藻因子IX組合4勿穩(wěn)定
離子交換色譜具有部分地分離電荷和/或電荷分布不同的蛋白亞型的潛力。因子 IX 的陰離子交換色譜采用 GE Healthcare TricornMonoQ 5/50GL 柱(5 X 50mm，10 μ m)實(shí) 施。二元梯度方法利用50mM Tris pH 7. 5作為流動(dòng)相A，以及50mM TrisU M NaCI pH 7.5 作為流動(dòng)相B。如在本研究中實(shí)施的，陰離子交換色譜產(chǎn)生作為單個(gè)對(duì)稱峰(其在40°C /75% RH 下的儲(chǔ)存時(shí)間內(nèi)被加寬)的Rl配制因子IX(無海藻糖)的洗脫液，而R2配制的因子IX(+ 海藻糖)的洗脫液看起來在這個(gè)方面基本上無變化。這些結(jié)果如圖6所示。Mit通過向制劑中加入海藻糖(1%)，已知可使高度純化的凍干因子IX在2 8°C下 穩(wěn)定至少2年，在保持蛋白的結(jié)構(gòu)和功能方面，獲得一種甚至更好的制劑。無海藻糖的因 子IX組合物(Rl)看起來在室溫(25°C /60% RH)下能夠穩(wěn)定約1個(gè)月。在海藻糖存在下 (R2)，因子IX藥物產(chǎn)品能夠穩(wěn)定約6個(gè)月(基于> 90%的保留活性)。當(dāng)因子IX在含有組氨酸、甘露醇、氯化鈉和聚山梨醇酯80的凍干制劑中用和不用 海藻糖配制時(shí)，具有海藻糖的制劑在25°C和40°C儲(chǔ)存期間呈現(xiàn)優(yōu)異的穩(wěn)定性分布，這可能 是由于通過所干燥的二糖的無定形性能產(chǎn)生的防凍益處。具有海藻糖的因子IX制劑呈現(xiàn)出的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)相當(dāng)于因子IX在冷藏溫度下儲(chǔ)存 的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)支持在含有海藻糖的制劑中的因子IX藥物產(chǎn)品在室溫下幾周和 可能甚至更長時(shí)間的溫度偏移(或溫度偏差，temperature excursion)的可能性。在無海藻糖的制劑中因子IX在40°C /75% RH的儲(chǔ)存導(dǎo)致-如通過SE-HPLC鑒定的，高分子量物種(物質(zhì))增加。-如通過一步凝血測定確定的，在12周內(nèi)活性呈降低趨勢。-IE-HPLC色譜曲線顯著加寬。在無海藻糖制劑中的因子IX在25V /60% RH下的儲(chǔ)存還導(dǎo)致如上所述的降解， 盡管到較小的程度。對(duì)于重構(gòu)產(chǎn)品的餅形態(tài)、濃度、濁度，或RP-HPLC，制劑之間沒有觀察到顯著差異。在冷藏和冷凍溫度下因子IX的26周穩(wěn)定性對(duì)于兩種制劑是相當(dāng)?shù)?。相比于沒有海藻糖的制劑，殘余水分水平和重構(gòu)倍數(shù)(reconstitution times)對(duì) 于含有海藻糖的制劑來說每一個(gè)都稍微偏高。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，應(yīng)該理解到，能夠作出許多和各種變形而不會(huì)偏離本 發(fā)明的精神。因此，應(yīng)該清楚地理解到，本發(fā)明的各種形式僅僅是舉例說明性的而不用于限 制本發(fā)明的范圍。
1權(quán)利要求
一種凍干組合物，包含因子IX和海藻糖，其中，所述海藻糖以在凍干和在25℃下儲(chǔ)存6個(gè)月期間足以保留超過90％的因子IX的鈣結(jié)合性質(zhì)的量存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，海藻糖以按體積計(jì)為0.5 3%的量存在。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組合物，其中，海藻糖以按體積計(jì)為1 2%的量存在。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的組合物，進(jìn)一步包含作為緩沖劑的組氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的組合物，進(jìn)一步包含甘露醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的組合物，進(jìn)一步包含氯化鈉。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的組合物，進(jìn)一步包含聚山梨醇酯80。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的組合物，進(jìn)一步包含濃度為5 20mM的組氨酸、 按體積計(jì)濃度為2 5%的甘露醇、濃度為50 80mM的氯化鈉、和按體積計(jì)濃度為0. 001 0. 005%的聚山梨醇酯80。
9.一種用于制備因子IX的穩(wěn)定干燥組合物的方法，包括 混合包含因子IX的溶液與海藻糖以獲得防凍溶液；和 冷凍干燥所述防凍溶液以獲得因子IX的穩(wěn)定干燥組合物，其中，當(dāng)在25°C下儲(chǔ)存6個(gè)月時(shí)，所述因子IX的干燥組合物保留超過90%的鈣結(jié)合活性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，海藻糖以按體積計(jì)為0.5 3%的量存在。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，海藻糖以按體積計(jì)為1 2%的量存在。
12.根據(jù)權(quán)利要求9 11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述溶液進(jìn)一步包含組氨酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求9 11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述溶液進(jìn)一步包含甘露醇。
14.根據(jù)權(quán)利要求9 11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述溶液進(jìn)一步包含氯化鈉。
15.根據(jù)權(quán)利要求9 11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述溶液進(jìn)一步包含聚山梨醇酯80。
16.根據(jù)權(quán)利要求9 11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述溶液進(jìn)一步包含濃度為5 20mM的組氨酸、按體積計(jì)濃度為2 5%的甘露醇、濃度為50 80mM的氯化鈉、和按體積 計(jì)濃度為0. 001 0. 005%的聚山梨醇酯80。
17.根據(jù)權(quán)利要求9 11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述冷凍干燥包括一個(gè)退火步馬聚o
18.—種凍干包含因子IX和海藻糖的藥物制劑的方法，包括以下步驟(a)在-40°C或更低的溫度下冷凍所述包含因子IX和海藻糖的藥物制劑；(b)在約-20 -35°C之間退火所述藥物制劑；(c)將所述藥物制劑的溫度降低至-40°C或更低；(d)在5°C 20°C于減壓下在第一干燥步驟中干燥所述藥物制劑；和(e)在45°C 55°C于減壓下在第二干燥步驟中干燥所述藥物制劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述藥物制劑進(jìn)一步包含濃度為5 20mM的 組氨酸、按體積計(jì)濃度為2 5%的甘露醇、濃度為50 80mM的氯化鈉、和按體積計(jì)濃度為 0. 001 0. 005%聚山梨醇酯80。
全文摘要
本發(fā)明公開了制備因子IX的凍干制備物的方法，這樣的制備物保留了超過90％的因子IX的鈣結(jié)合性質(zhì)。相對(duì)于沒有用海藻糖配制的因子IX，用海藻糖配制的因子IX在25℃/60％相對(duì)濕度(RH)和40℃/75％RH下儲(chǔ)存12周后，顯示出優(yōu)異的穩(wěn)定性分布。這些數(shù)據(jù)表明，在制劑中包含海藻糖能夠允許因子IX凍干產(chǎn)品的溫度偏移或甚至長時(shí)間的室溫儲(chǔ)存。所測試的制劑含有10mM組氨酸pH 6.8、3％甘露醇、66mM氯化鈉、0.0075％聚山梨醇酯80、含有和不含有1％海藻糖。在40℃/75％RH或25℃/60％RH下儲(chǔ)存超過12周后，含海藻糖的制劑與在2～8℃下儲(chǔ)存的產(chǎn)品相當(dāng)，而發(fā)現(xiàn)不含海藻糖的制劑產(chǎn)生了顯著的聚集并且喪失活性。這兩種制劑證實(shí)了在-20℃和2～8℃下實(shí)時(shí)儲(chǔ)存超過26周的類似穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)A61K38/00GK101903030SQ200880122207
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2008年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月21日
發(fā)明者薩米亞·曼卡里奧斯, 邁克爾·J·格里菲思 申請(qǐng)人:靈感生物制藥學(xué)有限公司